serie de biologfa

monograffa no. 12

Programa Regional de DesarroDo Centfflco y Tecnol6glco Departamento de Asuntos Oentfflcos

Secretarfa General de Ia

organlzaci6n de los Estados Amerlcanos

EI dibujo Que itustre fa portada fue hecho por et profesor Ross Inman de la Untversided de Wisconsin, EE.UU.

,

BAC ERIOFAGOS

par

Romilio~p.?jO T. Unidad de Virologfa

Departamento de Microbiologia y Parasitoloqia Escuela de Medicina

Universidad de Chile

Santiago, Chile

Programa Regional de Desarrollo Cientifico y Tecnol6gico Departamento de Asuntos Cient(ticos

Secretaria General de la

Orqanizaclon de los Estados Americanos Washington, D.C. - 1973

@ Copyright 1973 by

The GeneraL Secretaria t of the Organization of American States Washington, D.C.

Derechos Reservados, 1973 Secretarfa General de la Organizacion de los Estados Arnericano s Washington, D.C.

Esta monografia ha sid a preparada para su publicaci6n en el Departamento de Asuntos Cientificos de la Secretarfa General de la Orqanlzacion de los Estados Americanos.

Ed itora: Eva V. Chesneau

Asesor Tecnrco : Dr. julio I. Colon

Departamento de Microbiologia e tnmunotoqia Escuela de Medicina

Un iversidad de Puerto Rica San Juan, Puerto Rico

Et p r og r arna de rncnog r affa.s cienti'ficas e s una [aceta de La va sta labor de la O:rgani:>;ac:i 6n de los E~tados" Americanos, a cargo del Departarnal'lto de Asuntos Cientrficos de 101 Secretari'a Gel'le~al de dicha Or-g an iz.ac ion , a cuy o financt arrrientc ccncr ibuye en forma impo rt ant e e1 Pz-og r arna Regional de Desarrollo Cientr1ico y Tecno16gico.

Conc ebi do por los JeIes de Estado Amel'icanos en au Reuni6n c e l eb r a da en Punta del Este, Uruguay, en 1967, Y cristali.zado en Ia s deliberaciones y mandates de La Quinta Reuni6n del Consejo t nee r arne r ic ano Cultural, llevada a cabo en Ma r ac ay , Venezuela, en 1968, e l Pr og r arna Regional de Desarrollo Cientlfico y Tecno16gico es la expresi6n de las a.s pi r ac ione s preconizadas por los Jeres de Estado Am e rd cano a en el sentido de poner Ia ciencia y Ia tecnologra al servicio de 10 S pu e b'lo s latino arne rlcano s .

De mo at rand 0 g .. an vis lon, die has d ignatario s r e eonocta ron qu e la ctencia y la tecnologfa estan transfor-mando la estructura econOmica y social de muchas n acfon.e s y que, en esta bora, po r- s e r instrumento indispensable de pr-og r e.so en America Latina, nee e srt an un rmpurso sin

precedentes. III

El Prograrna Regional de Desarrollo Cientrfico y TecnoL6gico es un complemento delos esfuerzo5 nactonal e s d e Io s parses Iattnoame r i canos y s e orienta hacia l.a adopci6n de medidas que pe r.mf tan el fomento de la investigaci6n, la enseJianza y Is difusi6n de Ia crenci e y Ia tecnologla; la formaci6n y perfeccionamiento de personal cientuico; el i nt e r c arn bao de iniormaciones, Y Ia transf,,1'encia y adaptaci6n a los pars e s Iattnoamericanos del conocinriento y las tecnologlas generadas en otras regiones.

En el cumplimientodeestaspremisas fundamentales, elprograma de monograflas representa una contribud6n dire:cta a la ensellanza de las c ienctas en niv e le s educ aei vos que aba r can i'mportantfsimos se ceor ee de la poblaci6n y, al rrri s mo tiernpo, propugna Ia dHusi6n del sabe r cientrfico.

La co l ec ci dn de monogra£!as cientrIieas c one t a de euatro series, en espa.l'lol Y POl-tugues, s ob r e t e ma s de rrsiea, qufrni ca , biolog{a y n'li1tenu~tica, De s d e sus eOITl1enZ06, estas obras a e destinaron a pro[esores j' alumnos d e c i errc.i a s de en 5 e!1 an z.a s e cund a r i a y de los primeros arlOS de la universitaria; de estos a e tiene ya testimonio de BU buena acogida.

Este p re fac i c brinda al Programa. Regional de Desarrollo Cienti'fico y T'c cno lSg i c c de la Secrdarra General de Ia Organizaci6n de los Estados Americano" Ia oca9i6n de ag radecer a l doctor Rami lio Espejo T. , autor de esta. rncnog r affa , Y it qui erre s tengan el interes y buena voluntad de eon!:ribuir a BU di vu lg ac ion.

Marzo de t 973

lNDICE

A los Lectores

CAPiTULO 1.

EL SISTEMA 13ACTERIA-IlACTERI6FAGO ..

- £1 Reconoc:i.mlento de los Bacter16£agos .

'- La Bacteria Hospedantc ..•........ ' , , ' '

Deteeel6n y Ensayo de las Bacteri6£agos ' , . , .. ' .

Crecimi ento de 10$ llacte ri6£agos cn uri Cicio .... ' , '

CAPITULO 2. PURIFlCACION Y CARACTERIZACION •....

PUl"ificad6n •............. _ . . . .. . , •.. '.

Caracteriza cion d e los Bacte ri6£agos y sus

Componentes ............•...............•.........

- Microscopia Electronica , .

- Absorcion y Dispersion de Ia Lu'I: Ultravioleta: .

CAPITULO 3. ESTRUCTURA Y COMPOSICION '. , ..

Mo r fo l og fa .. , ....•..... ,., ' .. ' •. _ ...•....

Contposici6n Qlllrnica .. I ~ • ~ ••• ~ .

. ADN Bitenico .

ADN Monotenico , ...........•.....••...•.••.

ARN Monotenico ..............•.....................

Protcinas _ ~ _ .

CAPITULO 4. PROPIJ-:DADES ANTIGENICAS Y ACCION

DE AGENTES FISICOS Y QUIMICOS •......... _ •...•..

Re a c ci dri FagO-Antisucro ' .•............

Anrfg e no s Vi r a l e s •.......•.••.•..•.•..•.......•....

Acd60 de Agentes Ffsicos y Qufrnicos , ' .

Radiaci6n .. ' ' , _ .. , .

Ra dta ct Sn No lonizante ...........•.....•..•........•

Radiac:ion Io n i z a.rrt.e ~. _ , •... ~ •• 4 •• 4 •••• r 4 ~ •••••• ~ •••• Is6topos Radiactivo S •..•.••••••••••••••••••••.••.•••

CAPITULO S. CICLO REPRODUCTIVO, ADSORCI6N E

INY£CCION ........•......... ' ....................•

Adsorci6n ' '

Inyeccion I •••••• ~ 4 •••••• _ •••••

CAP(TULO 6_ CICLO REPRODUCTIVO, P£RfoDO DE

ECLIPSE, MADtl RACI6N Y LISIS ....•... ' .

Sintesis de Proteinas ...................•..... ' ..... S!ntesis de Acido Nucleico . .. . ............•....... ,.

Duplicaci6n de ADN Bitlinico .

Dup H ca ci dn de Acidos Nucleicos Monoteni,cos . , .

Modo de DupHcaci6n . _ .

Ma du r a ct Sn ... ' ..... _ ...........•...........•......

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4l. Lisis , ' , . , . , , . , , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ".:i,? .

Cicio Lftico y CicIo Lisogenico ........•....•. , . . . . . . . . . 44 •

CAPiTULO 7. GENETICA: TIPOS DE MUT ANTES Y

MUTAGENESIS •................•... , ,... . . 47

Mutag6n .. sis ...•....•.....•.••....• , ...• , , ..•... 47

Tipo!; de Mutant e s ••....•...••..•••••.••••...•• , •• ,... 5 I

CAPITULO 8. GENETICA: RECOMBINACI6N, COMPLEMENTA CION, MODlFICACION INDUCIDA paR EL

HOSPEDANTE ......•. , ..••.....•....•...... _ . . . . • . . . . 53

Re co mb i.na ci dn .••••.•••.... , ...•.•••.•.. ',........... 53

Estructura Fina del Gene , ............•. , . . 57

Mecanisrnos de la Recom.binaci6n •........ , ... ,........ 58

Cornpkernenta cton ...•.......... , • . . . . . . . . . . •. . . . . . . . . • 5·9

Modi!icad6n de los Bacteri6£agos pOl' .. 1 Ho sp eda.nte . . . . . . '1)0.'

CAPITULO 9. flACTERIOFAG05 CON ADN BITENICO .... .. . 63

Corrrpo s i ci Sn y Mol'foLog(a _ . . 63

Duplicaci6n del ADN , , . . . . . . 66

Bi o afrrte s i s de Protefnas 'I S l! Rcguladon . , . • . . . . . . . . . . . . 66

Maduracion , . • . . . . 6 <;I

VI

CAPiTULO 10. BACTERIOFAGOS CON ADN MONOTENICO ..

71

Rep r oducci Sn . , ., •••....•.•.•••• , ••............ ,..... .. 72

CAPiTULO 11. BACTERIOFAGOS CON ARN .. ;............. 75

E's t e uc tu r-a del ARN , , ,... . ... . .... .... .... 15

Duplicaci6n del ARN . . . • . . . . . .. .. .. . . . . . 76

B'io e In te s i s de P rotc(nas y au Reguiaci6n .... , . . . . . . . . . . . 77

CAPfTULO 12.. BACTERlOFAGOS TEMPERADOS .. 79

Estructura del Bacteri6fago \. , ...•.............. , . . 79'

Integraci6n , , •.... 80

Inmunidad , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • 80

Inducci6n .•........ , .•............ ,............ . . . . . . 8)

Fagos Ternp.,,.ados Distinto5 de}.. ,.............. 81

Conversi6n de Atguna s Propicdades Bacterianas pOl'

e1 Pro£ago , •. . . . . .••.... . . . •.... 82

Transduccion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . . . . . . . . . . 82

Ba c te r i.oc i na s ., ..............••••......•.. ,......... 113

Agradecimientos . , , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

Dibliogra!fa , , , . . . • . 87

1

EL SISTEMA BACTERLA - BACTER16FAGO

EL RECONOCIMIENTO DE LOS BACTERI6FAGOS

Los vi ru s ba.cee rd.ano s fueronde8cubiertospor F.W. Twort en 1915, quien los describi6 camp ag ente s que p ro duc fan una "tr"nsforlnac i6n vidriosa" en colonias bacterj;!.l1as. Veinte anos ,ant_e_s. habra aido neconoctda enpfantas y animales la existencia .de ag ente s in€$'cdosos de propiedad·es·-muY--iiimna-i-e-~:- -_ '£_~.8_ e_~_ts'-;'_ ag e nt e s i nfe<e<;:iOBOS _podr .... di s tinguirs e facilrnente de las bacterias por e I hecho de pasar a traves de Iiltros que r et enfan a estas ulti=as. COUlO 10 s ab ido s ob r-e los virus era Uluy poco en aquef Ia epoca, la gran s ernej ane a entre los agentes que pr ovo c aban ciertas enIer=edades - - c o mo el mosaico del t ab aeo en plantas y la fiebre aftosa en ani=ales- - y los que produclan Ia ' tran"for=aei6n vidriosa" de las colonias de rnrc r o c o co a, Iue 8610 OScuramente 50S pechada.

La de9cripei6n por Twort d e estos agentes pas6 relativarnente desapercib"tda hasta que dq,,, anos mall tar"'e FelixD'H.}l"elle public6 sus obs ervacioneB sobre agentes liltrables que podfan provocar 1a Li e Ls de b ac i lo s entericos, a los que llam6 __ "bac;;w.r_iophag,e". Ahora Be ilaman indistintarnen:tevrrusbact;;;ri~no;" bact,ez:i6fag<H! 0 simplen)ente fagos, D'Herelle, un canadiense--de origen frances,. obt~vo 109 prim.eros indtc io s de la existencia de es tos agentes Inic08 mi ent r as estudiaba 1a dia'rrea de 1 a langosta y e1 po s ib Ie emp1eo del agente que la produci' .. , como insecticida, en e1 estado de Yucatan, en Mexico_ La diarrea de ra'angosta. e e producida por dertas bacterias que D' Herelle cultiv6 y esparci6 en Argentina y en el Norte de Africa en UJl esfuerzo por terminal" 0 atenuar las plagas debidas a este insecto. Durante e st.a s inveBti~ gac::ionea loa cu Itrvoe bacteria-nos mostrarOl1 ciertaH anornal(as oca e Lonadas por un agente que lis ab a las bacteria". La de"cripci6n hecha por D'Herelle de e sbo s agentes caus6 gran s ensaci6n entre 10"9 ba cte rtotog oe eunicos de 1a epoea, por la posible utilidad de los bacteri6fagos en Ia profOaxis y terapia de las enfel"lnedades de origen bacteriano. D abido a au rmpo r+anc ie terapeutica, Ia investigaci6n de los bacteri6fagos Be extendi6 r~pidamente a nt r-o s laboratorios. Como siempre ocurre des· pue9 del descubTinliento de Wl fen6rneno y de su posterior investigaei6n por varios g rupos independientes, pronto surgieron controversias aob r e l a naturaleza de estos agentes, ",Son par tfcu las o un fluido? l,Pueden rep r oduct r s e? /.5011 siempre el rnismo 0 disti.ntos los entes deseubiert o s ? etc.

Ya en 19 Z(, s e ten{a una opini6n mas urri.Fe r rrre sobre Ia naturaleza de los bacteri6fagos, y D' H.'i1'elle, a I r-e aurnf r sus prop;a" investigaciones y las de otro", como Twort, J.Bordet y A. Gratia, describi6 au cido bio16gico en lorrna bastante exacta:

"El primer paso de bacteriofagia consiste en e I ac ercamiento del bacteri6fago a la bacteria, Y luego o cu r ne la fijaci6n del primero a la s eg unda, El co r pris e ulo ba cte r tofa gt co penetr" en el interior de la celula bacterlana. Entonces, como resultado de la multiplicaci6n de esta, e l, corp.,sculo, que ha penetrado en la bacteria, forma uua colonia de num er oe o e elementos; la bacteria Be romp" .. epentinamente 'I libera en el media co r pds cu los j6venes que e s ean entonce s Ii stOB para repetir su a.cc i cn!". Considerando que , en e ae entonees, no se contaba con el poderoso equipo analihco disponible hoy, COTnO son las tecnicas de mic r-o s c opi a electr6nica, eentrifugac;i6n analltiea, is6topos z adj ac tfv c s , etc., la descripci6n de O'11ere1le fue un aderto, rrct ab l erne.nt e cercano al cuad r o que poseemos hoy d{a.

Las esperanzas pue s ta s en los fagos como hcrramienta tera_peutica s e Irustraron, d'eoid'o principalmente a la alt:;> Ir ec u errcf a can que apa"i-ecen baeterias reaistentes. En II' decada del 30 a1 40 la inve slig ,,-c16n'can bact e rf dfag oa ees6 c as i po r completo, exc e pto po r algunos investigado)'es que vi e r on en los ragas un material apr opi ado para e s'tudto s mas basieos. Aun persisten, sin embargo, intentos aislados de usar los bacteri6Iagos COmO agentes p:;'ofilactic"os 0 t~rapeut!.<;o_s en cOl'llbin..."i6n

con antibi6ticos. _

Entre lOB i'lvestigadores euyo lnteres por los bacteri6£agos es di s-

2 tinto de. que origin6 SU estudio, uno de 105 primeros en destacara e fue M. Scb Ie s ai ng e r-, po r s u aplicact6n rigurosa de principios fisicoq\lfmicos. Est e fi s i co qufrrri co obtuvo ta prime .. a purificaci6n de un vi rus bacteriano, 10 que pe rmitio el analisis quimico posterior que re:"eI6 que los bacteri6£ago8, 0 mas exactamente el e s tud i ad o , estaba compuesto de partes aproxirnadamente iguales de pr otefna s y de acido deoxirribonudeico.

En 105 ultimosano5deladecadade130 a140AlfredHel'sbey, Salvador Luria y Max De Ib r tick , advirtiendo 10 bien que ae prestaban los b act.eri6fagos a'l estudio de problemas b.:lsicos de biologfa y de genetica, ini~ c ra r on los trabajos que condujeron 1'1 r ena.crrru ento del e seudrc de los bacteri6fagos. Su meta principal era enhnder c6rrlO, do r anre menOS de media ho r a , una 901a part{cula de bacteri6fago daba origen a mas de ejen v ec e s su mirne r o en el interior de Ia bacre ria atacada. E1 entendiIniento de este proc eso, reeonoeian, ayuda rfa 3 co'mpr endex 13 natur a l.ez a y pr opt edada s del rrlate:rial transportador 0 -v eb.Jc.u Io de Ia informacion g e ne ti ca. Sus t.r a baj os durante 1 ... decada del 40 sentaron las bases para el surgimiento de Ia bt o logfa molecular y los hi zo a c r e e - dares al Premio Nobel, oto:rgado an 1 Q69.

En las c1ecadas siguicntes la inveatigaci6n siernprc cz ec i en.t e s e sirv.6 de los bacteri6fagos pa r a e I c studio de II' bioqulmica y bioHsica de 1 a duplicaci6n y organiz.aci6n del =aterial genetica, de 1a mutaci6n y r ec ornbtn act on , del control rrio lecula r, de La, b lOBi'lte sis de Pl' ot efna e , de lamorIogene"is, etc. En e at a forma, s e ha l Ieg a.do :rnuy cere" del entendimiento en detalle de los procesos de creci:miento de los virus.

l.A BACTERIA HOSPEDANTE

La e s t r u ct u r a de la celula 'bacteriana es distinta de Ia de las celulas a ntrna Ie s y vegetales; Una de sus ca r-a cte r fs etc ae principales e s la ialta en las bacterias de rrrernb r-ana nuclear, po r 10 que recib en eL nombra de procar;6ticas. Los virus b a ct e r i an o s estudia.g91'. hasta 1 .. fecha ,,610 c r e c e n en un o de. ~s~r;'g'l!'ndes subgrup.<?,'l. j:ju4\. .. ~e."h~ p.odido distingui r claramente entre las bacterias, el subgrupo de las eubacterias 0 bacterias verdaderas.

El dLimetro de las eubacterias aseila e l r ed eclo r- de 1~, por 10 <;Iu" estlin Cerea del l(rnite de r e ao.Iuct dn del microscopio 6pttco. S u estructura 5610 s e puede diBtinguir claramente cuando s e tinen y s e observan rried i ane.e el microscoplo e1ectr6nico (Fig. 11. Labacteria esta envuelta

rip::. 1. Lo s principales compone.nt as es"truct'u:ra1 •• s de una ciUu1a prccal'iotica se pueden obser-var- en esta mic.rol1:rafla de una secci6n d ... BaciZ ~us BubtiUs. (CoJ;'tesia de C. Robinow y J. Marak.)

3

pOl' una pCU'lld aeZuZ= r{gida que contiene po l l s a c d r i do s , prote{nas y 1(pldo s, y es Ia que Le da for:ma. :!:-.a, co rripo s'i c i.err ci e esta pa r ed perInite dividir Ia s eubacterias en do s grandes grupos s egdn los colorantes con que pued an teh~ri;e di.sti.ntamente el grupodelas Grampositiva (Gram +) y el de las Gram negativa (GralTl .). EntreelprQtoplasIna y ellado inte_rno de 1a pared c eful.a r s e e n cu ent r a 1" rrre rrrb r azra oitoplasmatica, de l a que depende la perlTleabilidad de 1" c ~lu.la. En el interio r resalta 10. falta de membrana nuclear y organeios, c OInO mitocondrtas 0 c 10ropLastos : 8610 5 e dl stinguen facilmente una zona o.-"a5 clara, 0 rrre n o a densa a los electrones, formada por el ADN, que representa e l "nual-ea" de la clliula procari6tica., un gran numero de pequeil.os granos de uno s 200 A de diametro, que se den01ninan 108 ribeeonlas, y una e s tz-uc ru r a memhranosa llarnada meeoeona,

Las requerimientos de nutrici6n de las bacterias 5 on rnuy v a r-Lado s ; las bacterias lYlas interesantes en c uant o a los fagos que las parasitan r equt e r en un compuesto org~ico como [ue.llte de energfa y de carbona,

generalrnente g luc os a. Pueden c r-e c e'r en mediae sintj'-tic as bastante simples, un medic sintetica en e l cua.l E. coZi aurnerrt a s u mirne ro a l dable (-tiempo de geneMcionJ en una hoxa , c cnrfen e , par litro de agua, N~Cl, 1,0 g: MgS04, 0,13 g; KH,?04, 3, Og; Na~HPO., 6, Og y glucosa, 4,0 g. Este medio conrtene todos los elementos y la fuente de e ne r gfa neces":r;og para 130 reproducci6n de E. coli, excepto los reQue:ridos en mu)' pe qo en a a c antidades contenidos en el agua, incluso la destilada, 0 como c ont arntn anre s de las sales usadas. Los medios sintetieos s e utilizan genaralrnente cuando sa desea "m3orC3or" el Cago a la bacteria can algun i s6topo, ya que el medio definido evita la diluci6n del is6topo par el rm srnc elemento no radiactivo, que puede ser omitido a agregado en eantidades pequeflas y conocidas. En esta Io em a., e s posib1e c orioc e r exa cea ment e la radiactividad eBpeclIica del elemento [c ue nt a s pOl' minuto/masa de elelllento) 0 compuesto rna r cado , y calculal'lamasa de material presente a partir de la radiactiviatl, que puede sel' rrred i.da facllmente mediante un contador apropiado. Cuando no s e requiere un media deiinido e s mas conveniente utilh;ar medios que, aunque mas comptejos , son mae fadles de preparar y permiten un crecimiento mas rapiclo de la bacteria. Estos medias se abtienen facilInente disclviendo en ag ua un extracto de carne u otros exh'actos deshidratados disponibles comercialmente. Aunqu e las bacterias lion muy pequeflas, su pres errc i.a en suspensi6n, a concentraciones a upe r Io r es a to" c~lulas/rnl, puede s e r notada par 1a turbiedad que producen en el rrred'i o, Esta. turbiedad debida a la dispcrsi6n de la luz en angulos distintos a aqu el con que Ll.e g an los rayos incidentes I es una cons ecuencia del aLto lndice de refracei6n de las bacteria .. con respecto a1 medio.

4

DETECCl6N Y ENSAYO DE LOS BACTERr6FAGOS

Los Jagc s nl_as estudiado5 __ ~_onlOos q.'Ie pa r a s Ican alaba_c~!~aGr<\ITlEscnerichia: CG;~i.--iT':'s -q_~:e atacan a las bacteria.s Grarn+ mejor conocido s SOn los del BaciUuB subtiZi8.

La propiedad mas notaria de los bactet'i6fagos es s u ca.pa<;:id_ad de romper 0 Zisa!'las ba cte r la s ; 1a lisia de la bacteriainfectadaes La ultima etapa distinguible del cielo de lTlllltiplicaci6n y tiene c orno cons ecuencia La liberaci6n de 1 a progenie del fago infectante. La Carma m.is frecuente de veriliear la infecci6n V,(rica de un cu ltrvo bacte dan? e9 otas e r-vwr la disrninuci6n de Ia turbiedad del cuitivo s ub s rg ui ent e a Ia lids de las bacte r tas (Fig. 21.

Sf rrri l a r-rn ent e , como las bacterias puedencr"cer ade ma s en medias s6lidos, e s poelble tambi<,n obeervar la infecci6n fagi"a pOT Ia aparici6n de r eg ion e s c l a r a s 0 de Hs i s en el punto infectado. Estes medios s6lidos s e obtienen agregando agar, en concentraciones de 1 a 2%, a1 rrre d io lrquido. E1 agar es uri polisacarido derivado de ciertas algas, de propiedades a i.rrri La r e s a la geLatina; s e <lieuelve a lOO' C Y permaneee Huido hasta 10845a50'C. pero una vez sali<lificado pe r-rn an ec e en este estado ha.s ta te mpe r aru ca e muy superiores a los 37·C. Los medio5s6Hdos s e colocanenpequehos recipientes Bamados eapeubs de Petri (Fig. 2), Y una vee solidihcados en la capsula de Petri, permiten I ... s i ernb r a de bacteria.s en s u 9uperiicie. 51 una capsula que contenga e l rnedro s6lido de cultivo s e siembra con 105 0 mas bacteria,;, c ad a una de ellas a e reproduc Q y

rig. '2. La pr-op Iedad mas notoria de los fatlos as su capac idad de romper 0 "Li sar-" las bacterias. Izquierda: Cult iva con a s pecto t urbio debido a La presenc ia de bacteria ... Centro: Despues de la lisis provocada POl" un fa,;o. Derecha: Capsula de Petri que muestra las p1acas de 1i5i5 obt en Idas al titular e1 fago pOI' e1 metoda de "p,ar en capa.

forma una pequel'la colonia, y Hnahnente las 10& a mas pequen as c010- 5

nias II e unen y forman una capa turbia en La superfide de Ia capsula.

5i aho r a sobre las bacterias s e coloca una gota de una suapens ion de

Iag o s , estos las Ii san y producen una regi6n clara 0 cr ans Idc ida en Ia

c apa turbia de bact er ras , Basta un solo {ago para produdr una regi6n circular clara a p'laea de u.si"s en ~n medio s61ido d onde haya bacterias

en cT~o::imiento activo. Cuando una pa r tfcu!a "inCec cao s a penetra en una bacteria s e inicia un delo Iftico; la progenie de este primer c i c lo infecta

s eguidamente a las bacterias ve cina s y a.af s uce sfvarnerit e produdendo-

s e , en esta forma, un c{rculo de lisis que s e ens ancha y Uega a al c anz ar

UI1 dh\:metro de varios mil(metros. Estapropiedad de los baderi6iag'os

d~ iniciar individualmente la formad6n de p Iac aa de lisis facilmente detectable s, permiti6 hallar un metodo rapido y simple de determinar

el numerO de pa rtfcula s infecci08 as presentes en una muestra. Este metodo s e conoce con el nomb re de "agar en ca pa" y se usa universal-

mente. Cons i s te en mez c la.r las ba cte r ia s s ens ible s can una diluci6n

apr optada de suspensi6n de fagos ell agar al 0,60/0, pr eviarnent e fundido

y enfriado a 45'C; vertlr la me z c Ia sobre una capade agarnutritivo 50- lidHicado e incubar las capsulas POl' varias h or a s basta Ia ape r ic icn de

las placa s de lisis (Fig. 2). El numero de pl.ac as de Hsis que aparece

e s proporcional a Ia c antdd ad de I'ag o s ag r eg ado s : con var i as e specf e s

de bacteri6fagos e e pued e detectar c as i un 100% de las parti'culae infe c-

cros as , ya que la eficiencia con que cada fag 0 produce una pla ca de lis is

e s cercana a uno. La simplicidad y precisi6n de este metodc han e i do

los factores mas import antes del ;;",ito de los estudios cuantitativos irnprescindibles a Ia interpretaci6n de 10 S fen6menos viralea. La aph ca-

ci6n de este metodo al estudio de los virus animates pOl' R. Dulbecco,

en 1955, marc6 el co mi enzo de la Inve s tdga ci dn cuanhtativa en este campo, Esta ultima ob s e r va e idn e s bastante general y convien e que el

lector la considere alleer los capitulos siguientes, pue s a medida que Ia efic act a de los rnetodo8 de estudio de los fagos e s apredada) los investlgadores de virllS de animales y planta.s reaHzan un esfuerzo COIISdente para utilizar e stOB :rnetodoB, ade.ntis de los conceptos, al at.a c a .. una gran cantidad de problemas virales.

CREGLMLENTO DE LOS HACTER.16FAOOS EN UN CICLO

La !ormad6n de las pl.a c a s de lisis s e ba de e cr tto co:mo el l"~~.lJ;.ado de va r io s ci c los de crecirniento del Iago, Esta er a Ja idea que tegIa D' Herelle del creci:rniento de los bacteri6fagos, ya descrita en la introducci6n, y que, aunque at r a.ct i va , tard6 en ser aceptada. La.cre-tnos~· cl6n ccnvinc ente de que la preg enie a par ec e abrupta:mente Y. B.gg. ~1.1.§I,Y~;' transcurrido un derto Hempo de apu es de la absorci6n de las partIe..,las in£ectantelO, s e debe a E. Ellis y M. Delbruck, en 1939. Este e"peri:mente que Inarc6 e 1 c.orrri e nz o de Ia inv ..... tigaci6nactualde.l9_~_I:>""cter_i6- £agos s e c onoc e como ezpel'imcmto de cl'ecimiento en un cic~c, y consiste en sLntesis en:

a ) Meo;clar fago y bacteria en conc ent.e act cn e s que pe r rru ta.n una r;S,pida adsorci6n ( 109 celulas/rnl infectadas con un p r o rried io de Lin fago pOl' celllla) por uno s 2 a 5 minuto s ,

&

b 1 Diluir a continuac:i6n en u n zne d io que co nt.e ng a antis ue r o pa ra dehmer la adsorci6n y neutralizar eJ fago no adsorbido, e rn cuba.r po r varios minutos para pennitir La accion del antisuero.

c) Di lut r luego para evitar que los fagos resultantesdelaprogenie sean Ina ctt vadoe por e1 antt sue'r o y ev ita r ademas SlI adso:rci6n a Ia s b a c « terias que no <ueron infectadas inicialmente.

d I DeterIninar e 1 numero de unidades Ioa-rnadc eas de pIacas de lisis 0 centros infecciosos al cabo de distintos perfodos,

La mt expr etact on de los datos obtenidos en un ex.pe r i rnerrt o de e s te tipo (Fig. 3) requier e c i.e-et a s explicaciones. La5 pl ac as de Us; s produ-

10 20

ri~. 3. El crecimiento en un ciCIO del bacteri6fago ~1 en Escheriohia coli, cultivado en cal do nulOritivo ,,:17°C. (Cortesi" de ~H. rreeman and Company.)

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Minutos despues de infecci6n

c i d a s al titular las mue st r a s toroada s antes del aumento de las Wlidades forrnadoras de placas, tienen distinto origen que aquellas provocadas pal' las rrrue s tz a s tomadas posterior:n;ente. Las p la ca.s producidas par las pr trne r as muestras no derlvan de lagos libres sino de bacterias inCectadas. Una bacteria infectada, cuaj.qut e r a que sea el mirne r o de !agas progenieque<:orltenga, ,,610 provocari una p la ca de lisis debido a que los Ia g o e intraceiulares, pos- estar alojados en labacteria, 610 comportan como uno solo, 5610 d e spue s que estoB han Hs ado Ill. bacteria y Se han diBpersado en e1 media, act1ian independientemente y cada uno forma una placa de Ii ai s , Los datos representados en la figura 3 dan idea del creci:n;iento de los bactel'i6fagos ya des c r rto ; el numero de c e n - tros in!ecciosos permanece constante durante 108 primeros 24 rruno to s sigulentes a 1 a infecci6n y aumentan luego abruptamente mas de LOO 'IIeces. Debiclo a que las condiciones de] experi:mento impiden la ini.ciaci6n de un nuevo cicio, el titulo alcanzado s e manti ene po r un Iarg o tiempo. El l ap s o de tie:rnpo :inidal durante el cual el titulo s e mantiene con stante se denornina pe1'lodo latente y representa, ent.onc e s , el Hempo que medill. despu(;s de la ads o r ctcn y el momenta de la Usis de las prim.eras celulas inIectadas. La raz6n entre el tItulo final y el titulo inid a l de ba-cterias In€ectadas se llama tiaea de ecloBioi1. que corresponde at nurrre r o promedio de fag o s producidos pOl' bacteria i nf e ct ad.a,

E I pe riodo latente y Ia ta sa de eclosi6n en condiciones fisiol6gicas exaCtamente deter=inad ... s son caracterlsticos de Ill. e s pe ci e de fago y de bacteria hospedante. El p r i me r o es seTll.ejante entre di a !iotas eape· des de fago; en cambia, Ia ta s a de e c lo s i dn va rfa entre uno y va r io s dentos par a Ia mayorla de los fagos qlle contienenADN hasta va r i o s miles para uno a pequeiios fa.go s que cont ie.ne.n PoRN en ve z de PoDN. Sin embargo, aunque el rendimiento nu me r-i co de part{cu!as lOS bastante dl - fe rent e , e1 rendirniento expresado en funcion de rna sa de Iag o por ba c « teria infectadaes ca st Igua.I, pOI' cua nt o e l rria vn e rendimiento en ndme.r o de los £ago .. PoRN queda compensado por su menor tamaiio.

2

PURlFICAC16N Y CARACTERIZAC16N

PO RIFICACION

LOB n::t~todos e or r tent e.merrt e s eg uidc s en Ia determinacion del tarnano , Jo r ma y cornpo s i c ion quimica de una e apec i e de bacteri6fago, excepto La microscopia electr6nica, requieren La pur e aa de las partlculas virales. E~ter.ial_<l __ ~...1'~E.t_i._da_para_ la o~tenci6n .. de,fa~:, p~.ro ."!'s u n Lia a do de b a ct e r i.a.s infe<;t~_<1"'_s. En g en e ral un Ii s ad o contiene, ad erna s de lo!! i;;'gos, los r e s to s cg\)..I.1ares de las bact-e,das, tales:comot1:ozosdepared,_ membranas, r tbos orna.s , .l'l.DN, ARN, p rot efnas , o!_ros c orrrporterit e a de peso- molecular mas bajo y los compuestos propios del Ine\:lio. El corrto.nido de lag 0 de un lisado es del orden de 0, 01 mg po r ml; y Como para obtener 1a ca.ntidad apropiada para a u caracterizaci6nesnecesar'iopar· tiT de va r io s litros, una de las pr i me r ae etapas de 1 a purificaci6n implic a una concentraci6n_ La centrHugad6n a alta ve lo cf d ad y Ia res uspensi6n s ub s ig u ie.nt e de las partfculas s ed i rn errtad a s en un vo lurn en rrru c ho menor, fue unO de los n.,~todos mas c oz r iencernente u aado s , Esta

t.Scnica ha s l do , cu audo po s fb l e , r-e eznp Ia.e ad a can LHi si sterna de dos 9

Iaa e s basado en Ia propiedaddealgunos polfmeros de alto peso rno le c u-

lar (como el polietilenglicol, el dextransulfato de sodio y e1 d ext r a.no :

de s e p a.r a r s e Iormando dos fa s e s cuando se disuelvcn en una misma

S oluci6n. (1) El fag 0 Be pued e cone ent r a r ell una de las fa ses 0 en la interfase me dtarrte detertninadas coa ce nt r acf one s de polietilenglieol y

d axt r an s uUato, y condiciones apropiadas de pH, Iue r-z a i6n:lca y tllmpe-

r at u ra , Una v e e conccntrado, s e puede r ecuper a r facilmente de la interfase 0 de cua Iqute ra de las do s Cases en un vo Iurrren v a r i a s v e c e s

rrren o r que ,,1 'i.n i c i a L Adem!", como las part(culas pequel'\as s e distri-

buyen en i gual cone entrac \6n en arnb as [as es ,e sea te em cap ropo r ct ona

tam bien una ete rta purHicacion de los bacted6fago B.

La 5 te cnt ca s rna" comiJnment e ad optadas par a La puri fie a d 6n POB t e - riot' s e basan en 1a. separaci6n de las part(clIlaB de [ago de aqu e Il a s que provienen de la bacteria, por su diferencia de t arriano 0 den5idad. La s epa ra ci cn pOI' dlferencia en tamal'lo puede l o g r a r s e pOl' cen tr-Ifuga.cion diferencial, pOl' centrifugaci6n en gradiente y po r ultrafiltr;).cion. La centrifl<gacion diferoenciat permite separar 0.1 fago de ot r a s part,,,u la.s que difiel'en bastante en cu anto a ve l oc rda.d de sedim.entaci6n, y consist", en c io l oa alte'l'nos de c entrifugad6n a alta y baja ve lo cad ad, Centrlfuga<::i6n de 2.0 000 hasta. 50 000 r evo luctone s por rntnuro (rev/min) durante 1 a 3 horas s ed i rne nt a los fagos junto can ot r a s partfculas de rria y o r 0 ;gual velocidad de sedirnentaci6n y d eja los c orrrpnn en te s solubles y las part(culas mas pequenas en e I sobrenadante. ,Elsedimento, dis pe r s ado en una s o l uc i dn s e Hn a tamp6n ap r opf ad a, e e recentrifuga a b aja velocldad, 8000 a 10 000 rev/min, paraeHmtnarhacteriasno l i s a d a.s y. r e s t os celulares, como paredes y rnat em a.I membranOBO. La c ent r-if uga c i dn subsiguiente a alta velocidad del sob renadante sedimenta nueva mente

IOE vi r u s , 'i do s 0 Ire s r epeej c ionea de eat e ct clo - -descartando los 5 edhnentos obt en rdo s a b aja velocidad y los 90brenadantes a alta v .. locidad-perrntt en obt e nez; algunos iagos grande s , como T4, en forma b ae tanee pur a,

LaC:E!ntrij'L<ga(;iQ'1 en gradiente h ace po sib Le 1 a se pa r ac i.6n de par tfc ulas que difi"ren poco en SIl veloc'tdad de "ediInentad6n. Consiste en aedinlentar e1 material rnedf ante una 501uci6n estabilizadora que co nbezrga un g radiente de on 501",to, de tal manera que la parte mas densa de Ja s o l u ci Sn '!uede en el Iondo del eubo, Generalmente s e erripl ea un grad; e nte de sacar os a de '3 a 20% que s e forma en el m'i. 5 mo tubo de Ia centr{["ga, rne z c l ando en Io r ma apropiada una soluci6n de s a c a r o s a a1 20% c on ott-a 01.1 5'10, La. solu'~i6n que se quie:n" sedimentar, rrsenoa dens a que 1 a s a c az-o s a al 5%, s e co lo ca como una delgada c apa flotanda .. <1 la parte s upel'lor. del g r adi errt e y ,,1 tubo Se c;entl'i£uga en una ultra.centrtfuga, Una VeZi transctrrridoel tiempo apropiado, las diBtinta,s [racderre s del gradiente s e col e ct an como gotas despu4s de pedorar el tondo del tuba (Fig, 41,

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rig. 4. La centrl.'fugaci6n zonal en un gradiente de aacar-oaa es simple. A: La m\lestra 'Ie CClloc1! sobr-e un gradiente ya formado, de sacarosa de 5 a :20%, B: Despues de 1 .. centrifUY,aci6n. los distin t08 ccmponenres han emi,grade diferent:es distancias de acuerda con su constante de sedimentaci6n" C; El fonda del tubo se per-fora CO" una aguja del "ada y, posteriorment:e. se co lee tan las fracciones t'ecop;_iendo las go"tas en una se,;t1ie' de tubos . D; El anaHs is de 1a s di ferente1S fr,ac'ciones permit" de,ectar los componentes separados segiin su rapideoz de sedimentaci6n, (Cortesi,. de Harper & Row, Publishers, Inc,)

La uUl'afiltrac"i..on. conersre en Ill. retenci6n de, las part{culas a traves de algun material pr ovi sto de poros de t amano conoc ido y hOlUogeneo. EXisten va r ro e productos cornerci.ales hechos de a ga r oa a U otroe poli- 8acteridos, Uno de los mas c o n c c.fd c a e s e1 Sephadex,

La separaci6n de partlculas de di Ie r errte densidad ae logra par aentriJugacion a equitia",io en un ,gradient .. de den8idad ocentrifugacidn a equilibria i8op{cnico, 'tue c on a i.e t.e en centrifugar la muestra en una

S 01uci6n concentrada de una sal de alto pesO molecular, c o rrio Cs Cl. Cuando I a rriez c Ia se centrifuga a alta velocidad par un tre mpo prolongado (24 a 48 lloras), la sal tiende a concentrarso on 01 fondo formando rrri gradiente de denaidad. Las pa r tf'c u la s erritg r an fo rrnando una banda en 1a regi6n donde au densidad e s ;\gual a 1a de la soluci6n s a l.i n a en e s e pu.ntu del gradient". Una v ez, <llcanzado e 1 e qu.i Hb r-i o , las d i stinta" Irac cion"" se co le ct an en 10. forma descrita para la centrifugaci6n en gradiente de 5 ac arosa. El lector no debe c ori Eurrd i r la centrifuga<o\6n a equilibria, que s e b a s a en La separaci6n de las partlc.uia.s porsu d; stinta d en s tda.d , con la centrifugaci6n en gradiente anteriormente des crita. En aquella, La e ol.ucf.on de s ac a'r o s a a.ctua 5610 como e8tabUizante y Ia e epaaac i6n de las pa r-trc uta.s s e 10g1'a por au diferente veloc:idad de seditnentaci6n.

La cornbinac;6n de los d;stintos metodos d es c r i t.o s permite obtener preparaciones de fago homogeneas en cuanto a velocidad de sedimentad6n y den s idad, que las ad ecuan para un pas tertor anal; s is frs; co y qu rrrri c o, Estos rn et.o do s pueden, sin e rrrb a'r-g o , s e r- cornplementados CO'l ot r o s tarnbicll usados para La purificaci6n de protelnas, tales co rno 1a e l.e c.t r o Io r e s is, e1 fracciona=iento can iNH., )~04, etc. Algunas ve c e s para romper agregados diflcilmente s epa r ab l es del virus convrenen ade=as tratam.ientos con e.n a'i rria a que degradan acido s .n.u c l ed c c s "i pr ot e fna s , Algunas p r ot e aa a.a , deoxirribonucleasas y ribonucleasas e i r v en para este objeto, ~·a que n.O aduan s obre los fagos -i.rrt a.c t o s .

CARACTERIZACION DE LOSBACTERI6FAGOS Y SUS COMPONENTES

11

La caracterizad6n de los bacteri6fagos s e con sf g oe utiliz ando l as tecnica" c orrrunrrre nt e ernpleadas en e1 e studio de las macromoleculas, como par ejemplo, ultracentrifugac16n" difust6n, di.s per Bi6n de l a Iuz , !liIr ac ci6n de ra yo s X, etc.

Ultracentrifugac i6n. La centr:ifllgaci6n a alta velocidad permite determinar a Iguna s constantes de las pa r tfcu Ia.s , como e l cOlilficiente de sedimentaai6n rs) y La deneidad boyante (p). s -r e p r-e s e.nt.a la velocidad de sedimentaci6n de la parti"cula cua.ndo s e s orriere a una d ere ern mada Jue r e a centriIuga, y se determina por medio de la ultracent1·i"fuga ana1;"tica, 0 po r comparaci6n de la posici6n alcanzada en un g r adt enee de "ac ar oa a c on respecto a patrones de s conocidos. Como l a constante de sedimentaci6n depend e de las condiciones en que sedi1nenta la pa r tfc uka , C orne concentraci6n, temperatura y densidad d e l solvente, fr ecuent e - mente se expresa en condiciones normalizadas de Hntd as : temperatnra de 20·C, agua como solvente y concentra.d6n cera de pa.r tfc u l.a a ($~,~I. EI valor de s en esta ultima condi c:i6n s e obt i en e ext r a po l.ando los va lores obtenldos us ando conc e nt r-a ctone s dlstinta s a una concentraci6n de parti"eula. 8 ce r o , La oo ns ta nt e de sedimentaci6n e e una fundon de 1 peso molecular M, del coeficiente de difusi6n 0 y del vo.lurne'n parcial e s pe cf'(tco [) 0, en otros t(irminos, a.unque rn e no s exactos, de La masa, de 1a forma y de la densidad de l a pa r tfc u la, Por esta r az6n 1a ma sa de la pa rtfc ul.a 8610 8 e puede calcular a parti r de B una vez e on oc i do s el co ef'l c ie nte de difusi6n y e I volumen parcial e s pec f'Ii co :

R'Is D(l - TIl

[ 1)

COIne ,,1 coe£i.dente de sedimenta.d6n de Ia rnayo.rfa de los component e S es tud; ado a tienc valor rriu y bajo, de I a 1 000 X I O-,l~ s eg, ~s tea s e expre san generabnente en unidades Svedb erg (I S '" 10~1" seg).

La teo:;nica para dete1."minar la densidad boyante (p), ultracentrifu.Kaci6n a equilibria isoprcnico, a e des cribi6 al tratar la purificaci6n. Para hallar 10. densidad boyante de Ia pa t·ticula. basta Gonoe"r la. densidad de La 601uci6n en la regi6n donde s e fo r ma la banda; debe rrienc ione.r e e, sin embargo, que est a depende del e st ado de hidrataci6n e ieniil:sci6n de Ia par tfc u la , quo dependen, a su veil:, de las eonciiciones de centri!ug aci6n. La denaidad boyante de los fagas en Gs C'l osct la entre 1,3 y 1,5 g/cmS, y' es un b uen rndi"e de La prOper-CiM de proterna (0 "" 1,3 gl cm") y <icido nUC lea e o (ADN, P "" I, 7; ARN, P "" ],8) pre senceen Ia part{cula. EI bact e ri.6fago ¢X 174, pal" ejemplo, c onta ene apro.ximadamente 30% de ADN, de p '" 1, 72 g/ c nl~ Y 70% de prot ei"na. La densidad b cyant e de la partrc u1<> e s J,4Z·g/cm~: la esperada de las cantrdade s relativasdeacidonucleico y pr-otefnae s : 0,3 x 1,72 "" 0,7 x 1,3, que e s i gu a.I a Ia obtenida experi~ mentalmente.

M1<:: roscopia. Ele<::tr6ni<::a.

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La rru c r o s c opt a e Ie.ct r om ca ea e I mejor m. ... todo de estudiar la farIna de los bacter1.6h.gos. Los, virus hac ter rau os , pOl." t.erre r un di.hnetro rrren o r de 1 00000 1, estan pOl." d eb a.jo cJ eillmite de reso)uci6n del micros ~ copio 6 pti co; 9 inemb aeg 0,. e s po sib 1 e obs e r val" 109 mediante e L rni cr o s ~ copro e l"ctroni c 0 par qu e est" utili"'a una r ad i a c i6n de I ong ttud de onda mas corta, 'Iue permite un .. umento de 100 000 veees y una resoluci6n de 10 A. Para obs o:o:tvare~tas pa.-t{cula5 se sUI;penden en un medio voI at; 1, po r 10 general una saluci6n de a c etat o de arrrorri o; y se colocan sobre una membrana sostenida po r' una rejilla tnetalica que practicamente no ab se'l"be ere e trone s , EI pr obt erna t<, cruco :mas fr ecu ent e e s La !alta de contraste. Como la imagen obtenida es el resu'ltado de La clisper5i6n de eleetrone~ por 10$ electron"s d.e loa atomos de La paTtrcula, e8 .n e-. c es Brio, para la buenaobs er-va<;i6n,. una diferencia ap r-ec rab le de pod e r dispersivo entre las parti"cuias y e I rne.di o de sopo r-t e , y g ene r al rnerrte See mplea.n to; c nt c a s adido»ale". La mas uttli", ada See ono c e c orno tinaid" negativa, y consist., en m.ezclar La. suspensi6n del fago con fo,sfo~ vol£ram.ato de s oc i c 0 a c efa to de u rarri Lc a pH rre utrr o, A est" pH, e s t a s sales no se combinan COn e 1 fage, Y a1 s e c a r se forman una c ap a uniform" y opaca a los electrones en Ia cu a.l Los fagos destacan como parti"culaa n~as dar a". Como las sales en saluci6n penetran Ia s irregnlaridades en b superfid e de [a par-tfcu Ia , las rnicrograJi"as revelan los detalle's £inos de 105. fagos, como pu.ed e a pr-e ci a r s e en las p:tesentada.s en 10 s ultimo" c apfhul o s.

Absorci6n y Disperai6n de La Luz Ultl"avioleta

Una to rrrra fadl de determiIla.r La c anti dad de fag os puri£i cado s en una au ape ns rdn , e a rn"di~ la densidad 6pt;ca a la 1001 ultravioleta. La abs orci6n de luo; de 2. 600 fl. ob s e r va d a en 10 s fagus s e debe p r-Ln c i p a l « mente .<1.1 ac;do nucleico; en general, el e s pe c tj-o de absorci6n de los Eag o a ea rrau y semejante at del acido nudeico, exc epto per Una clara mayor ab so r ban ci a a mayares longitudes d" onda. d"bida a 1 a pre 9 enda

d e p r ot efn a . La raz6n de la abe or ban cia de Z 60 o/z 800 A e s un par-arnet'r o frecuentemente empleado en la caracterl:zaci6n de 10$ Iago s y, a I igual que la derrsfdad boyante, e s un lndice de Ia cantidad relatlv a de acido nucleico y p r ot efna que forman las partfculas. La ra:z6n de l a absorbancia de Z 600/Z 800 .~ para el AON libt'e de protelnaa as Z,O; el valor obtenido para lagos varra de 1,8 a 1,4.

Las s c l'u c.i c ne s concentradas de £ago, ad e rria a de absorber a la longitud de onda propia de sus componentes, presentan cicrta densidad 6ptica a lo.ngitud de onda mayor. Esta 6.1Hma no s e debe r ea lrnent e a absorci6n sino a la dispersi6n de Ia luz In crd ent e , 0 sea tur bi edad. l<:n e st a s soluci one s conce.ntradas la turbiedad puede n cta r s e a s i.mpl e vi s t a con ll.lz vf s ib l e: a51 Ia banda de rago, obtenida dura.nte la purificaci6n d es pu e s de ce.lltrifugar hast a e1 equilibrio, pu ed e s e r Io ca l'iz.ad a facilmente y co'le ct ada sin an s ay oa co rnp.l i c ado a,

13

3

ESTRUCTURA Y COMPOSIC10N

MORFOLOOiA

La forma y tarnarro de los bacteri6lagos va r fa bastante de un as espec'i es a'-otl'a" , pe r o al cbs e r v az-Io a il rrri c rc ac opt o elect:r6ni co, todos prea.entan una estructura bJ.sica que puede II er poliedr.ica 0 filamento_II a. i3) La fo r-rrra predoln'inante en 10.- Iago s de e st r-uc tur-a pol'i~dr'ica .. s ';'j-icosaedro (poliedro regular con 20 caTa. triangulares y 1 Z vertic e s \. Los de e G truct'1.r_~E.Q_l:i,~!l.r.ic a con ti en en e 1 a cido nucleico y la rna y. Or parte de Tasprote:l"nas ; gen-eralm.ellte van .. p:;'-Ovi,stos"de una. .,:;01,:1 que"ya,(a, en cuant c a ta=alI.o, forma y cOITIplejidad segUn Ia s ... !lspecie.a.,.y e ata cola. puede PQS ee,r a. .$U ~e..:: :-:-~,ri~..:~_f..2.~.:.:es ~,.Eo~~.f_~.l?r~~.o estru,cturaH terrni _, , na l.e s (veans~-ra;; riiicrograCias de! T~ Y ~. en lOB cap{tulos 9 y 12). Los fago~ que no pOse<ln cola suelen t.erie r pequ ena s "spiculas Ilbic,adas en los vet"Hcesdel icosaedro (veasc la rrric rog r affa de ~X 174 en e l ca.pl'tulo 101. Los ragas filiLmentQso,5. 50:0 b as+anre simples, pues c ar e.c en de a,pendice s , y 51> Il'structul'a es mas bien dlfndrica, con eL acide nuc led co uhi cado en

unacavidad be>licoidal intern". 15

El icosaedro Y. e l filam.ento estlin formados de $ub.unidades e s tr uctur ale s , al igual que,una c a sa conetruida de ladrillos. El numero de s ubun idad.e s estructurales d,istintas que [onnan. el rago var Ia s egtin Ia complejidad de este.. Las s ubunfdadas son prote!nas, de una 0 va r-Ia s c Ia s e s, 5i:oteti~adas ba}O-eJ' control del fago y que, repetidas mClchas vee ee, 10 Io rman. El fago ARN f 2 por I! j ernp lo , q Ill! pa e ec e s. e r uno de 106 mas s irnp'lea, consta de s610 dos e Iaa e s de prote(nas, Una de elias repetlda 180 veces, Esta estructura desubunidadeses general en los virus y ha sido conft r mada por e seudro.s de difraccl6n de rayos X, mtc r o sc opra electr6nica y anahsis qufrrn co, Fue por primera ve z postul ad a po r F. C;rlc'k Y J. Watson cOIT\O una necesid.ad para la con s t r-uc cron de los virus can prote,nas e.e pec Jfic ada s par au propio ":cido nuclei co. Su analiais s e oas,6 en la .cb e e r-v a c a.Sn de que e I acido rru c Ie i'c o s610 pood e especificar una, pr ot efna de un tamal'l.oapro:ot:imado a 1/10 de ell masa, Y que La mas a de pr o te fnas en un vi ru s e s mayo r que Ia mas a de ;icido nucIei co, En e ata forma, un faga que c cntuvt ar a igual cantidad de acido nuc l ei.co y de protefna solo pod rIa especifica)!" 1/10 de las protei"nas eStructur ale s, $i e.s ta a no e s tuv i eran r e petid,. 9 en l a par li'c irl a , E s t a s cifras SOn aun maS Javo r ab l e s a la hip6tl!s Ie de Crick,s;se considera que sMo s e dispone de una fracci6n del acido nudeico del fago para La s futesi.s de protefnas eat r-uctu r-afe s , ya que .. I ra.go neces.ita especifica.r, adema s, alS una s protei'nas ne ces a ri.as par a. s u rnu lt iplica ci6n.

COMPOSIC16N OUiMICA

Los fagos e"tan co rrrpu e at o s pOl" un s610 tip" de acido nucl el co y nU.nc a ,Par ambo,s. Segtin el Hpo 'J,. acido nucIeico que contengan s e Ie e

denom-ina Cagos ADN 0 ARN- Las p rot efnas , y a rnenctonada s con res~

"peeto a l:a e.<!tt'uctura de los-fago" ,'·constituyen e 1 otro corrrpon ente s i ern« pre present" en "'stos._I'kIA1gllJl06 fagos contienen ademas pohamilias, tales como e s pe r rrriria. y eapermldina, cuya funci6n consiste probabl"emente en iaciLitar e1 empacamiento del acido nuclei co. Ha c e s 610 unos p oc o s ,,1\05 s", de s cub r-i d en Chile un fago que, a dHerencia d", los e studiadoB ant.er i cr-rnente, posee ademi'is "pidos como uncomponente estructuraL Los 1fpi.dos de' este fago, denomtuado PM Z, forman una membrana que envuelve a Ia nucLeoprotei"na de aque l al igllal que en vaT'iOB Vi,TUS ani:males. EI aCldo nllelaiGo del Eag c contiene la informaci6n necesaria para la rep:rodu'cci6n de es_te en Ia _bacterif!., s,ensible, Se encuentra .a12- jado en e l po lt ed ro 0 fila rriente , protegido pOl' las p rot efn as de la ace ion de nuc Lea.sas (enzimasque pueden hidrolizilra los acldOjl_ Qlldefc,,'sr. Como S8 dijo--ya ;--;';-1 -'cido nuc l eic o de los bacteri6(agos pued~l'!'.ijl.DN o ARN, "I ADN pu ed e s e r a su vez; rnonoteinf co 0 bitenico. Hasta ahOTa s610 s e han descrito vr rus b acterlanos con ARN monoteni'co, aunque e e c cn oc en vxr u s arn.rna le s con ARN bitenieo. Sa han des c r-ito teenicas de tinci6n que permit en deter!ninar rapida:mentOl ,,1 tipo de acido nu c l e i co de un fago, pero una de las for!nss mas exactas de hacerlo consist e en e xt r a e r ,,1 ;iciclo nucleico y ana.Hz a.r sus pTopiedades, algunas de las cua Ies s e describiran !nas adelante. La ext rac cton del a.eido nu cL"iGO 5 e realiza generalmente tratando el virus con agentes que desagregan y de s na t'u r-a Li z a n la a proteInas, como fenol s aturado c o n una soluci6n salina. e ampon,

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AnN BITENICO

El ADN bitenico e s el veh{culo t r-anapo r eado r de la Info rrna cf en gen":tH:a-en'l,lIl' c e:lui<l.'S'-aninlal·ei'J, veg etal e s, ba.ce edana s y en La rna )io_ri"a de los vi rllS. Es d consHtuido pOT c ad.ena 5 C o:m.plemental'ias de po IideoxirTibonucle6tidos ora-en"'f.,,, en forma helicoidal y ma.ntenidas 'unl.d.as por puentes de hidr6geno entre las ba s es co:mplementarias guan\n:il= c it os ina y au enina· timl¥) ill: (Fig. 5 j, Las union es pOl" pu ent e s de hid:r6geno Co:rman La estrl.lctura, se cunda.r ra j lao clilucidaci6n de la e strudura. Be debe a J. Watson y F. C:.-ick,I"l y s e c orio c e como la dobl .. h,Hice Watson- Crick, pars er qui e rre s, con gran ingenlo, interpretaron el anaHsts qufrnf co y Ia difraccl6n de r ayos X, realizados p.rincipalmente pc r E. Chargaf£yM, Wilkins, r e s pe c erva rn ee te , Las cadena s helicoidal e e fo r madas po r los po Ii nucleotido .. a_pa r e cen en la. fi gu ra 5 donde ta!nbi en s e indica Ia po la ridad, Esta po l a.r-i.d a.d e 5ta dete rminada por la e stel'i£icad6n entre nucle6tidos ady ac ent e s, Al subir 0 baj a r a 10 largode La molecula, mientl'as en un.acadena helicoidalla di.recci611 de este e,nlac€O €Os .,' _, 5' .. n la cadena hellcoidal complementaria es 5' - 3'; de tal manera que en uri o:><tremo de la molecula 1a c adena helicoidal ter!ninara en)' -OHrnient r a s que ta cornp l erne nta r ta 10 ha r<1 en 5" -po,i'. Obs erveS e que las dos c ade na s heUco;dales que fonna.n la molecula Henen pc l az-Ld ad e s o pue s aa a I e1 5entido de La polaridades 5' - 3' 1.

Los grupo5 acidos primarios del ADN s e encuentran ioni~.a.do6 en c orrd'i c iun e s £; siol6giGaa yen las condiciones e><perimeltta.les mas c ornu-. ne e , Enel f ag o e st os i one s estan neo:tralizado5 pOl' poliaminas 0 pOI' 106 grupos basic05 de las protei'nas que lorman la c a ps u ka , En todos los Cagos en que ha sido e s tudt ado , s e ha venc ont.r ado una. sola moHic ula

Fig. S. La di sposioi6n de las dos cedenas de polinuclec"tidos en la doble helice Wiltsoncrick. (Cortesia de John WUey ~ Sons, Inc.)

P fo·sfa-ro

g deoxi,.ribosa A adenina

T timina

C guanina

C cito~ina

de addo nuc Iei.co por c ada fago, Este, salvo alguna excepci6n como el fago T 3, (4) esta fo r mado por po!inueleotidQs sin interrupciQnes, ucrno podri'an producirB e po r la c a r-e nc-i a de un enlace fQafodio!l·ster 'ent" .. rruc le6tido s ad y a c ente s , E 1 pes 0 m ol e cular de los AD N bi tl'=nie 0 6 encont",,·dos en los bact e riMag oS e s rnuy variab Ie, pues va de 6 x 106 a IlO X 1 rf' da lt on es, Como e1 ADN bitenico·tiene un di.:lmetro de 8610 ZO 1, sus mollkula" son la1"gursiTnas, de 3 micrones de la,.go las "InaS pequehas" a 60 rrrlc r-one s las mayorea. EI peao molecular s e pued e deducir de la constanta de sedirnentaci6n de Is rnoloacula, a partir de Is ecuad6n obtenida expe r imentalm.ente: s;',~ '" 0, 091Vf' 3> • TalYlbl.en pued.e obt ene r 8 e po r an,Hisis qufmrco , determinando Ia cantidad de ADN y- el numerode £agos pr .. aent" .. en una p,.eparad6p pu:riHcada y calculandoa partir de est"" datos la rrra s a de ADN pOl' Iago,

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Algunos Iagos contienen ba.s e s r a r a s en vez de las encontradas con>u.nmente; 109 lagos pares de Ia ser'ieT (T2, T4yT6)oOntie.nen 5-hid-roxi rn eti lei t.o s ina e,n veo; de cito s Ina, y ct "do 9 bade ri6 fago s de Baci Zlue subti HI' c ontienen 5 - hidroximetilura oilo en vez de timin... El hallazgo de 5 - hidr o'1[imetilcitos ina en 101> bac teri6fa.gos T pares pOl' G, Wyatt y S. Cohen pel'mit16 medir la arnte sis del ADN del [ago T4 enla bacteria i.n!ectada, ya que la p re e encra de e st a base 10 distingue del ADN bacte"iano. La afutesis de e s ta base s610 en las c'elulaa in£ectada5 condujo , ademas, a 1" demostraci6n de que el Jag o induce Ia si'ntesis de nuevas enzima~ durant e s U dupli ca ci60. El ADN de los fag os T pa r e s a e c ar a.ct er f z a ademas pOI' tener g'Iu co st Iada a una gran proporci6n de las bas es hid roximetHc; <o,sina.

E! ADN de IQS ba<:ter;6fagos tiene fo t-rrra lineal, pero no e e in£"ecuente ob s e r va r Ia a,paricj6n de formaa cj.r cule r e s durante s u duplt cac ion.

£1 bacte,.i6fago PMZ, que contiene lipidos, e s una excepc:i6n; SU ADN, como ot r o s encontrados en rnitocondrias, cloroplastos, p La s rrri do s y a lg uno s virus animales, tiene 108 extremos 5' y 3' encontrados en las rno Iec u Ia s lineales, untdo s por enlaces foslodH,ster 10 que produce una mol~cula de Ic r rna c i r cu la r, La uni6n de los extremos produce ademas ciertas Iu e r aa s que hace que la h e b r a bit~nica Be enrolle" obre s{rnistna, Las Jo rrnas cfcUcas de ADN con este superenrollatniento pueden ser vistas iacilme.nte mediante el microscopio electr6nico (Fig, 6J, La tecnica corrientetne.nte etnpleada para 1a observaci6n de ADN consiste en cornbi.na r Io con una pr-ot efna bas"ca, citoc r orrra 0, y e s cu r r i r suavemente Ia rne acLa sobre una sohu:i6n salina, EIADN "nido a la prot .. rna permanee e relativamente e.std r ado en la superficie, desdela cua.l es 1'ecogido en e1 pbrtaobjeto del rrrt cr os coprc electr6nico, La rnu es t r a se somet .. luego a una Uuvia de "VapOl"" de L1U tnetal, pOl' 10 general platino, de tal forrna que las parti'culas microsc6picas del metal ca igan sobre Ia rnue st r a formando un pequeno angulo. £1 rrret a'l provoca Ul1 mayor contraste debido a que las pal'ticulas s e d epo s tt an en los borde s del ADN unido a La p r ot efna y causan una mayor densidad a los electrones. La pr-ot efna unida y el metal d epo e rt.ado hacen qu~ las fibras de ADN apa r ez c an con un diarnetl'o 10 0 mas ve c es mayor que e1 real, de 5610 20 t

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rig, (;. La es'tl:'uctUI'a circ •• Lar- y super-enr-o Lfada del AIJN del bacteri6- fago P)12 puede compr-cbar-se mediante el micro."copio electronico,

ADN MONOT Er-UCO

l:1~UF_lU:.II.R.Q !i.e."peq.uel'los lagos, entre los euales los mae c s tudrado s s nn ¢X 114, Sl3 Y M13, qu_e . .E0ntien.o:-n un ADN.monoti!:nieo 0 pea.de (Ina sola c ade na helicoidal. La c a de na h eft c cfd.al encontrada en una prepar ac i on pu r-i.Ei.c a.d a de eualquier "specie de estos fago$ es de un solo tipo Y', en contra de 10 que s e podri"aesperar, amboshelicoides c crrrpl e rrterrta r io s no "stan p r e.s erit e s en distintos fagos. El pe 50mcieCl.Ilitr del ADN de e s to a fagos os cila alrededo r de I J 7 X IOe daltones y can tienl'" 5610 alrededoc de 5 500 nucle6tidos. Las mOleculas de ADN encontradas en e s to s fagos se d.i s bi ng ue n ademrsp,;;~ ;.; ..... ci r cu la r e s ,

ARN MONOTENICO

Otro grupo sui penel'is de bacteri6fagos 10 [0 r rnan aqueUos que c oo t i a n an ARN co rrio rrra t ec-La.I genetico. E!!i~, .. ARN e s monot<l1.nico,. lineal y de un peso rno Iec uta r de 1,1 )( lOG daltones, y a pesar de s e r rnonot eni co, presenta. una e st r uc tur a 8 ecundaria que da a las rnollkulas una forma baatante compacta, 10 que s e refleja en s u alto c oefj c i.c nt e de B ea·irnent·~i6n. "La' ';5t ructur a s e cundaria de e s tas mole cella s manotentc a s s e debe a La existencia de r eg ione s compiamentarias, pres errt es en e 1 rnlsmo polinucle6tido, capaces de aparear s e por media de puent e s de hidr6geno. Esta" reglones ab a r can alredador de un 70"1. de la ITlO liie n Ia,

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PROTEINAS

Las rnoleculas de las prote{nas ·estan formadas por largas caderias de arrnnoa.crdo s un j d.a s por enlaces p eptfdt co s , Los aminoacidoB terminales pueden di stinguirs e: e1 aminoacido de un extrema tiene libre el g1'UPO arrrrno "f e1 del otro extremo el grupo carboxilo_

R R

I I

NH2- CHCO - NH-CHCO

R R

I I

NH-CHCO-NH-CHCOOH

a

b

v

La s e cuenc ra de aminoa'.cidos en Ia cad ena s e llama 1a estructura pl'imaria. Esta .d et.e r rrri na la rna.ne r a en que pueden formars e otros enlac e s int ermole cular es (6strw::otul'a semmda1'ia), e.} rncdo de gi r iii rode plegars e la cadena sobre S1 rnisma para adoptar su estructura tridimensional (est1'uetuNl terci.aria) y La manera dl! a s o e i a r s e e s ta s c ad eria s , despues de adopta r 5U estruetura te r c l a r i a , con otros poUpeptid05 (811- 't1'!I.atura aUdtel''1a1!'ia).

Los bacteri6{agos est<lln Io r rrrad o s por w:>. ndmero relativa.nente pequeno de e s p e c i e s de p r obefna s , que puede varia} dellcte 2, en algunos Cagos ARN, a lO 0 mfis en bacteri.6fagos mas g r and es y coi'nP~E!j05, como e l T4. Las prot.efna s e structurales de los bacteri6fagos no acusan diferencias notables r e spectc de ot.ra s prote(nas. Es Crecllente, sin ernb ... :r~ go, en ce nt r a'r en las protei"nas capsulares cierta t end e nc i a a la conc e ntraci6n de a rrri n oa c ido s basicos que neutralizan 105 grupoll addos del o1:cido nucrei co, Las pr ot efna s virales deben cumplir requisitos e st ru c -

turales que las capactren para uni r s e , de una mane r a altamente e s pe c ffica, a rno1eculas identic as para formar e I poliedro 0 filamento, y a p rot efnae distintas en e1 nacimiento de los apendrc e a. Ad erna s de proteger e1 <icido nuc Iefc o del fago, las p r ct efna s virales d e ben participar en otras func.ionee , como la adsorci6n especlfica del fago a Ia bacteria sensible y la inyeccl6n del .icido nucleico en algunos fagas, como los T pares.

Un Tnetoda de separaci.6n e identi..ficaci6n de las protefnas, de gran utilidad en e 1 estudio de los polipeptidos v:irale s e structurales y de los rnduc i dos en Ia bacteria infectada, con s Is t e en Ia electroioresis en geles de acrilamida. ,e) La separaci6n de las protefnas s e b as a en su distinra migraci6n a l s e r sometidas a una difel·encia de potencial en e1 gel que les sirve de soporte. Los geles de acril:nnida pueden s e r f;!icil:mente preparadas ell ellaboratario con poros de d;istinto9 t amanos , de tal ITIane1·a que es posible obtener e1 soporte ITIas apropiado para que las rriov leculas Illaa pequel'las ernigren mas rapidarnente que las mas grandes. Para separar las protelnas del {ago de acuerda can su tamal'lo, s e las desagrega co n u n detergent e ani6nico que s c co rrih i n.a. can ellas, de tal rria ne r a que tod,,!; s e comportan como polianiones de una rni s ma c a r-g a y la mig racion en e 1 gel s 610 d epende del tarnai\o de la prot eln a. E 1 pe so molecular de los polipeptidoo; s e puede c a Icu Iaz- por c orrrpa r-ac i dn con Ia movilidad de otro s de mas a C ono erda S ornetid "5 a las rrll s mas condidorie s (Fig. 7).

20

Fig. 7. El peso molecular de las protelnas se puede calcular por aU migracian despues de la electrofuresi". Diagrama "uperiof', Distribuci6n de las pratei.nas del bacteri5- fago ¢X 174 despues de ser separadas POI' elec'tl'oforeais, en un gel de acr :ilamida. Dia~rama inferior: Relaci5n entre el peso molecular de la proteina y su migrac~on en el I':el con I'especto al frente (RF). Los di-

versos puntos indicados fueI'on obtenidos con protein.a s de pe So moleCUlar conoc Ido , La relacian indicada permit" calcular e1 peso molecular de cualquier proteina, conociendo su RF al ser samet ida a electroforesis en iguales condiciones. (Cortesia de Academic Press, Inc.)

4

PROPIEDADES ANTIGENlCAS Y ACCION DE AGENTES FislCOS Y QUfMICOS

Un antlgeno es Una sustancia que a l SOlI' inye<ltada en un arri rrra.l estilnula 1a p r-od uc c i on de anticuerpos ly-globulina51 que reaccionan espectlicame"te can ,>1. La l'eacci6n anngeno-anticuerpo e s de alta especificidad y rnucba s ve c e s per mite distinguir p r ot efna s que pa.r-oc en identic as par varios ot r o s metodos anallticos. La mayorfa de las proternas son buenos antfgenos y por 10 tanto tambUin 10 son los virus; aun mas, los lagos son excelentes inductores de antj cuerpos debido a que los antig eno s, repre s entado9 por las sub unidad es es t ructu r al e s , e a tar, r e petidos much a s Vece" formando una e s t r uct u r a :rnultimerica. Par e e r exc el ent e s antfgenos 'I par 1a facilidad yalta aensibilidad con La que s e p ue de deteetar 1a reacci6n fago-antisuero, los virus baeterianos SOil tambien muy \1tUes en diver sos estudios inmunol6gicos.

REACC16N FAGO.ANTISUERO

La 'r e a.c c ifirr de un fago can el ant.Lsue r o obtenido de un animal inmuni:z.ado puede s e r detectada cb s e r vando di S tint.as cons ecuencias de La uni6n fago-a.ntieuerpo. La neutl"aUzacidn del Jag o po r e I antisuero es la con s ec uencj a observada con mas frecuencia, ya que la posibilidad de determinar Iacilme.nte el numero de parnculas infeceiosas neutrali2.adas permite estudios cuan.titativos pr ec i so s , La cinetica del proeeso de neutralizaci6n puede 5 er a eguida titulando rriue at ra s de la rnez c la Iagaanta s u ez-n , tornada s a distint05 intervalos de tiempos d e spu Ss del comienzo de la reacci6n. El mlmero de plReas de lisis obtenido en esta farIna, indica el numero de ragos que no han side neutralizados por el antisuero al n empo de diluei6n de Ia muestra, ya que ests d .. tiene eIeetivaJnente la reacei6n ant!geno -anticuerpo. La diluci6n no aIecta el mirne r o de fagos neutralizados debido a que la uni6n fago-antisuero e s caa i slempre irreversible. La cinetiea de Ia neutralizaci6n obedece a l a siguiente ecuaci6n escrita en tres to rmae dt s ttnt as .

2J

p

Pc,

P log, Po

- I$tc;

P 10g,_. Po

J "

- 21 "tC

,

[ z)

donde p. e s el ti'tulo ini<:ial de fago; P el titulo residual de. pu~s de t ntinutos de contacto con una concentraci6n C de antisuero; y k (rapide!'. de inactivaei6n iraceional) es una constante caraeterfstiea del Iago 'I antisuero en estudio. E sta ec uac.rfin es caracterfstica tanro d e una reacci6n de primer orden corno de una !Jeudotnolecula,r. Eata ultirna as una r eacci6n bimolecular en la que uno de los r ea c+ante s , e1 antisuaro en este c a.sc , s e encuentra en gran exceso; en esta forma la rapidez de neutrali2:aci6n ,,610 esta lirnitada pOI' el nUIIlero de fagoe sin r ea cctona r.

Los anticuerpos neutralizantes pueden gel' absorbidos po r las prot efna s virales, aunqu e estas esten en BU estado monornerico 0 forrnando par-tfc ula s incornpletas, disminuyendo asi' I'll poder del suerO para n eutralil1;ar .,1 fago. Esta propiedad s e conoce pOl' "poder- bZoqueadol' del antisuero" Y Be ernpl e a cOl·riente:mente para medir Ia eiDetics de la srntesis de los antfg eno s virales, en funci6nde la capacidad de los ext r acros de las c.Hulas in.fectadas para dis:tuinuir el poder neutralizante del .s u e r-o, La r eaeci6n an trg enO - anticue r po pu ed e tall1b ,en de te c tar s e poria preaipitaaio1'l del Cago 0 de sus antrgen08 cuandoge us a una cancentraci6n apropiada. de a u e r-o y viI· us. Aunqne 111. concentraei6n de antrgenos requerida es relativamente alta (alrededor de 1 :mg), e at.a teenica s e usa fr ec ue nt e mente porq ue permite det ect a r r eaccione s an trg eno -antic ue rpo distintas a aquellas que provocan lao neutralizaci6n. Las reaeciones del antisuero con sitioa antigenicos vir ales no e5 endalea para la infecci6n pueden s e r tambi&l detectadas po r la pruebade /1.j=1.6n del compZemento (cornp le rnent.o eli un t'OruUno que se aplica a un grupa de proternas normalmente presentes en e l suero). Cuando los anticuerpos se cornbinan con el anti"geno en presencia del c ornpferne nto , algunos componentes de este s e unen e ina.ctivan. La disminuci6n de la. actividad delcomplernento provocada poria reacd6n anti'geno-anticuerpo, seensaya par la propiedad del complemento de lisar los g16bulo s r o jos de ovino unrdo e a canHdades rro ag1utinantes de anti cuerpos de conejo :>.ntigl6bulos rojos.

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ANTIOENOS VIR.ALES

Todo SUerO antHago contiene va ei a s c la s e s de a ntt cue r poe correspondientes a los distintos a ntfg eno s del fago contenidos en la ca be aa , col a, e a ; pfc ula s , etc. Las anttc ue r pos neutral:izantes a ctnian por Lo general combinand oa e en los sitios cionde o cu r r e la 3odsol·ci6n del fago ala bacte ria, coma porejemplo, lasfibrasdelacola del fagoT4. La rriay o r fa de las c la.s e s de anticuerpoe vt r al e s halladoe en el suero no n eut r a Hz an 108 .fag os , y 9610 se pueden desCIlbrir por las tecnlcas en las que 5'" ob s e rv a 130 precipitad6n 0 Is fijaci6n del complemento. El ADN de los fagos puede tambi~n inducir anticuerpos,. pe r o e s un antigeno rnuy d~bil que pasa desapercibido, a menos que se recurra a tecnicas especiales de indue· ci6n )' detec ci6n. El AD N de los ragos T pare a e s el tini co acido nuc lei co del cual se ha podido probar la inducci6n de a.nt i c ue r-pc s especi'ficoB, Los determinante" antigenicos, a que s e debe la especificidad, san en este ADN los re sidtloS glucosil unidos a la hidroximetilcitosina..

Con frecu.encia se emplean tecniea.s inrr:mno16gicas para identificar distintas especies de lagos, aprovechando Is alta especificidad de estas reacciones, en especial la. de ne-utralizaci6n. Par 10 general, cada es· pecie de raga 9610 e e neutraliza par el antisuero hom6logo, 0 sea el inducido po r Ta rnts ma especie de fago. Sin embargo, en algunas especies muy relacionadas que for.-nan g r upo a de c o rrtp.o s i c ifi n quimica y ciclos de repro due ci6n muy simi lares, s e pr e sentan r e ac cion e .. c r uz acla S IC uadra II. La falta de reaed6n cruzadaentreel bacteri6fago y 5U bacteria sensible fue uno de loa primel·os in.dicio s experimentales de que no e.nt r an protei'nas baeterianas en la composici6n de las part{culas v i.r a Ie e,

Cuadra I

N eutraliz ac i6n C r uzeEia Entr e .B eo ter 16fa8 a" T' y "U8 Ant ie uer a.

Valores expresados como rapid.,,, de inactivaci6n fraccional, k(min-l)

BACTERr6FAGO

Suero TZ T4 T'l T3 T7
Anti TZ 400 150 0 0 0
Anti T4 75 Z50 0 0 0
Anti T 1 0 0 80 0 0
Anti T3 0 0 0 lZO 30
AAti T7 0 0 0 75 120 ACCI6N DE AGENTES FISICOS Y QUiMICOS

Todo 8 los efectos producidos par ag ent.es qus rrn c o s y f(sicOB son c a.u s a.d oe por c.a.rrabd oe de 1a estructure de 108 componentes del bacteri6- fago, y 109 que se pueden detectar mas iacilmente son aquellos que afectan la capacidad in£ecciosa de La s part{culas. La inactivaci6n del bacteri6fago puede deberse a. alteraciones del acid a nucleico que 10 Ln-

capacitan para producir una progenie infecciosa en 130 bacteria infectada, 23

o a 1esiones de las proteinas que irnpiden 130 adsorci6n normal a penetraci6n del acido nucleico.

Las prote1nas de 1a superIicie de las par-rfcu la a son las determinantes principale B de La sensibilidad de los virus a los dhtint05 ag ent es qufrrn co s , Corn o el acido nucleico eslli. englobado por estas proternas, los bacteri6£agoa intactos son l'esistentes al tratamiento can nuc1easas, La capsula proteica es, sin etnbargo, perlneable a tnol4iculas mas pequel'las, como HN02 U otras, capac es de producir cambios qUlrnicos en el acido nucleico, que resultan en mutaciones 0 en la inactivaci6n del fago. Las protemas capsulares de 1:1. Inayorra de los virus se. caracterizan par ser, en au estado muitimerico, extremada:rnente resistentes a proteasas. Tanto 1a resistencia a nu cl e as a s corno a pr-ote a aa s , esuna propiedad util en la purHicaci6n de los fagos, pues perJnite utilizar est as enz Lrna s para elinrinar acido" nu cl efc o s 0 protemas contaminant e S.

Los detergentes, pH .icido a alcalino, yagentesdisruptores depuentes de hidr6geno, como urea y guanidina, pueden inactival' a los fagos rompieodo s u estructura ITIultirnerica, po r Lo que t.ambien Be u s an en el estudio de 130 organizaci6n estructural de los virus, Por 10 general, los bact,n'i6£agos son resistentes ala acci6n de los detergentes y no lOB afectan concentraclones de ';stos capaces de r ornpe r La rne rnb r ana citoplasm.1tica bacteriana. La desintegraci6n de las protelnas estructuraLes por detergentes i6nicos, corno laurilsulfato de sodio 0 agentes disruptores de puentes de hidr6geno, e s por 10 general incompleta. Para obtener todaa las protefnas del virus en .. stado monomerico "on neces arias tratanlientos bastantes dnisticos; uno de los mas eficaces co mbrna la acci6n de det er gent es i6ni.cos y temperaturas elevada9.

Los bacteri6fago6 son bastante estables a la temperatura ambiente, pl'opi.odad importante para e 1 intercambio de rnue s t r-e.s , ya que permite e I envi'o de lagos a lugal' es distantes sin necesidad de r .. frigeraci6n. La "nactivaei6n 6610 e s apreciable a temperatura$ superior e " a 50 6 60' C Y disminuye .. I poder a.ntigenico de la. s uspensi6n de Lagoa. La rapide'!. de inactivaci6n dependc en gran parte de la composrci6n del rri ed'i o , como c onc e nt r a ct on de protetoas, fllerza i6ni ca, pres encia de tneta les di valentes, etc.

Los bacteri6fagos SOn rnuy resistent e e a La agitaci6n; 10~ de muchas "species soportan bien la fuerte agitaci6n producida en las lll;iquinas homogeneizadoras dom~ stieas. Los fagos ieos a"drieos sin cola son =,(a r e sisten tee a este tipo de tr ata:miento y pueden S opo rtar aun 1a9 fue;rtea vibraciones pl'oducidas po r onda .. ultras6nicas, capaces de romper ot r o s fagos filamentosos 0 icosaedricos con cola r!gida, como .. l TZ.

Aunqu e 1a mayor! .. de los ragos soportan e I cong e la.mi ento , varios cicl05 de congBlaci6n y des congelaei6n produoen una rna r cacla inactivad6n, por 10 que s e prefieTe guardarlos a 4" C.

RADLACI6N

24

Loa e £eetos observados al irradial' los bacteri6fagos s e deben a La absorci6n de La energ{a. contenida en los cuantos 0 c01'puGculos de energra que [orman el rayo electromagnetico, Esta tl'ansferencia de energfa a un atomo 0 IUolecula del fago puede provocar distintos c arnb io s qu:i'rnicos dependiendo de la cantidad de energfa tranaferida. La energ:i'a de un cuanto depend .. de La longitud de onda de 1a radiaci6n (Ie) y Be puede calcular por la f6r:mula E'" 12. 400/A; donde E, eo; la energia en electronvoltios (eV) y ),_ la longitud de onda en 1. La radiaci6n puede s e r (de l. mayor 0 menorl: infrarroja, visible, ultravioleta (u , v .. I, roentgen o X y gamma ('Vj. La energra transferida po r los cuantos de lu", infrarroja y visible no e s suficiente para producir c arnbfo s qui':miCQS en los cOInponentes virale9. En ca.ln.bio, la energi"a. de los cuanto s de luz u. v , j irradiada pOl' las l~mparaJj germicidas cornune s , es Buficiente (4,9 eV) pa r-a producir ta di sociacion de los enlaces que LInen los aton'los de las mo1eculas del fago. La erre r g fa de los cuantos de 1'ayos X 0 gamma ea va r i o s ordenes de ro ag rri t.ud superior a La de la luz u.v., y su absorci6n tiene pOl' resultado la libera.ci6n de electrones e e cunda rf os de alta erie r gfa que Be propagan en el tnedio y provocan nuevas ionizaciones 'f excitadone e , Los "fectos de Ia ractici6n u. v . (no ianizun-teJ y X 0 Y t-ionieant.e ) son por 10 tanto btisicarrtente distintos y deben ser ana1izados pOT separado.

RADLACI0N NO IONIZANTE

La einetica de inactivaci6n de los bacteri6fagos al ser estos i1"radiados con Iu z u.v. se puede interpretardela rrran e r a siguiente: c ua n do s e e xponeri los (agos a un fluj 0 deq cua nto s X cm~ X seg-l., absorben r/J cm.a de los c ua nbo s y s610 una fracci6n RC de estos produdra "fectos Le ta Ie s , El numero de e vcncos que pueden producirun efecto letal de s pue s de t Begundos de irradiaci6n e8 pues q ¢ RC t. Cuando e l nurnero de ev ent oe Let a.l.e s e s igual a1 de lagos irradiados, no todos s e han inactivado co rric es de esperar, sino que e e obtiene una pobl.aci on de f'ag o s que han sufrido

0, 1, 2. 6 mas efectos Ie tal ea. Los sobr"vivientes corresponden a aqu aIla fracci6n de La pob1aci6" que l:ia s uf'r-i.do 0 e.Fe cbn a l e t a.Le s , y s e pu e d e calcula1: por Ia f6rrnula de 1a ley de Poisllon:

donde No Y N son 105 n6rneros de {agos, actjvOS t r as los tiempos 0 'I t de t r r-ad ia ctein, respe ctrvament.e, Y el exponente de e e s el numero de everit os letales "uIddos pOl' La poblaci6n. El factor ¢ RC representa la sensibilidad del {ago yqt La do ai s de irradiaci6n. La cwlSticade inactivaci6n, £l"acci6n de e ob r evtvtent e s en COTTlparaci6n con la do s Is cft vs qt}, obt enid a e xpe ri rnentalrnente es expon en cial de acue rdo con 1a e cuac idn [3 J . El factor ~ RC tambien se llama seoeidn efiea2 11l) 'I representa la s upel'fieie hipotetica del {ago que alrecibir el choque de un cuanto c ond ucira a la inactivaci6n de este. La e cua.c ion [3 J pued e escribirs" tambien:

[ 4)

donde D e s 1 a dos i s gt. La secci6n eficaz se puede catcutar f:icilmente a pa.r ri r de e eta ecuaci6n:

cuarid o

oD =

IN.,", ,;-l = __ 1 __

'N. 2,7114

0,37

25

o sea que c ua nclo La {racci6n de s obr-ev+vi e nte s e s 3 7"1" oD e 8 [gua 1 a I Y Ia 5 e cci6n dicaz a ser;i igual a _1_, d onde 0..7 e s la do st s que deja un Ds?

37% de sobrevivientes.

El efecto letal de Ia luz u. v. Be debe a1 dal'l.o pr oducf do por esta en el acido nucleico del fago y no en Ia pr otefna , uno de 105 prim.eros indictoa en favor de esta interpretaci6n s e obtuvo al medir Ia sen Bibilidad del fago par cuanto absorbido al irradiarlo con luz monocrom.Hica de distinta longitud de cmd a., 0 sea, RG a distinto5 L La cu r va obtenida al repres entar RC en funci6n de j._ (eepeoero de aao-idn) e s rnuy Similar a.1 e spect re de absorci6n del acido nuc lerc o y cla r.amente di s ttnt a del de las protefnas, 10 que indica que la. rnay o rfa de los cuantos rn actavant e s son abe orbidos par ,,1 acido nuclei co.

La s e cctdn efica..: a que presentan los fagos ala ra.dlaci6n no ioni· zante e s proporcional aI tarnano del acido nucLerco (Cuadra 11), pero tarnbien depend" en gran medida de una s erie de otroa facto:res/ como e1 tipo de addo nucleico, 1...: ba.cteria hospeda.nte y las condiciones en que se hace 1a titulaci6n. La explicaci6n de e sea s obs e rvactcnea Be vera a continuaci6n, i atenci6n !

Las bacteria" de mllc.ha.s e s pe cre s , entre e.Il.aa las E. oot«, son capaces de reparar gran parte del dane producido por la Iuz u, v. EXisten dos pxoc e so s de reparad6.n, uno de los ellale .. , conocido cc rrro iatorreactivaci6n, pued e di8tinguirs .. £acilmente porque 8610 occ r r e cuando las baete1:ias e e i1urninan pOl" La [uz, visible. El otro s e conoce como l'eparaaion en La oSClU'idad, porque pued e ocurrir tambieh en aus encfa

Guadro II

Seneibi.lidad de lOB 13acteri6fag08 a Ia Irrad(aci6n

Fago

PM Y Upo de acido nuc let co

o (cm~)

Luz u, v. (265 nrn) Bacteria r.cr+ Bacteria hc r"

V, (om") Radiaci6n Ionizante

2.5 x 105
T7 ADN bit6nieo
30 X lOB 3,.1 X iO-w
). ADN biteni.co
T4 lZ5 X lef 29 lO-l.B
ADN bit-linieo )(
t , () )( 10" 10-:'0
ex 174 ADN n>onoten.ieo 8 x
I, I x 10"
R17 AR.N monotenico 7,7 )( 10~

14 x 10 ..... "

10 X 10""""

2.5 x 10-"

Z, (, X 10""

26

del" 1"", Visible, y las b acee r iaa que 10 po s e en S e d.enorni.nan Hc r" (host cell reactivation). La secci6n e ficaz presentada en e I Guadro II para divers o s r ... gos coz-r espunde a la obtamda en aus enct a de foto.rreactivaCi6n, titulando el fag·o irradiado en au s eraoi a de luz a ct i va.nt e , Dado que las bacterias Hcr+ 5,610 puedenreparar el dana produeido en ADN biteru.co, 10.$ fagos con APN monotenieo, como e1 =l>X 174, apa'r ec en rriucho moSs sensible" a 1 a lu·", u. v. de 10 que s e esper,ar!", de a c ue rdo con .. I tamano de au ADN. Cuando e e emplea una bacteria. mutant", Her- c orno hospedante, los fagos ADN bit6ni<:;o, al no s e r r epa ra do s , rrrue st r an una. s errsibilidad similal· a h. , .. s pe r ad a para fagos can ADN monotenico de :igual ta.rna.n.o.

La absorci6n de Iuz u, v . pc r et ADN produce varios tipos de modi£icaciones, pero Ia causa mas frecu·ente del e{eeto letal e s Ia dimeri«aei6n de dos ba6ea tirnina adya.cente," (Fig. 8). La fotorreadivaci6n Be debe a 130 activaei6n por la luz )" entre :3 000 y 4 500 A, de una enzima. capaz de romper e sto s d{meros. En c arnbto , la reactivad6n ell 130 oscuridad e s \In proces,o en el que i.ntel"vlen-en va r ia a e.n:tirrlas} que pa:r'ecen te:n."er tambi6n una funei,6n importanteeD la reeom.h'naci6n gen.6tiea. Este grupo de enz.i rria s , en aedones c cns ecuttvas , remueven los di"meroe de t irnrna junto con urros 20 rru cle 6tidos adya.c antes a. am.bos lados del d{m".roo La brecha dejada en una de las ead enas helieoida.1es del ADN se :resintetiza iuego anadiendo nuc;le.6tl.dos a1 extreme 3' -Ofl Y eTIlplea.ndo como mold .... 1 pol'lrruc.le 6tido cornplenle:ntario inta cto. Po 8 teriortnent e, el ext,,-emo 3'-OH de la l""egi6n reci~n :sintetizada ae une al extrema 5' - PO: del polinue le6tido, 0 riginai (Fig. 8).. Obv;'am.ente., los fag 0 B que contrenen ARN 0 ADN monotenico no podr6.n s er r e.par-ado s po r este rne c ard arno. Fago. o ozno los TZ y TS" aJ. impedir la sfntesis de las enzimas de Is eelula hospedant"e despues de Ia infeed6n, no s e ,·eparan por el Sistema celular p r ovf s to para e ste objeto, pe ro sen c apace s de indu",ir nuevas enz rmae que efectuen una reparaci6n sintilar.

fig. 8. La rePQracion en la oscuridad del da~o causado per 1a lu~ ultravioleta en e 1 AlIN oeurr" en la fOJ'mil repr-e serrt ada , La perc ion superior de la f~ura corresponde a la estructura del d1mero de timina IT. (Cortes:ia de John W.i.ley ~ Sons, Inc.)

Dfl.rERO DE 'nM.INA

1111 'II ,I'=:n:;:

EBZIIIJ. D~ esCIaIOli

@ "I' """'1)[" i j.1!!lLl11IJ..,.

EXOJlUCLlWU3

Ql TTIm ='TIT7IT';

i ~n~ l'OL lIG!P';\$ ~ (7)

(i) J r r-r-r-r-r-t II .. i j I, III r i, t" 41;

i ~1I3DIA LlGAmIU @ • 11111"'1111,1' I·, II 11111, I ~

Las mutaciones obtenidas par il"Tadiaci6n de 105 fagos can !lIZ u , v . pa:recen deberse a II' e e g u la r Ida de s cn 1a s ec u encda resintetizada de rru « cle6tido8 durante este tipo de reparaci6n en Ia o s c u r i da.d: la fotorrea<:t-ivaci6n no conduce a la aparici6n de mutanles, y par esto al murar lagos con u. v, debe tenerse especial cuidado en evitar1a utilizando Iuz raja 0 a:marilla a l c u l t.i v a r 108 fagos irradiados.

21

RADIACI6N IONIZANTE

La acct en letal de los rayos X y Y puede d eb e r s e a La acci6n directa o ,ndit'eeta de l a radiaci6n. El ,,[eato dil'ecto.,,, probable:mente la <:00.sec ue nc i a de ioni2>30ione9 y excitaciones p roductda s par los e l ec tr-one s s ecund ar ros en el fago. £1 efeot;o indi'-I'eato se debe a Ia pr-odu cc i dn de sustancias t6xicas en e I :media, como radicales libres que reaccionan can el raga. El efecto directo e s mas 6tH como medio de estudio de los lagos; para estudiarlo en au s errc i a del efecto indirecto s e pued e irradiar el fago en estado s ec o , 0 en suspension e " que contengan pl"otei"nas, ag entes r educeor e s a ambas cas as, que atrapen las e ust an cf.a s t6lCi.cas antes de que reaccionen can eI fago,

La inactivaci6n debida a 108 efectos directos sigue una einetica exponencial, co:mn 130 obgeTv-ada al ;,radiar con Iu a u , v, La f6Tn'lula que la de scribe e s similar a la de la ecuaci6n (4J, excepto que, como esta radiaci6n e s penetrante, se mide en ionizaciones pOI' clna, a dire, rentia de 1a radiaci6n u, v , que 50! mid., en cua.nto por cm'1. En e et os t~rrninos la ecuaci6n (4) puede s e r expresada en parametros :mas apl"opdad oa , reemplazando 1a s e cc ron eficaz pOI' el volu:men .. fica:.o a sensible (V.l

N N.

[5J

v, e s el volumen bipotetico del fago que al s e r afec ta do po r un a ionizaci6n conduce ala inactivaci6n de este. Al i.gu a.I que l a s ec c'i Sri eficaz, e I volumen 9 ensible c o rr ea ponde a1 valor reclproco de Ia D3". El valor de V, e s , COUlO ,,1 de 0, tambilln dependiente del contenido de acido riuc Ici co del fago [Cu ad r o III, Esto, junto a ot ro s datos experimentales, indica que el efeeto leta1 consiste en una 1e8i6n del acido nucleico; ademas) al igual que iJ, e1 valor de V, tambien depende del tipo de acido nuc Iel c o viral; los virus AnN bitl!nicos son rrren o s s ensibles que los ADN monotem co e 0, ARN, perc en este c aao no hay una explicad6n plausible de e st a s diferencias.

ISOTOPOS RADIACTIVOS

La desintegraci6n de los i s6topos r adtacttvo a meol'porados en e1 b act er Iofag o , como ""P 0 3H, p roduc e un efect c ioactivante. Al in£ectal' bacte rras e ul.ttva.da s en un medio que conte nga ~p como fosfato, los fa g o s sintetb,ados contendr an e l ""P como parte de a lg unos de los enlaces fosfodiester, La fracci6n de e s tc a enlaces formados par "'p s e r a igl.lal a la ra2'on entre fosfato radiactivo y no radi a cttvo (:l<lPO:/~lPQ;'I, 10 que a SCI vez e s p r opo r ctorial a Ia actividad e s pe cffi ca del fosfato en el medic. EI estudio cuantitativo del cornportarniento de los fagos cuyo acido nucleico contiene una fl'acci6n c onocf.da de (l;!p, ha side bastantc eficaz en la explicaci6n del mecanismo Iera l de e ste is6topo y del mecanisme de autoduplicaci6n de algunos fagos.

ZB

Al g:uardar un Jag o que contenga 3ap, s e observa una disminuci6n en e l numero de partlculas i.niecciosas que gua r da relaci6n con e l nume ro de atom05 radiactivos que s e han desintegrado a l ti.ernpo del errs ayo. Al d es tneegr ars e un atomo de :oap se produce la siguiepte reacci6n:

3ap i15 protones + 17 neutrones)

""oS ( 16 P + 16 n) + ~-

Las cau s as de inactivaci6n pueden s er:

a) La alta e,nergi'a cin.!hica del eiectr6n I'l que, al Igua.l que los rayos X 6 Y, p r ov oc a ioni~acioue5 en au c arrrirro :

b i La hansmutaci6n del f6.Coro en azu£r e , "

c) El g o lpe recibido pot" ,,1 polinuc1e6tido al ernitir e I electr6n, comparable at golpe r e c ibrdo al dis par ar una e s c opera de alto calibre. Divers'as pruebas experimenta1es indican que este ultimo efecto e.s e1 c aus ante deL dal'lo letaI, a1 produ ci r una intorr\\pci6n 0 qureb r a del polinucle6tido. La e£iciencia de inactivaci6n pOl' $ap e s )0 veces TTlayor para fagos ADN monot eni coa , y e s ta difereneia parece deberse a que basta una soLa quiebra en estos para inaetivar el fag 0 , mientl'as que en ADN bitl!nico s ez fa neeesario rOrnpll>T a rnb as cadenas helieoidales a una rnl s ma a Iru r-a.,

5

CICLO REPROOUCTIVO: ADSORGION E INYECCION

En e I cap{tulo 2 se d eseribieron las ca.ra ctez rs trc as m~s Hiciltnente observables del crecirniento de los ba<;teri6Iagos y algunas etapas de s u cielo de r ep r od uc ci6n 0 veg .. t a tivo. En e I gdifieo (Fig. 3 \, obtenido del e xp er i rrre nt o en un ca c lo des"rito en .. se ""'prtlllo, se pued e " ob se r va'r dos etapas cLaramente dt s etng utbl e s ; e l pe rfodo latente y Ia Ii s i s . El tiempo de a ds e r-ct Sn del fago a Ia bacteria no "5M r e p r-c s e nba d c en .. 1 gd; fi co, pucs la titulaci6n cOTTlenz6 s610 despues de 110 infee ei6n. Como 5 e r e cc r da r a , I a adso.-ci6n 5 e r ea Ii aa c on las bac.terias can centradas y ta titulaci6n 5610 comienza de s pue s de la inactivaci6n con antis ue r o de los Cagos no adsorbidos y de Ia posterior dt l u ci ein del ou l tav o , En est e capitulo a na.Li.zsa r-e rrro s 109 proct!lSOS mas i mpo r ta nre s que tienen Iuga r durante .. I cicIo de reproducci6n de los baeteri6Iagos.

ADSORC16N

La adsorci6n 0 fijaci6n del [ago a 1 a bacteria se pu ed e d e rno at r a'r

iacilmenta mediante I a cbs ervaci6n a l m.ic r-o scopic electr6nico (Fig. 9) 29

de las bacteriae in£ectadas. Esta tecnica s e ha usado vent ajos ame nte

en e1 examen detallado de las e st r uct ur a e inherentes a 1a ad s o r ci on,

perO tiene La de sv ent aja de no permitir el estudio euantihtivo 0 110 dn';-

tica de este proc;e 60. La cin.,§tica de adsorci6n puede, en earnbro , c ornprobars e :midiendo e l n':'me!"o de (agos no ad s o r bjd oe a distintos inter-

valos de tiempo d e s pu e s de agregarlos al cu lt rvc de b act e r+a s ,

Se han d e s c r if o v a r-i a s tlknicas pa!"a medir la cu anrfa de la adsorei6n.

Una de las mas us ad a s consiste en titular e1 nUTnero de {agos en el 50- brenadante, despu6s de una centrifugaci6n di(erencial que sedimenta los Ia gc s adsorbidos a las bacterias. La. cin~tica de 1 a adsorci6ncorresponde a una reacci6n de primer orden:

P 1

tog,o 15: = T3 kNt . ,

donde P e s el nlllnero de part{culas no ad s o r b i.d a e a l cabo del tie:mpo t" Po el Dum e r-o de Ia.go s iniciale6, N 1a eoncentraci6n de las bacterias, t el Hempo transcurrido despues de mezclar fagos y bacterias, y k la con stante de 1a velocidad de adsorci6n. Al ignal que en La reacci6n fag 0- anti s lie r 0, s e podz fa .. spe rar una cin~tic a. de s egu.ndo orden porq ue participan dos partrculas d.istintas. Sin ernbar g o , como e1 numero de sitios ext st enre s en 1a bacteria a los cuales puede e1 fago a d s o rbeTse .. 8 ·muy grande. este 1"eactante s e e n cu e.nt r a casi siempre en exc es o y por 10 tanto Ia velocidad de la r-ea ccf dn 6610 e sta lirnitada par el nomero de ragos no adsorbidos. Esta condiei6n Ocurre au n c uarrdo s e rrre z c l a una ea.ntidad mayor de fago s que de bacterias debido a que cada bacteria c:ontiene varia" dentos de s it i o.s de adso:rci6n ..

El nurnero de fagos ad s o rb ido s pOl' bacteria" s e denorrrina muz-tipZi<:!idad de infecci6n. [m, i. ), y s e "mplaa acm qu e e1 valor s e a menor que uno. Corno Be calcula a partir de va Io r-e a obtenidos en una poblaci6n ~\!.!!l!}O ,~e .fag os ad s o r b i.d os . e s 1:,lQ valor promedio y en realidad , el

I numero de bacterias J "

ruirrie r o de faRos adsorbidos par cada bacteria c s bet e r o g erieo. La ads o r ci dn de los £ag03 por bacterias de una rm s rna c epa pr es enre s en una rrrue s t r a s610 esta lirnitada po r e l mimer o de coHaianes ete cttvas entre e.Il a s l' e l £ago; como e ara.s co H ai c ne s ocurren a 1 a,zar, La fracci6n Bn/B de bacteria. qu a han ad s o r b ielo , a chocado efectivamente, c cn ri Iag os , "egulTan la distribuci6n encontrada pOl' Poisson para fen6ITlenos est adi'stica111ente s i rru Lar-e s ,

( 7]

S" B 'I n. Iue r on definidos 'la, F.d.IB es Ia multipHddad de in£ecci6n, a sea que F ••• f B corr eaponden al niirne ro de fagos ad s o r-brdo s y al nilme r o de ba ct.e r i aa po r volumen de cu ltj vo , r ee pe ctavarnent c. Cuando Be d e s ea c al cular l a fracci6n de b act e r Ia s no mfectadas (Bo/B),

(Fd.IB)"

--,..-.-,-

e s 19ual a 1 y e l ca1c:ulo s e reduce a

30

[ 8]

Al infect". con rrr, 'i , = 1, e 1 37% aproximadam"nte de las bacterias no hab r an adsorbido Iag o s : con m. i, = 5, s610 un 0,70/0 de las bacterias no s e r an infectadas, y con In,i. = 10eateporcentajedisrninuiraa 0,0045%.

La cons ta.nte de la ..,elocidad de ads<>rct6n, ioE, depende de 13 especie de fago, de la bac te r ra aenarb Ie empleada y de Ia s condiciones arnbl en ta le a, como fue r za ionica, pH, composici6n salina y temperatura. Las condicione 5 ambienta lea r equc rrdas para una ad s o r ct o n 6ptima dependen de Ia eSp e c l e de lagos 'I bacterias sen s rb le s ernp leada s , El mecanismo y Ia s ecuencia de los eventos que conducen a una adsorci6n irreversiL>le del fago a Ia bacteria son todavfa os cu r o s ; s e s ab e , s in embargo, que la acis o r c irin corrs i.st e prillcipahnente en interacciones de Upo electrostatico entre e l ernent o s e at r'u ctu r al.e s presentee en la super fide del fago ~. de la bacteria. Los e Ie rn czrbo a pre e errte a en l a bacteria s e concc en como sitios receptol'es y estangeneralrnente situados en las capas mas ext e rnas de la pared Io r rnada s pOl' lipoprote!nas y Ii popo li s ac ar-idos , que en illpmas e s pe ci e s ba ct e r i.ana s han sido aislados l' anaH",ados qufrnrc arne nte , No todos los sitios r ec epto r e a s e enc uentz aa en 10. pared de 1a bacteria, pue s algunos fag os, como el X, se adsorben solarnente al flagelo, y otros, un grupo de fagos ARN, se adsorben S olamante a un tipo de fimbriae 0 pi Zi pr e sente 8610 en bacterias E. "ali F+. El tipo de inmumdad mas f"ccuente en las bacterias e s el pr ovo cado poria auaen csa o modi£icaci6n de los sitios receptor e s, El 6rgano de adsorci6n de los fagos est;i ubicado en Ia cola; los que no pcs een cola poseen generalmente pequeno s apenclices llamados esp.(cu'l.aa, q u e probablemente ejercen las Func i orre s de los 6rganos presentes en 1 a cola de los primeros.

Dcbido a que la lUli6n rago-sHio receptor as altaTTlente e s pe cfIt ca , Ia infecci6n por bacteri6fagos se usa corrienternente para Ia identificaci6n de diversas especies bacterianas con prop6sitos taxon6micos y epidemiol6gicos. Algunos de los lagos de Salmonel-la typhi, par ejempIa, son utUes para este objeto por que son especrficos para las c c pa s que poseen ,,1 antrgeno Vi, un antigeno de superficie que as cara.cter(stico de las cepas virulentas.

La. cel"la bacteriana no pa r ec c tomar parte activa en 1" ad so r ci dn, ya que 1" mayorra de los £agos se adsorben trreversiblemcnte en presencia de KCN, que inhibe pr-o ce s oa Uletab6licos ce Iula r e s , 0 en a us en eta de metabolitos esencialea para c I creciTniento de las bacte r i a s , y aun m~g, SOn capaces de adsorbers e a Ir a gro cnto s de Ill. pared ce lwla r ,

IN"YEGGI6N

El fago, una v ez, adsorbido a la celula ba ct e rf ana , introduce en ella el material que transporta la inlor=aci6n rre c e s aj-La para Ill. s(ntesis de s u propia progenie. La identificaci6n lograda en 1952 del ADN c orno el componente viral tny e ct ado en Ill. celuia ata ca da , sugiri6 que "I ADN era 61 compuesto clave de Ill. continuidad hereditaria de lOB vt r us 'I c ondujo a la aceptaci6n de el como la bas e {{si.ca de La h e r e.nca a en Loa s e r es 9uperiores. El experimento decisivo fue reali"ado par H. Hershey y M. Chase,(S) y bas ic amente conslsti6 eo deterIninar que cornponent e s

vir ales penetraban en e1 interior de La celula y cu al e s per rrranec fan Iu e r a J 1

de e l.l a adheridos ala e upe r Ii ct e, Para este experimento Hershey y

ChaSe emplearon e I bacteri6(ago T2, que Be ad so r-be mediante au cola

{Fig. 9i. Ra ao na r on que 01 material quo no penetra en Ill. c"':h,la y que

per rna.ne ce unfdo a la ba.cteria, podrfa s e r ehminado por una agHa.ci6n violenta; aUn. mas, "i este :material no e s requerido Iu e go de Ill. in'lccci6n

las oa,cterias dobre r an s e r ca.pa.c e s de p r oduc i r pa rtfcutas in£ecc1osas

des pue s de au eliIninaci6n. Para detectar los distintos c omponentes

Fig. 9. E1 fago T2 se une a la pa~ed de 8. coli mediante SU cola e inyecta e L ADN poe ccrrtr-acc Idn de la va ina . La linea representa 1 000 A.

32

"irales, estoe Be" rrra r e ac c n' infectando can TZ bacterias sen sabIe s cultivadas en o n :media que conteni'a los radiois6topos "'"p 6 3'S. El <l<lp p r e s en ee en e1 media, se incorpora en e 1 ADN; el asS, en cambia, s e incarpora en los arrrtnoa ctdc s e ul.fu.ea doa de las p r ot efnae (:metionina y cisterna). Las partlculas de Lago T2, obtenidas al cu1- tivar1as en 001 medio con ""P, tenlan e ntonces su ADN radiactivo, rrri errt ra s que las cultivadas en un =oodio con ""s po s efan radiactivas sus protei'nas, Estos fagoB, una v e.z purificados para eli:rninar contanrinantea radiactivos de origeo celular, Be utilizaron s eparadaulentoo para inIectar di£erentes al{cuotas de un cultivo de E. coli. DespueB de transcurri.do un corto ticmpo, que permitiera 1a adsorci6n de 1a mayori'a de los (agos, las bacteria" infectadas fueron separadas del {ago no adsorbido sedhnent,{ndolas a baja v el c cd.d ad en una centr:l£uga. Las c.Uulas in! e ctadas fu er on r e slispendidas en medi 0 ere s co y, post 00 rio rrnellt e, s ornetf.da s a Ia agitaci6n provocada pOl' una licua.dora, similar a las de usa dOlnestico, para desprender 105 co:mponentes vt r a Ie s adsorbidos a la pared de la bacteria. Despue s de este tratarniento s e 'midi6la aob r evida de los centros in£ecciosos, y lueg 0, despues de centrifugar las celulas a baja voolocidad, s e determin6 l a fracci6n de $S 6 ""P desprendid a , contando la radiactividad que pertnaneci'aenelsobrenadante. Los resultados de est e experiu".nto (Fig. ]O)nmestranque con una a.gitaci6n s ufici ent e para des pr ender 75 al 80% del 38 S (prot ei'n as ), s 610 s e de sprendi6 20 al 350/, del ""P (ADN) del Iago y que en estas condiciones las b act e r ta s inCectadas pen:nanecieron In alt e i-ada s en au capacidad para producir pa.rtrcllias infecciosas. El distinto co rnpo r-t arrn ent o de los co:rnponentes rrra r-c ado e con ""S y ""'P pern'ritio concluir que el ADN entra en la bacteria al iniciar .. e 190 infecci6n, en tanto que 1 a, ·rnayor{a de las protei'nas pe r-mane cen en el exterior, Esta. canclusi6n permiti6 inferir que e s el ADN e1 e au s ant e de la srntesis posterior de las part1culas 0, en ot r a s pa.Iab r a s , 001 tJ:ansrnisor de las caracteristicas heredltarias.

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T1-J>O d. ~_id .. Fi~. 10. £Xperimento de Hershey y Chase, Ordenada: Porcenta4e de3'S y <l<lp que se desprende de 1 .. bacteria infectada can T2 marcado con uno de los de s is6topos radiactivos y porcentaje de celulas infectadas que sobreviven. como centros inf'ecciosos. Abscisa: Tioompo de agitacion de las bacterias en 1a Lf c ue.do r-a , (Cor'tesia de The Rockefeller University Pr'ess.)

La prueba mas concluyente sob r e est a inIerencia s e obtuvo, sin eUlbargo, va r Io s anos despues, allograrse la i.nducci6n de una progenle notmal infectando las b a cte r ra.s con el iciclo nucleico del (ago libre de protelnas. Para logl'ar inIec ci6n en e st a s condiciones lue, e s o sl, nec es axi c utili2'al' bacterias desprovi~tas total tpratoplaeioe} 0 pa r ci a.l-. :mente (esfel'QPZasws) de 1a pared, 0 bacterias euya pared c s t u'vi.e r-e danad a de tal rrran e r-a que pernJitiera el paso de mol<'iculas de gran tamann, COUlO las d e ADN viral.

El Ulee arri s rno de Ia inyec c i6n del acido nue 1 eic 0 e s e s cas arnente entendido. En 105 primeros lagos en que Be estudi6, como el T l Y T4, que estan provistos de cola, s e vic que el ADN pas a desde Ia c abe z a del Iag o al interior de la CiBula Ilospedante a t:raves de 1a cola, que acrda a modo de c or r edor . La cola deestosIagostieneunaenzima (lisozima), que hldroliza Ia capa r{gida de ta pared bacteriana, Y aSl pe r mrte el pas o del ADN po r el attio hidrolizado, La cola pose e adema s una c a pa externa 0 varna fornlada de una protei'na contractU, .ifniLa,. a una de las que forman el teji.do mus cul a r de o rg a n i s rnoa aupe r-io r ea j Ia cont r acc izin de esta vaina acaso impela e 1 ADN desde la cab ez a del fago al interior de 130 cia«la a 10 largo de la cola, en fo r-rn a 9i111il",. a La acci6n de una jeringa, de ah{ que s e llame COlnUnIllente a e at e pr o c e s o "inyecci6nll, Esta inye cci6n e s a<in rrreno s entendida en los fagos que no poseen cola, y quizaa, en e at e c a s o , el termino empleado no e s ",1 mih a p ro ptado,

Cuando la multipli,cidad de infecci6n con lagos que contienen lisozi'rna es muy alta, e1 nurnero de sitios hidroUzados en Ia pared puede ser tan grande que provoque una lisis eapontanea de Las bacterias. Este fen6meno se denomi.na UsiB desde afuera; paradiBtinguirlo de} normalmente ob s ervado a I final del delo r-e pr oduct ivo.

33

6

CICLO REPRODUCTIVO: PERIODO DE ECLIPSEt MADU RACI6N Y LISIS

D~~ .. ej"I?"'r.rodo 1atente, 0 Sea. _cl intervalo de tiernpo ccmpr endrdo entr e Ia adsorci6n irrever sible y 13 aparici6n de las prime:t"a.s partr"ulas infecciosas extra" ",lula):es, 101 !"ido nudeico del £ago debe de "eneadenar una e e cuencfa de. ev.entos que .Ilroducirtin Cinahnente las partlc-ula~ in:f-;;;~i09a; de l~ progenie. J:1urante]a fracci6n de e s t e per;odo en que .. 1 fago no 108 infeccio50 S <';. d.~Ornina fago veqetiatriuo , y 101 lapso, dur-a ntc 101 cua.l nc s e encuentran pa r efcu la s infecciosas en el i n t e , ::lor d~_"a cclu~ s e d~!,ornil.'a_R"-,,ro~_s> c!~'d~c~ip8e. Durante e a fe perfOdo 101 acido nuclei Co d';;iia:-ii,Q indue',: J ... slntesis de nu'evas protetnas' en La bacteria, r~:!, c ua l es conducen a La sfntesis de 109 c ornpon enee s v-i r-a Le.e y a l posterior ensa=b13je de estos para formal' los Ia.go s infecciosoll. La s acu;~';'ia y rOB mecanisTnos de estos eventos cOflstitllyen uno de los aspectos mas !asCinantes de la biologi'a m.olecular.

Durante la biosrntesis de los componentes vhales J 1a celula at a c ada

sirve de fuente de energfa y adem!s provee la. lIlayo rfa. de los preeu.r- 35

sores y 1 .. rnaquinaria para La srnt e sis de las lTlacromoleculas vi r al es ,

La sfntesis de esta~ macrolnoleculas r equre r-e dertos caITlbios en la maquinaria:--~'-"rrnahnente de~tina.da a 1a [0l"TT).aci6n de 109 com.ponentes celiilares. Tales-'C·a.:mbios s e producen par 1a lnducci6n de nuevas en-

zi~as 0 de elementos estructurales que a c ttia.n ert sitios clave del s l s t e rrra ,

SlNTESlS.DE PROTEINAS

~..!.~g,os est,!'ln [ormados por protefnaa, ausentes en la bacteria no i_nfectada, qu..e, se 8in,~~tizan de spues de la in!ecci6n a partir de arrrinoacid9s. Este he ch o fue m.e.ncionado ya en re1aci6n con Ia au s enc i a de antfgenos co rrruzre s al rago y a 1 a bact e ria atacada. Una prueba :m.lis directa que ~sta s e obtuvo posteriorntente con distintos fagos, utilizando is6topos radiadivos. Los £agos obtenidos a1 infectar bacterias cuyas protei"nas han sido rnareadas previamente con arrunoa crdos l4C, no pt·esentan radiactividad una v ez purificados. En cambia, los fagos obtenidos al infect ... r b a ct e r aa e cultivadao en presencia de aminoac:idos r adta ctivos muestran una r adt actavf d ad especffica cor respondiente a 1 a exi st errt e en e1 medio, 10 que indica que las proterna.s viral .. " s e sintetizan a partir d e arninoacidos, (7)

Las propiedades .d e las protei"nas estructural e s de los _fagos rio dependen'de la bacteria hospedante, sino del acido nucleico del £ago. La pl'l.l"eb"a "ITUlS eDnvincerit,;; de este hecho radica en que lOS pos Ib l c ITlodificar las propiedades de estas protelnas, tratando e1 fago con agentes rnueag erric o s que alteren la secuencia de las bases en e) acido nuc1elco. Para cornprender xnejor esta cuesti6n, e s necesario conocer algunas etapa!! fundam.entales del mecanismo de La bioslnteeis de las prote{nas.

La figura 11 e s un dt ag r arna de la bioslntesis de p"l'ote'nas. La inforrna.ci6n para con~trL>ir 1 a protei'na e s trans<:rita desdeuna delas <:adenas heli<:oidales del ADN al ARN mensajero y, pos eer tor menre , tr aducida en La secuencia de arninoacidos por 1a acci6n de los ribosomas, del ARN de trans!erencia (tARN) y de v ar-Las cnzima", La in!orTnaci6n cUrada en el ARN, en tripletes, ITIediante un sistemade cuatro si'mbolos [a.d ern.na , uracilo, guanina y cHosina), sa traduce en la secuencia de arr>inoacidos de las proternas con un codigo de 20 sitnbolos (los 20 arninoacidosl por la acci6n del tARN, q ue act6a de jnterprete. .Pav a cste e Eec t.o , cada tARN posee dos funciones, una que Le permite reconocer un amino~cido especlfico 0, exacta:mente, gel' 1'e<:onocido par la ollzilna que 10 une 0 ca r g a con el arninoa cido , y otra pas a ree 0- nocer las tres bases contenidas en el triplete 0 codon que especifica e1 anUnotLcido que debe e e-r afl.adido.

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36

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Fig. 11. La informacion para construir la proteina es tI'al1serita desde el ADN .. 1 ARN meos"1"<'o y, pos"te<,io<'mente, 'tl"aducida en la secuene ia de aminoae idos en 10s ribosom .. s , (Col"'t .. "la de Harper I> Row, Publishel'S, Inc.)

El saber que son necesarios tz e s nucle6tidos para deter rrun az un arnrno acado en La secuencia del polipeptido, pe r rrri.t e c a Ic u.l a r apvoxrmadamente c I n.:imero de protein a" que es capaz de aintetizar un virus, que tel1g a un aciclo nuclei co de tarriano conoc Ido, en La b acte ri a infe ct a d a, Como para deterrrtina;r un a'rrri n oe c'Ld o s e ... equieren tres nucle6tido&, para determinar la secuencia de una prote1na de regular t arrrano - -de alrodedor de 300 arninoacido9 - - So requeriran 900 nucleoti.do9 (3 x 300) del ARN mensajero, equiva1entea a 90'0 pares de nucle6tidos en e1 ADN biteruco. Co:mo e1 AnN del fago T 2 tiene uri peso molecular de 120 l( lOS dalton e s y el peao 'molecular promedio de los nucle6tidos .. 5 apl'oxi1nada.rnente 300, Be puede caleular el n(i'mero de pares de nucle6tidos en este ADN:

120 )( lOB _ 2)<. 10"

300 x 2 -

y como 900 pares de nucle6tidos especifica.n una pl'otei'na de regular tarn ano, e 1 ADN del rago T2. pod""a especHicar a1radedor de 200 nuevas

prote(nas 2. :oJct en 13 bacteria i..nfectada. En caTll.bio, 109 fagos ARN

que poseenun <icido nuc l ed co de 1, 1 x lOs da Ito rre s , conti en en 3 000 nu-

l 1 x 10"

c1e6tidos ( 300 ). Corno e 1 acido nucleico de e sto s Cagos es mono-

t~nico y actua como ARN 'mensajero, son necesarios t r e s nucle6tidos y no tres p a re s de llucle6tidos para ""pe cificar llJl arninoaddo; 1)01" 10 tanto, los 3 000 nucl,,6tidos le podrian pern1itir sintetizar apr oxt ruadam enre 3

protei'nas (~). Es p r e ct s o s ub ra ya r 'rue estos datos SOn apr oximados; 1.:. principal Iu e nt e de error esta en .. uponer que las j>l"oternas especificadas pOl' los lago$ contienen un pro:medio de '300 arninoiiciilos y qu" todo ,,1 acido nu c l e i c o viral es lItilizado como rno lde 0 matriz para La, sfutcsis proteica. No obstante, 108 e<11cu10s indicados sugieren que el mirn e'r o de nuevos pr o ce s os inducidos por el vi r us es mucbo mayo>: con los lagos que contienen Wl acicio nueleico relati ... arnellte grande. La complejidad, pOl' 10 tanto, de.l proceso de re.prcducd6n piled e variar notablatnente entre distintas especies de fagos.

Deapues de la infecCi6n ocur r en v: a rfo s cambios en Ia rnaquinaria c cru la r de la slntesis de pr orefna s , que de s vi'an su ': Ifn ea de producci6n" ha ci a I a smtesis de las protefnas requeridas para Ia multiplicaci6n de] £ago. El principal rcquerimiento para .. sto es 1 a, incorporaci6n del ARN rrien s aj e r o viral al sistema sinteUzante de proternas, con lrecuencia acom.pafl.ado del des plazamiento del ARN mensajero baderiano. Las rnodificaciones que provocan estos c ambi o s son bastante 8utiles, de tal rnan er a que Ia rnay cr-fa de los com:ponentes del sistema, como riboso-

mas, tRNA y las varias enztrn.as, pa r e ce r-fan continuar funcionando en el 31

rru s rno estado que ten>"u antes de 1" infecci6n, 561" en e a to s liltilnoS

al\.05 SOl han podido detectar c.i e r t a s modificaciones de: a.l g urro a tRNA,

ribo s orria s y enzilnas que pa r e cen ten .. r (unciones clave en la det e r rrn-

naci6n de las protei'nas sintetiz.adas pOT el sistema, Estas Be analizaran

par separado a I de scribir Ill. ~. eproducci6n de las dt s ttnt as especies de

lagos (capflulos 9 al 12).

La utili:z.aci6n de 1a rnaquinaria bacteriana de slntesis proteica en la construcci6n de las protemas 'vi ra.l e .. ha "ido demostrada en diversas pr ueb as experi'mental"s, La participaci6n de los r tbo s omas bacterianos se adrntt e principalrnente a base del s i.g in e nt e expe ri;mento: s.i se marcan los ribosomas bacterianos antes de la inlecci6n, SOl puede observar que e1 ARN rnens ajexo inducido per el £ago T4 s e asocia a estos, £or:mando los polf s o ma s doude oeur1'e la sintesisproteica. (B) Para dis tinguil" entre los r Ibn s orna e sinteti:z.adoB antes y despulis de la infecc16n, 5 e utiliz6 un ingenioso metodo que consiste en cultivar las ba.ct er i as en un medio que contiene 15N y 13C, Y despuEs de in!ectarlas se transfieren in:mediatamente a un rrredi o que contiene los elelnentos 'mas livianos norrnatrnent e encontrados en la natur e.le za., HN y l."'C. Los :ribosomas &intetizados antes de 1a infecci6n pued en sar as r di s tfngufdo s por au :mayor densidad en un gradiente de CsCl, debido a la presencia de los c{to'mos p e s ad c a. Ade-Jnas de est e experimento, existen var i os otros indicios que indic an La 'partici paci6n, no s 610 de 108 ribo somas, sino t.arnbt en de c aat todos 105 componentes ba cee rlanos de l.a rnaqutnar ta de sLntesig proteica, en 1a producci6n de las protefuas "';'1"a1es, Por ejemplo: a) los mutantes de baderias c apac e s de sintetizar protefnas a 28"C, pero no a 40' C, son incapaces de reproducir iagos a 40" C pero 10 hacen normal=ente a 2B" C: b) al combinar ",in vitro" los distintos componentes

bacterianoeque pa rui ci.pan en 180 sfnte st s de protelnas y aGregar ARN mensajero viral, es po s ib l e de tect.a.r la smtesis de a Ig una s p rot efnae vir a. 1 ... ,.

Las distintas protei'nas inducidae por el Eago no s e sintetizan en [0,1'ma simultanea, ni en cantid.ades equimolec-ulares (igual ndmer o de moHkulas): 'hay un e£iciente rn.ecanisma de regulaci6n, tanto de las ecuencia en el t.i ernpo co rrro d.e Ia c antd dad en que s e sinteti.>lan diversa; c'la ses de protemss., El ba c te ri6fago T4, por ejemplo, sintetiza ensecuencia a I menos cuaer e c Ia.e e s de p rot efnas : apena.e inida.da la infec ci6n, se puede detectar Ia il1ducCi6n de varia s prote(nas; la sihte sis de ~st as es poste,riormente inhibida y reemplazada por Ia de una nueva <:lase {o;nna,da por protei'nas dUerente s , y e st e c lelo s e repite varias ve c e s , El

bacteri6fago f2 es un buen ejernpl o de Ia regulaci6n de Ia cantidad de

proteIna.., sintet1zada.,; es te fago - debe sintetizar una de las -prote{nas estructurales en rnuc ha mayor c antfdad que otra que fun.ciona como enzima. Se requi er e 180 mo16C\llas de la prot",rnae ",truetura} P01;" par tfcula madura; en cambio, bastan una's poe,,"s ",,0Iec1)la8 de Ia enz;ma pal"a satis'facer Io s requerhnientos durante la dnpl;caci6n. Los rrie c anismo" causantes de 1a reg\llaci6n, tanto temporal c orno cuantitativa, aunque can a lguna s caracter(sticas· generales, son distintos para diversag "species de £agos y por 10 tanto s e describiran en los ca.pi'tulos post "dores.

38

SlNTESIS DE ACIDO NUCLEICO

L .. bioslntesis del acido uucleico viral reql;liere una fl;lente de e.nerg,a, as! CQn10 precur so r e s de bajo pes 0 molec-ular, ribonucle6tidos 0 deox;rdbonucle6tidos para ARN 0 ADN, respectivamente, Y la -maquinaria sintetizadora propiamente tal. Experimentos de diversa mdoh- han establecido c la r amerree que los fagos dependen de la bacteria hospedante en cuarito a 1 sumiru st ro de las auburride.de s r equez-Ida s para la s{ntesis del polinucle6tido. Cualquier rrrut ant e de una bacteria. que requiera, algiln nucle6aido, sera incapaz de sinteti1.ar el acido nuclei co Viral, a rnen os que el nucle6sido sea6uTninis t r ado a las bacterias infectadas. Algunos rag os que contrenen bases r ar a s , como el T4,son, sin embargo, capac ea de inducir las =,,;;mas necesarias para la srntesis de elias. EI fago T4 induce una hidroxhnetilaaa dCMP (dCMP '" deoxicitidinn ""0- nofo afato] que hid1'oxila e1 dCMP normalmente encontrado en la bacteria. para dar al dHCMP (dHCMP eo deoxihidro:ticitidina mono[osfato) que posteriormente se incorporara a s u ADN. Algunos fagos, entre e110s el 1'4, nO s610 utUizan los nucle6tidos sjntetizados de s pues de la in£e~· d6n sino tamhien loe; presentee en e I ADN bacteria-no; C0l1e6te objeto, hidrolizan extensamente e l ADN ba.cte r ia no en nuc1e6tidos que son u aadoa postet'iormente en Ia s{ntesis del ADN viral;' Ia eituaci6n enc ont r ada var,a eegUn Ia espect e de Iago,

La s,ntesis del acido nucleico con st s te .m La for ma ct on de un

po Ii nu c) e6tido c On una sec: uencia dete r rnj nada , Lo s pr e cn r so r e s in-

medi.atos del acido nucleico s on los nucle6sid05 - 5' -trifosfato que s on hidrolizadoe durante la formad6n del po Ituuc Ie ctado , lib'erando prr ofoafato. La s ecueneia en que los nucle6tidosse un en es especiIicada por el acido nucleico viral, que actUa como rno ld.e , Las enzima5 que

catalizan e see proceso han sido identificadas en algunas especies de ragos y SU acci6n s e dt s cutf r d en caprtulos posteriores. La slntesi.s del acido .nucleieo viral rro t e r-rrn.n a con la poliInerizaci6n, sino que rnu cha s vee e s se requiere la acci6n de otras enzimas para producir un aeido nucleicO identico a I del bacteri6Cago. Por ejemplo, e1 ADN de los Cagos T pares debe ser glucosilado y metilado; el ADN monot~oico del fago M13 debe unirs .. en sus ext r erno s para formar una ITlol ecula circular, como Ia encontrada en las part.i'c,,"las m.aduras.

A continuaci6n s e muestra un esquema de las di s ttnt as etapas discuHdas de la biosi'ntesis del /icido nucleico viral.

NUCLEOsIDOS MONOFOSFATO I NUCLEOSIDOS TRJFOSFATO I

POLINUCLE6TIDO DE SECUENCIA IGUAL AL MOLDE I

AClDa NUCLEICO VIRAL

DUPLIGACI6N DE ADN BITENICO

La estructura del ADN bit~nico se di5 cut16 previamente. La rapida aceptaci6n del modelo de Watson y Crick para la estructura del ADN, Se debi6 en parte a que este suger!a un modo simple y plausible de duplicaci6n. Watson y Crick postularon qu e la duplicaci6n del ADN implicarfa la separaci6n de las cadenas helicoidales y La lormaci6n de polinucle6- Hdos complementarios s o b r e ca.da cadena helicoidal a eparada (Fig. 12). El rompirniento de los puentes de bidr6geno entre las bas e s , necesario para Ia separaci6n de las cadenas heHcoldales, puede no requerir enz rrrra s , ya que esta uni6n, aunque altarnente especifica, e s relativarnente

debil. Una ve z separadas las cade- Parental Parenta.l

na.s helicoidales, s us bases pu.e-d e n formal' puentes de hidr6geno con las bases de los nucLe6tidos que vall forrrra ndo las nuevas cadena s, ordcnando en e8ta forma una secuencia complementaria.

Para probar 111. hip6tesis del mecanismo de dupiicaci6n meociona.do, M. Me s s al aon y F. W. Stahl (1958)(91 cultivaron bacterias en un rnedro can l6N1:4 Cl y luego las trans!lrieron a uno coo 14.NH,. Cl. Deapu~s de diatintos lap- 50S de incubaci6n en el medio con loON, 5 e ext r ajo al ADN y s e ana.liz6 por centrifugaci6n a equilibria en un g1:"adiante de CaCl. Inmediatam.ente despues de la. transfer encia, s e encontr6 el ADN en una banda "pesada" con III. dellsidad correspondiente a1 ADN que conteni"a. lEN. Despues de una genera.-

39

ParWl~ Hij.. Hi~" Paoro"t<OJ. fig. 12. Duplicaci6n del ADN. (Cortesia de WoA. Benjamin, Inc.)

ci6n, 0 sea, despues de que 1a c ant i d ad de ADN se habra. duplicado, el ADN seditnentaba fortnando una banda con densidad inter:nedia entre 1a dell.5N-ADN y l·N_ADN. De s pue s de dOB g en e r a c+one s aparecla una banda "liviana" de densidad igua.l a La del 14N-ADN y aUn pe rmane cfa Ill. banda de densidad interrnedia. EBtos resu1tadoli eran exactamente lOll e e pe r ad os de acuerdo can 1a hip6tesis de duplicaci6n mostrada en forma. esquernatica en la ugura 13. Se conoc e can el nornb r e de dup'l-ioaaidn oemic:!011servativa porque s610 s e co n s e r va una cadena helicoidal de 1a d.oble helice parental en Ia TnoHicula hi ja, Aunque esto e resultados £uer on tambHln interpretados corno el productode ot:ros ·modos de duplicaci6n no semiconservativos, otras pruebas e.xp ez-i rnerita le a co r r-obo r-an de man era Ie hadente La expli ca ct 6n dada en Ia figu r a 13. EB te me canis rna de duplicaci6n de ADN bitenico es g errez af , s e han obtenido r e s u'lt ado e sinrila.res en celulas de c la.rrrid ornona a y anima l es , Y por supuesto ta=bien en 108 hacteri6£agos. De acuerdo can esta hip6tesis, a1 infectar can bacteri6fagos cuyo ADN es "pesado" (15N -AnN), a.1gunos de Ia p rog erti.e debieran cont ene r mo1~c u1a s II h1h ridas", fo~··m.adal! par una cadenahelic oidal "peElada" del ADN

parental y W1a "liviana" sintetizada en La bacteria infectada. Este tipo de parti'culas es [acilrnente detectable c cn e1 bacted6fago 10. y con ot ro s , pero no con el T4. La excepci6n del T4 no significa que e1 ADN de e see £ago se duplique en forma diferente; en realidad, La ausencia de "rnoleculas de ADN hibrido s e d ebe a que estas se encuentl"an diapersas, Ior·rnando pequenos t r-oz os del ADN en las part1culas de 1a p r o g en.i e, E"ta dispersi6n del ADN es la con aecuenct a de una fragInentaci6n exrens iva que se ha eetablecido cla r arnente analbando la transferencia del ""P del ADN parental de la progenie. Las c au aa s y mecanisrno de e s ta fragmentacl6n no han sido toda v{a expli ca dos , rna B su scan sec uenci as han side dilucidad as en par teo La frag·mentaci6n y reuni6n entre di .. tinta5 ·rnoleculas de ADN as urio de los pr o ce so s de 1 a recotnbinaci6n genetica. La elevada dispersi6n obs ar vada en e1 fago T4 e s consecuente con Ia gran frecuencia de r e corrrbinaci6n t1pica de este.

~ Molecul~ ~%'eDtal

~ orl.g.l.J1al

e 1 ~ gene:rilcion ~ molecula hija

40

fP .~.<j t}

~ ~) r::~ '"! 2g. generaci6n ~ f~ F~ f, molecula hija

Fig. 13. La duplicacioll del ADn ccuer-e en forma semiconservativa. (CortesJ:a de F. W. Stahl.

DUPLICACION DE Acmos NUCLEICOS MONOTENICOS

El descubrirniento de los Iagos que connenenADNoARNtnonotenico present6 un nuevo pz-obteroe en cuauto a 1 ... duplicaci6n del material genetico. A dHerencia de las ·moH~culas bitenicas, [armadas por caderias complementarias, las monotenicas son incapaces de s ervir de molde de au replica. i. C6m.o entonc e s ocurre la duplicaci6n del .icido nucleico de aetos vil"us? ~ Tiene e l meca.nismo semiconservativo alg6n significado a qui", o existe algun rrrec aru arno distinto y nuevo" Adualn"lente e1 proc ee o de duplicaci6n de algunos de estoB lagos, c o rn.o e Le X 174, Sa corroc e can ba stanee detalle. En la.s bacteria.s Inf e cta da s con \bX 174 s e utili"a el ADN del fago como molde para sinteUl<ar una cad ena heli coad al complementaria; en esta Io r-ma , ae Iog ra una molecula bitenica (forma

pepl.icativa) que posteriorlnente s e duplica en fo r-rn a ~ erni.cc ns e rv atfva. La constrllcci6n del ADN lTlOnotenico qlte entl:ara en la progenie del fago, s e logra porIa srntesis aSimetricade ADN (s{ntes"is de una sola c ad e na, helicoidal de la ITIolecuia bitenica) usando como molde Ia c ade na he ltcotdal complemcntaria del ADN del lago presente en Ia forma rcplicativ a bitenica. La duplicaci6nde ADN yARN monotenrco s Be discutira en detalle en los c api'tulo8 10 }' 11, r-us pe ctf varnant a.

MODO DE DUPLICAGION

Es posible imaginal', al 1TIenos, tres rnodoa Q s e c ue n ci a s de d ..,p1icaci61) del rn at .. rial g enetico 0 acido riuc Lc i c o de los Ia go s (Fig. 14)

Fig. 14. La producci6n de los p.:enomes viral,es puede ocurrir de acuerdn can alp.:uno de los modos re~resentados. ~ortesia de John WUey & Sons, Inc.)

a) AUIT1ento par reduplicac:ione s repetidas.

h) Aurnento por duplicaciones s u c e s iv a s del ele:rnento 1nicia1. c) Aumento par duplicaci61l del ultilno ele:rnenio p r ocru cd d o.

41

S. Luria (1951 1,1l<l) r-aaorrando que laposibilidad de .. r ro re s de ccrpi a que ocurren durante la duplicaci6n tendrra consecuencias estadrsticas diierente8 en cada modo de duplicaci6n, diseJ\6 y electu6 varias pruebas experirnentales que pe rrrri te.n di stingui.r ent:- e los t r e s modos e ei'l.al ado e. El supuesto fundamental en la interpretaci6n de e s'to s experimentos e s que elmimero de rnut ante s libcrados pOl' una bacteria infectada d epender a del mimero de errores de copra y del modo de duplicaci6n. En terrrdnos generales, 8i una mutaci6n tiene una probabilidad cons tanre de ocurrir en c ad a dupli ca c irin , e1 nu.mero de mutantes deri v ado s de una mutaci6n depende de 1a secuencia de duplicaci6n. 5i cad a replica se produce independientemente de las otras (Fig. 14 bl, las :diplicas mutadas (circulos 11en08) estar~n dist1"ibuida.s 31 a aa r entre las bacterias inCectadas. Si, en cambia, las replicas pueden a s u vez reproducirse y original" mas replicas, los rnut ant e s , .. , encontl"al"an en grupos a cLones (Fig. 14 a). En resumen, la distribuci6n de la frecuenciade clones que c ont eng an 1, Z, 3, 4 ... ,." rnubant e s , sera distinta para cada secuenda de duplicaci6n (Fig. 15). La prueba experi'menta1 e e obtd e ne contando todos los 'mutantes de a Igrin tipo tacil de dete etar, producidos individualmente po r cada bact e ri a inf ec tada. La di 6t %'ibu ci 6n de Ia 11" ec Il encia enc onrr ade experimentalmente depende del fago estudiado, y sugi:ereque el modo de duplicaci6n del ADN es diferente en distintas especies. La dlstribuci6n encontrada del b act e rt cfa.g c TZ es la esperada de acuerdo con e 1 modo a y, en carnbto , Ia encontrada del ¢X 174 es l a esperada de acuerdo con e1 modo h).

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Z Fig. 15. La distribucion de la frecuencia de clones de mutant .. s 121' permite inf .. rir .. 1 modo de producci6n de los genomas. La ordenada representa el numero Y. de bacterias que producen n. a mas mutantes r. Las lineas s61idas representan la distribucion esperada en cada uno de los tres modos de duplicaci6n del genoma "hal ilustrados en 1<1 f'ill"ura 14. (Cortes~a de S. E.. Luria.)

42 Diferentes exp e.r rme nto s indican que en Ia bacteria existen sitios

e spcci'fico B de duplicaci6n del ADN. E1 nUTTIero de e st o s sitia,s en una rr'lisrna bacteria varra s egun l a e s pecie de (ago en es+uda o , desde uno 0 dos, ha sr a v a r-j a a do c ena s , y diehonumero podrr" ser uno de los £actores determinantes del modo de reproducci6n. El modo a}, por ejemplo, no podr{a oeurri1' en los fagos en los euales e 610 hay uno 0 dos sitios de duplicaci6n. .Estos se encuentran 10calizadoB en 1a membrana y deben contener las enz i rriaa que catalizan la po lf rne rizaci6n de los nucle6. tidos en la s ecuencta d et e r rrrirrad a por el ADN molde.

MADUR.ACrON

.Durante .elperlog.o latente se produeen :multipleseopias ~.e .icido nucleico y de protei'na viraf, form.1ndose en e l interior de las c~l,!,~a.s varios fondos (pool) de los distintos precursores del fago. .b!!:_._I(!q.dUl'"a:cion coris i st e en el ensamblaj.lO. e.IH!Il:o;;{fico de estos compo_nen~"".~). 5.'!!Uetizados pOl' separado para p r odu ci r finalmente 105 Iag o a infeccio.llQ.§. La aparici6n de ":sto" y su aumento en el interior de la e.Hula s e pueden dCtectar antes. a e1.-::conrienz0 de l a Ii'~is. El m;';todo corrienteinente-s.,,, guido con este obj e eo consiste en romper con lisozbna La pared p1'otectora de la bacteria, y d e s pu Ss lisarla con cambios bruscos en la !uerza i6nica del -medio, 0 can deter gentes (Fig. 16).

Durante el proceso de maduraci6n los dj stintos cc rrrporrerrt e a del fago que s e r an ensamblados, s e torrian de los varios rondos ext st ente s para cada componente, sin otro requerimiento aparente que e l poseer la estructura que Ie s co r r e s pond e. Uno de los fen6menos que c cnd ujo

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rig. 16. loa aparici6n y aumento de los fap:os intrace1ulares se puede detectar antes de la lisis del cultivo. E1 numero de fallos intracelu1ares se determina POl' las u:nidades foI'madoras de p1aoas ohtenidas a part:!:r de 1"1 1 isis arl:ific 1<\1 de las bacteri<ls infectacla:s. (Cor-tesia de 1-1.11. freeman and Company. )

a ee ta s apreciacioue .. as .. 1 llan-.ado meeal.a ff!<>U)ptpiaa., que s e pu e d e obs er-va r at inrecear una rrus me bacteria con dosmutantes de T4, di s ttrrtos

en cuauto 11 la espeoiIi.cidad de till. hos ped.ant e, Al anaH,,,,ar Ia p'l"ogenie 43

r eBultant e dee s ta in fee d6n, .. e pued e ob s e rvar, adelTlas de fagos id~n-

ticoa a los infectant'l s , otros que conrtenen genotipo de un rnut ant e )" lenotipo de oer-o : es to s (ago s poseen ADN de un mutante, p e r o las fibras

de la cola Henen La e.S p-e cj Ei cad ad. del ho s pe da.nt e del ot r o,

El ensamblaje parece s e r un pz-o ce s o e s pont aneo , durante e1 cua'l 109 di stintos ccrrrpon e nt e s es tructu r al es d<ll fag 0 Be uneri rnedl ant e '''''laces no covalentes y en Una secuendaordenada. Con algunos [ag06 estructul"almente' simples que coner ene n ARN. ha sido po Bible lograr SU ensamblaje in vit"!'o me2>d:l-ndo el ARN con las protei"nas est r ucru r a-, Ie s en oc n.d'ic i o n.e s ap;ropiadas. E s :mas difi" ci 1 .. magin ar q ue est e pro c,,ao 6 ea esporiean eo en fagos de esrructur a tan corrrpl eja como los 'T par es; para .. 1 co r r e cto errs amblaje del bacteri6fa{lo T4ae I'eq~1i"ren, al menos, 30 fund ones determinadas pOl' eI &ddo nucleico viral. Algunaa et apa s , como Ia uni6n de Ia c ab ez a con lacola, pueden ocurri.r' espontanea=<3nte in vitro; sin embargo, nO puede ser aun d esca r+ada Ia partkipaci6n de algunas enzimas para que 5e verifiquen otr a s et apa.s,

LISlS

El pe r-fodo latente tertnina con Ia lisis de I a s b act e r i as '/ la Hbe r a-

c;6n~de"loa._nuev-o" {agos. En varias £agos s e ha d errrcs t r a dc la a.c c i ori de-'u';a enzima., ca.paz d c de.9integrar lii'pared rigida. de las bacteria" y p rovo cax de e st a Ioz rna Ia lis;s, Estas enz;'mas, siroilares a Ia lisazirna en 6U aeci,6n sobre el mueo;peptido de la pared, s e llarnan lisi>W.B. La lis;" no e s , sin embargo, corrcorra t anee con 1,,- aparici6n de esta enzim,,-, sino que parec e estar controlada por nn sistema complejo, depen-

diente del es tado fisiol6gico de 10. celula. Asr, por ejempfo , ,,1 bloqueo de la producei6n de energra 0 ATP en las celulas inCectadas, enque ya ha apa r e c ido 10. Ii s ina , provoea una It s i s pr ernatu r a,

!i?.!£l.9.o.s .. los,l~go~ p1:0V:9~an La Ii sf s de la bacteria atacad~~lJ~~l del crete r-eproduc ttvo. Los Cagos Cilamentosos como el MIS y ot-ros, so liberan J.} traves de 1a s uperlicie de la bacteria sin previa disrupci6n de esta. Aun mas, una bacteria infectada con e st o s lagos puede s eg ui r r epz-oduct endoe e y formal" colonias de 10' 0 rna;' cHulas sabre una Su-

perfide de agar nutritivo.

CICLO LiTICO Y CICLO LISOGENICO

44

El ci<;lo~9"!_reE.!()d~.<:;.c,i§,~ d.~s:'2:ito .. c~::.re~ponde a l que se <?b§e!Y,a n01.':rnalrnente en los fagos,.que s re rrip r e s e multi,plican c.uando . .in£ectan una bacteria sensible. Hay, sin embargo, algunos fagos llamados [agos tiemperadoe, que no s Lernp r e e e mil It:lplican, sino que, en c ie r ras o c asiones, estabIeeen una si'mbiosis de tipo Inolecul":r. A], infectar una bacteria 5 ensible con estos Jag os , 5U <'icido nueleico puede, en vez de iniciar un cielo lrtico, dupfi ca.r s e en sanc r onf'a con el"cromosoma" bacteriano, s610 una vel. pOl' cada generaci6n de Is bade-ria (Fig. 17)., El

"cromosoma" viral en e s t e .. stado de duplicaci6n conh'olada s e llama

profaqo , y las c.lOlulas que 10 contienen, baotier-iae Zisogeniaa:s'. El pro£ago pued .. e spontanearnente, 0 por inducci6n con diver so s ag ent es , iniciar un delo Utico con Ie. coneiguiente producci6n de partfculas in.!eccro s as y Ia Li s i s de Ia celula. La frecuencia con que esto oeurre en fo r rrra e"pont~ea, ° sea, la fraed6n de las celulas que l i s an en c ada

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fiy,. 17. Loa baet@ri6fa~os temperados pucden seguir un cicIo 11 t ico 0 uno lisog€.nico. (Cortes 1s de t.anK8 Med iea 1 Publications. )

flenerad6n bacteriana varra de 10-a a 10.ofl. Debido a 10. oc u r r en.c'i a de e st.c s cielos H'tiC06, 105 cultivos de ba c te r i.a s lisogenicas contienen fagos 'rraa.du r-c e que pueden provocar la lisis de ot r as bacterias a eris tb Ie s : las ba cte r-ra.a lisog linicas pueden multiplicars enol' rnafrrient e en pres enda do este fago debido a que el p eorago l e s c onf i er e inmunidad.

El r e c orroc i rrd errto de los fagos t ernpe r ado s tuvo una gran tnfl uen ct a en el desarrollo de las tearias 'mas plausible s sabre e1 origen del cancer. Los fagoB temperados s e describen en mas detaile en e1 capilulo 12.

45

7

GENETICAl TIPOS DE MUTANTES Y MUTAC.E:NESIS

Los fa.gos, al igual que todos los organisrnos vivos, s e caract e rf aan por au capacidad de transferir sus propiedades estructurales y Iunctonales a sus des cendientes. La infecci6n viral, par c ons i ari r en la entrada de un fragmento ex6geno de 'material gent;tico en la celula, es de natur al e za esencialmente genetica. Por esta raz6n, 11'1 a.n:i.lisis gen,HieD de los fagos es una parte escncial del estudio de su c ornpc r t arru errto y una de las ramas mas activas de Ia genetiea molecular.

Los elementos a que incumbe la transrnisi6n de los c a ractere.' hereditarios s e d.e.norrrin an ge.,..,. y, c orrio ya se ha indicado, son una parte e specfft ca del ADN de Ia s cHulas y de rnucbo s virus [de oxi r r i bov i r-ue}, 0 del ARN de los vi r u s que contienen este >icido nucleico(ribovirus I. Loa genes s e cnrre e r-va n norrnalrr:tente y s e coplan sin a l t e r a ci on e s , no obstante a lguna.s ve ce s s e producen en e l Io s cambios 0 17Iut.Clcione8 que dan origen a nuevo a tipos 0 mutiantiee , diferentes de los de la cepa original 0 silvestre.

El "cromOaoma" viral cons ta de una 86la mol ecuta de .icido nuc1eico, 41

par 10 cu a l los bacteri6fagos se comportan como or garus mo s hapl odde s ,

a1 igua1 que las bacterias. Hay adernae ot r-a s dHerencias cuantitativas

y cualitativas entre el comporta.miento genetico de los virus y el de los

s er e s aupe r.io r es s como contienen 10 000 a 100 000 ...-aces Inenos ADN

que las celulas hurnana s haploides, as 16gico esperal' un nUIne-ro de g e-

nee proporcionalmente menor; cOInO son ha plo ide s y pos een un ci c lo de reproducci6n peculiar, la c.orrrpl e rne.nt a cl Sn y recornbinaci6n ocurre en

forma sui ge71"l'is. A pesat' de estas diferen~ias, los InecanisInos ba-

ai.c o a d e la genetica de los bacteri6Iago$ tal v ez Bean \guaJea, en 8\.1 .,sencia, a los que operan en s er-e s Bupel'iores.

MUTAGENESIS

Las rnut acf one s son r econocrd as pOl' las modificaciones hereditarias de cte reo s c aractereS estructuralee y funcionales del o rg ani s mo. A ntvel molecular, las muea ctone s constituyen una aiteraci6n en Ia s eeuencia de nuc1e6tidos del genoma (conjunto de genes). Serla muy diCi'eil r e cc - nocer las nwtaciones pOl' e1 an;f.lisis de lag Ia r ga s secuencias de nuele6- Hdo s; sin embargo, en numerosos casos ha sido po sible explicar un carnbfo en las propiedades de U1I faogo, po r una determinada anomali'a en una regi6n espec{fica de su acido nuc led co, Las rnutaciones pueden orig Ina r s e espontaneam.ente a s e r inducidaa pOl' l.a acci6n controlada de diversoa agentee mutagenico$.

La s rnuea cdone a e apont.ane aa produeida8 en Cagoa rnadur os s e deben probablemente a Ia acci6n de mllbigenos a l ernpr e pres entes en ,,1 m.edio ambient e , c omo los rayos c6emicos, Iua u, v., etc.; las producidas en el Iage vegetativo pueden deberse a la presencia de analogos de b as e s ,

como, por ejemplo, cafei'na. Sin ernb a'rg o , ta mayor parte de las mutacione 9 e spontan eas apa r ec rda.s durante I a reproducci6n del Cago, s e d eb en a un apareamienta incorrecto de l a s bases durante Ia duplicaci6n del acido nuclei co. Como s e r e co'r da r a , durante la duplicaci6n del ADN, las dos cadenas parentales s e separan y cada una sirve de rno Ide para Ia "'ntesi s ordenada de un nuevo polinude6Hdo cornpl errreut.ar-i.o. Los mononucle6tidos que forman las nuevas cadenas s e ordenan en las e ecuen ci a.s cornpfe merrta rIaa , par la Iormaci6n de puerrtes de hidr6geno eepeclficos adenina-ti'mi.na y guanina- cito s in a, La uni6n de 9610 e s to a pares mediante puen te s de hidr6geno r e.q ui e r e que las bases estenen una forma tautomo'iricaparticular. En soluci6n, stn emba r go , las bases e st an en equilibria entre distintas formas tauto:mlhicas, en una de las cua Ie s , Ia diferente posici6n del atorno de hidr6geno c onduc e a un apareamiento con otra base; distinta de la habitual. .El equilibrio de las Ior ma.s t aut orrre r-i.c a s eeta nluy desplazado ha ci a e l estado de Ia base corrienternente errc ont r ado , de tal 'maneraque la frecuencia con que apareee Ia forma. <;apaz de r ea Iiz a r un apaream.iento an6malo as rnuy r a r a (Fig. 18). La ocu r r enc i a de un aparearniento inc orr eeto p r oduc i r a £inalmente una moHlcula hija con una s ec ue ncra distinta de La original. Como la f:re"uen<;ia de rrrut.a ci.orre s espont.aneae e s relativaTnente baja, e I 116me r o de rrrutarrte s s e debe aumenta r g e ner a lrrierrte en las pr ueba s expe r irnenta le s utilizando mutag enos . Se pueden induclr las mutaciones tratando e l fago rria.du r o 0 l a baeter la in{ectada can di ve r so s agentes rr· sic o s 0 qulmicos.

48

Las mutaciones pueden ser inducidas en loa lagos rnadu r o a tratando e stos con rayos X, luz u, v., acido nitroso, had r-ox i Ia rru.na , agente"

Oeo>;llol'ioosa

[oj

OeoxiI'ribosa

fig. 18. La especificidad del apareamiento de las bases en e 1 ADN depende de su a stada. tn a) se muestra que no puede ocurrir la union mediante puentes de hidr6geno entre citosina y aden ina a consecuencia de l<l distribucion mas estable de sus atomos de hidror,eno. En b) se muestN com.o e 1 cambio de un atomo de hidrogeno en la molecula de adenina permite la union con cit08ina. La posicion normal del atomo de hidr6~eno esta indicada POl' un pequeno c1rculo de l':inea discontinua. (Cortesia de Bla"kwell Scientific Publications Ltd.]

alquilantes, tales COInO etd Iznet ano sulfonato, etc. La muta.ci6n no se detecta en los £agos tratados, sinoque 13610 se man,ifiesta despues de 1 a, ITIultipLicaci6n delfago afectado. Como un e j ermp l o de una de las distintas fonnas de acci6n de los agentes rnut ag enf c o e , se describe a c:ontinuaci6n el mecanislno de acci6n del :icido nitroso.

Cuando s e trata un [ago con acido nitroso, las bases guanina, cHos in a y adenine. Son d e s arrri n ad a s , La desarnillaci6n de adenina, pOl' eje.mp'lo , que normahnente aparea con timina, produc e la base hipo:xantina capa:ll de formar puentes de hidr6geno con c Ito san a fFig. 19). Asf,

Fip,. 19. La desaminaci5n de adenina a hipo~antina por e1 acido nitroso conduce a 1a uni6n COD citosina en vez de timina. ~ortea!a de Blackwell Scientific Publications Ltd.)

cuando el iago tratado inIect" a una bacteria y 111. cadena aIectada 5 e n s a COInO molde para la construcci6n de 1a cadena cornplementaria, una de

las rnoli!!culas hijas di£erira de 111. normal (Fig. 2.0). La alteraci6n de la 49

fil!:. 20. La desaminaci6n de adenina POl' el ;icido nitroso y su union posterior a citosina produce, despues de Ia dup1icaci6n del genoma, ~a aparici6n de mutantes estables, en que e1 par adenioa-timina ha sido reempla",ad.o po. e1 par guanina-citosina. (CoT'tesia de p,;.entice"all, Inc.)

9 ecuencia s e perpetua cuan.do esta nueva c ad e.na de la nlolecula hija sirve de molde. La bacteria infectada producira Cagos rnuranee s y sf lve atre s, ya que s e copian amb as ca.dena a de la doble heli ce, y una da progenie silvestre y la otra lnutante. Bas;h,.dos e en la £igura 20, el lector pOdl·.! explica:rse par que ua a bacteria in£ectada par un fago ADN rnonotenico alectado en Ia rru.srna forma, 9610 producira mutantes.

Las rnutacionea de los Lagos en ta bacteria i.nfectada pueden s e r provoca da a con loa =;"=08 agentes rrie n c i o na do s en e1 cas 0 de los fagos rrra d-u , r oa , aderna s de ot eo s que a 610 actuan sabre el Iagovegetativo, como los analogos de bases. E1 p r o c e s o es esenciairnente el mismo de s cr-i to a r riba para el acido nitro.o, excepto que 18 acci6n s e ejeree ahara s ob r e las mol!ieu}as de acido nuclei co contenidaa intracelularmente. Los amUogos de base s, como e1 bromouracilo, s610 "fectan 11.1 fago vegetati"oporque eu a c-. cion o cu r r e durante la dup lt ca ci Sn del ADN. £1 atorno de brom.o, en e s ta base, conduce a un estado de ... quilibrio en que ambas formas tautom6ricas s e en cue ntz an en propo:rci6n Similar. Una, 1a forma con un grupo cet6nico, puede fonnar puentes de hidr6geno Con ademna, la ot:ra can guanina; as(, el b r orrrouz aca.Io s e puede mcorporar tanto en lugar de ti~ min.a como de citoaina. y, una vez incorporado, complemental' coo adenina 0 guanina, aumen"taMo en eeta foma la freuuenc1.G con que 06 producen alteracioneo de cop1.a.

50

Los c arnbfo s p r od.uc i do e pOl' 10$ divers os agentes rrmtag€nicos no s i.eznp r e conducen al reemplazo de un par de nucle6tido a par otro; en rea.lidad e l efecto de au ac ci6n puede Sel' rnucbo mas diverso y alectar a mae de un par de nuc1e6tidoe. Segw. la extensi6n de la secuenci ... aiectada, las rnuta c.ione s pu ed err e e r pu ntu a.l e s 0 de otro tipo. La s >m<taCioM8 puntualeo son cambios que aIectan a un solo par de nucle6tidos y pueden con.hti:r en, al e~ l"eemptaao de un par de nucle6tidoe po r otro dife:rente, bj la inaerc~on de un par de nuele6tidos extra, y c) 18 "del:ecion" 0 perdida de un par de nucle6tidos. El reernplazo en una regi6n que especifica una proterna puede cambial' 001 significado del triplete t:ranscrito, de tal rrran ex a que ,,1 ARN lTJensajero especifique un a.nlinoacido distinto del originalmente p:res ente. £1 carnb io del amlno actdo en 111. prote{na puede producir una molecula no Iuncional o inestable, 0 eatados intermedips de arnbas forma .. , El ree.rnpla21o puede tambi'n convertir al triplete en un ooddn sin lIentido 0 incap"z de "specificar cualquier axninoacido; durante 1a s{"tesia del poJ.:ip6prido, este cod6n, 11.1 no s e r t r adu crdo , pr-ovo c a.r a la tertni.naci6n prematura del polipeptido producH,ndoee una. proteina incomple\<l..

La ineerci6n 0 "del.eci.6n" de un par de nucle6tidos s e puede Jog r-a r po r tratamiento de Iae bacterias infeda.daa con acridina; e at.a a rrmtacionee producen general:mente genes no funcionales. E1 estudio de los recoznbinantea entre mutaute s de este tipo del bacteri6fago T4 iodic6 que el c6digo gen6tico s e lee en grupos de trea nucle6tidos,{·1) La pr educci6n de g ene s no func{onales par insercl.6n 0 .. deleci6n" s e explica en la siguiente forma: durante la slntes;5 de protefnas 111. traducd6n del c6digo genetico c orrri en aa en un lugar e specfiico del ARN rnene aje r o; sl 1 a secuencia normal de un gene e s ATTAGACAC •• ,' se lee en grupos de a tres como ATT - AGA • CAC ., • , la in s .. rci6n de un nuc le6tido produce una secue.ncia ATTCAGACAC . ,. y condue e anna lectura de los signi",ntes grupo!) ATT - CAG - ACA - C ••• , can un significado totahnente distinto 11.1 ante-rior.

Entre las mutadones que afectan a. mas de un pa.r de nucl,,6tido9, las rnaa.ee;tudiadas sonlaa11delecionesl'. Los lTlutantes con'ldeleciones'l de va r los nucle6tidoa s e caracterizan por tener una frecuencla muy baja de 1'!l'IMI"SWn (retorno a Las propiedades anteriores de Ia mutaci6n).

TIPOS DE MUTANTES

5610 a.lg una s rnodificaciones de las caracterrsticas estructurales 0 luncionales de los fag os , provocadas po r una rnutaci6n, son apropiadas par a e s tudios genetic 0 B. Las pri'rne ra B e-l as e 5 de rriut a nt e 5 obeeru da.s s e di.stingulan del 6po silvest1· e por el t arriano y la apa1'"iencia de las p l a c a s de lisis 0 par 1a c apa crd ad de inCec:tar distintas cepas de b act e r i a s, A l a primer a cla.s e pertenecen los mutanteB de tipo de pl.aca ; y a Ia Begunda, Los mutant .. s de rango de hoepedanbe ;

Los rnut ant.e s de rango de hospedante (h, po r ejernplo T2h\ s e pueden obtener fa.cihn.ente ais lando prirnero un rnut ant e de la bacteria resistente al fago silvestre, y lueg o, un mutante del Cago ca paz de infectar La bacteria resistel"te pz-evrarrrent e a rs Iada, Estos :mutant e s s e pueden distinguir del tipo s i Ive stre, titulando en agar en c apa que contenga una rnez c'la de ambo S: ttpo s deb a<;teri as; los mutante S: de rang 0 de hos pedante s e distinsuen facH-mente por produci r pheas de li.sis claras, dt stintas de las pr o ducdd as por los Iago s s'i Iv e st r-es , que son turbias d .. bido a1 c r ect.mi.ento de las bacterias resistentes. Las diforeneias entre e I Cago silvestre y los rnut anre s de rang o de hospedante 0 lOB de tipo de p la ea s e deben a propiedades fisiol6g;cas 0 e structurales dife r enee s , Los mLltaut"" de tipo de placa, c orrro los d enorn i na.d os r paraT2 y T4 (T2r, por ej emplo), producen una !isis rapida y debido a e sta propiedad forman placas mas g ra nde a que las del tipo sHvestre, En los mutantes h SO' alteran las pratei'nas de las fibras de ta cola, causantes de Ia ad s o r ci Sn. En la c e pa

bacteriana resistenteal{ago silvestre (po r ejernplo 1? ooti B/2, .. "5;5- 51

tent .. a l £ago T2) s e a l te r-a algun componenre de los sitios r e c e pt c r-e s ,

E 1 analis;s genetico de los Iagos se limi t6 por varies a1l.0.9 a ul105 pucos ca ra ete r e s, COIUO los men cionados ante ri.o rmente, Un a va 11 ce s .gni fi caUvo, que permite probab lemente e l e s tudio de todo .. 109 genes e s enct.a Ie s del {ago, fue el deacubrilniento de los mutantes tetatee aondiciooole8. Estos son mutant e s que puedencrec e renciertas condiciones, ormdioion pemi8iva. pero que, debido a Ia mutaoi6n, no se pueden propagar bajo otras condiciones experimentales deIinidas, condicion reetI'icti1Ja. Los dos tipos de mutantes letales condicionales maa frecuentemente empleados BOn los Inutantes termo 5 ensibles y los supre s i b Ie s , Los termosenBibles 0 te, son aquellos en que Ia rnutaci6n altera cualquier gene esencial, de tal man e ra que su produdo e s for mado y perman e c e estable a te'mperatlaas b aj as (par eJemplo, ZS· C), pero e s ineBtabLe a t ernpel"aturas =as a!tas (par ejem.plo, 42' C). As{ pues, ~st08 mutantea se tnultiplicarall a 28· C, pero no a 42° C.

Los mutantes eupreeibl.ee o s up.r es Or-S ensibles (GU8) t arnbi en s e 11aman'mutantes dependientes del hospedante, porque pueden c r ec er en un tipo de bacteria Hamada:; permisivaa (810) pe r o no en ot.r a s llarnadas no pemisil.laa (su-). Los mutantes r II del bacteri6fago T2 son un ti.po especial de rrrut ant e a supresibles, que seran anali2;ado$ en mas detalle poarer i or rnente. Las mutacione s supreslble 6 mas generales SOn las conocidas eOInO a'mbar, ocre y 6palo. Plleden a f"ctar a cualquier gene e sencda l para la r e.pz-odu ccf dn , de tal manera Que irnposibilitan al £ago para inducil" algun a de las p rot efn as ea enc i a.l es para suduplicaci6n. La bacteria permisiva habUita 1a duplicacl6n de e s to s rnut ante s par que pued .. suprinrir e1 efecto de e st aa ·mutaciones. Estudios geneticos indican

que estos mutant.es s e originan pOl' el cambia de un codon, que normalmente es pe cifrc a un aminoacido, po r otro que no tiene sentido ° significado en 1 a maqutnazia eelular responsable de I .. bioslntesis de p:rotei'nas. La (alta de significado de estas codones se debe a Ia auseneia del ARN de transferencia necesario para BU tradueci6n. La supresi6n de es tas mutac ion e SSe deb e a qu e hay en Ia b acte ri a s u pr e sora un ARN de transferenda capaz de traduci:r el cod6n sin sentido en el arninoa cido origiJlalmente presente en la proteIna, 0 en algUn otr o que permita obtener una pr ot efn a funcional. La elase de mutaeiones llamada ambar (am) co r r es » ponde a aquellas que producen el cod6n sin sentida UAG en el ARN menaaje ro , y pueden s er suprimidas 11.1 menos pOl' tres c epa.s supresoras (tm (J)1I) distintall, capace s de traducir UAG, COmo senna, glutamina a tirosina cuyos codone s normales 80n, respectivamente, UCG, CAG y UAUo UAC. Las muta.cdone s oc r e (oe) p rodu ce n e l t r ipfete sin s ent ido UM, que puede Set suprimido pOl' otro conjunto de supresores llamados $U 00. Fina1rnente, las muta cione s 6palo lop} producen e1 triplete UGA. El analisis genetico Y fisio16gico de estos mut ant es 81<S, especialmente los :bnbar y oc r e , ha sido una de las r arnas mas efi ca ces en la bio1og Ia molecular.

52

8

OB:NETICAl RECOMIlINAClON, COMPLEMENTACION. MODIFlCACIOW LNDUClDA POR EL HOSPEDANTE

RECOMB INAC ION

Cuando s e infecta una bacteria sensible can dos mutanre s distintos de un rni srno Iago, los cromosomas de estos s e pueden recombinar en el interior <:Ie Ia bacteria. LOB recombinantes pueden ser detectados en e l lisado po t: la apa cl c icn de nuevas tipos de £agos que no estaban p r esentes en la mezc1a inicial, y que poseen cornbtna ctones de los ca ra cteres de los padres. Para. c ornp .. erid e r mejo .. e l fen6meno de r ecornbrnacion e s necesario cono ce r a lguna s car-acte rfati ca s de la inIecci6n COn Una me ac la de mutantes ,

Como ya se menciono a l tZ'atar de la adsord6n, una bacteria pued e adao rbe r va rtas pa.r tfculas al s er inCectada can una multipliddad de in["ccion elevada. Iguatmente puec e r epr-oduct r s e en Ia bacteria infectada

mas de Una pa etfcu la , Si tod oa los Iag os iniectantas son iguaies, Sa 3

trata de infeccidn mu.Uip"Le; s i son distintos, de in!eaoion ",i.3:ta. Para 5

obtener una in£eccion mixta es necesario agregar al cul trvo ambos f a go s

al miamo tiempo, ya que uno s po co s minutes de ctiferencia en la inIec-

ci6n entre el .primer y segundo mutante, puede causa .. la exclusion del segundo. La exclusion es un f e nomeno poco entendido y s e obs e rva mas d·rarnat:icamente con Iagos no r e lact onados , Can estos) a un en infecci6n simultinea, s e obs e rva un tipo de interfel'enata caracterizada por la exclusion completa de uno de los rag os .

Un c r uce entre fa g os consist", en Ia inIecei6n mixta con dos tipos relacicnados , a los cua les s e 1e9 permite un s610 ci c lc de cr eci mi ento . Como s e debe uea r una multiplicidad de infecci6n elevada (5 a 10) para que uno 0 mas fa g o s de cada dase s e adsorba a una misma bacteria, s e obtiene practicarnente un solo cf cl o , ya qlle, al finalizar /';ste, todas las bacterias s e lisan. Los resultados de un c r uc e s e exp.r e s an en forma cuantitatlva como frecuenda de recar:oilUlci6l1. 0 sea la fr ac - ci6n de recombinantes en e1 total de fagoB de 1a pr-og eni e, Por ejernp'Im en el Cruce TZhr- X TZh+r (el signa + indica Ia forma s i.Ive s tr e) s e obtend ran en Ia prog.enie los tipos parenta.les y los r ecornbdna.nte s Tlh' r" y TZh r. 5i e l Hs ado obtenido s e titula en agar en capa que contenga una mezcla. de E. coli. B sensible a los £agos h+ y h, Y E. coli B/Z, sensible solo a lOB que ti.enen e I caracter h, se obtend..a.n cuatro tipos de p la ca s : turbta a chicas, correspondiente9 a l fagosilvestre TZh· r +; turbias grandes, at T2h+r: claras chicas a l T2hr"'", y claras g randes a1 T2hr. EI mirne r o de pia-cas turbias chic a a mas las claras grandes, dividido par e l total deplacas observadas, i ndi ca.ra la !recuencia de recombinaci6n. Generaimente, eeta df .. a se multiplica por 100 para expr es a r lOB valores de frecuencia de recombinaci6n po r 100 fagos de la progenie.

EI analisis cua rrti ea Hvo de los c r uc es entre rrru tarrte s ha s Ielo urio de los medios mas eficaces en e1 estudio de Ia organizaci6n del mate rial genetico. En condiciones nor ma h zadas , Ia f r e cucn ci a de recombinaci6n 8610 depende de 1.0 naturaleza de lOB ma r cadc r e s geneticos p r e s eute s en los lagos pa r-anta Ies ,

Los resultados obtenidos mediante cruces entre un mutant .. h y d i s » tintoe mutantes rid, r7 y r13), pe r rrrrm e r on interpretar es tas investigaciones en terminos de la genetica clisica. Los genes, s "gun es ta. interpr eta ci 6n, es tan ordenad as Iinealm e nte , y po r 10 tanto una In uta ci6n de elIoe debe estar situada en un lugar particular 0 locus de esta es truetura lineal. La recombinad6n entre 109 mutantes hr " y h+r puede ser entonces entendida como un intereambio de pa r eua hom.610gas entre los g e noma e de los [agos (Fig. 21). Este interea:mbio se Cree que oeurr .. por un entrecruzamiento ("crossover") en eualquier parte comprendida

h r' h r h
X
h' h' r' h' r-
Fig. :11. La recombinaci6n en ragas Se puede rep""-
"ental" como e1 en~l"ecruzamiento de dos eromosornas. 54

entre los loci (plural de l.ocus) rrrutado s . La probabiUdad de que OcUrra un entreerllzamiento de dos wei da doa , d e.pende rji de 10. dis tan cia entre los loci, a ligam<m.to. Mientras mas cercanos esten los dos loci, menor seroi 10. probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento cn algun lugar cornp r endi do entre e11os, y por 10 tanto, sera taInbien meno r la £rec:uencia de reeombinaei6n de los loci en cues ttcn , Podemo" ahara expfi ca r las distintas frecuencias de r e cornb ina cdtin entre T2 h y T2r I, TZ ,1'7 Y TZr 13 (veae e Cuadra UI) como La c on s ecuencia de la distin!.a posicion de los

Cuadro III

Rec omb iaac ldn en el Baeteri.6fago TZ

Cruce
Freeuencia de recombinaci6n h )( rj3 h x ,1'7 h X ,1'1
1% de recombinanteB}
1,7 13,3 24 Zoci mutados en los fagos Tlr. Las distintas seeuencias s eiialadas abaj o son compatibles Con los resultados indicados en la tabla

I) r I h
2) h r13 r7
I 1 I
3) rl3 h r7
4) rl ,1'13 rl3

r7

h

r7

La irecuencia de r ecornbtnacl cn obt en ida de otros cruces entre e s ros mutantes permitio eliminar las alternativas 3 y 4 a I demostrar que 1,'7 esta mas cerca de rl3 que de h; en un c r uc e r 13 x r7 la p e opo r c i Sn de recombinantes r" eS rnenor que la p r cpo r ctcin c e recombinantes h+r+producidas en el cruce h x 1'7. EllectoT atento podrla ahora pos tula .. que e l c ru c e r 7 X 1'1 permite decidir entre las alternativas I y 2: s i 1& alternativa j eS la correcta, la frecuencia de r" obtenida en este c ruc e debe s er mayor que Ia frecuencia de h+ r+ obtenida en el c r uc e h ~ r , Sin embargo, para insatisfacci6n del lector atento, la irecLlencia de r: (15')'0) obtenida en el cru ce 1'7 X r I e s igual a la frecuencia de hOr+ en el cr uce h x r I. La mejor interpretacion que se pudo dar de es te res ultado inesperado, f\le que el tocus r l no esta ligado a h nt a r7, sino que esta situado en un grupo de Itgarnento disanto. En otras pa Iab r as , e1 bacteri6£ago TZ tendra a1 menos Z c zorno aorna s , 1 y U.

1 rl

11

h

rJ3

x7

De a cuerdo con e s ta hip6tes is, la ex ec uencia del 5% de r e com binantea tipo sllv.,strc, 0 de 30% de ambos tipos de r e combtnantes complem enta r Io 5 .( r+ y r 7, 1 en ,,1 c rue e x 7 :~ r 1) repr es enta la probabilidad rnaxilna de recombinad.6n genetica.. 0, en ot r a s pa1ab r a s , el inter cambio de dos loc·i geneticol> presentes encromosomas distintoB ocur r e con

una freeuencia de 300/0. Aunque relativamente convencional, esta inter- 55

pretacion e8 incor recta, pues investigaciones posteriores con mayor numero de m.utantes derrlOstraron que 108 genes estan ligados, 0 sea presentes en Un misrno cromosoma, y que genet; muy distantee s e com-

portan c orrro s i no estuvieran ligados. POl' ej eznp lo , s e puede demostrar

que r I y r7 estan ligados probando que r esta ligado a un marcador hipo-

tetico "a", este a s u v ez ligado a "bOO y lib" ligado a r7.

ht6

c h rl3

1'7

rl

u htl I III ht4 htB

La distanda en los rna pa s geneticos se expresa en !'midades de mapa. Esf.a unidad COr responde a 1a dis tancia que s e pa r a do s Looi: que producen recombinantes con una frecuencia del 10/0. EI Il1apa del T4 confi ene genes s epa r ados poz ha s ta varios cientos de unidades de -mapa, <>6to no significa, sin embargo, que e I c cuc e entre dos mutantes cuyosloci esbin muy disf.ante,. produzca recombina.ntes en una proporcion correspondiente a las unidades de mapa que los separen. Como ya a e ha mencionado, cuando Ia distancia entre los genes e s relativatnente grande, estos s e cornpo r tan como si no estuvieran ligados. Teoricamente, ai s e e£ectUa el cruce entre dos mutantes TZh+ r 1 y T2h r+, s e puede imagina.r que ae tiene una mezda de cuatro marcadores en Ia bacteria infectada: h", h, r" y rl: si estos 9 e d i e tr ib uyen 0 segregan independientemente, Ia. pl'oporcion ell que apa r e ce r an todas la.s po sibles combinaciones (hO r I, hr", h+r" y hr II sera Ia encontrada a I combinar 108 dis tintos rna.r ca do r es al azar, 0 sea 25'70 para cada Una. La frecuencia de recombinaci6n esperada de genes no l1gados es po r 10 tanto 50'70. i, POl' que .. ntonc .. S 1a frecuencia obse rvada es de s610 30%? Antes de contestar es ta pregunta es conveniente rrren.ci ona r otros problemas r eferentes a Ia re combfna ct Sn

g en eit'i c a obs ervada en 105 bacteri6fagos. Uno de eUos es la intel'f6I'6nala negativa 0 la tendencia a que ocurra una alta caincidencia de evenros de recombinaci6n entre genes eer canos • Otro e s 130 depend,mcia de la j'recuencia de l"'eccmrbi1lantes de la "ta6a de ecl.osion.; 301 c ompa ra r la £.I:ecuenc ia de recombin3oeion obtenida allisar prematuramente las bacterias (cuando solo s e han pr cductdo unos pecos fagos por bacteria) con la frecuencia de lisados normal e s, s e puede obs e .ev a.r- que 130 primera es mucho menor. POl'- ej ernp lo, en e l c r ue e T2h~r· X T2h r 13, la frecuencia de ;r"combinaei6n aUl'nenta d" 0,01% en lisados p rerria tu.e oa , a 0,1% en lis ados no zrrta l e s , con una ta s a de ecl08ion de 400 a 500. Estas obs e r va ct onee y loa problemas de interpretacion que presentan fueron considerad08 e ingeniosamente explicados par N. Visconti y M. Delbruck en 130 teori'a que Hava sus nombr es . (1.)

La bas e del desarrollo de la te o r fa Visconti-DelbrUc:k r actt ca en considerar el c ru ce de ragos como un experimento can una poblaci6n de genomas, en v e z de un cruce en e1 s enri do cl;isico, como se ha subentendido ha s ta ahara. A diferencia de 10 que Ocurre en e1 apareamiento de una drosonla. <nacho con o t r a h errtb e a , en la bacteria in!ectada pueden ocurrir rnucha s interacciones 0 apareatnientos repetidos entre los genomas de los fagos pres entes en una b!lcteria rnf'e e ta da., Teniendo estas c on s i d.a r-a cbone s en c uenta, vi~ co n ti. y Delbriick pud ie r on e s tablecer una formula qu" reladona 130 proporci6n de recombinantes observada exp e « rimentalrnente (X,.) can 130 dis tancia en el mapa g enetico (P), en otras pa Iab r a s , Ia probabilidad de recornbinaci6n entre dos g e.norna s en un apa r earru ento individual.

56

X.s = ZABftl2(I-e-·f")

[ 9J

Donde A Y B son las Lr e cu eric ia s r e Iata va s de los ragas in!ectant"B a y b (A + B ,. 1) Y 11' f ~,'II Y F son fadores de correccion que pued en s e r calculado~ a partir de los datos experirnentales. Para c orrrp r end e r mejor 06 ta teorla, e I lector pued e c ons u lta r la bibUograffa pertinenteo (12, 13) Solo s e pretendi6 destacar que 1a frecuencia de recombinaci6n obtenida expe ri m enta.Irne nte n e ceS ita S e r cc r r egida pa r a poue l' iden tifica ria can la dis tan cia en un mapa genetico,considerando las particularidades del c e uc e entre fagos.

Gracias al aurn ento del numero de rna r cado r e s geneticos "studiados, Be fue conociendo con Inas detail!) el mapa genetico de va r Ia e especies de fag o , Una nueva ca r a cter Is ttca del mapa genetico descubierta en el bacterio£ago T4 s e e ncontr6 posteriormente en oeros [agos; a medida que s e iu" ron e s tudrandc maread ores mas distantes entre S I, s e encontr6 que 108 que debieran e s ta r en extremos opuestos del mapa y pOl' Lo tanto debieran c orrrpo r fa r s e como no-ligados, rrio s traban frecuencias de r e corrrbj.na c irin rn.eno e e a que 30'1'0. La. rri ej o r- interpretacion de est" ha.Ifaz.g o £"e que el mapa genetico del T4 era ciI'(JulaI', hecho que ha s tdo posteriorm.ente contirmado por resultados obtenidos en mnum erable~ cruces. Otros fagosen los c ua Ie s s e han encontrado ma pa s genetieo" circulares son los que et enen ADN rnono eenl co, c orno e l $X 174. Los bacteri6£agos \ y T7 po s ee n mapa s lineales. El total de unidades conteniuaa en un mapa refleja e I tarnafio de la molecula de ADN 0 "erorn os orna ", El baoteriofago T4 que contiene un ADN de J 2.0 X 106 dalto~

nes mues tea un mapa gen.hico de va r i oa c i e nto s de unidades; en cambia el ~:x 174, cuyo ADN es de ',(, X lOs daltones, muestra. u n mapa de solo 24 uni dad e s . E1 lector nota ra probablemente que no a e ha hecho refer enc ia a Ia r eccrnbtne ctdn eo lagos ARN. La ra",On es muy s irnp le 1W 8e ha deteotado recombinaci6n gemi t.ioa en e8t08 fago .. , aunq ue e s ta exi s - te en los vi.us anfma l es con ARN monotenico,

ESTROCTURA lflNA DEL GENE

En Ia s eccion pr ec ed ente se descdbio la fo r-rrra c n <jue e I analisis <I e los cruces permite c rd ena r los genes en una s e c ue nc i a detertninada, ya sea lineal 0 circular. Los e s tudi o s cuantitativos de recomi>inacion, a d emas do per,nitil' ,,1 o rd en arru en to de 106 genes en un rnapa, permiten es tudta r Ia estructura fina del gene, Este tipo de estudio 10 r e a lil!;o S. Benzel' (1957j(14) utilizando los Tllutantes rIl de los lagos T pares. Sa des cribiran con c i er to detalle las propiedades de e s t o s mutant" 5 ya que fueron de gran hnportAncia tanto en Ia factibilidad de las p r ueba s experimental"s como en la int"rpretacion de este estudio, Los rrau ta n « tes I'll 5 e cultivan sabre 8. coli B y dan placas de lisis grandes, trpi_· cas del (enatipo t": "demas, son tuutantes letales co ndi.e l ona.Lee s up r e » sibles po r .. I hospedante, por<jue s on i.n ca.pa c ea de rnultiplicars e en cua.Iq'ui.e r- ccpa deE. coli lisogenica para el fago ). (E. coli (J..)), Los rrnrta.n ta s rIl a i s la do s independienteITlente eat:!:n pOl' Io g"neral m uta do s en sitios d if e r en te s , a sea, a I infectar E. coli B can una mezcla de do s

rnutantes dl s e observa la apa r-icion de r e.cornb inan te s , Una de la s ven- 51

tajlL~ d~e.st e sistema os Ia gran senaibilidad can que s e detectan los recornbinantes r " (uno entre IOe parti'culas 1'1, debido a que 8610 los fa·

gas r+ pued e n r ep r od uc i r s e y dar pta ca s de lisis a1 t it.ula r la pr og eni e

s ob r e E. coli (),,). En es ta forma resulta facil detectar la l.recuencia de recom.binacion, aun en niveles muy baj os , determinando el numerO de recombinantes 1'+ en E. oot« PJ y e l total de pa r tfcu.la s de La progenie

en E. coli B.

Benzel' ha ai a tad e y contruido e l mapa de mas de 3 000 rnutance s puneua les I'll, y de e s ta manera d e te r rrrrnd .. 1 mapa mas detallado ha s ta 1a fecha de la regi6n de un genorna. Hab r fa sido imposible r-ea Hza r es ta Ia.bor c r uaand o todos 105 mutanres entre si', pue s si a e hubiera in· tentado en esta forma aun s e estarfa haciendo cruces pues ello requerirla va r i os millones de tales c r uc os . Un ingenioso m";todo hrzo factible es te an.ilisis; algunos de los mueante s rll de T4 contienen"deleciones", cuya longitud gene:!!ica puede medirse determinando los distintos lnutan~ tel> puntuales con los cua le s no dan r ec ornbf na.nte s r", En esta (oruela ElS po s Ib l e dividir La region r11 en segmentos, definidos par la extension del rnapa abarcado po r una "deleci6n" pa r ti cu ta l', pe ec no par Ot1'2S (Fig. 22),

Cr uz.ando cada mutante I'll call va r i as " deleciones" como las senaiadas en la fig'ura 22 era facil entonces asig"a de una ubicaci6n a.p r ox.irrra.da en el rna pa. La ubicaci6n rna s pl' ecrs a s e log raba po 5t ... ri or mente, c ruzando en· tre sf Los mutantes asignados a una misrna region. Experirnentos utilizando mutantes con deleciones permitieron a B enz e r demostral' que "I mapa genetiao de Za region rII ee estrictamente l.ineal sin 1'a1>Iae_(1.6) E 1 analiBis fino can los 3 000 rnuta n te s pel'miti6 in£el'ir que e l nUITlero de .. itios rrruta »

h. a..""M-Mtilol- w.M :_ •• '-1,11;,

BUTeiltu

.-PTI .-PB~42 .-AIOS ~Q.1S

58

fig. 22. La re~i6n rII se puede subdividir en segmentos par medio de "deleciones" . Primer plano' Mapa r,enetico del fago Til. Segundo plano: S iete "d .. lec Icnes to clef Inen siete segmentos de 1a "egion I'll. (Cortesia de Scientific America>!. J

b l e s e s semejante al nume r o de pares de nucle6tidos, y que la recomhinaci6npadr(a ocurrir entre sitios tan cercanos como d o s pares de nucle6tidOB a dy a ce n te s , Los cakulos que perIniten hacer estas dos Ultimas in£erenciassebaBanenlaextenai6nde Ia regi6n rII y e l n(unera de muranee s dife rent.,s, capa.ces de r e cornb ina r , c orrip r errd i do a en e s ta regi6n. Corrro .. I s egrnento dl abarca 2."/, del g enorna del fago y este, 0 sea, el ADN, tiene un peso molecular de lZO x lOS daltones, la region rII ten-

, 120 X 10s )( l -

tra 100 '" l, 4 l( 10'" daltones. Como el pe8omoiecular prome-

dio de un par de nucleotidos eS 600, La region rn contendrla 2, 466J r:f3-;

'" 4 000 pares de bases. De acue rdo can este calculo, el mim e r o de mutante s ca.pa c es de recombi.nars e entre s 1 compr endidos en es ta region [a.Ie euedo r de 3 000) es 8 emejante (el lectOr puede vo lv e r a leer las dOB inIerencias m enc ioriada s ) .

MECANISMOS DE LA R.ECOMBINACI6N

La rec:ombinac:ion s e -ha repre.5entado f(sicarnente ,,610 par extrapolacion de la genetica claslca, COTnO el intercaTnbio de partes homologas par e nt r e c r uzamiento de d os c.r-orrroa orria s , e s ta co r r es po nde r fa a l intarcarnbio de t r oao s entre doe c r orno e orrra s por q ui eb r-a y reuniOn posterior. En e s ta seedon sa pres entan las pruebas experimentales que permiten c orrc Icd r- que e s t e proceso e s la causa, a l m.enos en parte, de 1a r e cornbtna ci Sn genetica; una de las cons e cue nc ia s de es te pr oc eso serra Ia c eat ruc ct Sn de la integridad fIsk". de 105 c r orrros orna s par erita.Ies . En la s e ccton sob r e I,. dup lt ca ci dn de ADN bitenteo, se m en-. ciano que el ADN parental del ba c te r i.Sfa g o TZ apa r ecfa dis per sado en el ADN de Ia p r og eni e; y que probablemente e s to s e debla a all alta tr e cuencta de recombinaci6n. Can e I 'bacteri6fago )_, en cambia, no s e observ6 e s te f e n6mena; la dispersion can ,_ es mucho rrieno r que la ob-. servada can Tl 6 T4 y po r 10 tanto pasara de.sa pe r-ctbrda en un experirn enco que no sea di" enado COn e s te ° hj eta. Fa ra pl' oba r la exis tencia de quieb ra y reunion y au po s l b l.e relaci6n con recombinantes, Mes s e l s on y J. Weigle(la) realiza.ron e l siguiente experimento; E:. aol.i cultivada en uri rnedio normal a e infect6 con c"rni+ II pes a d o!' (que contenla l~C y 15N en vez de l>lC y l4N) Y c rnt "liviano" (que contenla laC y 14N). La progenie de es te c r u c e , que conten!a 1,50/0 de r e cornbf nant.es c"mi y

c rrri" (los rrruba.nbe s c y rn], a e pue.den diatinguir par La apariencia de Ia s

p la ca s de i i s i s } fue anaU"ada por centrifugacii'in a eq ui lib rio en Ca Ct, que s epara las part{culas de acuerdo con s u d en s id ad , La distribuci6n de los tipos par enta tes y recombinantes en el gradiente de densidad a e obtuvo titulando en agar eo capa. En 1a progenie s e observaron tres cotnponentes con el genotipo parental c" rrri" originalme.nte pesad,o: a 1 uri componente de menor d ens ldad y en rna yo r p r opor-c icin, que representa pa r tfc'ul.a s formadas po r ADN y protelnas sintetili!:adas durantela dupli" caeiiSn del fago en el medIo normal, 0 sea, conteniendo =c y 14N; b) un componente de densidad intermedia, que co r r e.s ponele a las pa r tfc ula s e s pe r ada s par La dupfi c a.c ion semieonservativa del ADNparentai y cuyo ADN contiene una cadena helicoidal parental pesada, y c) un componente mas d ezi s o , que tiene la. densidad de las pa r tfc ula s que s610 contienen ADN p e s ado , originado pOlO la utilizadon de ADN parental no duplicado en e l orra arrib Ia j e de algunaspartfculas de la progenie. Los genotipos reeombinantes c" mi s e encuentran distribuidos en forma s errreja nte , La aparici6n de r ecornbina.ntes con don s idad s irnilar a Ia 5 d 05 ba ndas rna s pe s ad a s indica que estos contienen algo deL ADN parental pes ado. La presencia de ADN originalmente ,,'" mi+ en los r ecombinantes c" rrri , BUgiere que l.a recombinaci6n oc u r e e p o r- quiebra y r-e.ura i Sri , Estos exporimentos, sin etnbargo, no descartan la posibilidad deque junto a1 mecanismo de quiebra y reuntdn puedan existi r otro~.

Forque y como ocur r e La quiebra y reuni6n de los c r orrioe orna s son

dos incogl).itas de gran actuaHdad e i rnpo r tan cta . 5e ha ava.nzado rela- 59

tivamente poco en este problema y solo e e tiene una vision bastante restringida de e s te proceso. Se han Iog r a.do mutantes de ba cue r Ia s , en

las cua Ie s algunas especies de fagos son rnca.pa ce s de recombinar; e1 estudio de e a to s mutantes ha permitido identifiear algunas de las fun-

ciones bacterianas necesarias para Is ocur r-encia de la recomblnaci6n.

La union. entre dos fragn'lentos de ADN requerir(a primero la Io r rna cf Sn

de puentes de hidrogeno entre s eeuencias ccrnp lernenra r ias I pa ra ser

unidos posteriormente en forma covalente por enlaces fosfodiester. Algunos fagos, como loa T pares y J.., deterrninan sus propias en:>.lmas

para Ia realizs.ci6n de e s t.e p r oe e s o y par 10 tanto son, a diferencia de

otros, lndependientes de la capacidad de Is. bacteria para llevar a cabo

Ia recombinaci6n genetics.

COMPLEMENTACION

Como ya s e ha mencionado, Los mutantes "ll del £ago T4 son incapaces de proliferar en E. coli (~J. Sin embargo, cuando s e infecta E. coZiP .. ) con una rrraz c'la de T4rlI y T4r+ e s posible observar la producci6n de mutantes rrI en proporciones similares al tipo silvestre. El tipo silvestre e s entonces capaz de supUr la funci6n necesaria no 5610 para s u propio crecimiento en E. ool.i , sino tarrrbi en para e1 del mutanteo Basado en e s ta s observacionea Benzer disen6 una prueba de aomplementaci6n;(t?) en e s ce ensayo E. coli (~J es i.nfectada con un par de rnuta.nee s rH, con ,,1 objeto de probar s u capacidad de cooperar en la produccion de pz-og ent e infeeciosa. 5i el par de rnutantes e s capaz de cornpiementarse puede concluirse que ambas rrruta cf one s afectan a distintas unidades funcionalGBo En e {ecto, 109 mutante5 rl1 pudi e r on dividirs .. en e s ta forma en dos g rupos funciona1es deno:rninado8 A y 13; 108

rnuta nte s del g r upo A s e complementan con los del .6, pero no s e cornpt erne ata n entre s{. Un par de mutariees de diferente grupo e s capaz de r ep r oduc i r s e en m ez c la porque uno suple Ia funcian es enci at en la cua.l e 1 otro eS deficiente. 'I'od os los mutant es d e l g r upo A c onti enen mutaciones q"e s e ubican en una region determmada del gene rIl, los del grupo B s e ubi ca n en una regi6n inmediatamente adyacente; de acuerdo con ea tos resultados la region ril Be pue d e dividir en do s r e.g i one s 0 ciat:PonE!S d enorrdrradoa A y .6.

La prueba de complementaci6n puede realizarse con pares de rrnrtantes de cualquiera de los tipos letales condicl.onales. Consiste e e encialm ente en determinar s i un par de rnutarrtes puede cornpl ernenta r en condiciones restrictivas para producir progenie infecciosa. A e ste axperimento no 10 afec ta la posibi lidad de que oeur fa recornbinaci6n entre 105 rrrutan te s para producir el tipo s i lv es t r e , ya que el mirne r o de r ecombinantes es muy p equeho: en contr a s te , Ia complementaci6n cntre mutantes de diferentes cistronee produce una ta s a de "closion cercana a 1a normal. Para compr ende r mejor e s ta pr ueba, el lector podr ia ahara dete"minar las condiciones expe r im enta Ies en que s e debe rea1i~ "a.r La p r uaba de corrrpfern enta cl.Sn para mutantes te 0 SUB. Can estos ultimos mutantes 5 e obtiene un numeroITlucho mayo r de g rupos de corn> plementaci6n que el observado con mutantes rII, ya que las mutaciones que Ilevan pucden a{ectar a cualquier cistron n~cesario para 1a reproducci6n del fago.

60

Los experimentos y obs ervaciones de B enzer con mutante9 de 180 region rll a c Ia ra r cn e l conc epto de gene, tradicionalmente co ns ide rado como la unidad de rnuta ci Sn , recombinacion y funci6n. Benzer demostr6 que estos t r es aspectos del rnaterialgenihico s on e epa r-ab l ea operacionalmente y par 10 tanto no puede» compartir una rrrrs ma unidad. Sc via que una mutacion podfa abarcar de s d e un par de nuc l eoridcs a miles de pares cn a lg una s "delecionesll• En carnb io La unidad de recombinaci6n p a r e ce c o r r e s ponde r a un par denuclel'itidos. Finalmente, 1" uni~ dad de £uncion r ep r e s erita el numero de pares de nuc l eottdos nec e s arias para espedhcar una protei'na, 0 mas p r e c i s a.rrre nbe , un polipeptido requer Idn para expr es a r un caract e r d eee r-rrrina do ,

MODlFICAcrON DE LOS BACTERIOFAGOS POR EL HOSPEDANTE

Antes de discutir est .. fen6meno debe quedar bien c la r o que las mutaciones en los lagos, aun cuando o c u r ran en el fago vegetativo, son independientes de la bacteria bospedante .

Alg unas bacterias pueden modiiicar ciertas propiedades del material genetico de dartos fagos. Por ejemplo, e1 bacterio£ago A obte ni.do par infecci6n de E. coLi C e s r e cba zado po r l:. coli B; solo un pequeiio por~ centaje (0,0 I '/0) logra reproducirse en esta ultima cepa y los fagos .r e~ sultantes pueden proliferar nor ma lrne nte en 8. coli B 0 C. [Cua » d.r o IV). Situaciones s Lrrn.Ia r e s pueden pr es entar9 e con otra~ capas bacterianas y con ot r o s fagos, como los T pares. La distinta efid.encia de inieccion del £ago en relaclon a 8U origen no s e debe a di1erentead~ 50"d6n: en los hgo!l e.s tudi.ado s , el ADN "5 eficazrnente inyectado en las distintas cepas, pero s e degrada rapidamente en las c epa a que 10 r echaaan, Los cambios rnduc idos por e l hos pe da nte no afectan la aec uencia de bases del ADN, s rno que, con mayor p r oba'ci I'ida.d, introducen

una. mOdlfica.ci6n que puede s e r 180 e;densi6n de g l uc os l la ci Sn de la hldro!l:imetilcitosina en los Iag os T pares a 1a metiladon de crtos ina a ademna. en fages como X, Es te fen6meno e s de trnpor ta ncta general po r que muestra que hay una (orma de reconocilniento entre las ba c te r ia s que les permit e deshacers" de las moleculas extranas de ADN que pue dan penet>:ar en e l la s ,

Cuadr o IV

Modificaci6n del Fago )_ por e l Hospedante Proporci6n de ba cte rt a a que p r cduc en ragas

Bacteria hospedante

8. coli C

E. coli B E. eot« K E_ coli K (PI)

Fago y or;gen

x de E. coli C 1, de E. coli B J.. de E. ool.i. K

~ deE. coU K (PI)

10-" 4 X 10-4 10-7
4 x 10 ..... I O-~
j 0--4 I (iii
10 ..... 61

9

BACTERI0FAGOS CON ADN EllTENICO

En e e t;e capi'tulo, como en lOB que signen, se de s ta ca r a La interpretacion rno Ie cu'La r de La. es t r uctu ra 'I reproducci6n de los bacteri6fagos. Para poder tratar este a s pe cto con cierto detalle, s e lrrruta ... La descripcion a uno 0 dos de Los virus :rnas estudiados del g r upo , y solo se rnerici cna ean b r ev ernerrte las e s p e cj e.s m.as irnpo r tarrte s que lorman el grupo. Va r i o s de los mecanismos que s e dese ribiran de los {agos eScogidos pa r e c e n s e r generales; e1 lector debe esforzars e eo determ.inar cuales s e pcd r fan, 0 no se pod rfan extrapolar a1 resto de los Lagos 0 a otros 0 rganisrnos.

Los £agos can ADN bitenico son probabLen;ente los mas abundantes en 1a naturaleza y presentan una gran diversidad en tarnano y Lorma. Los conocidos en mayor detaile son eJ lago ).. y los d.e lao s e r te T de E. coli; .. 1 .Cago ).., j unto cc n otros fa g c s c on ADN bitenico q LIe a e distinguen par s e r temperados, seran de.s c ri.to s en el capitulo correspondiente. La 5<H .. ie T c orrrp r ersd e los lagos Tt, Tl, T3, T4, TS, T6 'I T7; 10. T

pares son rnuv semejantes y no s e pueden distinguir morfalogicamentc, 63

los impares en cambia son bas tanto. diferentes en composici6n, estruc-

tura y p r opi edad es fisioL6gicas. Otros fagos im.portantes d e este grupo

son los lagos de Bat:!iH.u8 IfUbtilis. entre los cuales estan los de La s e r i e

PBS (PBS 1 Y PBS l) que contienen uracilo en su ADN en ve e de ti.m!na,

y los de 1a s e r i e .sP, muchas de los cuales contienen 5-hidro:Kin n etilura-

ello en vez de tim.ina. EI bacted6fago PMZ de una es pecie marina de

ps eudornona s (Pseudomonas sp BAL 31) que sedisl:ingue por poseer una

m erab r ana y un pequeiio ADN circular, ha s ido m.encionado va. Eneste

capftu lo e e describlran principalmente las propiedades de los fagos T

pa.res y de T7.

COMPOSICI6N Y MORFOLOClA

La forma y dimensiones de todas los bacteriofagos T pares cor res - pond en a las del T4 i lua t r ada s en Ia rigura Z3. Existen vadas cepa s de ca.da uno de estos lagos denominadas, de acue rdo con e1 laboratorio de donda provellgan, TZH (Hershey), TZL (Luria) y TZD (De lb r ue k): las c e - pas son, sin ernba r go , generalrnente indistinguibles. El peso molecular de estas pa r tfcula s e s 215 X 10" daltones, e1 del ADN as 1 ZO x 10", y Is diferencia, 95 x 10" daltones, corresponde a la masa de protei"nas. Como Ia protei"na que forma Ia cab eza del £ago tien" un peso molecular de 4Z 000 daltones y cons tituye aproxirnadaxnente un 90"" del total (SO x X 106 daltones), la cabe sa debe e s ta r c ornpue s ta po r a l r ed edo r del 000 8 ubunidades.

£1 ADN del T4, adem.as de po s ee r hidroximetilcit06 ina en ve z de citosina, exhibe varias otras propiedades inesperadas t una de las cuales expfi ca claramente el c;omportamiento an6rnalo de algunos recombi-

r i.l1;. 2J. La e01l1pleja e S1:ruetuN del fago Tij se obser-va en la "'icro~afia y en La representaci6n diagramlitica _ AJ Fago con La vaina ex1:endida ; B) Con La va ina contra ida. En II) la cabeea cont iene ADN en tanto que en B) e .. 'ta "acia. (Cortesia de Harper & Row. Publishers, Inc.)

64

nantes. Gierta pr ope r ct Sn de las par tfcuras de.r ivadas de un czuc e COntienen ambos ca r a ct e r es pa r enta le s , 0 sea que s e compo r tan como Ileterozigotos, a pesar de que 109 fagos son obviamente haploides. Ea to s heterozigotos s e COITIpO rtan como tales pa r a s610 un l% oe l genoma vi r a l: au cornp or tarrri ento pu ad e ser entendido s I sugenorna muestra redundancia terminal, de tal forma que contiene un 102% de los genes te6ricamente esenciales para au duplicaci6n.

100%

Este modelo de e s t r-uc tu r a del g eriorna del fago T4 explica Ia aparicion de heterozigotos para solo un 2."/0 especlfieo del genmna (el r epr es enta.dc diagrarnaticamente bajoab). Sin em.bargo, e l problema no e s solalnente e ,,1)0, ya qLU~ cua lqut e r marcador puede estar presente en el heterozigoto; as la ca ntl dad de rna r cado r e s la que e s ta limitada a un 2%. La exp.ltca ctdn de la exi6tencia de e s tos heterozigotos, ingeniosamente elaborada por G. Streisinger (l962),(le) pos tu la que los c r orrros orna s enc ont.r ados en las partfculas de Una pob la ci Sn de {agos T4 SOn heterogeneos, y rnue.s t r-an , adclnas de 1a redundancia terlninat, una pezw:tltaai6n ail'auZar de los genes.

abc

x!Ja ab

c

xya abc

xyz

EI .ADN de los Iagos T pares e s lineal, a. diferencia del mapa gen~tico obre ni do par r ecornbinac ion, esta di s c r epanc i a apa r-errte puede s e r tarnb i en exp Ii cada basantiose en este modelo ya que los genes te r+ minales en a Ig una s molecuias estan Iigades en ot ra s , Hay va rios Indl cf o s experimentales que indican que eJ modele de Streisinge r es cor recto; uno de los mas simples 'I convincentes e s la s iguiente observaci6n hecha po r C. Thomas y L. MacHattie (1963),(19) cuando una so1uci6n de ADN Be !leva a un pH alcalino, los puentes de hidrogeno entre las bas es cornpl erne nta rias son d es t r uido s , permitiendo Ia separacion de Las cadenas helicoidales, Si este ADN desnatura1izado se incuba en condiciones apropiadas, las regiones cornp lernenta eta s de distinta.s cadenas helicoida!es pueden vo lve r a unt r s e y Io r rna r ADN bitenico, Thcrna s y MacHattie, razonando que debido a la r edundan cta term.inal y permutad6n circular lie pr-oduci r Ian c i e r to s tipos de mole culas (Fig, 2.4), sometieronalADNdelT2. a las condiciones anteriormentc d e a c r i ta s y pudi e r on cbs e rva r cla rarnent e a l rruc r cs ccpko electronico e s tas molecufa s ci r cu la r e s pr ev i ata s ,

I 1 l • , • 1 • 2 Q I >
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4' g' ~ ,. ~ ~ a l' ~ i 4i ~,

(J(5G

(.)

fig. 24. La redundancia terminal y/o permutaciOn circuMr se puede comproher pOl' el tipo de moleculas obtenidas a partir de Ia desnaturalizacion del ADN y porterior aparearniento de las eadenas helicoidales, Formaciol) de moleculas cit'culares al usar ADN de T4 que muestra redundancia terminal y permutac ion circular. (Cortesia de Academic !Tess. Inc,)

65

EI bacteri6fago T7 es uno de los Cagos mae peq uefioa , au ADN lineal tiene un peso molecular de 25 x 106 da l tonea y por 10 tanto s u genoma contiene menos genes que e l T4. S610 s e han enccntra do 19 c is t r one s e s enc ia l es , que, a diferencia de la forma en que s e p r oc edi S con otros fagos, fneron numerados cons e cutavarnerrte una ve s que s e determino ell s e cuenc ia , de esta manera, e l mapa de T 7 5 e r epr-e s enta en la siguiente forma, muy facH de recordar:

Z 3

17 J 8 19

AI igual que el mapa genetico, el ADN e s lineal; estas mol~c 1I1as pres entan redundanCia terminal que cornp r ende aproxtmadam enee e 1 0,7% del genoma.

DUPLlCACION DEL ADN

En lOB p r lrn e r os minutos des pues de Iainfe c ctdn con T4 ocurren var i o s p r oc e ao s destinados a preparar las celulas p" r a Ia multip licacion del virus; aparecen un grupo de anz irna s inducidas po r el lago, s e inhiben tanto la slntes;s de ARN mensajero como de pr o tefria s celulares, y e l ADN c e luI a r es deg radado. Un grupo de e s ta s enz;nlas e s Ia causa de la Cormaci6n de dHCMP nec esa.r io para 1a sintesle del ADN de 105 fagos T pares a partir del dCMP existent" en la c;;lula. La sfntesis de ADN comien:z.a pecos minutos des pues de la infecci6n, pero las mo leculas del tipo encontrado en el fago madur o s6Io aparecen a l final del pe r-fodo de eclipse. La mayor parte del ADN sintetizado durante este periodo s e incluye en un cornpues to de gran tamaiio con un coeficiente de 5 edimen~ tacion de 2.00 S, q ue parece Bstar fonnadoporvarias molE'culas de ADN viral unidas po r sus extremos. 5i estas s e escinden teniendo en consideracion solo e I tamano, indepen<lI"ntemente del sitio en que debe predudrs e la quiebra, Se explicarian las ca.r act.exfs tica s encontradas en e1 ADN que forma Ia progenie.

, •• xyzab .••.. .xyza~ •.•.•• xyzabn

X1.Jza

abC' ..•. xyza zake .... XliZ

Hgczbg x1l

t 1

Escision 3 Escisi6n 2. Escision

66

Los mutantes Ieta Ie s condiciona les han sida de gran utilidad en e I estudio de la r epr oduc c ion de los fagos y se tn enciona ran frecuentementoo, en especial con r e s pecto a Ia dupltcac ion del ADN, regula don de Ia slntesis de las proteinas y ens arnb laj e., La particl.paci6n de varios genes del T4 en Ia duplicaci6n de au ADN ha side d errio s trada usando di£erenteB mutantes ts que fabrican proteinas s ensibles. El r equer-irni eneo del producto del gene 31:, por ejemplo, s e ha dernostrado claram.ente pc r « ql;le las cclulas Inf'e c ta da s COn un mutante te en este gene 5 intctizan normalmente el ADN de T4 a 25· C, pero dejan rapidamente de hacerlo a I ser trans feridas a 420 C. El producto de este gene ba s ido recientemente idC'Iltificado como una proteina capaz de um.r s e al ADN y co opera r en Ia separaci6n <Ie las cadenas helicoidale s complementarias que es ne c e aa ria para la duplicaci6n semiconservativa del ADN. (~) En forma s lrru la r a 10 s eha lado para el gene 32, se ha Iog r ado la identificacion de otros cinco genes del T4 necesarios para 1a dup li ca cdon de su ADN.

BlosfNTESIS DE PROTEfNA5 Y 5U REGULACION

En 1a celula Inf'ectada con T4 s e puede d ete cta r la apa r i.ci Sn de mas de 30 nuevas protei"nas inducidas par el £ago. La regula cion de 1a s(nte s is de estas pr oeefnas , ya mencionadaanteriormente, sepuedeobservar por la tecmc" de J. HOB ada y C. Levinthal, (31.) que e ons i s te e a enci a lrn anf e en 10 .,;guiente: se infecta un cultivo de celulas y, a distintos lnrer vatos , se taman partes a Ifcuota s que son mezcladas por uno 0 dos minutos con un arninca cidn radia.ctivo para marcar las proteinas sintetizadas en ese instante. lnmediatamente des pues las ce1ulas son cokec - tadas para la preparaci6n de un extra eto , y una pardon de "ste s e

analiza por e te ct e ofo r e s te en gel de acrilarnida. EL gel que contiene las prote,nas radiactivas ya s eparadas, s e utiliza postedormente para i rri - pr es i onae una placa sensible a Ia radiaci6n. En e s ta forma, 05 posible tener una imagen de las protelnas eintetizadas a disrintos i.nt e ev a l c.s des pue s de Ia Infecci6n, cuyo ana.h sis perrnitirli detecminar el momenta en que 5<': inieia y c e e a Ia 81nte9i8 de cada proterna s e pa r acta en e I gel. Usando esta tel;nica, Ho s od a y Levinthal pud'iecon agrupar las p r o t.efria s inducidas por T4 en cuatro clases, de acuerdo con e1 pe .. roda durante el cual se sintet;i.zan (Fig. 2.5). La s Int.es i s secuencial de va r ta s e s pe c te s

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61

Fig. 25. Las distintas proteinas inducidas par e1 virus se sin~etizan a dis~in~os in~ervalos. Autorradiograma de los gales que contieneD pro~elnas mal'eadas a distintos momentos despues de 111. infeccion. Diagrama Central: Resumen esquematieo de loS resultados pr-eaetrtadoa _m e 1 au tort'adiogl'ama. Los numero's correspond en a los gan",s que determinan las prote:tnas sefla1adas. Diag1'ama Inferior: Las distintas pt'o~es.nas s" pueden agrupat' en cuatro elases de acueedo CO" el periodo dur-arrt e el cual se s iot et izan. (Cor'tes!a de Academic Pre ss , Inc. )

de: ARN rnensajero d e s p ue s de infecci6n con T4 sugiere que la iniciaci6n y c e sadon de La ,,{ntests de e s ta.a proternas esta regulada poria transcripci6n del ADN viraL El rrre c a rri s rrio de regu1aci6n de la ,,{ntesis de estos ARN rn ena a je r o s ha sido bastante adarado en las ultimos anos, pero antes de e nt r.a r a dis e uta r Io e s necesario describi r alguna s propie· dades de 1a ARN polimerasa-ADN dependiente.

La ARN paLirnel'a-ADN dependiente 0 ARN polimerasa, enzxma res ~ ponsable d e 130 s{ntesis de ARN mensajero, esti formada pOl' cinco polipeptidos, Za., lB, IB', Y!<J. Laestructurabaeica, iormadapor la.£!~', e.s capa a de transcribir ADN de timo de te .. nero y algunos polilTleros sinteticos, pero requie re <J para la transcripci6n aficiente del ADN de T4 y T7. Sin embargo, todos estospolipeptidos no bastan para La s{ntes'is de las mo1eculas de ARN m.enaajero e s pe cfftc o, sino que s e requier" ademas la presencia de o t r o factor llamado p; sin este factor. 1a ARN

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polimerasa sintetiza largas y b eee r og en eae moh~culas de ARN, por lo que p parae e ne ce sa r Io para la terminaci6n de la trans cripci6n en puntos determinados. La regulacion de Ia Slntesis s e c ue nc i a l de las distintas clases de ARN rrre n aa.j e r o apa.r ec ida s despues de la infeccion con T4 no 5 e entiende todavfa bien, pero rrru cb oa indidos experitnentales indican que" e debe principalmente a I a modifieacion de la a ct iv id a d de la ARN po Hrn e r a.s a , C;ertaa regiones do) ADN, a las cua.l.es s e un e Ia ARN poliInerasa, determinari"an la iniciad6n de Ia s Intes i s d e l ARN rne ns aje roj otras s ecueneias, actuando en forma inversa, indicarlan e I cese 0 Hirmino de la transcdpcion. La ARNpolimerasa de E. coU s610 sintetiza "in vitro", en condiciones determinadas, las c la.s e a de ARN Il'lel1sajero que aparecen durante el tr ans cur s a del primer minuto a partir de la infecci6n. De es te experimento 6 e concluy6 que Ia enzima norrna.Im ent e pr es ante en E. l'oU es capa s de sintetizar las c la s e s deARN mensajero de T4 que determinan las primeras pr otefuas inducidas. AIguna s de estas protelnaa podri'an modificar Ia a cti vrdad de Ia ARN polimerasa, permHiendo aSlla sintesis denuevas c1ases deARNmensajero que apa r e cen mas tarde. LaB siguientes alteraciones de la ARN polime rae a han e i d o obs c e vada a durante la reprodueeion de T4: rnodificadon de o, que drs rrri nuy e l.a afinidad de la e s tr-uc+ur-a basica po r 0, inducci6n de un nuevo fa etor 8 Irrri la r a 0 y modifi ca ci on de la eade na 8 I. Aunque Ia cons ecu"ncia de cada m.odificacion es todavfa dud c s a , e s indudable que 1a o c u r r errc La secuencial de est"" podrla r"gular Ia producci6n d.e las distintas c Ia s es de ARN mensajero, cambiando l.a afinidad de 1a euz i.rna par los s jtios de inicia.ci6n. (.a:!) EI e atado de] ADN pa r e c e tener tarnbt en un papel importante en e s ta regulaci6n; 1a slntesis deARNmensaj e r o ta r dfo , par ejemplo, r equl e z-e la presencia de ADN r epltcartvo viral.

La pos Ib Ie r egula cton de l a sfnees is de las protefnas de T4 a m ve'l de t r a du cc idn, a unque ultimamente olvidada debido a los adelantos hechos can ARN polimerasa, est! respaldada par va r ta s pr ueba s expe r tmentaIes , El bacter16fago T4 provoca va r roe cambios que pod r fan determinar 1a traducci6n de solo cte r ta s c la s es de ARN mensajero; estos consisten en la aparici6n de n<.1eVOS ARN de transfel'encia y la modificacion de Ios rib as omas ce lula r es , La alte r adDn de Ia a ctividad de 108 r iboe oma.s o cur r e temprano despues de infecci6n y es p r ob ab Lerrae'nbe un fa c to r determinante en la inhibici6n de la elntesis de las prote{"as ce l.u la r e s ; 108 r ibo s orria s de f.'. 001.£ infectada con T4, s on tan eficientes como l09 de bacteria e no imectadas en la traducci6n de ARN 'rn e n s e.j e r o viral, pero eetan fuertemente mhi bid os en su habiHdad de traducir ARN mensajero de E. coHo

La regulaei6n de la si"ntesis s e eueneial de las p rocefna s de T7 la deterrnina, al rn e.noa parcialrnente, Ia slnt .e sis secuencial de varia. c la s e s de ARN rn en s aj e r o: e l mecanismo de regulaci6n de 1a transeripd6n e s , sin e rnba z-g o, distinto delsugerido para T4. Este m eca.nt s mo se estudla utilizando mutantes en el gene 1 de T7 que 80n incapace.s de multiplicars e: estos tnd ueen s610 3 de las ,Z 4 nuevas e sp e ci.e a de protelnas que e pa.r e c en en la bacteria de s pues de una infecdon normaL Originalmente s e penso que e l pr oducto del gene 1 cra un nuevo fa ctor semejante at 0, necesario para Ia "lntesis de las o tr a s c las e s de ARN rrrens aj e r o, po r analogla can 10 que pa r e ce o cur r i r en T4. Poste-

rlo r mente s e derrio s t r-S que e l producto del gene) e s realmente una nueva ARN pc Lirn e ca s a determinada po r el fag 0, capa z de transcribir el r e s to del ADN de T7; e s fa enzima actua p r e s c i ndj en do de cua.Iqur e r a de las cadenas 0 Ea ct o r e.s pra~ antes en la enzima de la bacteria. (.a;)

MADO R.AC ION

La pa rticipacion de dis tintos genes en e l cns arnb la.j e de T4 se determino e s eudra ndo los p r oduc tos de Ia infecci6n en condiciones restrictivas, c ori rrnrfa nt e s letales conertctonat es : en e s ta s condiciones los rrurtante s a cum ulan pr ecur so res que s e pueden r e corio c e r morfo log i cam e nte mediante e1 microscopio e l e ct r orric o, Un mutante, por ejemplo, prOduce, en v oz de cabe",a, largos c i l i'nd.r o s hue cos COn el dia:rnetro de Ia cab ez a del fago; e s ta s es er uctu r a s tal vez s e originen por la aus encta del producto del gene rnutado, que S e r equte r e para formal" los "erti ces del Lco e a ed r o de Ia cabeza normal. Can este tipo d e a na.Ii e i s se"happodido identificar va r l o s de los genes requeridos para ,,1 ensamblaj e de T4, pero .. 1 a va.n c e en Ia eomprensi6n de es te p r oc e.s Q rue Iirnitado has ta e1 descubrirniento de la oompl.ementaaion. in vitro po r R. Edgar y W. Wood. Cuando Se rnc z c tan dos It s adoa ob te nt do s de bacteriaa infectada" con rnutantes distintos, los precurs ores del fago pres entes en ambos l.isados pueden complernentarse para p r orl'u c i r part{cula.s infc""iosas. Usando las dos teen;cas descritas, Edgar, Wood y co lab o ead o r e s han podido detertninar la s c cue nc ta en I a mor!ogenesis de T4; como sa ob-

s e eva en 1a figura 2.6, lamaduraci6n es un p e oc es o s ecuenct al en el c ua I 69

cada e tapa ocur r e s610 con pr oductos de la Cas e inmediatamente anterior •

.....

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1)9; 41

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F iy,. .26. El ensambla:l e del fago T'I es un proceso secuenc Ia l. Los numeros indican los f;tenes identificados que participan en ';1- Do s larg;." secuencias de genes, X e Y, actuan para pr-oducir la cabeza del fago. Z corresponde al nGmero de genes necesarios para produc!r 1a placa hasal. El total de genes ident if i.cados "'I 45. (Cortesia de Academic Pr-ess. Inc.)

10

BACTERIO.FAGOS CON ADN MONOTENICO

Los bacteri6Iagos con ADN monotenico as tudiados en detail e son trn oe pequeno s virus que parasitan E. oo ld , Todas las especies estudiadas pueden ag r upa r s e en dos cIa s e s bastante bomog Sneas en cua nto a propiedad ee nntig ~nicas, morIo16gicas y fisiol6gicas: el g r upo del tX J 74 (ot>X J74 6 .,/>Xy SLI) y el del td (fd, fl, MI3, .f12y ZJ/Z). Los fagos de diferente grupo son ITlOrfo16gicament .. tuuy distintos, los del grupo del <,6Xson icosa;';dricos con Un diaT11etro de 250..1. (Fig. 21), en tanto que los del grupo .fd 5 On filam.entoeos 0 cili'"ndricos con un largo de g 000 A y un

.. -Q . ••••

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71

Fig. 27. Los bacteri6faF,os con ADN monotenico son pequenos y mas simples, como se observa en la micrograf1a electrOnica de ¢X 174. La linea representa 1 000 i. Kortes1a de Acadl'!mic Press, Inc.)

diametro de 501. Otras ca r a c te r Is tieas ([sieas de los Cagos de ambos grupoa figu.ran en el Cuadra V. Los fagos del grupo del $X pueden in-

Cuaclro V

Propiedaeles de 101i FagolJ ¢X l74 Y f d

P ropiedade $ ex 174 tel
Sa.,. (5) 174 40
Peso de Is pa.r tfcu.Ia {da Iton es l 6,2. x 106 11,:))( I OE
Cantenido de ADN 2.5,50/. 12.,20/.
Densida.d boya nce en Ca C'l (g/ ern") 1,43 1,29 £ecta.r, adem ... de E. coli (""peci"ficamente E. cal.i: C}, ot r a s ente r obacte r-Iaceas como Shiget'ta paNldYBI!mt"l'iae y Salmonella typhimul'iW1l. Los del grllpo fd tienen una especificidad por bacterias "machos", F+ 0 H£r; e s to significa que los fagos de es te grupo 5610 pueden lnfectar las cepas capace s de transierir par c onj ug actdn s u material genetico a ot ras cepas "hembra". La especificidad probablemente s e debe a la exi s terrcia de un pilus 0 apendiee llam.ado F, que conti en" 108 s lt ios r ec eptor es de es to. Iag o s .

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Los fagos de ¢X eetan constituidos po r C uat r o c.las ea distintas de proteL'nas: en carnb'io los de fd parecen contener s olarn ente una. EI icosaedro que aloja el ADN en (!IX esta cons treuido por alrededor de 60 rno Ie c ula s ds prou,i"na can un peso rno Iec ula r de 4B 000; en cada vertice del tcoaa ed e o hay una pequefia proJongaci6n a e spfcula compuesta por protei"nas de las orr-as tree clases. La. pres enda de ADN mcnotemco en sstos fagOB, eapecL'ficament" en ¢X 174, Iue demostrada por R. Sinsheimer en 1959. El ADN del ¢X, como el de los otros Eago s con ADN mono teni co , tiene un peso molecular de J, 6 X 106 da ltcne s . Las dos pr opj.e da.d e s mencionadaa no 80n, sin ernba r go, las (inicas que distinguen el ADN de e stoa Iago 8. Cuando Sins heirne r e studi6 las p r opi e dades fisicoqufrrrica s del ADN de ¢X, hizo una observaci6n que no se pudo expl'i ca r : c uarido e1 ADN 5 e s edimentaba en La ultracentrfIllga s e ob s e r va ba n dos componentes de distinto $. Estudios posteriores indica ron que el ADN de iIlX e s , adezna s de monot1!nico, circular, 0 sea pos e e sus extremos unidos. Los dos componentes se d ebfa.n a Ia ocurrencia de rupturas de las moliEculas ci r cula r e s durante Ia preparacion, que originaban rnoleculas lineales con un 8 un poco menor. La ci r cu.la r-idad de las mcte culas de ADN puede ser directa.mente observada a.l microscoplo electr6nico.

1::1 "ADN de i1lX puedc infectar es {eroplas tOB obtenidos po r tratamiento de E. coli con lisozima. (34) La activiclad infecciosa del ADN r equie> t:e que la mo le cula s ea extrar.:! a de las pa etfcula s sin producir qu'i eb ca s en ella; e s to e s tacil de Iog ra r debido a Ia pequene e de tarnafio delADN, que 10 hace mas resistente a La agttaci6n. Con ADN de rna vo r tarnano, como el de los T pares, basta Una. pequena agitacl6n, como Ia prodllcida a l transferir la soluci6n con una pipeta, para q ueb ra rlo en va r ias partes.

REPRODUCCION

El pr o c es 0 mas es tudiado de I a r epr oduc c idn de ~X es la. dupfica cion de su ADN, este imptica la produccion de una forma replicativa y la poa terior ",{nresis asimetrica para pr cducl r va r I os dentos delADN monoten;co contenido en et {ago. La conversion del ADN rn on ct en i c n vi r a l en la forma replicativa bito~nica s e logra porIa a c ci on de enz irrias del hcs peda nte preexistentes en Ia ce lula , ya que \a inhibici6n de Ia i nduccacn de p r-orefna s v i r a Ie s en Ia bacteria Infe ctada no impide e s ca comve r e i Sn , La forma r epltcarrva s e duplica varia 5 veces de rnane ca s emrccns e rvattva ha s ta p rodu ci r una s veint" rno Ie culaa por ba c te r'ia; e s ta duplicaci6n ocurre en sHies preexistentss en La celula, cuyo mirne r o (I 0 v a r i oe ) depend e del es tado fta [OLogieo de 110 celu!a.

La forma bitenica, adernaa de dupticar, sirve como molde del ARN meris aje r o , que e s transcrito de la cadena helicoida.l compl em entar-ta 101

AnN del [ago, ya que e1 ARN m.ensajero pz oc ed errte de c';tulas infectadas no forma rnoleeulas bitenicas con eL ADN de eX.

El proeeso de duplicaci6n de 1a forma replicativa no est;;: claro to ; davlaj. es po s ib le la o c u r-r-e n c i a, de uno 0 ambos rrre c arri s rri oa r epr es enta> dos en forma e squerna ti ca en Ia figura Z~. Ambos ti]los de moleculas

a

b

Fi~. 28. La duplicaci6n del ADN bitenico podria ocu~ir de ac:uerdo con cualqui"ra de e stos dOlO _delos.

representadas se han encontrado en las celulas infectadas. En e l modelo b la $1nteai5 oeur .. e po r adidon de nucleotidos a uno de los extremos de una cad ena helicoidal, con ta formaci6n de Ia e ga s ca.d eria e helico ida l ee detectables despues de de"natllralizar Ia Corma replicativa. Favorece e s t e modelo la p r e s en ci.a en las rno l"culas duplicantes de ADN mcnoeeni co mas largo que e l ADN de ~X.

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Cuando s e han a curnula.do unas J 5 a 20 formas r ep lt ca tiva a oc ur r e una abrupta transicion en e1 !nodo de ">,,teais de ADN; Ia "rnte"is de la (orma r eptacattva s e inhibe y los antf los ct r cu la r es bit"nlcos s e utilizan para una srntesls ashnetrica de Ia que resulta 101 ADN viral. El p r oc e » 60 basico es de "i'ntesta y de sp Ia zazni.ento como eJ que rnue s tr-a 130 flgura 28 b, excepto que ahara La. cadena helicoidal de ap Ia z.a da no e s utili. zada para "intetizar s u complementaria, sino que e s e ncap s utada por las proterna" estructurales a medida que s e produce. S., desconoce Ia manera en que se produce la forma circular del ADN encontrado en los Cagos.

espicula

dupl:icaci6n

forma" replicativas

"spicula

espicula

prote!na icosaed-r-o

slntesis ADN 1IIOnotenico

a1ntesis ADN monotenico

lisis

fig. 29. £1 genoma de 0X 17ij contiene ocho c:istrones. Los diferentes cistrones han s.ido encontrados mediante las pruebas de complementaci6n, 1a secuencia mediante analisis POl' recombinac.i5n, y la funci6n per- an§lisis hioqu'imico de diversos mutantes.

Mediante el analisis genetico por cornplementaei6n de nurrre.r-o so s rn uta.nte s de ¢X s e han d e te r-rrd na do al rrre no s oeho ci s t.r cnee ; el amilisis por r eeombina ct Sn ha perrnitido determina r La secuencia y tarnafic apr oxim.ado de estos cistrones, y finaLmente, gracias al analisis bfoqufrn lc o de Los productoa acumulados en La ceIul", s e pudo determinar I,. f'llnci6n de cada detr6n. (Fig. 29.)

BIOSlNTESlS "IN VITRO" DEL ADN DE ex

La tecnica utilizada pa ca ensayar La inIectividad del ADN de <tiX en es!eroplastos permiti6 .. atudia r La acttvtdad bioLogiea del ADN sintetiz.ado "in vitro" por las enzimas de E. l!oU, eapaces de sintetizar y unir polinucle6tidoB, La obtencion de ADN in!eccioso de <,!IX! 74 utilizando e I ADN del virus corno molde puso de relieve Ia notable capacidad de e s ta s en z irn as y e l a Ican c e de las teemca", logradas.(a;) Sin embargo, elpToces o "in vitro'; pa r e ce ser bastante di!ecente d e l que o cu r r e en Ia cHula in£ectada.

14

11

BACTERI6FAGOS CON ARN

Este grupoesta cornpue s to de fagos relativamente muy simples de forma icosa.edrica., c u-yo di'metro mid e de 2. 00 a 2. 70 A y ellye con te ni > do de ARN es de 30%. Los mas estudiados tienen 8. aoZi como heapedante y pued en ag r upa s-s e en do s c la.s es imnunol6gicam .. rrt a d'stintaa, La de tipo 12 (f 2, MSZ, R 17 y MIl) y 1a del tipe QS. Arnba s cka s e a de £agos difie ren adema" en a lgunaa pr cpi.edad e s fisicoqurmicas. Al igual que los de ADN monotenico del tipe .fd, estos lagos son l!apeclCicos para bacterias ma cho y los "ibos receptores pal:ecen estar en e l pilus F.

Los fa gos fl e s ta n fo r ma.dos par una molecula de ARN, ISO molecu la a de una protern a cornpuesta. par 129 aminoacido~ y urra rrio l e eu ka de proterna A 0 de maduraci6n, de pesO molecular de 42 000 daltones.

ESTRUC TU ItA DEL ARN

.LaB tnolecula.s de AR N contenidas en e s to s fagos tienen un peao mo-

lecular de I, j X 106 daltones y un S de27S, coeficientedesedimentaci.6n 15

relativa.mente alto para un ARN del peso molecular senalado, Su e1e-

vado S y otras propiedadesfisicoqui'micas indican que tienc una gran cantidad de puentes de hidr6geno, apareando secuencias complementa-

rias Io ca Hz.a da s en distintos lugares delpelirribonucleotido. Se estima

que Ia exzen s i Sn de esta autoeompiementaridad cubre c e r ca del 700/. de

la mol e cula ,

EL am~Hsis de nurne r os o s mutantes ts y SUS ha pe r mttado ha l la r tres g rupos de complementa ci on que pa r e cen r epres enta rei total de ci S t rones de los lagos! 2 y R 17; QI3, en cambio, pa r e ce contene r cuatro cts - trones. Los pr oducto s de Los cts crone s de los lagos tipo f 2 han B ido identificados como 1a pr otefna estructu.ral, protei'na de madu.raci6n 0 A yARN replicasa. Aunque La falta. de recombinaci6n genetica en es tcs fagos ha impedido obtener un mapa genetico de eHos como los allteriormente p r es ertta.dos , otros ingeniosos metodos anali'ticos han permitido lograr un cuad r o basta.nte detaUado de ladistribuci6n de los genes en el ARN. POl' metodos qui'micos y enz;imaticos a e handeterminado las secuencfa s t e r rrri na le s en e1 ARN de La rna yo r-Ia de es tos fagos: todos terminan en pppG en el extremo 5' y en CCCA-OH en e1 exer emc 3'. Debido ala estructura que presentan estos ARN, como consecuencia de la a.utocompiementarldad, tratamientos s uave s con rfbonuc lea s a s610 introducen unas pcca s quf eb r a s en las regiones monotenicas, procluciendo grandee fragn1entos "speclficos. Estos fragTDentos pueden s er pos terio rm ent e B epar ados y uti li'<:acl05 pa r a deterlninar BU s ecuenda: corno s e conoce el orden de 108 arrrinoa e idos en la protei'na ea t r-uc tu ra I, la compa r a cton can la secllencia de nucle6tidos en .e l tro2;o de ARNpermite identi£icar el t r o z o con' espondiente al cistr6n que determina la proterna es tructural. El analisis de las protei'nas sintetizadas "in vitro",

utilizando 10. dife rente s t r-o zo s de ARN viral como ADN rnensajero, tambi~m p ez-rm.t e determlnar las partes del ARN viral eo r r e sporid i en t as a cada cistr6n. A traves de una combinaci6n de las tiknieas de s c ri ta e s e ha log r a do obtener e l siguiente mapa del fago R 17, probablemente tarnbren v~lido para el r-e s to de los fag o s del mrs me tipo.

Prote(na

5'

Prot .. Lna A

Es t.r uctur-a l Replicasa

3'

pppG

______________________________________________ CCCA-OH

300

1 500

3 000

El ARN contiene alr e d e do r de 3 400 nucleotidos y una longitud d e

... m. Aunque la Ie ctu r a del ARN ocu r r e en dil'eccion 5' -- 3', los ribo s orna s no 6 e un en a.I ext rerno 5', sino que exi s te una larga a ecuencia, airededor de 300 nuc!e6tidos, antes del comienzo de Ia region que dete rrruna la p rirrre ra pr otefna , Hay t r e s Iuga r ee a los cuales s e urien los r ib os oma 5 y que probablemente reflejan los s t tt o s de iniciaci6n de La slatesis de las t r e s distintas pz-orefna s inducidas pOI' e l fago. La sec u e ncf.a de nucleotidos de e s tos sitios ya s e conoc et e s po s ib le que con 109 rapidos avances logrados en este campo pcdarnos saber dentro de poco La s e c'uen c ia corrip Ie ta del ARN de algunos de estos virus. Este logro sera im.portante, ya que permitil'a corroc e r con pr e.cision los disttnto s s i tt os funcionales del ARNmensajero como, por eje:rnple, los que marcan el corru e nao y t,hmlno de Ia sintesis de pr o tefna s , "itios de union a los r ib os ornas , etc.

76

DUPLICACION DEL ARN

El m.ecanismo de autodupti caci Sn del ARN es similar a lobs ervado en el ADN rrro no t.erri c o , D'e s p u e s de 1a infocdon, e1 ARN viral pa.s a a Io r-ma r una mol e cula replicativa hitenica que poa te edo rrrient e pa r tl c ipa en una s fntes Ls asirnetrica qlIe pr oduct r a varies mUes de copias del ARN v i r a L Durante e6ta ultima etapa es posiblc obs e r va r La p r e s c n.c Ia de un ARN, llamado intermediario r eplf cativo, que esta fo rruado por una cadena helkoldal complementaria, una vlra I y varias copias parciales de e s ta (iltima.c~~ Esta forma s e r-fa e l r es ul tado de la s(ntesis asim':;trica q\.le produce 5610 copi a s de una de las d os cadenas helicoidal e s : Ia. presencia de va r ia.s c opfa s parcial .. s de ARNviral pod rfa d eb e r « s e a que la si'"ntesis de una n ue va cadena s e irucia antes que termine la slntesis de la cade na que la precede.

At igual q<le ,,1 ADN monotenico de ciertos fagos, el ARN de estos es capaz d e infectar e s fe r-opda a t o s de E. coli, 'f 5 e ha logrado Ia slntesis "in vitro" de ARN infeccioso. Esta pa r e ce s e r muy s ern ej anee 0 igual a Ia ~fntcsis que ocurre en Ia caiula Infe crada , a diIerencia de la "r"tesis "in vitro" del ADN de ;tX. La di!erencia probablemente radica en que la enz irna us a da con AR N viral es 1a inducida po r e l fago (La ARN replicasa), que ha s i d o extratda de celulas infectadas y extens arnente purificacta.(:;gj La extrai'd." de celulas i nf ec ta da.s con QS tiene un peso molecular entre 130 000 Y 150 000 da Itron c s y esta Ior rrrad a por 4 s ubuntda.des , de las cua l as solo una esta deterrninada par ,,1 virus y las o tr a s t r e s so-n de o r ig e n bacteriano. La ARN repUcasa rrrue s t r a una alta especificidad, Ia de 08, po r ejernp lo , solo duplica ARN de 03 Y no el ARN de otro fago, como el de MS2.. La sintesis de ARN in[eccioB 0

.requiere varios c orrrpo ne nt e s , entre e l Io s , la enzima, ARN de OS que acfua. como rrio Id e iniciador y va r i os Ia ceo r e s del hospedante. Entre lOB factores celulares se han podido identificar dOB, F] Y Fa' que ,,610 par ecen t: "que ~ irs e en las eta pas ini cia Ie s (si"ntesis de fo z-ma replica ti va 1 pue s to que no son necesarios 8i s e emplea comornolde el ARN complementa rio a1 viral.

BIOSlNTESIS DE PROTElNAS Y SU REGULAGION

Con e s tos f'a.g o s s e pr e senta un caa e muyespecial, ya que au ARN debe r ea Ii z a r dos funciones Inuy distinta s: dup h ca r s e y a ctua r de rrre ns a-. jero. Tanto 0.1 ARN viral infectante como el interrnediario replicativo y las nuevas In.oleculas de ARN v'i r a l pa r e ceri s e rvir de mensajero porque los tres tipos de molecules s e pueden enco ntr a r a.s cctados can los ribosomas durante e I perfodo de e cl.i ps e. En losestudios de La slnteais de las p r ot e.Irra s inducidas par e s to s fa.gc e , ha sido de gran util'idad la ca e eric ia de histidina en la. p r-ote fna e s t r uc tu r a I, ya que La incorporad6n de histidilla. r adfa cri.va permite distinguir la slntesis de las otras cto s , La. ARN replicase. se sintetiza. rapidamente despues de la infecci6n; Ia protei"na es tructur af s e s intetiza mas ta rcfarnente , 51 bien en rnucb o mayor c:a.ntidad; Ia p r o t efna A pa rece sintetize.rs e a 10 largo de todo cl perlod 0 la ten t e , Se cree que la pr ot efna estructural ti ene una Cunci6n i rrrportante en Ia regulaci6n, puesto que inhibe Ia slntesis de AR N r ep b ca aa , tanto " in vitro" como en la co; lula infee ta da; II u adi ci 6n a un II is terna de srntesis de pr-o t efna s virales "in Vitl·O" i n'hfb e la incorporad6n de histidina. La inhibici6n de la SrnteslS de La ARN r ep Ii.ca s a en la celula in· fectada. 1a indica Ia observa.ci6n de que los rrruta.nt.e s incapaces de sinteti sa r La p r orefna e structural producen una a. Ita cantidad de es ta enz.i rna , Otro posible rn e carri szno de La regu'la ctzin de la sfntesis de proteinas puede ba sa r-s e en el e·stado del ARN, pues Be ha ob s e s-vado que cuando se usa ARN parci.alrnente biteltico corno mensa.j ero, s e obti.ene 'Una producd6n preferente de proteina. estructural.

71

12

BAC TER10F AGOS TEMPERADOS

Est., ultimo cap;'tulo trata de las propiedades de una serle de ragas, agrupados segun BU capa crdad de e s tab le c e r can la bacteria una larga relaci6n o;imbi6tica Hamada Zieogenia. Todos los fagos temperados hasta ahora men.cionados contienen ADN bitenico; e l rniembro de este grupo olcas estudiado y conocido en mayor detalle ee sin luga r a duda s el bacteri6£ago \. Otros miernbros importantes SOn PI, que po s e e una forma e s p e c i a I como p r ofa g o , P2 y s u fago satelite P4 que parasitan E:. coU a l igual que \, y PZZ, el primer fago temperado de scubte r tc, que parasita Salmonella typhimurium. Hay Una serie de £agos eernpe r adc s capa ces de r e c ombfna r can ~, llamados "lambdoides" par s u gran similitud can el, y que generalmente s e cle s Ig uan can Un rnirn e r o , como eJ 434, 2 J Y ¢ BO.

ESTRUCTURA DEL BACTERIOFAGO )..

Los fagos de ;I cons tan de una cab e za de 500 A <1e diametro y una cola

de J 500 A de largo (Fig. 3 0). El ADN forma un 50"10 del {ago y tiene un 79

pes e molecular de 3l ~ ! 06 daltones; s e disting LIe por po s e e r en ambos e><trernos 6 endas regione$ rrroriot eni ca s comp l emenea r Ia s entre s r. Cada

Fig. 30. El fago ~ y otros relacionados paseen una cola con una estructura mas simple que la de los T pares. (Cortesi" de Academic Press, Inc.)

una de estas regiones esm formada aproxirnadarrlente por ZO nucle6tidos y al Io r rria r entre s( pue nte e de hidr6geno gene ran moH,culas ct r culares. Esta cil:eularizaeion puede ser Iaciltnente d errio s t r-a da. incubando e I ADN eoet r-e.fd o de los Ia g o s , en condt cl one s adccuadas para el apareanliento entre arnbas regiones n).onotenic:as~ las fo r-rrra s c i r c u La r-e s producidas e e pue d en observar posteriormente en el rn i.c r-o e c npi o e.Iec - tronien. El estudio de un gran numero de n n uca nte s de),_ ha permitido d eze c ea r ca.si t od os los genes del Ia g o , Los genes .apa recen ag rupados de acue rdo con s I.! fune lon, as r, po r ej emplo, todoa los g en as a qua compete Ia p r ocruc c i Sn de la ca.b ez a aparecen en un extretnodelgenoma, los genes de ia cola en 108 sitios adyacentes, etc.

3' Cab a z a Cola Inreg ra c t Sn Rcgulacion ADN Lisls 5'A

S'G

INTEGRAGION

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En una celula lisoglinica, el proiago ). estil asociado a l c r orrac s orn a bact", riano !or:rnando una region integral de 101. Est" as ociaci6n entre e l genoma del (ago y el de Ia ba cteria se ba demostrado en cruces entre bacteria" macho (Hfr) y bembra (F'"). cua ndo la bacteria Hfr l i s og erri ca transfie,·" S"U c r orrao s crria a una ba cee rta F-, ",1 profago se comporta como si fuera un grupo de genes de La bacteria. Mediante esta tt~cnica esposible determinar la posicion relativa del profago en "I g onorna bact e r i a.rro , .EI c r orrio s orria del Cago \ y el de los "Iambdoides" tienen aitios especlnCOS de union al c r orrio s orna bacteriano. A. seuneentre 105 genes de La bacteria responsable de 101. utilizacion de g a Iac eos a yde ta s In tes t s de biotina; 080 se une c e r ca, del gene responsable de Ia s lutesis de triptofano, etc. La s ec uenc Ia de los g"neB en e l profago ). ha sido cteterrru na da po r una varieda<l de to:'icnicas geniSticas y plante6 un interesante problema, ya que ",. diferente de Ia e rrc orrt r a.d a en e1 {ago vegetativo.

La s o l uc'i dn de este problema Cue sugerida po r A. Campbell (1962.) y po s te riorrnente co r r ob o r a.da en forma cxpe r+merita.L Des pues de Ia in£eccion, el ADN de ),_ s e ct r cul a r-l z a apa r ea ndo las r egiones monotenicas c ornp lern enta r-ta s yacentes en a-nab o a extrett:l.os, Ia Jnolecula circular s e aparea posteriormente COn e1 CrOmOBOma bactedano en Ia regi6n c crrip r e ndfd a entre los genes galactosaybiotinan.ediante la regi6n eornplementaria denorninada "integra.ci6n" en el mapa del fa g o , Una vez a pa rea da , basta un simple entrecruzarnieuto para qu" el ADN del rago s e insel'te en la forma dcscrita.

INMUNlDAD

Despues de infectarlas con un fago teInperado, a Ig una s bacteria" producen un de lo lrtico y ot.r a s uno lisoglmico; la. elecci6n entre ambos Irnp lt ea urra competencia entre des s e cuenctaa de e ventos biosinteticos, uno que conduce a la lnrnunidad y e l otro hacia Ia duplicaei6n del Cago. 5i la inmunidad Be establec e antes de unaetapairrevocable del cic!o l(tico,

este e s bloq_ueado y la celula da una. respuesta Lisogeni"a; como rcsultado de es ta Inrn unfda d, las ",Hulas son J" eSistente .. a una nueva infecd6n con el mismo fago (irrmunidad a /J"upel'infecci6n). Por e s ta r a",6n, al titular .. 1 fago ),. en agar en capa con bacterias sensible", las placas de lists a.parecen turhias debido a III. apadcion y proliferaci6n de bacterias lisog<inicas Lnrrrurre s , Las bases geneticas de la decisi6n entre ambos ciclos ban sido estudiadas ats lando mutantes incapaces deprovocar Una r es pue s ta lisog<inica, los que se pueden reconocer f;iciltnente por formal' pla.cas de !isis claras debido a s u incapacidad de generar bacteria" lisogenicas inmunes. Estos rrruta nte s pe rt erre c eri a s610 t r e s g r-upo s de complernentacion, cor respondientes a los cistrones C!, C1! Y Cllr• El producto de Cr parece s e r e1 unico as encial para produci r c.Hulas lisogenicas eetiabl.ee ; es una proteIna capaz de di£undirse en el protoplasm a bacteriano y tm i r s e a 1 ADN de I.. inhibiendo s u dup lt ca ctcn y p roduct endo aS11a inInunidada III. superinfecci6n. La Inznunt dad 0 e1 b Ioq ue o del ef c lo Iftico ha s Ido estudiada tambien utilizando mutantes Ilarnados ).. vh·, capaces de reproducirs e en celulas lisogenicas y par 10 tanto ins ensib 1" .... la imnunidad que r epr es entan e s tas. E a toa rnutante scan ti ene·n 11.1 rn euos tres sHios rnutados. De acuerdo con las caracterlsticas reden seii.aladas de la "in.munidad, Sa ha observado que e1 ADN de I.. vir no se une al represor deterIninado por el gene Cr. La Eo r rrra enque e l repre~Or inhibe 1 .. dupHca.ci6n autonom.a del AON de t.. aUves er e es os cu ra: pareee que Ia acci6n i.nmediata e s e1 bloq ue o de 1a tr a nscripci6n de ci er tos genes del fago que s e neeesitan para una respuesta tnica de las celula a infectadas.

81

INDUCCION

Los cultivos de ba cbe r i a a lis ogenicas contlenen c ie r ta cantidad de fagoa maduros; s u pres eneia 5 e debe a Ia lisi5 ocasional de algunas cEIula s que, e spontanearne nte , generan un cicIo li"tico. El cicio litico puede ser inducido po r medio de tratatn.ientos b a.s ea n t.e dj.v e r-s c s , pe r o que tienen en c orruin afectar Ia sIntesis 0 r eparaci6n del ADN; e1 de us o mae frecuente consiste en la irradiaci6n con luz u , v. que puede awnentar e1 ntime rc de las celu1as que generan UJ"I clclo Iltico a ca s i 100'0. Como 1 a l"z u. v. no inactiva al represorJ La inducd6n pa r e c e de be.r-s e a un "ambio en la actividad del profago, p r od uca do po r la. acumulaci6n de algun precursor del ADN 0 par Ia aparici6n de un inductor.

FAOOS TEMPERADOS DlSTlNTOS DE x

Un fago unico entre 108 temperados es e1 PI; este tiene un ADN de peso molecular 70 x J as daltones, y pres enta redundancia terminal. El ADN de este raga pued e s e e extraido de bacterias Il s og ern caa en forma circular, 10 que indica que a di!erencia de 1.., e l pro£ago no esM unido a1 cro'mOSOIna bacteriano. El profago de PL, sin embargo, a pe e a r de encontrarse libre en 1a celula para duplicarse en fartn. a aut6norna, 10 hace en sincronfa con e1 c r orrro a orria bacteria-no, manteniendo una c o pf a. de au genotna par genom ... bacteriano. EI ADN en conur-a do en los fago~ madur-o s e6 lineal; 1a fo r-rrra circular encontrada en el profago pa r e ce deberse al aparea.rniento de las r egj o ne a redundantes en los e:xtretn.os, ya una posterior r e cornb ina cd.Sn. De acuerdo can esta hip6tesis s e ha encontrado que el ADN del proiago es n~as corto que el ADN viral.

Se ccnc cen algunos otros Jag c s , como e 1 PZ y oeros reLacionados, que s e diferencian del)., pOl' no s e r inducibles y poder i ncor-p or-a rs e a una gran variedad de sitios d e l cz-orrios orna bacteriano. PZ s e distingu.e a.derna.s po r s u <;;apacidad d e actual' c orn o "a.sistente" del virus bacteriano" ~atelite" P4. Este £ago debe e1 caHficativo de" sat.Hite" a suincapaddad de prolif".1'a" independientemente; solo pu ade multiplica,.>;., en pres en cia de PZ 0 de ot.ro de, los fa.g o s r-e Ia d onado S y sed ebe en saya t: en celulas lisogenicas para P2 0 £agos reladonados. El ADN del P4 tiene LID peso rno l e cu l a r- de '1610 7 ~ 10" daltones y e a z e ce de va r Lc s genes nec e.s a r i os para s u repro<.luecion que e,stan presentee en Pl. La reproduc cton de P4 r equi.e r e todos los genes que determinan Ia cola de P2 y Ia rr>ayor{a de los que detcrminan s u cabe",a, s u cola e s identica a Ia de P2., p e ro s u cab eaa e s mas pequena. At cultivar 1'4 en eelu!as lisogen i ca a, 1'2. aema ~OmO as;stente en el e a ta do de profago, sin .de a pz-e n> derse del cromosoma ba cte rda no ,

CONVERSION DE ALCiUNAS 1'.ROPIEDADES BAGTERJANAS POR EL PROFACO

82

Des de sud esc ub riln; errto la Ii s oge oia s e 113 utiHzado como modelo para explicar 101. a c c'i on de los virus oncogenicos. Algunos virus oncogenicos, al igual que los fagos ternperados, integran su genoma con e l de las e,!lulas, produciendo una modificaci6o bereditada des us propi,,da.des , La conversion de 1 a rn o rIo logfa 0 pigmentaci6n de las colorria e de. ct er ea.s c epa s cbs ea-vada s en <:;elulas Hsogen.icas, ha ce aun mas apropiadaesta c orrrp a r-a c idrr, La i nrrnrni da d adqui,dda pOl' las cetula5 H" o.· gonicas, ya mencionada, e s LIn ej ernplo do modi,ficaci6n. Los' mas notables ej e rrrp Io.s de co'nv e r a i6n s o n 10'. carnb ios cbs e r va d os en los antt'genos somaticoB de Salmonella y la apa r l.ci.Sn de toxicidad en C'Ol'yrwbaqt;el'iWl'! diphtel'iae. El P<a:a e s ca.usa de Ia "-paddon de un nuevo. an~ tig e no en Salmonella, que e-e s ul ta de 1a induecion de una enz irna por 01 p"o.iago; esta actiia en e1 meta'bolismo de los polisacaridos, que II on los

dete r rri.i ria nbe s antigenic:os sornatic;C>$ en e.e tas' bacterias. En '$1 ca s 0 de

C. diphteriaa, las ce pas que p r oduc en toxrna s c o nti e nen p.r o fag o del g eupo deno,rninado B, Y las cepas n o pat6genas a e pueden co nv e r t-i z en texicoas pel" liaogen;_,.,aci6n COn es to's mismos fagos.

T RA NSDUCC 16N

N. Zind"r y J. Le.d a r b e rg (j 952) descubderonque e 1 fa.g o teUlperado P22. de S. typhimuriwn puede transferir 0' tra.nsducir ca ra cte r es geniitlcos entre <:;·epas, ba cte r-ta nas r e.Ia ciona da s , CO'InO de una gran var'iedad de genes, e.ua Iqu i.e r a pued". e r transciucido por e I fago, a e habla de transducClion qenera Uzada pa r a dis ti nguirla de la res trin.gida obs e rva da en ~.. Un lisado de Iagos tem.pera,do.s cxrn a i s t.e en una rrs e z c Ia de pa rtfculas transductoras y no t ra ne duc to r a s , Ambos tipO'S no son distin.guibles P'H' a us prepi"dades fi s i.c oqufrrri.c a s 0 s e r o l og Lc a s J pero. S rio son po r au actividad biol6gica; las partlcuLas transducteras Son i.ncapa,ces de prov o ca r un cre lo liaogenico y gen.eralmente tarnpoco pued en p r ovoca r wco li'ti co. Es ta s pa rti'culas son Iun c iona lmente ,ncomp1etas (defecti vas j debrdo a que parte de 5U ADN esW; r e ernpta eauo per un trozo. de ADN bac te r ia no: G uarido Ia partie"la t r ans du ctor a inyecta au ADN, e l fragmente del c r ornos orna bacteriano pu ed e e- e cornbf na r s e r-e errrpla aando los genes hom6Logos en Ia bacteria.

El bacteriofago l.. solo p ue d e transdudr los genes gal y bio, entre Itl$ e ua Le s 5 e integra a I geriorrra celuIar, transduccion e8pe~tal.il!<2da .. ( :>oj La pres encia de fagos transductores en las Hsados obt e nidos pe-r- inducci6n de celulas Uaogenicas se debe a e r r or es en el proceso de e s ct s i Sn del profago; e s to s errores producen fa g o s defectivos que ban p e r da do ADN vh·al y adquirieron ADN bactedano. Los fagos ~. transduc:tores s e denominan )'_dg p. defectivo-galactos a) y l.. dbio (1. def e ctivo-biotina I. La secuencia de Los genes presentes en e s to s do s tipos de fagos e s la siguiente:

Profago

Gal Integraci6n RegulaCi6n ADN Lisis Cabeza Cola Bio

I ••.

).dg

~ ~A~.d~b~iO=- I

La frecuencia de la transduccion del caracter gal+ a bacterias gar po r un hsado de ce1ulas lisogenicas pa r a X es baja , de 10 ..... a 10""'. Si, en cambio, e l lisado s e obtiene p o r- +rrd u c c'i Sn de celulas lisog.,nicas, para Adg, s e log r a un alto poder de trans due cion por Ia liberacion de part{culas Adg no infecciosas.

BACTERlOCINAS

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Mucbas cepas bacterianas producen una gUS tancia llamada baaeer-iaoina, que e s letal para c epa s relacionadas. Las bactedocinas productda s por E. coU se l1aman CJolicinas, las de Pseudononae aeruginosa, piocinas, etc. Las ba c te ria" no s ecretan bacte riocinas de 1.11\ rri od o continuo sino que, al igua1 que los fagos t errip e r-a dc-s , ,"stas son liberadas de subito par a.lgunas celulas del c u ltav o , y, a dilerencia de estos, SOn incapaces de reproducirse debido a que estan cons tituidas S olarnente por protei'nas. Las cell1las son in:rnunes a Ia bacteriocina que producen, del :m.ismo modo que las celulas lisogcnicas La son 11.1 fago temperado; el mecanismo de i nm unfda.d , sin embargo, e s diferente. En las celulas lisogenicas, la imnunidad se debe a1 bloqueo de Ia expresion y duplicacion del genoma vi.ral, rrte ca nt s mc que {alta a la.s bacteriocinas puesto que no contienen acido nuclei co. El rn e card s rno de acci6n de las diferentes Ibacteriocinas e s distinto y pucde causar catnbios en III. p e r rri e a b i Ia d a d de 1a bacteria, bloqueo del metabolisrno, degradacion de ADN, etc. La ob s e rva cion a.I mi cros copi 0 e1 e c tr oni co de 'I ue ci e. rtas ba cte riocinas tien e n una cstructura ca s i identica a III. de algunos. bacteri6fagos, demues t ea s u gran si:rnilitud a los fagos tem.perados Jill

La babiLidad de ciertaa c e pa s para producir una ba ct.e r-roc lria y para inmunizars e contra esta Ia dete rmina un elernento genetico a c e e s o r t o llamado faat;aro bactBI'ioainogeniao. En E. coli, e s te factor [oo l i c i n og e> nico 0 factor col) consiste en un ADN ct r c ular de un peso rrro l.o c-a l'a r de 5 x 107 dalton e s y s e duplica en forma autonorna., si bi e n en sdn cr-onfa con e1 c r-orrro s orria celular, a I tg ua I que e1 profago PI. La induccion de colicina con luz u , v , e s tdrrru Ia a d erria.s III. dupf Ic a e i on independiente del factor col.

AORADECIMIENTO S

E 1 a lito r de 5 ea 5 ince r arnente ag,radece r las criti ca s y sug e r encia 9 de sus colegas E liana GaneIo, Va.lentina Riveros y Bertold Fridlend"r. La. gran ayuda aportada par eUos tuvo Una importante i.nfluencia en 1a c I.a.-idad de "st" Hb r n .

*

La OEA agradece a. lOB siguientes autores y casas edi.toriai" .. Ia a utorizaci6n de reproducir las figura!> que i Ius t.r a n e s ta monograf{a,

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PubHcada.s

COLECCION DE MONOCRAFlAS CIENTlFfcAS

Serie de mat ernat tc a

N' 1.
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La Revolucionen las Mate rnatt ca s Escolares, po r- el Consejo Nacional de Maestros de Matematicas de los Estados Unidos de America.

Espacios Vectoriale 5 y Geometr{a Ana Hi i ca , po r Luis A. 5antal0.

Estructura. Algebraica. s , par Enzo R. Gentile.

Historia de las Ideas Modernas en Ia Matematica, pOl' Jose Babini.

Algebra Lineal, pOl' Orlando Villamayor.

A Ige bra Linear e Geornet ria Eu c:lidiana, po r A Iexa nd r e Augusto Martins Rodrigues.

EI Concepto de Niirne r o , pOl' Cesar A. Trejo. Funciones de Variable Cornpleja, po r Jose 1. Nieto. Introducd.6n a La Topolog(a General, po r Juan Ho r vath , Fun<;i5es Reais, po r Djat ro G. de Figueiredo.

ProbabUidad e lnferencia Es tad{ sti ca ,pOl" Lui .. A. Santalo. Estl'ucturas A 1gebraicas II I Algeb ra Lineal), par Enzo R. Gentile.

La Revolud6n en las lvlaternatkas Escolares (Segunda Fa ae}, 89

pOl' Howard F. Fehr, John Camp y Howard Kellogg.

Estructuras Algebraica .. III_(Grupos Finitos), po r- Horado

O'Brien.

N' 1. Concepto Moderno del Nucleo, par D. Allan Bromley.

N" 2.. Panorama de la Ast ronornfa Moderna, par Felix Cernuschi y Sayd Codina.

N' 3. La Estructura Electronica de 109 Solidos, par Leopolda M.

Falicov.

N' 4. F{sica de Pal"tlculas, pOl' tgor Saavedra.

N' 5. Expe riInento, Razonamiento y ereacion en F(sica, po r Felix

Ce r-nus chl .

N° 6. Se rrri.con du cto r e s , par Geoz-ge Bexnski.

N' 7. Acelerado r e s de Part[culas, par Fernando Alba. Andrade. N' 8. F{eica Cuant l ca , po r Onofre Raja y H. Mclntosh.

N. 9. La RadiacionCosrnica, po r Gaston R. Mejfa y Ca.rlos.Aguirre.

Serie de qu:rrnica

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N' 7. Cinetica Qu{mica. Elemental, pOl' Harold Behrens Le Bas. Bioenergetica, pOl" Isaias Raw y Walter Colli. MacrornolecalaB,. po r Alejandro Paladini y M. Burachik. MecanisrnD de las ReaccioneB Organicas,por Jorge.A. Brieux. Elementol'! Encadenado", pOl' Jacobo Gomez Lara. Ensefianza de laQu[rnica Experimental, par Francisco Gi ra l , Fotoqulmica de Ga s e s , pOl' Ralf-Dieter Penzhorn.

Seri .. de biologfa

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En preparad6n

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La Taxonorrria y 1a Re vo Iuc ion en las Ciencias Biologicas, por El{a s R. de Ia Sota.

P'r-in c lpto s Basieos para la Ensefianza de Ia Biolog{a, par Oswaldo F'r ota e Pe s s oa ,

A Vida da Celllla, por Reriaro Basile.

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Biosi"n.tesis de Protema" y e l C6digoGenetico, par Jorge E. Allende.

Fundamentos de Inmuno logfa e Inmunoqufmica, po r Felix Cordoba Alva y Sergio Estrada- Par r a.,

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Estructuras A 1gebraicas I V (Teor;'a de Guerp_os l, pOl' Darl'o J. Picco. Estructuras Algebraicas V (Estructura de Algebras), par A r+ibano Micali.

Serie de fi'aica

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Caieulo de Er ro r e s , Apttca ctfin y Teorfa, par Wolfgang Meekbach.

Serle de qu1'mica

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dares.

Estereoqu{rnica Organica, par Juan A. Garbarino.

Resonancia Magnetica. Nuclear de Hidrogene, po r Pedro Joseph-

Nathan.

Cromatog rafi'"a en Papel yen Capa Delgada, po r Xorge.A. Dom{nguez. Momento Polar, par Pedro Lehman.

Actividad 6ptica, Dispersion Rotatoria Optic a y Dte rofsmo Circular en Qu{mica Organica, pOI' Pierre Crabbe.

Po la rog ra rfa , par Alejandro J. A ['v(".

Fotorneb-{a de Llama. por ElTlision y par Ab so r ci on Atomica, por

J'uan Ra.m!'rez Muiioz.

Espectros cop ia Infrarraja, po r Je sus Morcillo Rubio.

C romatog raf1a de Gase s , po r Ha ro ld M, MeN ai r y Benja m{n Es qu tv .. 1. Cromatografra Llquida de Alta Presion, par Harold M. McNair y

Berrja rnfn Esquivel.

Introdu<;;ao a Espectrornetria de Massa da s Substiindas Organicas, po r Otto R. Gottlieb.

Los Esteroides, por JosafE. Herz.

Mod e rno s Aspectos de La Co r r os io n, por T. Markovic y E. G. Le6n Lopez.

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Fermentaciones, po r Carlos del RlO E.

Transferenda de Material Genetico, par Manuel Rieber.

Relacion HuespedMParasito, par Manuel Rodr(guez Leiva. Proeesas Microbianos Aerobios de hnportanda Industrial, por

Carlo 8 Casas -CalJ"lpillo.

Mic o logfa , pOI' Margarita Silva-Hutner y William G. Merz ..

Los Sistemas Ecologicos y el Hombre, por Francesco di Ca.st r i , BiogeografLa de Amedca Latina, por Angel L. Cabrera y Abraham

Willink.

Inventario de Ve ge ta.cfcn de Bi o ma s , por Jorge Morello. Microbiologfa de Sue Io s , por Luis Longed Spada.

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