AN. VET. (MURCIA) 19: 61-76 (2003). COLINESTERASA: FACTORES PRE Y ANALÍTICOS. TECLES, F. y CERÓN, J. J.

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DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE COLINESTERASA

EN SANGRE ENTERA DE ANIMALES DOMÉSTICOS: FACTORES PRE
Y ANALÍTICOS

Spectrophotometric whole blood cholinesterase determination: preanalytical and analytical sources

of variation

F. Tecles, J.J. Cerón

Departamento de Medicina y Cirugía Animal
Universidad de Murcia
30100 Espinardo (Murcia)
Telf: 968 36 70 82
Fax: 968 36 41 47
Correspondencia a: ftecles@um.es

RESUMEN

En el presente trabajo se describen aquellos factores pre y analíticos que pueden influir sobre la determinación
de colinesterasa en sangre entera de animales domésticos, provocando variaciones en los resultados. La
importancia que supone el conocimiento de estos factores radica en la posibilidad de controlarlos con el fin de
optimizar la precisión y exactitud de los análisis.

ABSTRACT

In this paper preanalytical and analytical factors that can affect whole blood cholinesterase determinations
are described. Knowledge of these factors is important since their proper control allows to optimize the
precision of cholinesterase assays.
Key words: Colinesterasa, variabilidad, sangre entera, factores preanalíticos, factores analíticos

INTRODUCCIÓN condiciones hidrolizan a los ésteres de la colina.

Su principal función fisiológica tiene lugar en el
El término colinesterasa (ChE) hace refe- tejido nervioso, donde juega un importante pa-
rencia a una serie de enzimas que bajo óptimas pel en la destrucción del neurotransmisor
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Cuadro 1. Características principales de las enzimas con actividad colinesterasa

Nombre común Acetilcolinesterasa Butirilcolinesterasa

Colinesterasa verdadera Pseudocolinesterasa

Nombre sistemático Acetilcolina acetilhidrolasa Acilcolina acilhidrolasa

(EC 3.1.1.7) (EC 3.1.1.8)

Lugar de síntesis Médula ósea Hígado

Localización Membrana de neuronas Plasma, hígado, músculo liso,

Membrana de eritrocitos intestino, páncreas, músculo
cardíaco y tejido nervioso

Función En tejido nervioso: eliminar

exceso de acetilcolina Desconocida
En eritrocitos: desconocida

Sustrato Acetilcolina, propionilcolina Butirilcolina, propionilcolina y

acetilcolina

Inhibición por Alta concentración del sustrato Tetraisopropilpirofosforamida

Etilparatión Mevinfos
Rivastigmina y fisostigmina Derivados fenotiazínocos

(Fuentes: Gage 1967; Wills 1972; Augustinsson et al. 1978; Harlin 1991; Sanz et al. 1991).

acetilcolina (ACh) a nivel de las sinapsis del tales pesados y detergentes (Guilhermino et al.
sistema nervioso central y sistema nervioso pe- 1998). Por ello, un nivel disminuido de activi-
riférico. No obstante, esta actividad enzimática dad colinesterasa en tejidos de origen animal
también podemos encontrarla en otros muchos es un signo fuertemente indicativo de que se
tejidos orgánicos, aunque su función en ellos ha producido algún tipo de exposición a un
permanece desconocida. Principalmente, exis- agente inhibidor de esta enzima. El uso de la
ten dos enzimas con actividad colinesterasa: determinación laboratorial de colinesterasa
acetilcolinesterasa (AChE) y butirilcolinesterasa como biomarcador está muy extendido, ya que
(BChE). Esta clasificación está basada en la lo- es un método simple, rápido, barato y no
calización tisular de la enzima, la especificidad invasivo, susceptible de ser automatizado en el
de sustrato, y en la susceptibilidad a inhibición laboratorio, y presenta como ventaja sobre la
por diferentes sustancias. Las características más determinación directa de los contaminantes que
importantes de cada una se describen en el cua- no precisa de la utilización de sofisticados equi-
dro 1. pos. Además, los insecticidas son rápidamente
Las enzimas con actividad colinesterasa degradados en el medio ambiente y
pueden ser inhibidas por ciertos agentes quí- metabolizados en los tejidos animales, lo que
micos como los insecticidas organofosforados dificulta todavía más su detección directa
(OP) y carbamatos (CB), así como ciertos me- (Hatch 1988).
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La colinesterasa puede ser analizada en un Entre los mayores problemas que presenta
gran número de tejidos orgánicos, pero su deter- la determinación de colinesterasa se encuentra
minación en sangre entera ha demostrado pre- la falta de unos parámetros analíticos
sentar una serie de ventajas, como: la facilidad estandarizados, pues los laboratorios de referen-
de obtención y manejo de las muestras, la posibi- cia suelen utilizar modificaciones del método
lidad de analizar acetilcolinesterasa y de Ellman y preparar sus propios reactivos, mien-
butirilcolinesterasa en la misma muestra sin ne- tras que otros prefieren emplear kits comercia-
cesidad de separar plasma y eritrocitos, la utiliza- les (Wilson et al. 1997), lo que da lugar a una
ción de un volumen reducido de muestra, y la falta de homogeneidad en los resultados. Así,
falta de interferencia de la hemólisis en los análi- en estudios desarrollados por Harlin y Ross
sis espectrofotométricos (Tecles et al. 2000). (1990), Christenson et al. (1994) y Marden et
Además, se evitan la baja reproducibilidad y sen- al. (1994) se encontraron unos coeficientes de
sibilidad que muestran las determinaciones de variación (CVs) superiores a un 20% cuando se
colinesterasa en eritrocitos (Wilson et al. 1996). compararon resultados obtenidos por distintos
Los procedimientos analíticos desarrollados laboratorios que analizaron una misma serie de
para la determinación de colinesterasa son muy muestras. Por tanto, los posibles cambios y mo-
diversos, pero los más empleados actualmente dificaciones de los parámetros de medida cons-
son los colorimétricos, que se basan en la detec- tituyen fuentes de variación analíticas, cuyo co-
ción de la tasa de desaparición del sustrato de la nocimiento y control posee gran importancia de
enzima o de aparición del producto de la reac- cara a mejorar la calidad y precisión de los re-
ción. La técnica espectrofotométrica más utili- sultados, así como a permitir la realización de
zada es el método de Ellman (Ellman et al. comparaciones entre laboratorios distintos.
1961), empleado tanto en sangre como en di- Otro problema que contribuye a la falta de
versos tejidos (Fairbrother et al. 1989), así como homogeneidad de los resultados es el manejo
en una gran cantidad de especies animales (Hill inadecuado de las muestras previo a su análi-
y Fleming 1982). Es además el procedimiento sis, sobre todo en lo referente a las condiciones
que más facilmente se adapta al uso de de almacenamiento (Wilson et al. 1997). Estos
analizadores automáticos (Humiston y Wright factores constituyen fuentes de variación
1967). Se basa en la hidrólisis del sustrato preanalíticas, que actúan al margen de las con-
acetiltiocolina (ATCh) por la enzima diciones analíticas empleadas pero que tam-
colinesterasa. La tiocolina liberada reacciona con bién son susceptibles de provocar cambios en
un cromóforo, el ácido 5,5’-ditiobis-2- los resultados, y por tanto deben ser controla-
nitrobenzoico (DTNB), dando lugar como pro- das.
ducto de reacción al ácido 5-tio-2-nitrobenzoico, A continuación se describirán, de forma bre-
compuesto de color amarillo cuyo máximo de ve y resumida, las diversas condiciones que pue-
absorbancia se encuentra entre 405 y 420 nm de den constituir una fuente de variación, afectan-
longitud de onda, con un óptimo en 412 nm do a la determinación de colinesterasa mediante
(Humiston y Wright 1967). La tasa de aparición métodos espectrofotométricos.
del producto de la reacción es mayor conforme
aumenta la actividad enzimática existente en la Fuentes de variación preanalíticas
muestra. Una concentración elevada del
cromóforo puede producir una inhibición de la Se producen en la fase previa a la realiza-
enzima, por lo que la concentración recomenda- ción del análisis de la muestra. Se incluyen va-
da de DTNB es de 0,08x10-3 M (Cerón et al. riaciones debidas al paciente (variabilidad bio-
1996; Dass et al. 1997). lógica) y a la obtención y manejo de la muestra.
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Cuadro 2. Causas de variabilidad biológica en la actividad colinesterasa sanguínea

Edad • AChE reducida en neonatos

• BChE reducida en cobaya y rata jóvenes
• BChE incrementada en ovino y caprino jóvenes

Sexo • BChE reducida en hembra de cobaya y vacuno

• BChE incrementada en hembra de ratón y rata
• BChE similar en hembra y macho de equino, porcino, caprino, canino,
felino, criceto, conejo y humano

Estado • BChE incrementada en:

reproductivo - rata: segunda mitad de gestación
- especie humana: menopausia
• BChE reducida en:
- especie humana: menstruación
- rata: primera mitad de gestación, parto y lactación

Estados • AChE incrementada con altitud y reticulocitosis

patológicos • AChE reducida en anemia, leucemia y mieloma
• BChE incrementada en insuficiencia renal, hipertiroidismo, diabetes
e hipertrigliceridemia
• BChE reducida en insuficiencia hepática, cáncer y caquexia

(Fuentes: Beveridge y Lucas 1941; Sawyer y Everett 1946; Wills 1972; Ecobichon y Coumeau 1973; Chow y Ecobichon
1975; Sidell y Kaminskis 1975; Bell y VanPetten 1976; Anderson 1983; Haas et al. 1983; Mount 1984; Lepage et al. 1985;
Cove et al. 1986; Harlin 1991)

Variabilidad biológica Por este motivo, serían de poca importancia para

los rumiantes, donde la isoenzima eritrocitaria
La variabilidad biológica es aquella que de- supone el 80-90% de la actividad colinesterasa
pende de forma implícita del individuo. Puede total de la sangre (Munro et al. 1991). El cuadro
dividirse en dos grupos: variabilidad interindi- 2 recoge de forma resumida los diferentes estu-
vidual e intraindividual. La variabilidad interin- dios realizados sobre el efecto que determina-
dividual se da entre individuos de una misma dos estados fisiológicos de los animales pueden
especie, y puede llegar a suponer hasta un 30% provocar sobre la actividad colinesterasa en san-
de la actividad colinesterasa (Munro et al. 1991). gre.
La variabilidad intraindividual se produce
por factores relacionados con el estado fisio- Efecto de la hemólisis
lógico del animal, como pueden ser la edad, el
sexo, el estado reproductivo y la salud del indi- Cuando se utiliza sangre entera para deter-
viduo. En lo referente a la edad de los animales, minar la actividad colinesterasa mediante el
género y estado reproductivo, parece ser que método de Ellman, las muestras deben ser di-
afectan más a la actividad colinesterasa luidas antes de ser analizadas. El objetivo de
plasmática que a la eritrocitaria (Mount 1984). esta dilución consiste en disminuir la concen-
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tración de hemoglobina en el medio de reac- nea en el medio de reacción, y a que se evita la

ción, ya que su alta concentración provoca un interferencia provocada por el movimiento de
elevado pico de absorbancia que enmascara sedimentación de los eritrocitos (Cerón et al.
cualquier cambio ocurrido durante la reacción 1999). El único inconveniente que presenta el
(Willig et al. 1996). Los diluyentes que se han empleo de diluyentes hemolizantes consiste en
empleado hasta ahora se pueden dividir en dos que el glutatión, que se encuentra en el interior
grupos: de los eritrocitos, se libera tras la hemólisis al
— diluyentes que provocan hemólisis de la medio de reacción. La molécula de glutatión
muestra, como el agua destilada, el de- contiene grupos sulfhidrilo que pueden reaccio-
tergente no iónico Tritón X-100, y la nar con el cromóforo dando lugar a un falso
saponina; incremento en la actividad de la enzima (Tietze
— diluyentes no hemolizantes como la so- 1969; Dass et al. 1994). No obstante, este pro-
lución salina isotónica, tampón fosfato blema puede evitarse utilizando un blanco adi-
0,1 M y la albúmina sérica bovina. cional compuesto por cromóforo y muestra en
Es preferible el empleo de diluyentes ausencia del sustrato.
hemolizantes, ya que proporcionan mayor pre-
cisión a la determinación de colinesterasa en Empleo de diferentes anticoagulantes
sangre y permiten detectar una actividad
enzimática más elevada. Esto se debe a que con Cuando se determina la actividad colines-
la hemólisis la enzima queda liberada de su unión terasa en muestras de sangre entera, es necesa-
a la membrana del eritrocito (Tarrab-Hazdai et ria la utilización de anticoagulantes. La figura 1
al. 1984), por lo que se consigue una mayor muestra la actividad colinesterasa en una misma
solubilización y una distribución más homogé- serie de muestras de sangre entera de perro ob-

Actividad ChE Anticoagulante

(µmol/ml/min) Heparina
1,8 EDTA
1,6 Citrato
1,4 Fluoruro
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
ATCI BTCI PTCI
Sustrato

Figura 1. Efecto de diferentes anticoagulantes en la determinación de colinesterasa en sangre

entera con tres sustratos. La actividad colinesterasa se expresa como µmol de sustrato hidrolizados/
ml de sangre/minuto. ChE (colinesterasa); ATCI (acetiltiocolina); BTCI (butiriltiocolina); PTCI
(propioniltiocolina). (Fuente: Tecles et al. 2002).
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tenidas con cuatro anticoagulantes diferentes: Cuadro 3. Estabilidad óptima de la

heparina, ácido etilendiaminatetraacético colinesterasa en sangre entera en diferentes
(EDTA), citrato sódico y fluoruro sódico (Tecles especies animales
et al. 2002). En base a estos datos se deduce que
Especie Estabilidad óptima
tanto la heparina como el EDTA pueden ser
utilizados para la determinación de colinesterasa Canina Hasta 1 mes a –20º C
en sangre entera, ya que no afectan a la activi- Equina Hasta 6 meses a 4º C
dad de la enzima. Sin embargo, se desaconseja Bovina Hasta 7 meses a 4º C
el uso de fluoruro sódico al provocar una leve Caprina Hasta 6 meses a –20º C
inhibición de la actividad butirilcolinesterasa.
Este efecto del fluoruro sódico fue descrito en (Fuentes: Halbrook et al. 1992; Tecles et al. 2002).
trabajos anteriores, aunque en ellos se detectó
una inhibición mucho más marcada y rápida determinación espectrofotométrica de la
(Jones 1985; Klette et al. 1993) colinesterasa, por lo que la estabilidad de las
muestras ya diluidas también debe tenerse en
Estabilidad de la enzima en muestras cuenta. Así por ejemplo, la sangre humana di-
almacenadas luida y congelada resulta más estable a largo
plazo que la no diluida, por lo que se ha llegado
Normalmente se ha indicado que las mues- a utilizar como control de actividad colinesterasa
tras de sangre deben ser mantenidas en refrige- (Meuling et al. 1992). En la sangre de las espe-
ración o en hielo picado desde que son obteni- cies canina, equina y ovina la estabilidad de la
das hasta que son analizadas en el laboratorio colinesterasa a –20º C resultó similar entre las
(Witter 1963). Estudios más recientes indican muestras diluidas y no diluidas; sin embargo, a
que el mantenimiento a temperatura ambiente 25º y 4º C las muestras diluidas perdieron rápi-
también puede ser adecuado cuando transcurre damente su actividad colinesterasa (Tecles et
poco tiempo desde la obtención de la muestra al. 2002).
hasta su análisis, pero no cuando se precisa de
un almacenamiento prolongado (Tecles et al. Fuentes de variación analíticas
2002). En general, la capacidad de conserva-
ción de la colinesterasa de la sangre a largo Son las que implican al propio método ana-
plazo parece depender no sólo de las condicio- lítico. Entre los factores que describiremos a
nes de almacenamiento empleadas, sino tam- continuación tenemos la temperatura y pH del
bién de la especie animal. De este modo, se ha medio de reacción, los reactivos empleados
observado que si bien la conservación a –20º C (cromóforos y sustratos) así como la concentra-
proporciona estabilidad durante más tiempo a la ción y estabilidad de los mismos, y los ciclos de
colinesterasa de la sangre canina y ovina, en la lectura de absorbancia.
especie equina es preferible la refrigeración a 4º
C (cuadro 3) (Tecles et al. 2002). Algo similar a Efecto de la temperatura de reacción
lo que ocurre con la sangre equina fue descrito
para la especie bovina, indicando que las varia- Al igual que en otras determinaciones
ciones de temperatura que se producen en el enzimáticas, la actividad colinesterasa es depen-
interior de los congeladores puede afectar a la diente de la temperatura (figura 2), y en los
estabilidad de la enzima (Halbrook et al. 1992). mamíferos alcanza su máxima actividad entre
Como se ha visto anteriormente, la dilución 37º y 40º C (Witter 1963). La mayoría de los
de las muestras de sangre es necesaria para la autores recomiendan emplear una temperatura
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Actividad ChE
(µmol/ml/min)
1,8

1,6

1,4
1,2

0,8

0,6

0,4
0,2

0
25ºC 30ºC 37ºC 40ºC
Temperatura de reacción

ATCI BTCI PTCI

H.N.E. ATCI H.N.E. BTCI H.N.E. PTCI
Actividad no enzimática

Figura 2. Efecto de diferentes temperaturas en la determinación de colinesterasa en sangre

entera de perro con tres sustratos. La actividad colinesterasa se expresa como µmol de sustrato
hidrolizados/ml de sangre/minuto. ChE (colinesterasa); ATCI (acetiltiocolina); BTCI
(butiriltiocolina); PTCI (propioniltiocolina); H.N.E. ATCI (hidrólisis no enzimática de acetiltiocolina);
H.N.E. BTCI (hidrólisisi no enzimática de butiriltiocolina); H.N.E. PTCI (hidrólisis no enzimática
de propioniltiocolina). (Fuente: Tecles et al. 2002).

de reacción de 37º C (Humiston y Wright 1967; las determinaciones a 25º C (Nostrandt et al.
Wilson et al. 1996; Dass et al. 1997; Winters et 1993; Tecles et al. 2001).
al. 1997; Tecles et al. 2002), ya que si se utili-
zan temperaturas más reducidas se produce un Efecto del pH del medio de reacción
descenso en la actividad colinesterasa (Lewis et
al. 1981), mientras que temperaturas superiores El pH afecta a la capacidad del centro activo
a 40º C pueden provocar la desnaturalización de de la enzima para realizar un ataque nucleofílico
la enzima (Silver 1974). Sin embargo, si la sobre el sustrato, y de esta forma llevar a cabo
colinesterasa se encuentra inhibida por la ac- su función. Esto hace que la actividad enzimática
ción de un inhibidor reversible (carbamatos), dependa de forma directa del pH (Fairbrother et
una temperatura de reacción de 37º C puede al. 1991). En el caso de la colinesterasa, la acti-
provocar la reactivación de la enzima, por lo vidad óptima se alcanza en un intervalo de pH
que en estos casos sería recomendable realizar que oscila entre 8,0 y 8,5. No obstante, no se
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Actividad ChE
(µmol/ml/min)
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
7.0 7.5 8.0 8.5 9.0

pH

ATCI BTCI PTCI

H.N.E. ATCI H.N.E. BTCI H.N.E. ATCI
Actividad no enzimática

Figura 3. Efecto del pH en la determinación de colinesterasa en sangre entera de perro con

tres sustratos. La actividad colinesterasa se expresa como µmol de sustrato hidrolizados/ml de
sangre/minuto. ChE (colinesterasa); ATCI (acetiltiocolina); BTCI (butiriltiocolina); PTCI
(propioniltiocolina); H.N.E. ATCI (hidrólisis no enzimática de acetiltiocolina); H.N.E. BTCI
(hidrólisisi no enzimática de butiriltiocolina); H.N.E. PTCI (hidrólisis no enzimática de
propioniltiocolina). (Fuente: Tecles et al. 2002).

aconseja emplear un valor de pH tan elevado, Empleo de diferentes cromóforos

ya que se produce una hidrólisis espontánea de
los sustratos que eleva el valor del blanco y Aunque el método de Ellman puede ser fá-
puede disminuir de forma notable la sensibili- cilmente utilizado para la determinación de
dad del análisis, sobre todo si el pH excede de colinesterasa en sangre entera, su uso está limi-
7,5 (figura 3) (Tecles et al. 2002). Así, la mayo- tado por la similar longitud de onda de máxima
ría de los autores emplean un pH que oscila absorbancia existente entre el producto de la
entre 7,0 (Ellman et al. 1961; Lewis et al. 1981; reacción y la hemoglobina presente en la mues-
Tor et al. 1994) y 8,0 (Harlin 1991; Halbrook et tra (Augustinsson et al. 1978). El empleo de
al. 1992). Para la sangre canina no se describe cromóforos diferentes al DTNB tiene como ob-
una excesiva diferencia entre los resultados de jetivo la obtención de un producto de reacción
actividad colinesterasa obtenidos a pH 7,5 y 8,0 entre el cromóforo y la tiocolina que posea un
(figura 3), por lo que se recomienda la utiliza- máximo de absorbancia alejado del espectro de
ción de un valor de pH de 7,5 (Tecles et al. la hemoglobina, y de este modo evitar su inter-
2002). Sería recomendable ampliar estos estu- ferencia. Tal es el caso de la 2,2’-ditiodipiridina
dios para determinar el pH óptimo que se debe- (2-PDS), cuyo producto de reacción con la
ría utilizar en función de la especie animal. tiocolina, la 2-tiopiridona, posee su máxima
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Cuadro 4. Ventajas e inconvenientes del empleo de distintos cromóforos para la

determinación de colinesterasa en sangre entera
Cromóforo Ventajas Inconvenientes

DTNB • Utiliza la región visible del espectro. • Sensible a la luz.

• Es rápido, permitiendo detectar • Interferencia con la hemoglobina
inhibición por inhibidores reversibles. a 412 nm.
• Fácilmente automatizable. • Necesaria dilución de las muestras
de sangre.
• Reacciona con glutatión.

2-PDS • Puede utilizarse en sangre entera, • Reacciona con glutatión.

permitiendo el uso de muestras más • Inhibe colinesterasa a alta
concentradas. concentración.
• No es sensible a la luz.
• Permite utilizar un amplio rango de pH.

DTNA • Puede ser utilizado en sangre entera, • Reacciona con glutatión.

permitiendo el uso de muestras más • Inhibición de colinesterasa a alta
concentradas. concentración.
• No es sensible a la luz. • Difícil solubilización en soluciones
tamponadoras.

4-PDS • Mayor sensibilidad. • Reacciona con glutatión.

• Pueden ser utilizados sobre sangre entera, • Longitud de onda fuera del espectro
permitiendo el uso de muestras más visible.
concentradas.
• No son sensibles a la luz.

(Fuentes: Grassetti y Murray 1967; Humiston y Wright 1967; Brownson y Watts 1973; Augustinsson y Eriksson 1974; Dass
et al. 1994; Willig et al. 1996; Dass et al. 1997).

absorbancia a 343 nm de longitud de onda. Cuan- la inhibición de la enzima (Augustinsson y

do la hemoglobina deja de suponer un inconve- Eriksson 1974).
niente, es posible utilizar diluciones de sangre El ácido 6,6’-ditiodinicotínico (DTNA) fue
inferiores (Tecles y Cerón 2001), lo que permi- utilizado por primera vez por Brownson y Watts
te minimizar la reactivación de la colinesterasa (1973), y posteriormente por Dass et al. (1994)
(Wills 1972). La escasa solubilidad del 2-PDS y Willig et al. (1996). El producto de reacción
en las soluciones tamponadoras puede salvarse del DTNA con la tiocolina, el ácido 6-mercap-
realizando una dilución previa del cromóforo en tonicotínico, posee su máxima absorbancia a 340
un volumen reducido de metanol. La concentra- nm de longitud de onda. La concentración ópti-
ción ideal de este cromóforo fue determinada ma de este cromóforo fue determinada por Dass
por Cerón et al. (1996) en 0,08x10-3 M, aunque et al. (1997) entre 0,125 y 0,25x10-3 M, ya que
estudios anteriores indicaron que una concen- concentraciones más altas provocan una inhibi-
tración superior a 0,05x10-3 M podía provocar ción de la enzima. El principal inconveniente
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Actividad ChE
Sustrato
(µmol/ml/min)
ATCI
2,5
BTCI
PTCI
2

1,5

0,5

0
Perro Gato Caballo Vaca Cabra Oveja Cerdo

Especie

Figura 4. Actividad colinesterasa (ChE) en sangre entera de siete especies animales con tres
sustratos distintos: acetiltiocolina (ATCI), butiriltiocolina (BTCI) y propioniltiocolina (PTCI).
La actividad colinesterasa se expresa como µmol de sustrato hidrolizados/ml de sangre/minuto.
(Fuente: Tecles y Cerón 2001).

que presenta este cromóforo es su baja solubili- Tipo de sustrato

dad en soluciones tamponadoras y alcohólicas,
por lo que la preparación del reactivo para su Existen discrepancias a la hora de recomen-
uso requiere de calor y agitación constante dar la determinación de acetilcolinesterasa
(Willig et al. 1996; Tecles y Cerón 2001). (AChE) o de butirilcolinesterasa (BChE) para
El cromóforo 4,4’-ditiodipiridina (4-PDS), monitorizar la exposición a agentes inhibidores.
tras su reacción con la tiocolina, da lugar a 4- La AChE se considera más representativa de la
tiopiridona, cuya máxima absorbancia se en- enzima del tejido nervioso. Por otra parte, de
cuentra a 324 nm de longitud de onda. La forma general se admite que la BChE es más
absorbancia de la 4-tiopiridona a 324 nm es casi sensible a los OP que la AChE; aunque presenta
tres veces mayor que la de la 2-tiopiridona a como inconvenientes una mayor variabilidad
343 nm, por lo que su uso confiere mayor sensi- entre individuos, que su actividad se recupera
bilidad al ensayo. La concentración de este antes que la de AChE, y que puede verse inhibida
cromóforo puede oscilar entre 0,1 y 0,25x10-3 en mayor grado antes de la aparición de los
M (Grassetti y Murray 1967). El inconveniente signos clínicos (Iyaniwura 1991; Winters et al.
que presenta el empleo de este reactivo es que 1997).
la longitud de onda a utilizar se encuentra fuera De forma general se recomienda determinar
del espectro visible, por lo que se necesita de tanto AChE como BChE en una misma muestra
lámparas de cuarzo que no suelen estar presen- de sangre entera, ya que la inhibición de una u
tes en los autoanalizadores bioquímicos dispo- otra enzima depende en gran medida de las ca-
nibles en el mercado (Dass et al. 1994). racterísticas químicas del compuesto inhibidor
El cuadro 4 muestra las ventajas e inconve- (Wills 1972). Así por ejemplo, existen insectici-
nientes del uso de estos cromóforos. das organofosforados como el coumafos que
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Actividad ChE
(µmol/ml/min)
2,5

1,5

0,5

0
0.1x10-3 M 0.5x10-3 M 1x10-3 M 5x10-3 M 10x10-3 M

Concentración de sustrato

ATCI BTCI PTCI H.N.E. ATCI H.N.E. BTCI H.N.E. PTCI Actividad no enzimática

Figura 5. Efecto de la concentración de sustrato en la determinación de colinesterasa en

sangre entera de perro con tres sustratos. La actividad colinesterasa se expresa como µmol de
sustrato hidrolizados/ml de sangre/minuto. ChE (colinesterasa); ATCI (acetiltiocolina); BTCI
(butiriltiocolina); PTCI (propioniltiocolina); H.N.E. ATCI (hidrólisis no enzimática de acetiltiocolina);
H.N.E. BTCI (hidrólisisi no enzimática de butiriltiocolina); H.N.E. PTCI (hidrólisis no enzimática
de propioniltiocolina). (Fuente: Tecles et al. 2002).

inhiben tanto AChE como BChE (esta última total, y posteriormente se incuba con el inhibidor
con mayor intensidad), mientras que otros in- y se analiza de nuevo, determinando así la enzi-
secticidas como el carbamato dipropionato de ma no inhibida. De la diferencia de ambas se
imidocarb inhibe principalmente AChE (Tecles consigue la actividad de la enzima inhibida.
et al. 2000). De esta forma, en caso de exposi- B) Mediante el empleo de sustratos específi-
ción a un inhibidor selectivo, la determinación cos para cada una de las enzimas (Khan et al.
de una sóla de estas enzimas podría enmascarar 1988).
el proceso. Este último se apoya en la existencia de di-
La determinación de AChE y BChE en una ferencias en cuanto a la especificidad de sustrato,
misma muestra de sangre entera puede realizar- y ha sido recomendado por la British Association
se de dos formas: of Clinical Biochemistry (1980) y por el National
A) Utilizando inhibidores específicos para Comittee for Clinical Laboratory Standards
una de las enzimas, como es el caso de la iso- (1987). Así, la acetilcolinesterasa hidroliza prin-
OMPA (tetraisopropilpirofosforamida) o los de- cipalmente acetilcolina (ACh) en mayor o simi-
rivados fenotiazínicos como inhibidores selecti- lar grado que propionilcolina (PCh), mientras
vos de BChE (Augustinsson et al. 1978). La que la butirilcolina (BCh) no es hidrolizada. La
muestra se analiza para obtener la actividad ChE butirilcolinesterasa hidroliza BCh en mayor gra-
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do que PCh, mientras que la ACh es hidrolizada en el plasma. Así, las especies canina, felina y
muy lentamente (Dass et al. 1994). Aunque este equina presentan una elevada actividad
método no sea del todo exacto, ya que la butirilcolinesterasa en el plasma, mientras que
butirilcolinesterasa también es capaz de en los rumiantes y en el cerdo la actividad ChE
hidrolizar ACh en menor grado, es preferible al del plasma es casi inexistente.
uso de inhibidores específicos por la importan-
cia que supone la utilización de un sustrato óp- Concentración de sustrato
timo o adecuado para cada enzima (Wilson et
al. 1997). Además, su simplicidad permite una El comportamiento de la colinesterasa de la
fácil automatización y aplicación rutinaria en el sangre puede sufrir variaciones en función de la
laboratorio. concentración del sustrato (figura 5). En la es-
No obstante, una correcta utilización de este pecie humana, la máxima actividad se obtiene
método implica necesariamente la realización con una concentración de ATCh de 1x10-3 M
de estudios de caracterización de la actividad (Wilson et al. 1997). Sin embargo, en la especie
ChE en sangre entera de las diferentes especies canina esta concentración se ha estimado en
animales. Los estudios de caracterización reali- 5x10-3 M, y una concentración más elevada
zados en la especie humana recomiendan la (10x10-3 M) produce una inhibición de la enzi-
determinación de AChE y BChE en una misma ma (Tecles et al. 2002). Por el contrario, no se
muestra de sangre entera utilizando los sustratos describe inhibición de la colinesterasa sanguí-
acetiltiocolina (ATCh) y butiriltiocolina (BTCh), nea humana (Wilson et al. 1997) o canina (Tecles
respectivamente (Meuling et al. 1992). Sin em- et al. 2002) cuando se emplean concentraciones
bargo, las conclusiones obtenidas en este traba- de BTCh de hasta 10x10-3 M, por lo que po-
jo no se pueden aplicar a Veterinaria, ya que la drían utilizarse concentraciones incluso mayo-
capacidad de hidrólisis de estos sustratos por las res. En el caso del sustrato propioniltiocolina
diferentes enzimas de la sangre varía en función (PTCh) la máxima actividad en la sangre canina
de la especie animal (Dass et al. 1994). La figu- se obtiene a 5x10-3 M, sin describirse inhibición
ra 4 muestra la actividad colinesterasa de la al emplear concentraciones superiores (Tecles
sangre de varias especies animales, que se clasi- et al. 2002).
fican en tres grupos atendiendo a su afinidad La hidrólisis espontánea del sustrato se
por los diferentes sustratos (Tecles y Cerón incrementa de forma considerable cuando su
2001): concentración en el medio de reacción supera
— el primer grupo incluye a las especies 1x10-3 M (Tecles et al. 2002). Si este aumento
canina y felina, que poseen elevada afi- es lo sufientemente elevado, puede enmascarar
nidad por el sustrato ATCh, y en menor cambios de poca magnitud en la absorbancia, lo
grado por BTCh y PTCh. que restaría sensibilidad al análisis. Por tanto,
— el segundo grupo comprende a la especie se ha recomendado utilizar una concentración
equina, que hidroliza los sustratos PTCh de 1x10-3 M con los sustratos ATCh, BTCh y
y BTCh, y en menor grado de ATCh. PTCh, ya que proporciona elevada actividad y
— el tercer grupo incluye a las especies bo- escasa hidrólisis espontánea (Tecles et al. 2002).
vina, ovina, caprina y porcina, que se No obstante, las concentraciones recomendadas
caracterizan por una elevada afinidad por y empleadas por lo diferentes autores son muy
ATCh, siendo muy escasa o nula para diversas: para la ATCh 0,49x10-3 M (Ellman et
BTCh. al. 1961; Harlin y Ross 1990; Halbrook et al.
Parece ser que la causa de esta distribución 1992), y entre 4,5 y 5x10-3 M (Knedel y Bottger
es la presencia de actividad butirilcolinesterasa 1967; Meuling et al. 1992; Marden et al. 1994);
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para la BTCh entre 1x10-3 M (Singh 1985) y necesario un conocimiento exhaustivo de estos
7x10-3 M (Meuling et al. 1992). factores con el fin de poder controlar su influen-
cia y optimizar tanto la precisión como la exac-
Efecto de variaciones en el número y duración titud de los análisis.
de los ciclos de lectura
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zadas durante la reacción (ciclos) y intervalo de Anderson P. 1983. Studies on the toxicity of
tiempo existente entre lecturas influyen en el certain organophosphorus pesticides in
resultado final. Así, para analizar la actividad ruminants with special reference to
colinesterasa en sangre canina debe emplearse differences in their mode of action. Tesis
un mínimo de 4 ciclos de lectura, ya que con 3 doctoral. Universidad de Londres, Reino
ciclos se produce un descenso de actividad. De Unido.
la misma forma, si la duración entre ciclos es de Augustinsson K.B., Eriksson H. 1974. The effect
15 segundos se observa un descenso de activi- of two disulphides on cholinesterase activity
dad, por lo que se debe emplear un tiempo no in the spectrophotometric assay. Biochem.
inferior a 30 segundos, pudiendo ser de incluso J. 139: 123-127.
60 o 90 segundos (Tecles 1998). La precisión Augustinsson K.B., Eriksson H., Faijersson Y.
del ensayo no se modifica al utilizar ciclos de 1978. A new approach to determining
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et al. 1981; Tecles et al. 2002). A 4º C pueden serum cholinesterase variability in male and
almacenarse durante un máximo de 2 semanas female rats. Science 93: 256-357.
sin que se altere su capacidad para la determina- British Association of Clinical Biochemistry.
ción de colinesterasa. En cuanto a los cromóforos 1980. Proposed methods for determination
2-PDS y DTNB resultan estables al menos du- of some enzymes in blood serum. News
rante 3 meses en congelación, refrigeración e Sheet Assoc. Clin. Biochem. 202: 31s.
incluso a temperatura ambiente (Tecles et al. Brownson C., Watts D.C. 1973. The
2002). Esto va a incrementar la sencillez y el modification of cholinesterase activity by
rendimiento económico de la preparación, por 5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) included
parte del laboratorio, de sus propios reactivos. in the coupled spectrophotometric assay.
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CONCLUSIÓN Cerón J.J., Fernández M.J., Bernal L., Gutiérrez
C. 1996. Automathed spectrophotometric
Existe un alto número de factores pre y ana- method using 2,2’-Dithiodipyridine acid for
líticos con capacidad de influir en la determina- determination of ChE in whole blood. J.
ción colorimétrica de colinesterasa en sangre AOAC Int. 79: 757-763.
entera. Además, el efecto de algunos de ellos Cerón J.J., Tecles F., Espín J.C. 1999.
sobre los resultados pueden variar en función de Comparison of different diluents and
la especie animal analizada. Por tanto, se hace chromophores for spectrophotometric
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