U.M.S.A.

Universidad Mayor De San Andres

Docente:

Dra. EuIemia Briancon Gutierrez

Autor:

Univ. Javier Mendoza Callata



Fecha
Lunes 24 de Junio del 2013
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


1. FE DE ERRATAS
Para poder realizar un mejor inIorme, el autor recurre a Iotos de anteriores semestres para poder
enIocar desde diIerentes angulos; Equipos, reactivos, procedimientos. Es asi que en al anterior inIorme se
cometio un error de toma de datos.

Jerdadero valor del Cloro residual libre

Fuente. Elaboracion propia

Calculos.

Para hallar la cantidad de Cloro Combinado, se realiza una simple resta.

N1: Cloro Residual Libre 0.59 |mg/l|
N
2
: Cloro Residual Total 1.01 |mg/l|
N
3
: Cloro Residual Combinado 1.01 |mg/l| - 0.59 |mg/l| 0.42 |mg/l|

El anterior semestre obtuvieron un valor de 0.64 |mg/l|. Y tambien analizaron el agua de griIo del IIS
seccion Microbiologia. Valor que por equivocacion se coloco en el inIorme que ya se presento.

Todo es causal, asi que tratando de sacar provecho de este error, podemos tambien concluir que; El cloro
residual en un mismo punto varia segun la temporada que se haya medido. Siendo este tema, tal vez un tema
interesante de investigacion.

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2. OB1ETIVOS
1.1 OB1ETIVO GENERAL
Determinar el numero de bacterias vivas heterotroIas que existen en una muestra de agua.
1.1 OB1ETIVOS ESPECIFICOS
Observacion de colonias en medio agar en distintas condiciones de crecimiento.
Conteo de colonias utilizando el contador Quebec.
3. FUNDAMENTO TERICO
Bacterias heterotroIas
Las bacterias heterotroIas se deIinen como aquellas bacterias que usan compuestos del carbono
organico como Iuente de energia y para su crecimiento, en contraposicion con las bacterias autotroIas que
utilizan los compuestos inorganicos como Iuente de energia y el CO
2
como Iuente de carbono.
Esta deIinicion de bacteria heterotroIa es amplia e incluye tanto a las bacterias saproIiticas como a
las patogenas (Del griego Phatos EnIermedad). Por lo tanto, tanto las bacterias que causan como las que
no causan enIermedades pueden ser heterotroIas.
Medios selectivos Vs no selectivos para la reproduccion de bacterias heterotroIas
Los medios RHP (Recuento HeterotroIo de Placas) empleados para enumerar los heterotroIos
encontrados en el agua se consideran medios no selectivos porque no tienen compuestos inhibitorios ni
selectivos para un determinado grupo de bacterias.
Algunos compuestos que se usan en los medios selectivos son; Sales biliares, sulIato de laurilo de
sodio o desoxicolato de sodio (usado en medios para la deteccion de coliIormes), azida de sodio (selectiva
para Enterococcus), colorantes (verde brillante) y antibioticos.
Las condiciones de incubacion, incluida la temperatura, pueden ser selectivas y por consiguiente
tales condiciones deben estar especiIicadas para las bacterias particulares que se procura detectar o
enumerar.


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Recuento HeterotroIo
El recuento heterotroIo de placa es un procedimiento cuyo objeto consiste en calcular el numero
de bacterias heterotroIas que existen en el agua. Las colonias de bacterias pueden surgir en pares,
cadenas, grupos o celulas unicas, englobadas todas bajo un unico termino de: Unidad Formadora de
Colonia (UFC), cuyo numero Iinal depende de la interaccion entre las colonias en desarrollo.

Debe elegirse el metodo y el medio que produzca el mayor numero de colonias en un tiempo
determinado de incubacion bajo condiciones controladas. Par lo cual se emplean principalmente tres
metodos:

Mtodo de la placa difusa (spread plate)
Metodo de la placa Iluida (pour plate)
Metodo del Iiltro de membrana
Metodo de la Placa DiIusa.
Este metodo no produce choque de calor y todas las colonias se encuentran sobre la superIicie del
agar, donde pueden distinguirse de las particulas y las burbujas.
Las colonias son Iaciles de transIerir y es sencillo comparar los resultados con las descripciones
publicadas, sin embargo, este metodo esta limitado por el pequeo volumen de muestra diluida que puede
absorber el agar (de 0.1 ml a 0.5 ml) segun el grado de secado de las placas.
Para utilizar este metodo ha de mantenerse un suministro adecuado de placas de agar absorbente
pre desecadas.
Para la preparacion de placas se vierte 15 ml del medio deseado en placas Petri de 10015 o de
9015 y se deja solidiIicar el agar, sobre el cual se siembra la muestra por medio del asa bacteriologica.
Metodo de la Placa Fluida.
Este metodo puede adaptarse a volumenes de muestra, que oscilan entre 0.1 ml y 2 ml.
Las colonias que se producen son relativamente pequeas y compactas y muestran menor
tendencia a rodear unas a otras que las producidas por crecimiento de superIicie; las colonias sumergidas
suelen tener un crecimiento mas lento, son diIiciles de transIerir y no se describen en los estudios
publicados.
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Para mantener la temperatura del agar debe disponerse de un bao de agua controlado por un
termostato, a pesar de ello se produce choque de calor durante la exposicion transitoria de la muestra al
agar a la temperatura de 45 C a 46 C.
Temperatura a la cual se encuentra el bao maria del laboratorio

Fuente, Elaboracion propia
Metodo del Filtro de Membrana.
Este metodo permite analizar grandes volumenes de muestras de agua de baja turbidez que
contengan menos de 1 a 10 UFC por mililitro.
El metodo no produce choque de calor, pero aade el costo del Iiltro de membrana, ademas de los
inconvenientes que presenta la menor area y la necesidad de detectar las colonias mediante la luz
reIlejada contra un Iondo blanco de no utilizarse Iiltros coloreados o tinciones de contraste.
Recomendaciones.
Se debe iniciar el proceso lo antes posible para reducir al minimo las alteraciones de la poblacion
bacteriana.
El tiempo maximo recomendado que debe transcurrir entre la recogida de la muestra y su estudio
es de 8 horas.
Antes de proceder a su estudio se debe marcar cada placa con el numero de la muestra, la dilucion,
la Iecha, y cualquier otra inIormacion necesaria.
En el caso de los metodos de placa Fluida y Placa DiIusa se deben utilizar placas Petri de vidrio
(65cm) o desechables de plastico (57cm).
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Usos del recuento heterotroIico en placas
El recuento heterotroIo en placas (RHP) es un procedimiento sencillo que se puede realizar por el
metodo de placa Iluida, diIusa o Iiltracion por membrana (FM) y es una herramienta muy util.
Aunque no es esencial para evaluar la seguridad del agua potable, los resultados del RHP
proporcionan inIormacion que complementa los resultados de los coliIormes totales.
El RHP se puede usar para indicar la composicion bacteriana general del agua de la Iuente y la
eIicacia y eIiciencia de los procesos de tratamiento del agua, como la sedimentacion, coagulacion,
Iiltracion y cloracion.
El monitoreo del RHP en el agua distribuida puede proporcionar inIormacion sobre la limpieza del
sistema de distribucion, desarrollo de bacterias despues del tratamiento, eIectos de los cambios de
temperatura en el agua y del cloro residual en la poblacion bacteriana.
4. MEDIOS DE CULTIVO
En el ensayo se utilizan los siguientes medios de cultivo:
Agar Tristona Glucosa Levadura.
Se utiliza para los metodos de placas Iluidas y diIusas, se trata de un agar altamente nutritivo y
muy utilizado en el pasado, que produce recuentos menores que el agar R2A o el NWRI.
Agar m RHP.
Este medio es altamente nutritivo y solo se emplea para el metodo de Iiltro de membrana.
Agar R2A.
Se utiliza en metodos de placas Iluidas, diIusas y en el Iiltro de membrana. Este agar es de bajo
poder nutritivo, proporciona recuentos mas elevados que las Iormulas altamente nutritivas.
Agar NWRI (ARHP).
Se utiliza en metodos de placas Iluidas, diIusas y en el Iiltro de membrana. Este agar tiende a
producir mayores recuentos de colonias que los tres descritos anteriormente.

A continuacion se muestra un extracto de un paper que se tiene colgado en internet, descargado de la
empresa cultimed, donde se muestra las caracteristicas del agar utilizado en este ensayo de laboratorio.

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5. MATERIAL Y EQUIPO
4.1 Materiales y Reactivos
Pipeta graduada de 1 ml
Tubos de ensayo con medio Agar Plate Count
Cajas Petri Esteriles
Mechero
Muestra de Agua
Espatula Drigalski
Horno de Incubacion
Vaso de Precipitados
Agua destilada
Marcadores
Hornilla
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EstuIan de Incubacio
Contador Quebec
4.2 Equipos
Equipos utili:ados para este ensavo



Hornilla Electrica

Incubadora
Contador Quebec
Fuente. Elaboracion propia
6. ROCEDIMIENTO
Antes de realizar la preparacion se desinIecto el meson, donde se eIectuara el vertido en las placas Petri,
utilizando hipoclorito de sodio. Tambien debe registrarse previamente en cada caja los datos necesarios para
la identiIicacion de la muestra.
Mtodo de la Placa Difusa
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Preparar las cajas Petri con el medio de cultivo, secar toda la humedad que tenga la caja e IdentiIicar las
cajas Petri por duplicado.
a) Agitar la muestra vigorosamente, con 25 movimientos.
b) Colocar 0.1 ml de muestra en cada caja Petri con ayuda de una pipeta esteril graduada.

Cafa petri v la desinfeccion de su tapa


Caja Petri
DesinIeccion de la Tapa de la Caja
Petri
Fuente. Elaboracion propia

c) Esparcir la muestra con la ayuda de una espatula Drigalski debidamente esterilizada en la caja
petri cuidando que exista una dispersion total en toda el area de la caja para que exista una muestra
de cultivo representativo.
d) Hacer reposar durante 10 minutos y llevar al horno para incubar las muestras durante 24 horas.
e) Como se realizaron muestras duplicadas una se la pone en el horno en Iorma invertida a una
temperatura de 35C, poniendo debajo agua para mantener la humedad en el horno y la otra se la
hace incubar a temperatura ambiente.
Colocado v esparcido de Muestra
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Colocado de Muestra Esparcido de la Muestra
Fuente. Elaboracion propia

Mtodo de la Placa Diluida
a) Calentar los tubos con agar en bao Maria para IluidiIicar el medio.
b) Esterilizar las cajas petri con una muIla e identiIicarlas por duplicado.
c) Agitar la muestra y colocar 0.5 ml de la muestra en la caja petri, esto con ayuda de una pipeta.
d) Seguidamente verter el medio de cultivo en la caja petri que ya contiene la muestra, se debe de
realizar el vertido rapidamente para no obtener grumos.
e) Mover la caja petri cuidadosamente en Iorma circular encima del meson para homogenizar la
muestra en el medio de cultivo.
I) Dejar reposar durante 10 minutos y llevar un cultivo al horno a 35 C para su incubacion y el otro
cultivo dejar a temperatura ambiente.

Incubacion de muestras v Fluidificacion de agar
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Incubacion en Medio
Ambiente

Incubacion en Horno
FluidiIicacion del Agar
Fuente. Elaboracion propia
7. RESULTADOS
Antes de realizar el conteo, se observo que las placas que estuvieron en la incubadora presentaron
mayor cantidad de colonias en comparacion con las que estuvieron a temperatura ambiente. Es asi que
tanto en placa diluida como en placa diIusa se
Las colonias que se desarrollaron presentaron Iorma redonda y de color blanco y amarillo verdoso.
Es posible un error en el conteo de colonias para el metodo de placa diIusa, pues se tiene grumos que
se asemejan a colonias, por lo que se recomienda realizar un zoom traves de la computadora para delatar
los grumos, suciedades u otras particulas que nos hagan variar el conteo manual.
La Iormula utilizada para el conteo de manera general es la siguiente:

UFC/ml
N de Colonias
N de Cuadrados contados

Area Caja Petri
Dilucion



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8. CONCLUSIONES
En Iuncion a los resultados obtenidos se llegaron a las siguientes conclusiones:

Se recomienda preparar de manera cuidadosa las muestras en las cajas petri del metodo de la
placa diluida donde no tiene que existir grumos ya que a estas despues de la incubacion no se les
puede realizar el recuento de bacterias.

Para el recuento de colonias se utilizo el metodo de la placa diIusa y diluida, inoculando
volumenes de 0.1 y 0.5 ml de muestra por caja Petri, realizando el analisis por duplicado para
comparar el desarrollo bacteriano a temperatura ambiente y en incubacion a 35 C.

Temperatura a la que se encuentra la muestra que se encuentra por debafo del valor al cual regula el
horno

Fuente. Elaboracion propia

Para las muestras llevadas al horno, en ambos casos el metodo de conteo se realizo a traves del
contador Quebec, para dividir el area de la placa analizada y contar las colonias por sectores,
debido a la gran densidad de colonias desarrolladas.

9. BIBLIOGRAFIA

Guia de laboratorio, Instituto de Sanitaria UMSA.
Dra. Maria EuIemia Briancon Gutierrez
Apuntes de Clase Microbiologia UMSA
Tiempo de Incubacion: |hrs|
Temperatura de Incubacion: |C|
Volumen de Muestra: |ml|
Grupo: AlIa
Integrantes: Mendoza Callata Javier
Cuenca Rojas Fernando
Mamani Antonio Raul
Numero de Caja Petri:
Tipo de Incubacion: En Horno
Numero Total de Colonias: |UFC| (Valor Teorico)
Numero Total de Colonias: |UFC| (Valor Adoptado)
5 3
5E03
8
3
7
5
9 13 6
4480
METODO DE PLACA DIFUSA
UMSA Microbiologia Recuento de Bacterias Temperatura
de Horno Universidad Mayor De San Andres CIV - 369
322
10
5
24
35
0,1
11
6
Tiempo de Incubacion: |hrs|
Temperatura de Incubacion: |C|
Volumen de Muestra: |ml|
Grupo: AlIa
Integrantes: Mendoza Callata Javier
Cuenca Rojas Fernando
Mamani Antonio Raul
Numero de Caja Petri:
Tipo de Incubacion: En Horno
Numero Total de Colonias: |UFC| (Valor Teorico)
Numero Total de Colonias: |UFC| (Valor Adoptado)
2166
2E03
51
15
322
16
18
METODO DE PLACA DILUIDA
20 13 15 8 5 23
11
UMSA Microbiologia Recuento de Bacterias Temperatura
de Horno Universidad Mayor De San Andres CIV - 369
24
14
35
0,5
11
Tiempo de Incubacion: |hrs| Colonias Quebec:
Temperatura de Incubacion: |C|
Volumen de Muestra: |ml| |Colonias|
Grupo: AlIa
Integrantes: Mendoza Callata Javier
Cuenca Rojas Fernando
Mamani Antonio Raul
Numero de Caja Petri:
Tipo de Incubacion: Ambiente
Numero Total de Colonias: |UFC| (Valor Teorico)
Numero Total de Colonias: |UFC| (Valor Adoptado)
37
METODO DE PLACA DIFUSA
1821,538
2E03
322
0,1
24
35
UMSA Microbiologia Recuento de Bacterias Temperatura
Ambiente Universidad Mayor De San Andres CIV - 369
Tiempo de Incubacion: |hrs| Colonias Quebec:
Temperatura de Incubacion: |C|
Volumen de Muestra: |ml| |Colonias|
Grupo: AlIa
Integrantes: Mendoza Callata Javier
Cuenca Rojas Fernando
Mamani Antonio Raul
Numero de Caja Petri:
Tipo de Incubacion: Ambiente
Numero Total de Colonias: |UFC| (Valor Teorico)
Numero Total de Colonias: |UFC| (Valor Adoptado)
1103
1E03
112
322
METODO DE PLACA DILUIDA
24
14
0,5
UMSA Microbiologia Recuento de Bacterias Temperatura
Ambiente Universidad Mayor De San Andres CIV - 369
U.M.S.A.
| Microbiologia |
EKX 57:


:0 EQPENWUKQPGU
En Iuncion a los resultados obtenidos se llegaron a las siguientes conclusiones:

Se recomienda preparar de manera cuidadosa las muestras en las cajas petri del metodo de la
placa diluida donde no tiene que existir grumos ya que a estas despues de la incubacion no se les
puede realizar el recuento de bacterias.

Para el recuento de colonias se utilizo el metodo de la placa diIusa y diluida, inoculando
volumenes de 0.1 y 0.5 ml de muestra por caja Petri, realizando el analisis por duplicado para
comparar el desarrollo bacteriano a temperatura ambiente y en incubacion a 35 C.

Temperatura a la que se encuentra la muestra que se encuentra por debafo del valor al cual regula el
horno

Fuente. Elaboracion propia

Para las muestras llevadas al horno, en ambos casos el metodo de conteo se realizo a traves del
contador Quebec, para dividir el area de la placa analizada y contar las colonias por sectores,
debido a la gran densidad de colonias desarrolladas.

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Guia de laboratorio, Instituto de Sanitaria UMSA.
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Apuntes de Clase Microbiologia UMSA