Universidad De Oriente Ncleo Bolvar Escuela De Ciencias De La Salud Dr.

Francisco Battistini Casalta Departamento De Bioanlisis rea Toxicologa

PRODUCCIN DE INMUNOGLOBULINA DERIVADA DE HUEVO DE GALLINA CONTRA EL VENENO DE ESCORPIN (TITYUS CARIPITENSIS)

Asesor: Dr. Pedro Parrilla-lvarez

Trabajo de grado presentado por: Suarez Elizabeth C.I. 17657844 Velsquez Yonathan C.I: 17885918 Como requisito parcial para optar al ttulo de licenciado en Bioanlisis

Ciudad Bolvar, abril del 2010.

INDICE
INDICE ........................................................................................................................ii AGRADECIMIENTOS .............................................................................................iv DEDICATORIA.......................................................................................................... v DEDICATORIA........................................................................................................vii RESUMEN................................................................................................................viii INTRODUCCIN ...................................................................................................... 1 JUSTIFICACIN ..................................................................................................... 10 OBJETIVOS.............................................................................................................. 11 Objetivo general....................................................................................................... 11 Objetivos especficos ............................................................................................... 11 MATERIALES Y MTODOS ................................................................................ 12 Tipo de estudio. ....................................................................................................... 12 Universo y muestra .................................................................................................. 12 Materiales. ............................................................................................................... 13 Procedimientos ........................................................................................................ 15 Obtencin de veneno de escorpin T. caripitensis y su purificacin parcial. ...... 15 Separacin cromatogrfica del veneno del escorpin T. caripitensis. ................. 17 Inmunizacin de gallinas ponedoras. ................................................................... 18 Recoleccin y preservacin de los huevos de las gallinas, previa y post inmunizacin. ....................................................................................................... 19 Purificacin de las inmunoglobulinas (IgY) anti TcII y veneno completo del escorpin Tityus caripitensis, a partir de la yema de los huevos de las gallinas. 19 Cuantificacin de IgY especifica contra TcII y veneno completo de escorpin Tityus caripitensis en la yema de huevos ............................................................. 20 Anlisis de resultados. ............................................................................................. 22 RESULTADOS.......................................................................................................... 23 Grafico 1 .................................................................................................................. 25 Tabla 1 ..................................................................................................................... 26

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Grafico 2 .................................................................................................................. 27 DISCUSIN .............................................................................................................. 28 CONCLUSION.......................................................................................................... 29 RECOMENDACIONES........................................................................................... 30 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................... 31

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AGRADECIMIENTOS
Simplemente queremos agradecer a todas las personas que colaboraron en la elaboracin de este proyecto, principalmente al Dr. Pedro Parrilla gracias por tratar de confiar en nosotros, ojala algn da mas personas apreciaran la capacidad que usted tiene para querer hacer que la gente se supere y aprecien su trabajo. A la Lcda. Aminy Hudefe (Ami) y Lcdo. Alberto Parrilla sin ustedes nunca hubiramos podido terminar este proyecto muchas, muchas gracias. Al personal del Instituto de Estudios Avanzados: Dra. Caridad Malave y Dra. Noraida Zerpa. Al personal del laboratorio del Centro Mdico Orinoco: Dr. Eduardo Santos y la Licd. Solangel Marin muchas gracias. Al personal de Gentica Mdica de la Universidad de Oriente:

A todos muchas gracias.

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DEDICATORIA
AUSENCIA Habr de levantar la vasta vida que an ahora es tu espejo: cada maana habr de reconstruirla. Desde que te alejaste, cuntos lugares se han tornado vanos y sin sentido, iguales a luces en el da. Tardes que fueron nicho de tu imagen, msicas en que siempre me aguardabas, palabras de aquel tiempo, yo tendr que quebrarlas con mis manos. En qu hondonada esconder mi alma para que no vea tu ausencia que como un sol terrible, sin ocaso, brilla definitiva y despiadada? Tu ausencia me rodea como la cuerda a la garganta, el mar al que se hunde. JORGE LUIS BORJES.

A mi padre que siempre fue ms que un ejemplo a seguir, siempre estars presente viejo, se que te sentirs orgulloso, siempre lo estuviste y a mi hermana Jose te fuiste antes de tu tiempo, pero ahora mi viejo te est cuidando, se que te reiras de la locura que representa este trabajo te extrao hermanita. Ahora a los vivos, a mi flaca bella, mi bebe, Laura Suarez, que hasta me acompao a alimentar a las gallinas, a mi madre Josefina Inzana, indudablemente parte de lo que soy es gracias a ti, a mi Nonna Nicolina Giorgianni eres lo mximo nonnita te adoro y lo sabes, a mis tas Sebastiana y Mara Insana son un dolor de cabeza que no se puede evitar, pero las amo y le agradezco el esfuerzo que hacen todos los das para darme un mundo relativamente mejor. Como no puede pasar de una pgina ahora todos aquellos que son mi familia as no tengamos la misma sangre: Nathy (eres una Suarez Inzana ms), Mayru, mi chino, chucho, Eli, Ali, mi padrino Benzn, la esposa, el esposo, yasmi, Ibra (gracias por tratar de hacer feliz a mi bebe), Ramon, Manolo, Thomy, Alexandra, jose manuel, miguel E, viejo Nelson, Sra. Ana Mara, al final pero no el ultimo a mi chelo gracias

por ser mi compaero de tesis y jams rendirte mientras nos cubra la locura, te amo hermanito. Y a todos los que me dijeron que hiciera un trabajo de Parasitologa a todos va est ecunime dedicatoria. Elizabeth Suarez Inzana.

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DEDICATORIA
Dedico esta tesis primero que a nadie a ese ngel misericordioso, que me cuida a cualquier lado que vaya, a mi abuela Mara Adoracin Guevara aunque te fuiste de mi lado hace mucho tiempo tus enseanzas me hacen ser lo que soy ahora, a mi abuelo Roberto Zamora al cual quiero mucho, a mis padres Ana Mara Zamora y Nelson Moreno por ser mis padres, amigos y apoyo incondicional, por ensearme que no hay mayor triunfo que el que alcanza una persona con sus propias manos, por darme la confianza necesaria y todas las herramientas a pesar de las dificultades, para que pudiera culminar mi etapa de universitario sin ustedes esto no sera posible. A mis hermanos las personas que ms amo en este mundo, Ailen Moreno, Jhon Velsquez, Yohan Velsquez y Yohannitt Velsquez espero que siempre podamos estar tan unidos como hasta ahora, aunque muchos no lo entiendan a Diana Rodrguez por su ayuda y apoyo a la mitad de mi carrera y comienzo de este proyecto. A mi segunda familia, la familia Suarez Inzana por hacerme sentir que tena un hogar lejos de casa y por todo el cario que tan incondicionalmente me dieron, a mi compaera de tesis Elizabeth Suarez que a pesar de todas las adversidades que se le presentaron nunca abandon y siempre tuvo esas palabras de motivacin en los momentos de desesperacin, y a un gran pensador y un muy buen amigo Vctor Suarez donde quieras que ests se que estas orgulloso de nosotros por esta meta alcanzada. A todos ustedes este triunfo les pertenece tanto como a mi!!!

Yonathan Velsquez.

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RESUMEN
Inmunoglobulina Y derivada del huevo de la gallina contra el veneno de escorpin (Tityus caripitensis) Suarez E.C.; Velasquez Y.A. Escuela de ciencias de la salud Dr. Francisco Virgilio Battistini Casalta

El accidente escorpinico es considerado en algunos pases como un problema de salud pblica. En Venezuela, existen reas donde han ocurrido muertes, sobretodo en nios. En la regin oriental, el escorpin Tityus caripitensis ha causado accidentes graves y mortales. El tratamiento consiste en la administracin de inmunoglobulinas obtenidos de suero de caballos inmunizados. Para contribuir a la resolucin del problema mdico, el estudio del veneno y la produccin de una antivenina especfica con el menor maltrato animal es de vital importancia. El veneno se fraccion por el mtodo de cromatografa de exclusin molecular de baja resolucin, obtenindose 4 picos de elucin. La fraccin II (TcII) result la de mayor tamao con el 74,41% del veneno total, por lo que fue seleccionada como antgeno, junto al veneno completo, para inducir la produccin de anticuerpos (Ac) especficos, a partir de gallinas. Los anticuerpos IgY fueron obtenidos a partir de la yema de huevos mediante el mtodo de Polietilenglicol-Cloroformo y su especificidad medida mediante ELISAs, resultando mejor antgeno el veneno completo. Se demuestra que el uso de aves para la obtencin de anticuerpos es una alternativa menos agresiva para los animales de experimentacin.

Palabras Claves: Veneno de escorpin Tityus caripitensis, Fraccin IITc e InmunoglobulinaY,

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INTRODUCCIN
El origen de la palabra escorpin viene del latn scorpios y el nombre de alacrn procede del rabe Alakrab, y se denomina escorpionismo o alacranismo al complejo sintomtico ocasionado por las picaduras por escorpiones o alacranes. Los escorpiones son animales muy antiguos y se han encontrado en fsiles que datan del periodo siluriano hace 400 millones de aos. A pesar de su longevidad, solo han disminuido de tamao. Actualmente se conocen ms de 1500 especies en todo el mundo, de las cuales solo 25 se han incriminado como causantes de accidentes en humanos. Estn clasificados dentro de filo Arthropoda, clase Aracnida y orden Scorpionida (Valderrama et al., 1998). Los escorpiones tienen una amplia distribucin geogrfica y se encuentran en todos las regiones excepto en la Antrtida. Predominan en las zonas tropicales pero tambin se encuentran en areas templadas. Su distribucin en Amrica va desde la regin sur del oeste de Canad hasta la Patagonia. Se encuentran en casi todos los ecosistemas terrestres como desiertos, sabanas y bosques tropicales. Son artrpodos solitarios y activos en la noche, viven en lugares oscuros y escondidos bajo piedras, corteza suelta, pueden vivir en lugares muy secos donde pueden sobrevivir durante meses sin agua y ms de un ao sin alimentacin. Algunas especies invaden las habitaciones humanas y son causantes de accidentes por envenenamiento. Los escorpiones son carnvoros y se alimentan exclusivamente de animales vivos, las araas y otros insectos son sus presas ms comunes, localizan a su alimento por las vibraciones del suelo. El canibalismo es un fenmeno frecuente en estos artrpodos, los adultos se comen a los jvenes y a los recin nacidos, as mismo diversos animales los depredan, sus principales enemigos las aves (gavilanes, gallinas, entre otros.) adems de lagartos, macacos, coates, sapos y ranas (Lucas y Da Silva, 1992; Botero y Restrepo, 2005).

Los escorpiones peligrosos para el hombre pertenecen a la familia Buthidae donde se incluyen los gneros: Androctonus, Buthus, Centruroides, Leiurus y Tityus. En Venezuela, el gnero Tityus hasta 2006 (segn el ltimo informe sobre descripcin de nuevas especies) rene 52 especies, la mayora responsables de los accidentes graves de escorpionismo entre los cuales podemos nombrar Tityus arellanoparrai, T. monaguensis, T. quirogae, T. surorientallis, T.nororientalis, T. caripitensis, T. discrepans, T. falconensis, T. zulianus, etc. El escorpionismo tiene importancia en algunas regiones del pas como los estados Miranda, Zulia, Falcn, Trujillo, Mrida, Monagas, Sucre y Distrito Capital, donde ha sido considerado un problema de salud pblica (Gonzlez-Sponga, 1997; De Sousa et al, 1998; Borges et al, 2006). El veneno producido por los escorpiones, es una secrecin apocrina, que es expulsada violentamente por el orificio del acleo o aguijn. Dependiendo de la toxicidad de sus venenos, los escorpiones pueden dividirse en dos grupos; aquellos cuyo veneno produce solamente reaccin local y aquellos cuyo veneno interfiere con el funcionamiento normal del individuo y que puede ser letal, ya que existen varios grados de toxicidad hacia mamferos, insectos o crustceos. Los venenos de escorpiones son considerados entre los ms potentes, por la presencia de neurotoxinas. La letalidad del veneno de escorpin es excedida solo por la de ciertas bacterias y es comparable a la de neurotoxinas de serpientes. (Simard y Watt, 1990). El veneno se compone bsicamente de protenas y pptidos de bajo peso molecular, que reconocen canales inicos y modifican la excitabilidad celular. Contiene tambin aminocidos libres, sales orgnicas, lpidos y hialuronidasa. Los venenos de escorpiones americanos carecen de enzimas o han demostrado bajos niveles de actividad enzimtica. Por otro lado, el veneno del escorpin hind, Heterometus scaber, contiene fosfatasa acida, ribonucleasa, 5- nucleotidasa, hialuronidasa, acetilcolinesterasa y fosfolipasa (Simard y Watt., 1990; Krifi et al., 2001).

Las neurotoxinas del veneno de escorpin son de tres clases: de cadena corta que contienen de 30 a 40 residuos de aminocidos; de cadena mediana que contienen entre 60 y 70 residuos de aminocidos y de cadena larga. Las neurotoxinas de cadena mediana son las ms importantes desde el punto de vista mdico ya que afectan a los mamferos. (Krifi et al., 2001). Las protenas de estos venenos se separan cromatogrficamente por sus diferencias en pesos moleculares. El patrn de elucin del veneno de T. discrepans presenta cuatro fracciones bien definidas (TdF-I, TdF-II, TdF-III, TdF-IV). Cada una de ellas est formada por alrededor de 20 a 30 toxinas diferentes. La TdF-I contiene la toxina curarizante. La TdF-II contiene las toxinas neurotxicas por excelencia. TdF-III contiene las toxinas pancreatotxicas y TdF-IV presenta propiedades cardiotxicas (DSuze et al., 1995) Se ha determinado que, para escorpiones americanos, luego de la inyeccin subcutanea o intramuscular, el veneno aparece en sangre a los cinco minutos, alcanzando su concentracin mxima entre 15 y 30 minutos, disminuyendo apreciablemente a las dos horas siguientes para desaparecer casi totalmente 7 a 8 horas despus. Los mximos niveles tisulares aparecen en corazn, pulmn y bazo a los 30 minutos de la inyeccin y la eliminacin se hace principalmente por los riones (Botero y Restrepo, 2005; DSuze et al, 1995) Son responsables de los efectos generales del veneno sus acciones presinpticas, caracterizadas por la liberacin masiva de neurotransmisores tanto a nivel de las terminaciones autonmicas, parasimpticas y simpticas, como a nivel de la mdula suprarrenal. Los efectos experimentales o sintomatologa clnica parecen depender del sistema ms afectado, lo que a su vez estara en relacin con el tipo de toxina o especie de alacrn involucrado, la regin geogrfica, la estacin del ao, el

rgano o animal en que se estudia la accin del veneno, su estado funcional o el estado fisiolgico general del paciente (DSuze et al., 1997). As, a veces predomina francamente la estimulacin de las terminaciones parasimpticas y en otras la del simptico es evidente. Es casi un hecho, aunque no demostrado, que la venina atraviesa la barrera hematocefalica y que muchos de los sntomas graves son de origen central o quizs tambin por estimulacin intensa de los receptores perifricos. Es habitual, observar alteraciones metablicas por la picadura o por la administracin de veneno de Buthidae (Tityus), especialmente hiperglucemia e hipercalemia (DSuze et al., 1997). El tratamiento especfico del envenenamiento escorpinico se basa en la administracin del antiveneno, compuesto por la fraccin F (ab)2 (fraccin variable) de inmunoglobulinas equinas (IgG), desprovista del fragmento Fc (constante), responsable de las reacciones de hipersensibilidad por activacin de la va clsica del complemento. Este se administra por va endovenosa, lo ms precozmente posible con el fin de neutralizar el veneno. En Venezuela el antdoto para el envenenamiento por estos artrpodos, es el suero antiescorpinico elaborado por el Centro de Biotecnologa de la Facultad de Farmacia de la Universidad Central de Venezuela (Mota et al., 1994; Botero y Restrepo, 2005) Para su produccin se utiliza veneno extrado de escorpiones del Gnero Tityus, que es inyectado en equinos los cuales producen los anticuerpos especficos capaces de neutralizar los efectos nocivos de estos venenos. El proceso de elaboracin del suero se inicia con la extraccin del veneno de los escorpiones. En este proceso se estimula a los ejemplares para que piquen repetidamente un vidrio de reloj recubierto por una membrana plstica, la cual ser lavada para disolver la venina del animal (Barona et al., 2004; Borges et al., 2006).

Una vez disuelto, el lquido resultante se lleva a un liofilizador, para eliminar el agua de la solucin. Al momento de la administracin, el veneno liofilizado se resuspende y se inyecta en los caballos, previa determinacin de la potencia letal en ratones. Despus de 10 a 12 das de inyectar al caballo, se le extrae la sangre, la cual se deja coagular, se centrifuga para separar el sobrenadante, y luego de varios procesos de purificacin se obtiene el suero terminado (Borges et al., 2006; Barona et al., 2004). El suero antiescorpinico es una solucin de inmunoglobulinas especficas, purificadas por digestin enzimtica, concentradas y posteriormente titulado de forma tal que cada mililitro de suero neutraliza un mnimo de 0,2 mg. de veneno de escorpin del gnero Tityus (Mota et al., 1994; Botero y Restrepo, 2005) A partir de las ltimas dcadas el bienestar de los animales de laboratorio es considerado un tema tico crtico y la utilidad de los anticuerpos (Ac) de huevo comenz a ser reconocida, particularmente al demostrarse la posibilidad concreta de reemplazar el sangrado de los mamferos por la simple recoleccin de huevos de gallina. Este tema fue actualizado con el trabajo de Russell y Burch del ao 1959, titulado en ingls "The Principles of Humane Experimental Technique" en espaol Los principios de la tcnica experimental humana. En este se explican las tres R que se refieren a reemplazar los animales de experimentacin por otros mtodos que no impliquen su uso, reducir su nmero cuando sea necesario utilizarlos y refinar las tcnicas para aminorar su sufrimiento (Vinardell, 2007). A pesar que desde finales del siglo XVIII fue descrito el mecanismo de transferencia pasiva de inmunoglobulinas de la madre al hijo por nacer, debieron transcurrir ms de 90 aos, para que esta informacin fuera tomada en cuenta. Klemperer en 1893, demostr que ratones tratados parenteralmente con extracto de yema de huevo proveniente de gallinas inmunizadas con toxina tetnica quedaban protegidos contra posteriores dosis letales de la misma toxina administrada por va parenteral. Probablemente esto se haya debido a la falta de informacin sobre las

posibilidades y ventajas del uso de los anticuerpos inmunoglobulina Y (IgY). Los trabajos de Polson et al., (1980) mostraron las ventajas del uso de IgY y propusieron una metodologa relativamente sencilla para obtenerlas a partir de la yema de los huevos. El desarrollo de la industria avcola y la creacin de gallinas ponedoras (1 huevo diario) tambin contribuy positivamente al desarrollo cientfico y tecnolgico de la obtencin de IgYs aviares (Brierley y Hemmings, 1956; Polson y Wechmar, 1980; Chacana et al, 2004). El gran impulso que tom la avicultura industrial en los ltimos aos puso en evidencia la facilidad de contar con un animal relativamente pequeo aunque capaz de producir muchos ms anticuerpos que un mamfero de laboratorio al no ser necesario su sacrificio para la obtencin del suero sanguneo. Esto se debe al gran avance que se logr con el desarrollo de lneas genticas de gallinas ponedoras de alta postura capaces de producir ms de 300 huevos al ao por ave. A partir de 1980 se ha incrementado significativamente el uso de los Ac. IgY, en gran medida gracias a la disponibilidad de reactivos secundarios comerciales para la purificacin rpida y simple de IgY, estndares de IgY y anticuerpos especficos anti-IgY marcados con fluorescena, fosfatasa alcalina peroxidasa. Desde 1996 la produccin y el uso de los Ac. IgY se conoce como tecnologa IgY, denominacin propuesta por Staak en 1995 y que en la actualidad se emplea internacionalmente como una terminologa estndar (Chacana et al., 2004). En ese mismo ao el Centro Europeo para la Validacin de Mtodos Alternativos (ECVAM) recomend el uso de la IgY en reemplazo de la IgG mamfera para minimizar las situaciones dolorosas implicadas en la obtencin de anticuerpos en los animales de laboratorio. En este mismo congreso tambin se brind informacin prctica sobre la crianza de gallinas, la tcnica de inmunizacin de las aves, el uso de diferentes adyuvantes, tcnicas de extraccin y conservacin de la IgY, etc. En 1999

la Tecnologa IgY fue aprobada por la Oficina Federal del Gobierno Suizo como un mtodo alternativo tendiente a mejorar el bienestar animal. Actualmente el nmero de publicaciones sobre esta tecnologa se incrementa constantemente, abarcando diferentes aspectos como la crianza y el mantenimiento de las aves, la transferencia de la IgY hacia la yema del huevo, la purificacin de la IgY, su aplicacin prctica en diversos mtodos de diagnstico e investigacin y su empleo en inmunoterapia e inmunoprofilaxis mdica y veterinaria, entre otros temas (Chacana et al., 2004; Vinardell, 2007). Se han realizado varios estudios comparando las propiedades de la IgY de las aves con la de las IgG producidas en animales idnticamente inmunizados. En la mayora de los casos se ha confirmado que la IgY puede ser utilizada de la misma manera que la IgG muchas veces, la IgY presenta ventajas con respecto a la especificidad, reacciones cruzadas sensibilidad. Durante la dcada pasada, se ha incrementado el uso de la IgY en la terapia profilaxis de enfermedades mediante el nuevo concepto de alimento funcional nutracutico. Debido que la IgY es parte de la dieta normal no existe peligro de complicaciones alrgicas, y dado el gran incremento de la resistencia de las bacterias a los antibiticos, el uso de la IgY se presenta como una importante alternativa para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Adems estos tratamientos resultan muy econmicos y para enfermedades gastrointestinales estos Ac actan in situ mediante una administracin no traumtica como es la va oral (Xiao-Liang et al., 2006). Probablemente la distancia filogentica sera la razn por la cual se pueden obtener Ac que presentan distinta especificidad, an cuando aves y mamferos sean inyectados con los mismos protocolos de inmunizacin, adems de las diferencias propias de los sistemas inmunes de los mamferos y las aves. Varios autores han informado que, particularmente en el caso de protenas pptidos altamente

conservados, las gallinas dando pueden producir Ac en forma ms eficaz que otros mamferos (Wasif et al., 2006; Xiao-Liang et al., 2006). Estructuralmente, la IgY se compone de dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas. Estas ltimas contienen un dominio variable y cuatro dominios constantes. El peso molecular de la IgY es de alrededor de 167.250 Daltons. El punto isoelctrico vara entre 5,7 y 7,6. La IgY se transfiere activamente desde la sangre a la yema, mediante un proceso donde estn involucrados receptores especficos. En general, las IgM e IgA se pueden encontrar en la clara del huevo, mientras que la IgY predomina en la yema, con concentraciones de entre 10 y 20 mg/mL. Existen diferentes mtodos de precipitacin y cromatogrficos para la extraccin de la IgY a partir de la yema del huevo (Wasif et al., 2006; Xiao-Liang et al., 2006). Comparada con la IgG mamfera, la IgY de los pollos presenta varias ventajas: es muy econmica, se puede producir en grandes cantidades, se evita el sangrado del animal, no presenta reacciones cruzadas con los factores reumatoideos o los anticuerpos humanos anti-ratn, no activa el sistema de complemento mamfero, no interfieren con las heteroaglutininas humanas en la prueba de Coombs, presentan menor fluorescencia inespecfica en preparaciones inmunofluorescentes, etc. En muchos estudios, se ha demostrado que la IgY de pollo presenta afinidad y sensibilidad similares a las de la IgG mamfera. (Chacana, et al., 2004). Se han realizado trabajos anteriores en los cuales se involucra la IgY como una nueva solucin para el envenamiento por artrpodos como es el caso de la produccin de anticuerpos antiescolopendra (Scolopendra gigantea) realizado en el 2006 por un grupo de investigadores de la Universidad de Oriente y Universidad Central de Venezuela (Parrilla et al., 2008)

Desde el punto de vista econmico, la tecnologa IgY tambin presenta ventajas incomparables. El costo de criar una gallina no es muy diferente al de un conejo, a pesar de que la produccin de Ac de una gallina ms o menos se corresponde con la de un animal grande, como por ejemplo una oveja o una cabra. De modo que una cantidad formidable de Ac puede ser producida a partir de una sola gallina, esta inmensa produccin de Ac con costos relativamente bajos posibilita nuevos campos de aplicacin, como por ejemplo la inmunoterapia y la inmunoprofilaxis de infecciones virales y bacterianas, tanto en medicina humana como veterinaria. Para alcanzar semejante produccin de Ac utilizando mamferos, los costos son mucho ms elevados. Por lo tanto la intencin es obtener anticuerpos derivados de huevos de gallinas contra el veneno de escorpin Tityus caripitensis. .

JUSTIFICACIN
Los anticuerpos de yema de huevo son una interesante alternativa al uso de anticuerpos mamferos. Hacia fines del siglo XVIII, el investigador alemn Klemperer demostr que extractos de yema de huevo obtenidos a partir de gallinas hiperinmunizadas contra la toxina tetnica, eran capaces de proteger a ratones inoculados con dosis letales de la misma toxina. La importancia de la tecnologa IgY fue tenida en cuenta durante las ltimas dcadas, y actualmente se publican constantemente trabajos sobre la IgY, describiendo sus propiedades y aplicaciones en diferentes campos cientficos. (Chacana et al, 2004; Brierley y Hemmings, 1956; Polson y Wechmar, 1980). En Venezuela y el mundo siempre han existido los accidentes producidos por envenenamiento escorpinico e invariablemente se ha necesitado un mtodo eficaz para atender a los afectados el cual ya existe y es muy efectivo. Se trata del uso de suero antiescorpinico a base de anticuerpos especficos obtenidos de mamferos sensibilizados. Sin embargo, en la nueva era de la tecnologa, se requiere optimizar las tcnicas, disminuir los riesgos y tambin los daos ocasionados al ambiente, se necesitan mtodos menos invasivos y dainos. El uso de la tecnologa IgY ofrece tales ventajas. Con la aplicacin de estos avances se pueden obtener antiveninas de forma fcil y econmica, sin provocar sufrimiento prolongado a los animales de experimentacin. No se pretende un cambio inmediato, simplemente se desea contribuir en la bsqueda de soluciones concordantes con el nuevo futuro de la prctica mdica.

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OBJETIVOS
Objetivo general Producir anticuerpos derivados de huevos de gallinas contra el veneno de escorpin (Tityus caripitensis)

Objetivos especficos Obtener y purificar parcialmente el veneno del escorpin Tityus caripitensis. Separar las fracciones cromatogrfica del veneno de escorpin Tityus caripitensis. Inmunizar gallinas ponedoras por inyeccin subcutnea con la fraccin II (TcII) o el veneno completo de escorpin Tityus caripitensis. Recolectar y preservar los huevos de gallinas, previa y post inmunizacin. Purificar a partir de la yema de los huevos las inmunoglobulinas (IgY) anti TcII y veneno completo de escorpin Tityus caripitensis. Cuantificar la concentracin de IgY especifica en la yema de huevos contra TcII y veneno completo de escorpin Tityus caripitensis.

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MATERIALES Y MTODOS

Tipo de estudio. El estudio es de tipo cuantitativo experimental, cuantitativo porque el resultado de la investigacin de estudio emprico se expresa como un valor numrico y experimental; este tipo de diseo se caracteriza por ejercer un estricto control sobre el experimento por medio del establecimiento de grupos de comparacin a fin de manipular la variable independiente como la equivalencia de los grupos por medio de la asignacin aleatoria de las unidades de anlisis.

Universo y muestra La muestra es, no probabilstica, cualitativa e intencionada entindase por muestra no probabilstica cuando la eleccin de los elementos no depende la probabilidad, sino con causas relacionadas con las caractersticas de la investigacin que fue el uso de gallinas ponedoras; cualitativa porque la unidad de anlisis o contextos, eventos o sucesos sobre la cual se recolectan los datos sin que necesariamente sea representativo; e intencionada porque este tipo de muestra exige un cierto conocimiento del universo, en el caso del estudio es el estado de conciencia del saber que se trabajo con gallinas ponedoras Hy Line Brown, porque tienen la capacidad de poner 300 huevos anuales la tcnica consiste en que el investigador es el que escoge intencionalmente sus unidades de estudio. (Bijarro 2007). Por lo tanto la muestra estuvo representada por 6 gallinas que se emplearon en el estudio, utilizndose 2 para control, 2 para ser inmunizadas con veneno completo de escorpin Tityus caripitensis y 2 ms para ser inmunizadas contra la fraccin II del veneno de escorpin Tityus caripitensis.

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Materiales. Escorpiones. (Tityus caripitensis) Balance analtica (Ohaius) Cinta adhesiva de papel. Estimulador elctrico SM6 con rango de 0 a 10 voltios. Capilares de vidrio Corning de 50 l. Regla milimtrica Tubos eppendorf de 1,5 ml. Centrifuga de eppendorf mod. 5415. Espectrofotmetro Gnesis #6 Thermo Espectronic Nevera a - 40C. Tubo de vidrio de 1,85 cm de longitud y un centmetro de dimetro. Fijadores de pared recubiertos con caucho para no daar el tubo. Filtro de organza o tul. Buffer de acetato de amonio con un pH de 4,7. Gel sephadex de 100 Sigma. Gel sephadex del 50 Sigma. Veneno de escorpin Tityus caripitensis. Graficador por cambios isoelctricos en la elucin. Muestreador automtico para cromatografa de lquido (Alltech 570 Autosampler). Tubos falcn de 50 ml. Gallinas Hy Line Brown. Jaulas con dispensadores de agua y comida para el almacenamiento de las aves. Recipiente para el acopio del alimento. Taza para medir los 110 gr. comida/da y tratamiento hormonal.

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Ventilador para acondicionar el rea de los animales. Fuente agua para el uso y mantenimiento de los animales. Cartones de huevos para la recoleccin. Nevera para preservacin de los huevos. Marcadores Identificadores de plstico. Centrifuga Termo Centra CL3R. Embudos Gazas. Solucin reguladora de fosfatos (PBS) pH de 7,2 7,4. 75,59gr. de NaCl. 1,23 gr. de K2HPO4. 14,09 gr. de NaHPO4. 2 gr. de KCl. Solucin A al 17,5% de PEG-6000. Solucin B al 34% de PEG 6000.

Solucin de poli etilenglicol PEG-6000.

Pipetas automticas de 0,5 a 5000 l de capacidad. Placas para ELISA de 96 pozos de 400 l de capacidad, estriles de molculas libres sin ningn tipo (de anticuerpo o antgeno) adheridos. Frascos de vidrio mbar. Cilindros graduados. Antgeno (veneno crudo y fraccin II Tc). Anticuerpo primario (inmunoglobulina Y a estudiar). Pipetas automticas de 0,5 a 1000 l de capacidad. Pipeta automtica de 8 canales con una capacidad mxima de 400 l. Puntillas para pipeta automtica.

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Gaza. Cmara hmeda. OPD (orto-phenylendiamine dihydrochroride). Solucin buffer citrato fosfato sdico al un pH 5. Incubadora para Laboratorio (estufa de cultivo de microorganismos) marca CRAFT, con alcance de 5C arriba de la temperatura ambiente hasta 70C, as como en ensayos diversos de temperatura (normalmente se opera a 37C).

Anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rbano picante. Solucin reguladora de fosfatos (PBS) 10X pH de 7,2 7,4. Tween 20. Solucin preparada con albumina de suero bovino (BSA) al 3%. Lector de placas de ELISA Magallanes Tecan Sunrise Plate Readers. pH metro.

Procedimientos Obtencin de veneno de escorpin T. caripitensis y su purificacin parcial. Los escorpiones provenientes de la poblacin de El Limn del Municipio Punceres del estado Monagas, mantenidos en el Laboratorio de Alacranologa de la Escuela de Ciencias de la Salud UDO Bolvar durante al menos una semana, fueron pesados en una balanza analtica (Ohaius). Se ordearon los mayores de 1g, Antes de ordear, se utiliz una solucin desinfectante para acondicionar el local y la mesa. El veneno se obtuvo mediante estimulacin elctrica, para lo cual, el escorpin fue sujetado por su mesosoma a la superficie de la mesa mediante cinta adhesiva (3M). Una pinza conectada a uno de los polos de un estimulador elctrico (Grass, SM6 con rango de 0 a 10 voltios) se coloc en los pedipalpos del artrpodo, mientras que el

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otro polo se conect al telson. Se humedeci con agua destilada el sitio de contacto de los electrodos con el escorpin para facilitar la conduccin elctrica y se administraron entre 3 y 5 trenes de pulsos elctricos con frecuencia de 6pps, duracin de 100ms y 60 voltios. Se dej reposar al animal alrededor de 60 segundos luego de cada tren de estmulos elctricos. El veneno se recolect mediante el uso de capilares de vidrio no heparinizados (Corning), colocados en el extremo distal del aguijn del animal, fue cuantificado en su volmen y disuelto en aproximadamente 1ml de agua destilada. Mediante el uso de un agitador (Vortex) se mezcl vigorosamente el veneno con el agua, para luego centrifugarlo (Eppendorff mod. 5415) a 10000rpm, durante 5 minutos. El sobrenadante se separ del precipitado y se cuantific la concentracin de protenas mediante mtodo espectrofotomtrico (Gnesis #6, Thermo spectronic), para posteriormente almacenarlo hasta su uso a -20C en tubos Eppendorf de 1,5ml.

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Separacin cromatogrfica del veneno del escorpin T. caripitensis. Para tal fin, se us una columna de vidrio de 1,85cm de longitud y 1cm de dimetro (Fabricacin casera), que fue cargada con gel Sephadex G-50, previamente hidratado con Buffer Acetato de Amonio, pH 4,7. El extremo inferior de la columna se cubri con un trozo de organza triple. Antes de cargar el gel Sephadex G50 se coloc aproximadamente 1cm3 de gel Sephadex G100. Una vez cargada la columna, se dej eluir buffer hasta lograr la estabilidad del sistema, garantizando la ausencia de grumos o burbujas de aire en el gel. Un mililitro de una solucin de veneno concentrada aproximadamente 10mg/ml con una masa de 5 mg, se coloc en el extremo superior de la columna, evitando generar turbulencia. El eluato fue recogido en tubos de vidrio (10 cm3 de capacidad) mediante un colector automtico para cromatografa lquida (Alltech 570 Autosampler), a volmenes iguales por tubo. La concentracin de protenas en cada tubo fu determinada

espectrofotomtricamente, midiendo la absorbancia a 280nm de longitud de onda. Se construy un cromatograma graficando el nmero del tubo (volumen acumulado de retencin) contra la Absorbancia de cada tubo (concentracin de protenas). Luego se determin el nmero de fracciones cromatogrficas segn los picos de Absorbancia observados, y se procedi a reunir el contenido de los tubos que correspondan a cada fraccin. Para ello se usaron tubos de polietileno de 50ml (Falcon). Se midi volumen y absorbancia de cada fraccin y se almacen a-20C. El proceso completo se realiz por triplicado. Se calcul el rendimiento en base a la siguiente formula. Rendimiento = Veneno Recuperado X 100 Veneno Inicial

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Inmunizacin de gallinas ponedoras. Se utilizaron gallinas ponedoras Hy Line Brown, de alrededor de 18 semanas de edad, las cuales se ubicaron en el Bioterio de la escuela de Ciencias de la Salud UDO Ncleo de Bolvar. Se identificaron con letras del alfabeto e individualizaron en jaulas acondicionadas para proveerles de alimento y agua ad libitum. Se escogieron al azar pares de gallinas que conformaron grupos control y

experimental. El protocolo de inmunizacin contemplo cuatro administradas cada 15 das, procedimiento total de 45 das, cada dosis se administro fraccionada a partes iguales por dos vas: subcutnea (msculo pectoral) e intramuscular (muslo), alternando al lado izquierdo con el derecho en dosis sucesivas. La dosificacin se explica en el cuadro a continuacin. Da 0 CONTROL Gallinas I y E VENENO COMPLETO Gallinas A y D FRACCION II Gallinas H y J Ag= Antgeno AD= Agua Destilada ACF=Adyuvante Completo de Freund AIF= Adyuvante incompleto de Freund 300L AD 150LAg+ 150L ACF 150LAg+ 150L ACF Da 15 300L AD 150LAg+ 150L AIF 150LAg+ 150L AIF Da 30 300L AD 150LAg+ 150L AIF 150LAg+ 150L AIF Da 45 300L AD 150LAg+ 150L AD 150LAg+ 150L AD

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Recoleccin y preservacin de los huevos de las gallinas, previa y post inmunizacin. Los huevos fueron recolectados diariamente, rotulados y almacenados a 4C hasta su procesamiento.

Purificacin de las inmunoglobulinas (IgY) anti TcII y veneno completo del escorpin Tityus caripitensis, a partir de la yema de los huevos de las gallinas. Los huevos fueron lavados con agua y jabn, (Isorgan gel). Se rompi la cscara vertiendo el contenido en un separador de yemas. La yema se lav con agua destilada y se pes con balanza analtica. Se punz con una aguja la membrana externa de la yema y su contenido vertido en un beacker. Se agreg tres volmenes de PBS (0,01M y pH 7,35) equivalentes al peso inicial de la yema. Se mezcl por agitacin constante y vigorosa hasta homogenizar. Luego se procedi a agregar un volumen de solucin A (17,5% de PEG-6000) dispensndolo gota a gota con agitacin constante hasta homogenizar. La mezcla ya homognea se trasvas a un tubo Falcon de 50mL y se centrifug a 1000g por 20 minutos a 40C. Se filtr la mezcla con la ayuda de un embudo y gasa, y al filtrado se le adicion un volumen de cloroformo equivalente a la tercera parte del peso inicial de la yema, agitando la mezcla hasta homogenizar (alrededor de 5 minutos), y se centrifug a 1000 g por 10 minutos a 40C. El sobrenadante se recuper con una pipeta Pasteur, teniendo el debido cuidado de no absorber los lpidos precipitados en la capa blanca, ni el remanente de cloroformo. Despus se adicion un volumen de solucin B (34% de PEG-6000) gota

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a gota agitando constantemente, teniendo en cuenta que el volmen es equivalente a la tercera parte del volumen del sobrenadante obtenido en la separacin de grasas. Se agit por 5 minutos aproximadamente y se centrifug por 20 minutos a 40C a una velocidad de 1000 g. Se descart el sobrenadante y se disolvi por agitacin el precipitado resultante en un volmen de PBS correspondiente al peso inicial de la yema. La solucin resultante se distribuy en alcuotas de 2,5mL, y se almacenar a 200C.

Cuantificacin de IgY especifica contra TcII y veneno completo de escorpin Tityus caripitensis en la yema de huevos Se realizaron Ensayos Inmunoenzimticos (ELISA) de tipo indirecto segn el siguiente esquema: Se sensibilizaron dos placas una con el veneno completo de Tityus caripitensis y otra con la fraccin II Tc. Para ello se adicionaron 100l de una solucin del antgeno, (Tityus caripitensis y fraccin II Tc) a una concentracin de 5 L/mL en buffer carbonato bicarbonato a un pH 9,5 o con PBS en una dilucin 1:10 de la solucin inicial de PBS. Las placas se incubaron durante la noche a 4C, en cmara hmeda. Luego de descartar por inversin el exceso de antgeno sensibilizante, se coloc 200L de una solucin de albumina de suero bovino (BSA) al 3% con PBS 1:10 al 0,05% de Tween 20. Las placas se incubaron durante la noche a 4C, en cmara hmeda. Una vez descartada por inversin exceso de solucin de BSA, se aadi a cada pozo 100L del anticuerpo previamente purificado (Anticuerpo primario IgY en estudio) diluido 1:100 en solucin de bloqueo. Se incub a 370C por hora y media; se descart por inversin el exceso de anticuerpo primario y se lav 3 veces con 200 l de la solucin de lavado (PBS 1:10

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al 0,05% de tween 20). Luego a cada pozo se agreg 100l de una solucin IgG de conejo anti-IgY, marcada con peroxidasa de rbano a una dilucin 1:20000 en PBS 1:10 al 0,05% de tween 20. Se incub por una hora a 370C en cmara hmeda. Se lav 3 veces con un intervalo de agitacin de 10 minutos, entre agitacin. Posteriormente se agreg 100L por pozo de OPD (orto-phenylendiamine dihydrochroride) diluido en un rango de 0,75 al 1mg/ml en solucin buffer citrato fosfato sdico a un pH 5. Se incub por un periodo de 20 minutos en cmara hmeda a temperatura ambiente, para despus de agitar por 1 minuto fue ledo en espectrofotmetro a 440 nm. Las placas de ELISA se llenaron segn el siguiente esquema:

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1 A B C D E F G H X X X X X X X X

2 Y Y Y Y Y Y Y Y

3 Y Y Y Y Y Y Y Y

4 Y Y Y Y Y Y Y Y

5 Y Y Y Y Y Y Y Y

6 Y Y Y Y Y Y Y Y

7 Y Y Y Y Y Y Y Y

8 Y Y Y Y Y Y Y Y

9 Y Y Y Y Y Y Y Y

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Cp Cn Cs Cp Cn Cs Cp Cn Cs Cp Cn Cs Cp Cn Cs Cp Cn Cs Cp Cn Cs Cp Cn Cs

X= Protenas preinmunes Y= Protenas postinmunes Cp= Control positivo Cn= Control negativo Cs= Control sistema

Anlisis de resultados. Los resultados se presentaron en grficos y para variables numricas continuas, tales como las diferentes concentraciones de IgY sensible contra el veneno de escorpin Tityus caripitensis y su fraccin II. El tipo de grfico ms conveniente es la graficacin lineal.

RESULTADOS
Se obtuvo el veneno del escorpin Tityus caripitensis el cual fue parcialmente purificado por centrifugacin separando el sobrenadante que se conserv a 40C y descartndose el precipitado ya que este puede contener restos celulares y moco. Del veneno parcialmente purificado se tom una solucin de 10mg/ml de concentracin, que fue separada por cromatografa lquida de exclusin molecular de baja resolucin, los eluatos recogidos fueron medidos espectrofotomtricamente. Se construy una grfica usando el volumen acumulado de retencin, expresado en ml versus la absorbancia de cada tubo (concentracin de protenas) en la cual se pueden observar 4 picos, en el cromatograma lo que demuestran que especficamente el veneno en estudio posee 4 fracciones cromatogrficas. Siendo la fraccin II la ms grande, representando el 74,41% del total del veneno (Grafico #1). El rendimiento total del proceso de separacin cromatogrfica del veneno fue de 88,08%, se observ un mejor rendimiento en la segunda cromatografa, teniendo un rendimiento de 89,26% (Tabla 1). Los huevos se recolectaron diariamente, identificados y guardados a 40C. Las gallinas en razn de su fisiologa sufrieron una fase de desplume, que coincidi con la segunda y tercera dosis del protocolo interrumpiendo la postura diaria el tiempo que dur el desplume. Las inmunoglobulinas obtenidas en la purificacin, de hecho, son especificas contra el veneno de escorpin Tityus caripitensis, lo que se demostr con el ELISA. De las gallinas inmunizadas contra veneno completo respondieron en forma efectiva

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y cuantificable, desafortunadamente dicha respuesta no fue muy alta contra la fraccin IITc (Grafico #2). Se debe agregar que la respuesta no fue la misma en todas las aves ya que aparte de que las aves con fraccin IITc en el grafico # 2 gallina H y J, en la H la respuesta fue pobre y en la gallina J se puede ver que no hubo respuesta alguna.

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Grafico 1

Cromatograma por exclusin molecular de veneno de escorpin Tityus caripitensis

Absorbancia

P= peso en mg de la fraccin correspondiente. R= porcentaje del veneno total correspondiente a la fraccin.

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Tabla 1

Rendimiento de la Cromatografa de veneno de escorpin Tityus caripitensis.

Cromatografa TcI 1era 2da 3era Promedio (mg) % 0,266 6,08 0,288 6,45 0,275 6,24% 0,276 6,25

Fracciones en peso (mg) y (%) TcII 3,287 75,13 3,350 75,06 3,198 73,03 3,278 74,41 TcIII 0,654 14,95 0,625 14,00 0,676 15,45 0,651 14,80 TcIV 0,168 3,84 0,200 4,48 0,230 5,25 0,199 4,52

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Grafico 2

Curva de produccin de IgY especifica contra veneno de escorpin Tityus caripitensis y fraccin II del mismo

Absorbancia

Gallina A y D: inmunizadas con veneno completo de Tityus caripitensis. Gallina H y J: inmunizadas con fraccin II de veneno de Tityus caripitensis

DISCUSIN
Se evidenci que el veneno de T. caripitensis posee cuatro fracciones bien precisadas (grafico 1) al igual que el patrn de elucin del veneno de T. discrepans (TdF-I, TdF-II, TdF-III, TdF-IV) (DSuze et al., 1997). Haciendo comparacin con diversos autores tambin se puede observar que en este proyecto se evidenciaron 4 fracciones bien definidas, a diferencia del trabajo de Moanack y Rodney en el 2000 donde solo se evidenci 3 fracciones del veneno de T. caripitensis, suponemos que este resultado fue as porque usaron una cantidad de veneno menor que la empleada en este estudio.

El protocolo de inmunizacin es el mismo que se emplea para mamferos y dio resultados ptimos en las aves de experimentacin, y disminuye potencialmente el sufrimiento animal, obteniendo ttulos de ELISA muy similares al control, por lo que otros autores estuvieron de acuerdo en decir que el gran impulso que tom la avicultura industrial en los ltimos aos puso en evidencia la facilidad de contar con un animal relativamente pequeo aunque capaz de producir muchos ms anticuerpos que un mamfero de laboratorio al no ser necesario su sacrificio para la obtencin del suero sanguneo. Desde 1996 la produccin y el uso de los Ac. IgY se conoce como Tecnologa IgY, denominacin propuesta por Staak en 1995 y que en la actualidad se emplea internacionalmente como una terminologa estndar (Chacana et al., 2004). Investigadores diversos como Wasif et al., y Xiao-Liang han realizado trabajos anteriores en los cuales se involucra la IgY, como alternativa a las IgG mamferas, empleando el mismo protocolo de inmunizacin, obteniendo resultados igual de satisfactorios (Parrilla et al., 2008).

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CONCLUSION
Se obtuvo purificacin parcial de veneno de escorpin T. caripitensis. Se evidencio que el veneno de escorpin T. caripitensis posee cuatro fracciones cromatogrficas siendo la de mayor importancia medica la fraccin II Se logro inmunizar eficazmente a las gallinas Hy line Brown, contra el antgeno en estudio TcII y veneno completo de escorpin Tityus caripitensis. Se obtuvieron inmunoglobulinas Y por mtodo del PEG 6000 provenientes de las yemas de los huevos recolectados durante la inmunizacin. Se alcanz cuantificar la concentracin de IgY especifica anti-TcII y antiveneno completo del escorpin Tityus caripitensis por mtodos de ELISA.

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RECOMENDACIONES
Contar con las instalaciones adecuadas para mantener a los animales de experimentacin. Contar con el personal debidamente entrenado para la cra y cuidado de los animales de experimentacin. Concientizar que el uso de IgY es menos agresivo que el uso de las IgG mamferas.

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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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METADATOS PARA TRABAJOS DE GRADO, TESIS Y ASCENSO: INMUNOGLOBULINA Y DERIVADA DE HUEVO DE GALLINA CONTRA EL VENENO DE ESCORPION Tityus caripitensis.

TTULO

SUBTTULO

AUTOR (ES): APELLIDOS Y NOMBRES Suarez Inzana, Elizabeth Carolina Velazquez Zamora, Yonathan Alexander CDIGO CULAC / E MAIL CVLAC: 17657884 E MAIL: emanson56@hotmail.com CVLAC: 17885918 EMAIL: yalx19@hotmail.com CVLAC: E MAIL: CVLAC: E MAIL:

PALBRAS O FRASES CLAVES: Veneno de escorpin Tityus caripitensis, fraccin IITc e inmunoglobulina Y.

METADATOS PARA TRABAJOS DE GRADO, TESIS Y ASCENSO:

REA Departamento de Ciencias Fisiolgicas

SUBREA Farmacologa

RESUMEN (ABSTRACT): El accidente escorpinico es considerado en algunos pases un problema de salud publica. En Venezuela, existen reas donde han ocurrido muertes, sobre todo en nios. En la regin oriental, el escorpin Tityus caripitensis ha causado accidentes graves y mortales. El tratamiento consiste en la administracin de inmunoglobulinas obtenidos de suero de caballos inmunizados. Para contribuir a la resolucin del problema medico, el estudio del veneno y la produccin de una antivedina especfica con el menor maltrato animal es de vital importancia. El veneno se fracciono por el mtodo de cromatografa de exclusin molecular de baja resolucin, obtenindose 4 picos de elucin. La fraccin II (TcII) resulto la de mayor tamao con 74,41 % del veneno total por lo que fue seleccionada como antgeno, junto al veneno completo, para inducir la produccin de anticuerpos especficos a partir de gallinas. Los anticuerpos IgY fueron obtenidos a partir de las yemas de huevos mediante el mtodo de polietilenglicol-cloroformo y su especificidad medida mediante ELISAs, resultando mejor antgeno el veneno completo. Se demuestra que el uso de aves para la obtencin de anticuerpos es una alternativa menos agresiva para los animales de experimentacin.

METADATOS PARA TRABAJOS DE GRADO, TESIS Y ASCENSO:

CONTRIBUIDORES: APELLIDOS Y NOMBRES Dr. Parrilla, Pedro ROL / CDIGO CVLAC / E_MAIL ROL CA AS TU X JU CVLAC: 4771295 E_MAIL pparrill@hotmail.com E_MAIL ROL CA AS TU JU X CVLAC: 728867 E_MAIL mquirog@hotmail.com E_MAIL ROL CA AS TU JU X CVLAC: 3347894 E_MAIL norkaballiache@hotmail.com E_MAIL

Dra. Quiroga, Mercedes

Dra. Norka Balliache

FECHA DE DISCUSIN Y APROBACIN:

2010 AO

04 MES

21 DA

LENGUAJE. SPA

METADATOS PARA TRABAJOS DE GRADO, TESIS Y ASCENSO:

ARCHIVO (S): NOMBRE DE ARCHIVO TIPO MIME TESIS INMUNOGLOBULINA Y DERIVADA DE Aplicatios/ms.Word HUEVO DE GALLINA CONTRA EL VENENO DE ESCORPION Tityus caripitensis.Doc

ALCANCE ESPACIAL: Biotero de la Escuela de Ciencias de la Salud, Ciudad Bolvar, Estado Bolvar. Laboratorio de Biociencia del IDEA, Ciudad de Caracas, Distrito Capital. TEMPORAL: 5 aos. TTULO O GRADO ASOCIADO CON EL TRABAJO: Lcdo. en Bioanlisis NIVEL ASOCIADO CON EL TRABAJO: Pregrado REA DE ESTUDIO: Departamento de Ciencias Fisiolgicas INSTITUCIN: Universidad de Oriente

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DERECHOS

De acuerdo al articulo 44 del reglamento de trabajos de grado Los Trabajos de grado son exclusiva propiedad de la Universidad de Oriente y solo podrn ser utilizadas a otros fines con el consentimiento del consejo de ncleo respectivo, quien lo participara al Consejo Universitario