PODEMOS SEPARAR UNA MEZCLA DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA DE REPARTO?

Objetivo: Se llevar a cabo la separacin de mezclas de aminocidos mediante cromatografa en papel. Se revelar la
presencia de los mismos en el papel mediante reaccin con ninhidrina y se identificarn en la cromatografa por
comparacin con la posicin de los correspondientes patrones preparados al efecto.
La cromatografa es un mtodo fsico para separar e identificar compuestos. Se basa en que cualquier sustancia, al ser
disuelta en dos disolventes distintos no miscibles, se reparte entre ambos con arreglo a su solubilidad. La relacin entre
las solubilidades de dicha sustancia en cada uno de los disolventes se denomina Coeficiente de Reparto.
Si uno de los disolventes se mantiene fijo (Fase Estacionaria) se puede hacer desplazar el otro disolvente (Fase Mvil)
sobre el primero. Las sustancias a cromatografiarse vern sometidas a una distribucin entre las fases estacionaria y
mvil de modo que las ms solubles en la fase mvil avanzarn ms que las que sean retenidas por la fase estacionaria.
De acuerdo con el mecanismo que produce la separacin, se puede hablar de distintos tipos de cromatografa:
Uno de ellos es la cromatografa en papel que se utiliza para la separacin de cantidades mnimas de soluto y tambin
como un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a travs de una
fase estacionaria que es el agua retenida sobre un soporte slido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente en
movimiento. Una vez realizada la cromatografa, la posicin de los componentes se determina mediante una tcnica
que permita visualizarlos. Es comn revelar la cromatografa mediante reacciones que originen productos coloreados,
como la ninhidrina.

Los objetivos principales de esta prctica fueron llevar a cabo la separacin de aminocidos por medio de las
cromatoplacas utilizadas siendo as la fase mvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase mvil, el
aminocido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminocidos y una protena que fue la casena para
compararlos con ella sin embargo no se observ un factor de rendimiento igual al de la casena, no por que no tuviera
esta ninguno de los aminocidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminocidos e hubiera
tenido que hidrolizar primero esta protena para comparar sus residuos con los aminocidos utilizado

Los aminocidos suben sobre el papel cromatogrfico de manera distinta, esto se debe a su composicin qumica
estructural.
Si se emplea un solvente polar, aquellos aminocidos polares-con o sin carga- tendrn una interaccin mayor que los
otros aminocidos, en cambio, si se usa un solvente apolar, los apolares recorrern una distancia mayor, en ambos
casos, los neutros recorrer una distancia intermedia, debido a su naturaleza neutra.
Despus de realizar una cromatografa, en ocasiones, se necesita un revelador que nos indique la posicin final a la
cual llegaron los analitos, un ejemplo de revelador para aminocidos, es la Ninhidrina, ya que reacciona con el grupo
amino de los A.A. dando una coloracin azul-prpura, a excepcin de la prolina, ya que esta tiene su radical NH3
sustituido, por lo que toma una coloracin amarilla

AMINOCIDOS
Son compuestos orgnicos formados por Carbono, Nitrgeno, Oxgeno e Hidrgeno; (algunos poseen Azufre).
Los aminocidos reciben este nombre porque presentan los grupos funcionales Amino (NH3+) y carboxilo
(COO-); algunos autores los definen como derivados aminados de cidos carboxlicos.

DISCUSIN:

La ninhidrina que reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de amonaco
y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (la ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con
amonaco y otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una coloracin azulprpura, con la excepcin de la prolina que da una coloracin amarillenta, debido a que su grupo amino est sustituido.

LEUCINA
La leucina interacta con los aminocidos isoleucina y valina para promover la cicatrizacin del tejido muscular, la piel y los huesos y se
recomienda para quienes se recuperan de la ciruga. Este aminocido reduce los niveles de azcar en la sangre y ayuda a aumentar la
produccin de la hormona del crecimiento.
LISINA
Funciones de este aminocido son garantizar la absorcin adecuada de calcio y mantiene un equilibrio adecuado de nitrgeno en los
adultos. Adems, la lisina ayuda a formar colgeno que constituye el cartlago y tejido conectivo. La Lisina tambin ayuda a la produccin
de anticuerpos que tienen la capacidad para luchar contra el herpes labial y los brotes de herpes y reduce los niveles elevados de
triglicridos en suero.
PROLINA
Funciones de este aminocido son mejorar la textura de la piel, ayudando a la produccin de colgeno y reducir la prdida de colgeno a
travs del proceso de envejecimiento. Adems, la Prolina ayuda en la cicatrizacin del cartlago y el fortalecimiento de las articulaciones,
los tendones y los msculos del corazn. La Prolina trabaja con la vitamina C para ayudar a mantener sanos los tejidos conectivos.

Conclusin

Consultando el libro Laboratory Experiments for Introduction to

General, Organic and Biochemistry de Frederick Bettelheim, se encontr la
siguiente tabla para los valores de Rf para cada aminocido utilizando como
solvente una mezcla de butanol/acido actico/agua en proporcin 12/3/5.
Aunque el eluyente no sea en la misma proporcin que en la prctica, la fase
estacionaria y la mvil son la misma, as que se pueden esperar resultados
parecidos, al menos en cuanto al orden de menor a mayor factor de retencin
Amino acid

Rf value

Amino
acid

Rf value

alanine
arginine
asparagine

0.38
0.20
0.5

0.73
0.14
0.55

aspartic acid

0.24

cysteine

0.4

glutamine
glutamic acid
glycine

0.13
0.30
0.26

histidine
isoleucine

0.11
0.72

leucine
lysine
methionin
e
phenylala
nine
proline
not a true
amino
acid shows up
as yellow
serine
threonine
tryptopha
n
tyrosine
valine

Aminocido

Valor promedio Rf en la
prctica
0.589
0.389
0.291

Leucina
Prolina
Lisina

Sobre una placa de papel cromatogrfico de 20 x 20 cm se trazo con un lpiz una recta paralela
a uno de los bordes y a una distancia de ste de 2 cm. Sobre esta lnea se pone 4 puntos
equidistantes entre s y sobre los bordes (3.5, 7.5, 11.5, y 15.5).

NOTA: No hay que tocar la parte del papel cromatografico de la placa con las manos, ya que la contaminaremos con
aminocidos procedentes de nuestras manos. No utilizar nunca bolgrafo ni rotulador. No horadar la placa cuando la marqus.
Agregamos aproximadamente 20ml de el solvente (n-Butanol: Acido actico glacial: Agua) en la
cmara y tapamos para saturar.

0.43

0.27
0.35
0.66

3 Paso:
En cada punto (identificamos con el nombre de cada uno de los aminocidos) se aplicaron tres
gotas de la solucin de aminocidos y solucin problema (un aminocido en cada punto y en el
ltimo la solucin problema). Se utiliza un capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con
mucho cuidado). Procurando secar en cada aplicacin.

0.45
0.61
Valores Rf reportados en
proporcin 12/3/5
0.738
0.43
0.14

Distancia
recorrida por
el eluyente (y)

Factor de
retencin
Rf=x/y

Color

Leucina

Distancia
recorrida por
el compuesto
(x)
3.7cm

7cm

0.529

Morado

Prolina

2cm

6cm

0.333

Amarillo

Lisina

2cm

7.4cm

0.27

Morado

Mezcla.
Sustancia 1
Mezcla.
Sustancia 2
Mezcla.
Sustancia 3

2.3cm

7.4cm

0.311

Morado

3.3cm

7.4cm

0.446

Amarillo

4.8cm

7.4cm

0.649

Morado

Rf (Leucina)= 3.7cm/7cm=0.529
Rf (Prolina) =2cm/6cm=0.333
Rf (Lisina) =2cm/7.4cm=0.27

1 Paso:

2 Paso:
0.68

Observamos que aunque los valores no son los mismos, el orden de menor a
mayor son iguales. Hubo errores cometidos en la prctica, como el movimiento
no intencional del frasco donde se llevaba a cabo la cromatografa, por lo que los
resultados difieren de los reales.

Mediciones:
Aminocido

Si es posible, porque gracias a los diferentes

factores de reparto que tiene cada aminocido
ante el eluyente es que muestran diferentes
velocidades de desplazamiento ante la fase mvil.
Por estas diferentes velocidades es que el
desplazamiento final es diferente en cada caso y
entonces quedan separados cada uno de los
aminocidos.

Rf (Sustancia 1) =2.3cm/7.4cm=0.311
Rf (Sustancia 2) =3.3cm/7.4cm=0.446
Rf (Sustancia 3) =4.8cm/7.4cm=0.649

4 Paso:
Esta es nuestra cromatografa de reparto
en papel

Observaciones:
Se concluye que la sustancia 2 en la mezcla corresponde a la prolina
porque ambas presentan la coloracin amarilla ante el revelador de
aminocidos. La sustancia 1 en la mezcla es ms probable que se trate
de la lisina, y la sustancia 3 que se trate de la leucina, porque existe
mayor relacin entre los valores.
Hubo algunos errores que provocaron la diferencia en los factores de
retencin entre los primeros 3 aminocidos y los que formaban la
mezcla, principalmente que hubo movimiento no intencional del frasco
donde se estaba llevando a cabo la separacin de solutos por
cromatografa.
Promedio de los valores obtenidos de Rf por cada aminocido
( ) + ( 3)
2
( ) + ( 2)
2
( ) + ( 1)
2

=
=

0.529 + 0.649
2
0.333 + 0.446
2

0.27 + 0.311
2

=0.589

=0.389

=0.291

Ninhidrina

Pasamos el papel cromatogrfico sobre el bocal de la botella de hidrxido de amonio

concentrado para neutralizar (una vez secadas las muestras)

5 Paso:
Se aadi al tanque cromatogrfico eluyente hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que
ste alcance la zona de aplicacin de las muestras. Se mete la placa en el tanque, se tapa y se
deja desarrollar la cromatografa hasta que el
elulyente alcance el borde superior, sin llegar a sobrepasarlo (45min aproximadamente).

NOTA: Se opera en la campana extractora de gases, ya que el eluyente es txico y no mover la cmara.

6 Paso:
Terminada la cromatografa se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el eluyente, se
seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se roca con un
pulverizador que contiene la solucin reveladora (en la campana de gases). La placa se secar
hacindole llegar aire caliente con el secador.

Hidrxido de amonio
cido actico

CROMATOGRAFIA:
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene
aplicacin en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin
selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y
determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los
compuestos da como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin
efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla.
La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente:
Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan ser usados posteriormente
(etapa final de muchas sntesis).
Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad analtica). En este caso, las cantidades de
material empleadas son pequeas.
LA NINHIDRINA
La ninhidrina es un poderoso agente reactivo comn para visualizar (Castro, J. 1990) las bandas
de separacin de aminocidos por cromatografa o electroforesis, tambin es utilizada con
fines cuantitativos para la determinacin de aminocidos Reacciona con todos los aminocidos
alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloracin que vara de azul a violeta intenso.
Este producto colorido (llamado prpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la
coloracin producida por la ninhidrina es independiente de la coloracin original del
aminocido.

Material:
-Cmara
cromatografa
-Papel para
cromatografa (16cm
de largo X 18cm de
ancho)
-Estufa 90C
-Capilares

Acido etanoico
Frmula: CH3COOH
Masa molecular: 60.1
N CAS 64-19-7
N RTECS AF1340000
N ICSC 0363
N NU 2789
Reactivos:
N CE 607-002-00-6(>90%)
-Aminocidos en
ESTADO FISICO; ASPECTO: Lquido incoloro, con olor acre.
solucin 0.05 M
PELIGROS QUIMICOS: La sustancia es moderadamente cida. Reacciona violentamente con
-Solvente: n-Butanol:
oxidantes tales como trixido de cromo y permanganato potsico. Reacciona violentamente con
cido actico glacial:
bases fuertes. Ataca muchos metales formando gas combustible (Hidrgeno).
Agua (4:1:5)
LIMITES DE EXPOSICION: TLV: 10 ppm; 25 mg/m3 (como TWA); 15 ppm; 37 mg/m3 (como STEL)
-Revelador: Solucin
(ACGIH 1990-1991)
de Ninhidrina
VIAS DE EXPOSICION: La sustancia se puede absorber por inhalacin del vapor y por ingestin.
-Hidrxido de Amonio RIESGO DE INHALACION: En la evaporacin de esta sustancia a 20C se puede alcanzar bastante
concentrado
rpidamente una concentracin nociva en el aire.
EFECTOS DE EXPOSICION DE CORTA DURACION: Corrosivo. La sustancia es muy corrosiva para los
ojos, la piel y el tracto respiratorio. La inhalacin del vapor puede originar edema pulmonar
(vanse Notas). Corrosivo por ingestin.
EFECTOS DE EXPOSICION PROLONGADA O REPETIDA: El contacto prolongado o repetido con la
piel puede producir dermatitis.

Frmula: NH4OH
Masa molecular: 35.1
N CAS 1336-21-6
N RTECS BQ9625000
N ICSC 0215
N NU 2672
N CE 007-001-01-2
ESTADO FISICO; ASPECTO: Disolucin incolora, muy voltil, de olor acre.
PELIGROS QUIMICOS: Reacciona con muchos metales y sus sales dando lugar a la formacin de
compuestos explosivos. Ataca a muchos metales formando gas inflamable de hidrgeno. La
disolucin en agua es una base fuerte y reacciona violentamente con cidos.
LIMITES DE EXPOSICION: TLV no establecido. MAK no establecido.
VIAS DE EXPOSICION: La sustancia se puede absorber por inhalacin del vapor o aerosol y por
ingestin.
RIESGO DE INHALACION: Por evaporacin de esta sustancia a 20C se puede alcanzar muy
rpidamente una concentracin nociva en el aire.
EFECTOS DE EXPOSICION DE CORTA DURACION: La sustancia es corrosiva para los ojos, la piel y
el tracto respiratorio. Corrosiva por ingestin. La inhalacin de altas concentraciones del vapor
puede originar edema laringeal, inflamacin del tracto respiratorio y neumona. Los efectos
pueden aparecer de forma no inmediata.
EFECTOS DE EXPOSICION PROLONGADA O REPETIDA: Los pulmones pueden resultar afectados
por la exposicin prolongada o repetida al vapor o aerosol.

Frmula: C9H6O4
M.=178,15
CAS [485-47-2]
Nmero CE (EINECS): 207-618-1
INDICACIONES DE PELIGRO: Nocivo
FRASES R: 22-36/37/38 Nocivo por ingestin. Irrita los ojos, la piel y las vas respiratorias.
ALMACENAMIENTO: Recipientes bien cerrados. Ambiente seco. Temperatura ambiente
No se descartan otras caractersticas peligrosas. Observar las precauciones habituales en el
manejo de productos qumicos.
Butanol

NOTA: Esta operacin debe de hacerse en la campana extractora de gases.

7 Paso:
Se indican los valores de distancia recorrida por cada uno de los aminocidos en una tabla y se
calculan los correspondientes valores de Rf. Se indica la composicin de la solucin problema,
justificando la conclusin a la que se ha llegado.

CUESTIONARIO:
Frmula: CH3(CH2)3OH
M.=74,12
CAS [71-36-3]
Nmero CE (EINECS): 200-751-6
Nmero de ndice CE: 603-004-00-6
INDICACIONES DE PELIGRO: Nocivo
FRASES R: 10-22-37/38-41-67 Inflamable. Nocivo por ingestin. Irrita las vas respiratorias y la
piel. Riesgo de lesiones oculares graves. La inhalacin de vapores puede provocar somnolencia y
vrtigo.
FRASES S: 7/9-13-26-37/39-46 Mantngase el recipiente bien cerrado y en lugar bien ventilado.
Mantngase lejos de alimentos, bebidas y piensos. En caso de contacto con los ojos, lvense
inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico. sense guantes adecuados y
proteccin para los ojos-la cara. En caso de ingestin, acuda inmediatamente al mdico y
mustrele la etiqueta o el envase.
NMERO DE NDICE CE: 603-004-00-6

En qu orden migran los aminocidos de diferentes grupos?

En una cromatografa, migran primeramente aquellos aminocidos apolares, ya que los
solventes comnmente usados son menos polares que el agua, lo que hace que los
aminocidos polares (con o sin carga) sean retenidos en la fase estacionaria
Es a ninhidrina es un revelador selectivo, porque?
S, porque reacciona con el grupo amino o amoniaco de un compuesto, dando una tonalidad
entre azul y purpura, llamado purpura de Ruhemann
Cmo se calcula el Rf?
=