Tema 6 Introducción A Los Métodos Inmunoquímicos PDF

CFGS LABORATORIO DE DIAGNSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO.
TEMA 6. INTRODUCCIN A LOS METODOS INMUNOQUMICOS.
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TEMA 6. INTRODUCCIN A LOS MTODOS INMUNOQUMICOS

1. CONCEPTOS BSICOS
1.1. Concepto de inmunoanlisis. Clasificacin
1.2. Antgenos
1.3. Anticuerpos
1.4. Reacciones Ag-Ac
2. INMUNOANLISIS POR PRECIPITACIN
2.1. Tcnicas en medio slido
2.1.1. Tcnicas de difusin
2.1.2. Tcnicas electroforricas
2.2. Tcnicas en medio lquido
3. INMUNOANLISIS POR AGLUTINACIN
3.1. Aglutinacin directa
3.2. Aglutinacin indirecta
3.3. Inhibicin de la aglutinacin
3.4. Tect de Coombs (globulina-antiglobulina)
4. INMUNOANLISIS POR FIJACIN DEL COMPLEMENTO
5. INMUNOANLISIS CON MARCADOR
5.1. Clases de inmunoensayos con marcador
5.2. Fluoroinmunoanlisis (FIA)
5.3. Radioinmunoanlisis (RIA)
5.4. Enzimoinmunoanlisis (EIA)
Tcnicas ELISA
5.5. Luminoinmunoanlisis (electroquimioluminiscencia)
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1. CONCEPTOS BSICOS.
1.1. Concepto de inmunoanlisis. Clasificacin.
Los inmunoanlisis o inmunoensayos son aquellas tcnicas de laboratorio que utilizan
la reaccin antgeno-anticuerpo para poner de manifiesto la sustancia a determinar (el Ag
o el Ac). La reaccin Ag-Ac, in vitro, es indetectable por s misma; segn el sistema usado
para revelar dicha reaccin, podemos clasificar los inmunoensayos en:
Inmunoensayos por precipitacin.
Inmunoensayos por aglutinacin.
- Aglutinacin directa o activa.
- Aglutinacin indirecta o pasiva.
- Inhibicin de la aglutinacin.
- Test de Coombs o globulina-antiglobulina.
Inmunoensayos por fijacin de complemento.
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IES Ponce de Len - Utrera

Inmunoensayos con marcador:

- Fluoroinmunoensayo (FIA): el marcador es un fluorocromo.
- Radioinmunoensayo (RIA): el marcador es un istopo radiactivo.
- Enzimoinmunoensayo (EIA): el marcador es una enzima (p. ej., ELISA).
- Luminoinmunoanlisis: el marcador es un compuesto quimioluminiscente.
1.2. Antgenos:
Se denomina antgeno a cualquier sustancia que estimula la formacin de un
anticuerpo (tambin se les llama inmungenos). En su mayora se trata de sustancias
proteicas.Las molculas pequeas que no son capaces por s solas de estimular la
formacin de anticuerpos, pero unidas a otras molculas ms grandes si lo hacen, se les
llama haptenos. Se denomina determinante antignico a la parte del antgeno que se
une al anticuerpo correspondiente. Un antgeno puede tener ms de un determinante
antignico o eptopo.
Los anticuerpos pueden actuar tambin como antgenos, ya que son protenas capaces
de activar la respuesta inmunitaria (los autoanticuerpos son los responsables de las
enfermedades autoinmunes).
1.3. Anticuerpos:
Las inmunoglobulinas son protenas con actividad de anticuerpos. La estructura bsica
y comn de todas las clases de Ig consiste en 4 cadenas polipeptdicas iguales dos a dos.
Dos de ellas se llaman cadenas ligeras (L) y las otras dos, cadenas pesadas (H).
Dentro de cada tipo de cadena se distinguen dos regiones denominadas variable y
constante. En las regiones variables existe una gran diferencia en la secuencia de
aminocidos entre los distintos clones de Ig, de ah su nombre. Esta regin es la que le
confiere el carcter nico (especfico) a cada clon de Ig. En las regiones constantes la secuencia
de aminocidos es siempre la misma en todos los tipos de inmunoglobulinas.
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Las Igs son sintetizadas y segregadas por los linfocitos B (al ser estimulados por un
antgeno), que en fase de actividad mxima se transforman en clulas plasmticas. Cada
determinante antignico de un Ag genera un clon de clulas plasmticas diferentes que
producen inmunoglobulinas distintas, de ah que la respuesta inmunitaria sea policlonal.
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1.4. Reacciones Ag-Ac:

La unin Ag-Ac es una unin no covalente en la
que se implican diversas fuerzas como: atraccin
electrosttica, puentes de hidrgeno, fuerzas de van
der Waals e interacciones hidrofbicas. Las ms
importantes son las electrostticas, debidas a los
grupos polares de los aminocidos; el pH de la
solucin donde se desarrolla la reaccin es por ello
tan crtico; los puentes de H son menos frecuentes,
pero su alto n los hace significativos.
La fuerza de unin depende del ajuste
complementario (estrico) entre el determinante
antignico y el idiotipo del Ac (aquello de la llave y
su cerradura). La especificidad de la reaccin Ag-Ac
es tericamente del 100%, aunque en la prctica, no
siempre es as.
La unin Ag-Ac tiene varias CARACTERSTICAS:
Afinidad: es la suma de todas las fuerzas
implicadas anteriormente descritas para un
nico complejo Ag-Ac; si existe alta afinidad, la
mayor parte del Ag estar formando complejo
con el Ac; depende mucho de la especificidad, de
forma que a mayor especificidad mayor afinidad.
Heterogeneidad de la respuesta: se producen
distintos tipos de Ac para los diversas partes del
Ag (determinantes antignicos). Es debido a que
la respuesta inmunitaria es policlonal (cada Ac
es producido por una clona diferente de clulas
plasmticas). Sin embargo, hoy da podemos
conseguir la produccin de Ac monoclonales, es
decir, un solo tipo de Ac dirigido a un nico
determinante o locus antignico. Esto se ha
logrado mediante la transformacin in vitro de
linfocitos B en clulas tumorales de mieloma
productoras de una Ig concreta. Esto supone una
fuente eterna y constante de una Ig definida.
Avidez: a un antgeno pueden unirse, si tiene
ms de un eptopo, ms de un Ac, formando macrocomplejos insolubles. La avidez
mide la estabilidad del complejo multivalente Ag-Ac (la valencia de un Ag es el
nmero de molculas de Ac con las que puede combinarse dicho Ag).
Reactividad cruzada: cuando varios antgenos tienen eptopos con una estructura y
composicin qumica similar y por tanto reaccionan con el mismo anticuerpo. Es la
base de muchas enfermedades autoinmunes.
Existen tambin otros factores dependientes de la estructura molecular, que afectan a
la formacin de Ag-Ac.
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2. INMUNOANLISIS POR PRECIPITACIN.

Se basan en la insolubilidad del complejo Ag-Ac, de forma que la reaccin de
antgenos, con mltiples determinantes antignicos, con anticuerpos origina precipitados
observables a simple vista. Esta precipitacin Ag-Ac puede realizarse en:
Medio slido: existen diferentes tcnicas, mediante las cuales se observa la
formacin de arcos o anillos de precipitacin en el medio.
- Tcnicas de difusin: inmunodifusin simple, doble y radial.
- Tcnicas electroforticas: electroforesis en cohete, inmuno-electroforesis,
contrainmunoelectroforesis e inmunofijacin.
Medio lquido se utiliza la inmunoturbidimetra o la inmunonefelometra. Detectan
la turbidez o dispersin de la luz causada por los complejos Ag-Ac que forman
partculas en suspensin.
Uno de los factores que afectan a la precipitacin de complejos antgeno-anticuerpo
(Ag-Ac) es la proporcin que exista de Ag y Ac en el medio. Cuando a una solucin con
una alta concentracin de Ac (en cantidad fija), dispuesta en una serie de tubos, se le va
aadiendo Ag, a concentraciones crecientes, y se representa el porcentaje de precipitacin
frente a la cantidad de Ag, se obtiene una curva llamada curva de precipitacin que
tiene tres partes bien diferenciadas:
Zona de exceso de Ac o prozona: la precipitacin no existe o es muy pequea. Debido
a la poca cantidad de Ag, cada molcula del mismo reacciona con varias de anticuerpo
y el complejo que se forma es relativamente soluble (no se forma una red).
Zona de equivalencia: la precipitacin es mxima. Cada Ag est ligado a un Ac, que a
su vez est ligado por su otra (s) valencia (s) a otro Ag. Se forma una red con complejos
grandes y de baja solubilidad.
Zona de exceso de Ag o postzona: el fenmeno es semejante al de exceso de Ac pero al
revs, es decir, cada molcula de Ac reacciona con varias de Ag (tantas como valencias
tenga el Ag, que suelen ser dos). Prcticamente no existe red y la precipitacin de los
complejos es muy baja o incluso nula.
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Los mtodos de precipitacin que a continuacin vamos a describir suelen tener la

misma fuente de error, que es la falta de precipitacin. Para evitar esto, es necesario que
las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo contrario no se alcanza la
equivalencia y no se forma precipitado, es decir, se originan falsos negativos.
Las reacciones de precipitacin Ag-Ac pueden realizarse en medio lquido o slido.
En medio slido, como gel de agarosa, es ideal pues no existe la mezcla homognea del
Ag y Ac, formndose gradientes de concentracin entre el Ag y Ac; en el punto de
equilibrio entre los gradientes se forma un arco o lnea de precipitacin (esto no ocurre en
el medio liquido, es decir, no se forman gradientes).
2.1. Tcnicas en medio slido: se distinguen T. de difusin y T. electroforticas
2.1.1. Tcnicas de difusin:
Inmunodifusin simple tcnica de Oudin:
Consiste en incorporar el anticuerpo (a bajas temperaturas para no desnaturalizarlo) a
un tubo o a una placa Petri con gel de agarosa.
El antgeno a estudiar se aade al tubo, como una placa o se deposita sobre las placas
impregnando un disco.
Despus de dejar un cierto tiempo para que se produzca la difusin del Ag, se
observa la aparicin de bandas de precipitacin en el punto de equivalencia (la
concentracin del Ag y del Ac son equivalentes); es una reaccin unidimensional que se
produce en una sola direccin; se necesitan en el medio electrolitos para que la
precipitacin sea macroscpica (ClNa al 9%).
La distancia desde el punto de aplicacin del antgeno a la lnea de precipitacin es
proporcional a la concentracin del antgeno, si la concentracin del anticuerpo es
constante. Comparando con patrones de concentracin conocida, puede construirse una
curva de calibracin y, a partir de sta, se puede determinar la concentracin del antgeno.
Inmunodifusin doble:
En esta tcnica se colocan el Ag (protena) y el Ac en dos pequeos pocillos hechos
en una placa (o un tubo) que contiene gel de agarosa. Ambos difunden (doble) de forma
radial en el gel, uno hacia otro, producindose un gradiente de concentracin. Cuando se
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ponen en contacto, despus de un cierto tiempo (18 a 48 h), aparece un arco de

precipitacin o banda si es en tubo, que disminuye a medida que se alejan, en el punto de
equivalencia Ag-Ac.
La posicin y forma del arco de precipitacin depende de la concentracin y tamao

de los reactantes (Ag y Ac). El arco estar ms cerca del reactante de menor concentracin,
ya que la distancia recorrida es directamente proporcional a la concentracin. El arco de
precipitacin ser cncavo con respecto al compuesto de mayor peso molecular cuya
velocidad de difusin es menor.
Inmunodifusin radial:
Su utilidad principal es la cuantificacin de protenas especficas. Se incorpora el
anticuerpo en el gel de agarosa (disperso en l). A continuacin se forman pocillos en el
gel y en ellos se colocan estndares de protenas y la muestras a estudiar (antgenos). El
Ag se difunde en el gel durante varias horas y produce anillos de precipitacin a medida
que el Ag y el Ac alcanzan la equivalencia.
Existen dos tipos de tcnicas:
Tcnica de Mancini o mtodo de punto final:
Se permite que el Ag se difunda en el agar durante 24 a 48 horas, hasta que ya no se
produzca expansin. El dimetro del anillo es proporcional a la concentracin del
Ag. Para saber su concentracin exacta, se realiza una curva de calibracin con
soluciones de concentracin conocida (estndares), que se pueden obtener a partir
de una sola diluyndola (por ejemplo 1:8, 1:4, 1:2), y a continuacin se traslada el
dimetro del anillo de la solucin desconocida a dicha curva. La relacin mm de
dimetro con concentracin no es lineal sino logartmica, por lo que se representa
en papel logartmico para poder trazar una recta.
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Tcnica de Fahey o mtodo cintico:

Se requiere un periodo de incubacin ms breve (hasta 18 horas). El dimetro del
anillo se determina en un tiempo determinado, mientras el antgeno contina
difundindose. Esta tcnica es menos fiable.
2.1.2. Tcnicas electroforticas:

Electroforesis es la migracin que sufren las partculas cargadas al someterlas a un
campo elctrico. Esta migracin depende del tamao y la carga de la partcula, de la
viscosidad del medio y del voltaje empleado.
Electroinmunodifusin simple o electroforesis en cohete (tcnica de Laurell):
Es un mtodo cuantitativo utilizado para medir Ag en muestras biolgicas. Es similar a
la inmunodifusin radial, solo difiere en que la placa de gel se expone a un campo
elctrico que permite que las protenas migren en una direccin en forma de cohete. Las
alturas de los cohetes son proporcionales a la cantidad de protena. El Ac est incorporado
a un gel a un pH determinado (normalmente 8,6 que es su punto isoelctrico) para que el
Ac no se mueva y el Ag tenga carga negativa. Utilizando estndares de concentracin
conocidos, podemos extrapolar la concentracin de la muestra.
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Inmunoelectroforesis:
Es una tcnica que combina la especificidad de las reacciones de precipitacin con la
separacin de molculas por electroforesis. Se utiliza para detectar alteraciones
cualitativas, principalmente paraprotenas (inmunoglobulinas monoclonales). Consta de
las siguientes etapas:
Se realiza una electroforesis de la muestra, que separa distintas protenas segn su

carga.
A continuacin, en un pocillo adyacente (de forma alargada y paralelo al rea donde se
ha separado la muestra) se dispone un antisuero frente a una o varias o todas las
protenas que queremos identificar y se procede a una inmunodifusin.
Tras un periodo de incubacin, se lava el agar en solucin salina para quitar el exceso
de protenas que no han reaccionado y se interpreta el resultado, comparndolo con un
patrn conocido (los arcos de precipitacin pueden comprobarse directamente o bien
teirse con colorantes para protenas). Por ejemplo, en un mieloma IgG pondramos
antisuero IgG y observaramos el arco de precipitacin comparndolo con un patrn
conocido.
Este procedimiento se utiliza, generalmente, para caracterizar protenas sricas con
concentraciones superiores a 500 microgr/ml.
Contrainmunoelectroforesis:
Esta tcnica se llama tambin doble electroinmunodifusin. Se realiza una
electroforesis, como en la tcnica anterior, donde se separan los antgenos de la muestra.
En segundo lugar, la inmunodifusin (difusin pasiva espontnea) es sustituida por la
movilidad elctrica debida a la electroforesis, es decir, por una segunda electroforesis
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donde se va a dar la reaccin inmune.

El pocillo que contiene el anticuerpo se pone en el polo positivo (nodo) y el que
contiene el antgeno en el negativo (ctodo). Ello se consigue a un pH en el que los
anticuerpos tengan carga positiva y los antgenos negativa, es decir con el tampn
apropiado. Si la corriente elctrica y las concentraciones de los reactantes son las
adecuadas, se forma una lnea de precipitacin a mitad de camino entre los dos pocillos
ste mtodo se utiliza fundamentalmente para la deteccin de antgenos bacterianos
y virales en sangre. orina, L.C.R. y para la deteccin de autoanticuerpos.
Inmunofijacin:
En primer lugar, se realiza una electroforesis en gel de agarosa (una dimensin) para
separar las protenas de la mezcla. Luego se dispersa el anticuerpo directamente sobre el
gel, lo que hace que precipite la protena que quiere detectarse. El precipitado queda
atrapado en la matriz del gel y el resto de las protenas que no han precipitado, pueden
eliminarse lavando el gel. El gel puede teirse para identificar las protenas.
Esta tcnica se usa sobre todo para identificar paraproteinas.
2.2.
Tcnicas en medio lquido: inmunonefelometra e inmunoturbidimetra.
Son tcnicas espectrofotomtricas que se emplean principalmente para la

determinacin de protenas especficas. Se han aplicado para la determinacin de
inmunoglobulinas, protenas del complemento, apolipoproteinas, protenas de fase aguda,
protenas de la coagulacin, y marcadores tumorales. Tambin se usan en la
determinacin de frmacos y hormonas.
Utilizan la tcnica de inmunoprecipitacin en fase lquida con reaccin Ag-Ac, es
decir, mediante un antisuero especfico se puede determinar la protena plasmtica
correspondiente. El complejo formado aparece en suspensin en un medio lquido dando
lugar a una turbidez que puede ser medida por la dispersin de la radiacin que producen
estas partculas en determinados ngulos, siendo la cantidad de luz dispersada
proporcional a la concentracin del microprecipitado (inmunonefelometra) o por la
medicin de la luz transmitida (inmunoturbidimetra)
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3. INMUNOANLISIS POR AGLUTINACIN.

Las reacciones de aglutinacin consisten en el agrupamiento de partculas en
suspensin, debido a la reaccin Ag-Ac. Las partculas pueden ser clulas vivas (hemates
o bacterias) o partculas inertes (ltex, bentonita etc).
El antgeno ha de estar presente en la superficie de la partcula de forma apreciable (si
est en una hendidura el anticuerpo no llega a ellos) y debe poseer mltiples eptopos. Los
antgenos con un solo determinante no permiten su aglutinacin. Los anticuerpos capaces
de producir una aglutinacin se les denomina aglutininas o anticuerpos completos. La
IgM es el ms eficaz en la aglutinacin, por su multivalencia y tamao.
Para que las reacciones de aglutinacin se produzcan, la concentracin del antgeno ha
de ser de la misma magnitud que la del anticuerpo, ya que de lo contrario se produce el
fenmeno de zona (exceso de antgeno). Las tcnicas que facilitan el contacto Ag-Ac, como
la agitacin, centrifugacin, potencian la aglutinacin, y cuanto mayor sea el tiempo de
incubacin, mejor aglutinar. La aglutinacin es un procedimiento cualitativo que puede
usarse como semicuantitativo (se informa por cruces) o mejor como cuantitativo mediante
diluciones progresivas de la muestra manteniendo constante la cantidad de antgeno
unido a la partcula.
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Los estudios bsicos sobre aglutinacin se hicieron con hemates y sirvieron para
identificar los grupos sanguneos.
Existen diferentes tcnicas de aglutinacin:
3.1. Aglutinacin directa o activa:
En esta tcnica, el anticuerpo reacciona con un antgeno que encuentra presente de
forma natural en la superficie, o muy cerca de la misma, de un determinado tipo de clulas
como hemates o bacterias.
Este tipo de reacciones se emplean generalmente para detectar anticuerpos en
diluciones seriadas de suero y se leen a simple vista. El ttulo del suero es la recproca de la
mayor dilucin que da una aglutinacin visible. A veces hay que aumentar la viscosidad
del medio aadiendo albmina bovina, dextrano, etc., para que la aglutinacin pueda
visualizarse ( caso de los Ac incompletos).
Las tcnicas de aglutinacin directa se utilizan para el diagnstico serolgico de
enfermedades microbianas, como por ejemplo, anticuerpos contra brucella y salmonella y
para la determinacin de los grupos sanguneos.
3.2. Aglutinacin indirecta o pasiva:
En estas tcnicas, el antgeno ha sido transferido a la superficie de una particula inerte,
(p.ej. ltex) o de una clula (hemates de carnero o de pavo) que no lo poseen en estado
natural. El proceso de recubrimiento de la partcula con los antgenos se llama
sensibilizacin. A continuacin se aade la muestra, que si es positiva producir la
aglutinacin.
La prueba se realiza en placa (porta) para detectar anticuerpos solubles que se fijan al
antgeno adsorbido a la superficie de clulas o partculas.
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Como la concentracin de antgeno puede ser controlada artificialmente, la

sensibilidad de la prueba es algo mayor que en las de aglutinacin directa.
Ejemplos de estas tcnicas son:

el VDRL (prueba de laboratorio para la investigacin de enfermedades venreas)
para el diagnstico de sfilis o
la deteccin del factor reumatoide y
Deteccin de Ac anti DNA (ltex-DNA + Ac antiDNA).
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3.3. Inhibicin de la aglutinacin:

Estas tcnicas son una modificacin de las tcnicas de aglutinacin, que permiten detectar
antgenos solubles.
La muestra que contiene el antgeno en forma soluble se incuba con una cantidad
conocida de anticuerpo. Despus se enfrenta al mismo antgeno unido a partculas, y slo
ser capaz de aglutinar, el anticuerpo que haya quedado libre; cuanto mayor sea la
concentracin de antgeno soluble en la muestra, mayor va a ser la inhibicin de la
aglutinacin. La concentracin de anticuerpo y partculas son cuidadosamente controladas
para evitar un exceso de Anticuerpo.
Esta tcnica permite la semicuantificacin, valorando el grado de inhibicin en
diluciones seriadas de la solucin de antgeno. Ej: test de confirmacin de embarazo: la
orina humana contiene gonadotropina corinica (HCG) que se detecta de esta forma.
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3.4. Test de Coombs o globulina-antiglobulina:

Demuestra la presencia de anticuerpos incompletos (no aglutinantes) tipo IgG (p.ej.,
IgG anti-Rh), que estn fijados a un antgeno superficial (hemates principalmente).
El suero de Coombs es una inmunoglobulina antiglobulina-IgG (IgG antihumana de
conejo), que aglutinar la IgG que est fijada. Es necesario un paso previo de lavado con
suero salino para eliminar la IgG en forma soluble (no ligada) que puede dar lugar a falsos
negativos, ya que no se producir la aglutinacin.
Existen dos test de Coombs:
Coombs directo: detecta directamente el anticuerpo en los eritrocitos del paciente.
Suele utilizarse para la deteccin de hematies fetales recubiertos con IgG-materna
Coombs indirecto: analiza el suero para buscar anticuerpos, es decir, pone de
manifiesto la IgG no aglutinante materna. Para ello es necesario, primero, mezclar
la muestra con hemates del grupo O (+) y despus, aplicar el suero de Coombs.
Tambin se usa en la deteccin de IgG no aglutinante anti-brucella.
Otra aplicacin del Test de Coombs: deteccin de Ac anti-determinados frmacos, que se

unen a los eritrocitos y producen anemia hemoltica.
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4. INMUNOANLISIS POR FIJACIN DEL COMPLEMENTO.

Se trata de una tcnica que detecta la existencia de una reaccin antgeno-anticuerpo
por la capacidad de este complejo para fijar el complemento. La prueba requiere dos
pasos:
En el primer paso, el complemento es incubado con un suero (que contiene o no los
anticuerpos) y los antgenos correspondientes.
En el segundo paso, se aaden eritrocitos de carnero sensibilizados (recubiertos de
hemolisina -Ac antieritrocitos, que no lisan en ausencia de C') y la mezcla se incuba
a 37 C durante una hora.
Si el suero contiene anticuerpos contra el antgeno usado, se forman complejos Ag-Ac
que fijan el complemento y ste ya no puede utilizarse para lisar los hemates. Por tanto,
la ausencia de hemlisis indica reaccin positiva, mientras que una lisis completa seala
reaccin negativa:
- Si hay Ac en muestra => No C' libre => No lisis => Prueba (+)
- Si no hay Ac en muestra => C' Libre => Lisis => Prueba (-)
Es una tcnica que mide la concentracin de C', necesario para que se produzca la lisis.
Esta tcnica (detecta [ Ac ] inferiores a 1 microgr/ml), se utiliza en el diagnstico de

infecciones y en la cuantificacin de niveles funcionales de complemento por el grado de
hemlisis que aparece en una suspensin de hemates que se utiliza como elemento de
visualizacin de la reaccin.
5.
INMUNOANLISIS CON MARCADOR.
Revelan la reaccin Ag-Ac mediante un marcador ligado a uno de los componentes

del complejo. Su uso se ha ido generalizando debido a que necesita poca cantidad de
muestra y reactivos (Ag y Ac), son relativamente rpidos (desde minutos hasta horas,
pero habitualmente menos de 24 h), tienen una gran sensibilidad (de microgr. a nanogr.)
y son automatizables.
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En el caso de los radioinmunoensayos existe una dificultad adicional, que es la

necesidad de tener una instalacin radiactiva, por lo que la tcnica est siendo
progresivamente sustituida por las otras, salvo en mediciones concretas y en los
laboratorios de investigacin.
5.1. Clases de inmunoensayos con marcador:
1.
SEGN EFECTO DE LA UNIN, los inmunoanlisis con reactivos (Ag o Ac)

marcados pueden ser de dos tipos:
Homogneos: el compuesto marcado (p.ej, Ag*) se comporta de forma diferente,
est o no unido a su Ac (Ag* libre no da seal y s, el complejo Ag*~Ac), por lo que
no requiere lavado externo, es decir, no necesita separacin la forma ligada (Ag* Ac) de la libre (Ag). En definitiva, no tenemos porqu eliminar el excedente de
Ag que no ha reaccionado con el Ac, porque no interfiere.
Heterogneos: el compuesto marcado se comporta de forma anloga, est o no
unido a su Ac y, por tanto, se requiere lavado para separar la forma ligada de la
libre. Esto sirve para asegurarnos que lo nico que detectamos es la seal
(fluorescencia, radiactividad, etc.) producida por el complejo Ag* -Ac y no por el
Ag* solo. Generalmente se usan en fase slida; puede ser competitivo o no
competitivo.
2. SEGN LA FORMA DE UNIN, pueden ser de dos tipos:

Inmunoanlisis no competitivo: son inmunoanlisis heterogneos. Existe un
exceso de anticuerpo marcado para unirse al antgeno. Se clasifican en los
siguientes tipos.
Directo: Se fija la muestra (Ag) al soporte slido

[Ag muestra ?] + Ac* => [Ag-Ac*] <= medir (previo lavado)
La intensidad de la seal recogida es directamente proporcional a la cantidad de
Ag presente en la muestra.
Indirecto: Se fija el Ag al soporte slido

Ag + [Ac muestra ?] + Anti-Ac* => [Ag-Ac-Anti-Ac*] <= medir (previo lavado)
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Esta tcnica tiene la ventaja de que el Anti-Ac* es un reactivo universal, es decir,

sirve para cualquier inmunoglobulina la porcin Fab del anti-Ac* se une a la
porcin Fc del Ac que buscamos en el suero, y esta porcin Fc es igual en
cualquier Ig. La intensidad de la seal es directamente proporcional a la
cantidad de Ac presente en la muestra.
Tipo Sandwich: Se fija un Ac monoclonal (mc) a una fase slida

Ac mc + [Ag muestra ?]+ Ac* => [Ac mc +Ag + Ac*] <= medir (previo lavado)
El Ag de la muestra, que debe tener al menos dos eptopos (uno para el Ac
monoclonal en fase slida y otro para el Ac*) p.e, prolactina o insulina en suero.
La intensidad de la seal es directamente proporcional a la concentracin del Ag
de la muestra.
Inmunoanlisis competitivo: Pueden ser homogneos o heterogneos. Los

antgenos compiten por un anticuerpo que se encuentra en cantidad limitada. En
estas tcnicas se puede marcar el antgeno o el anticuerpo, por lo que podemos
distinguir dos modalidades:
Tcnicas de Antgeno Marcado: El Ag de la muestra y al Ag* compiten por el

Ac, por lo que la intensidad de la seal es inversamente proporcional a la
concentracin del Ag en la muestra. Son inmunoanlisis heterogneos y segn
se realicen en uno o en dos pasos, distinguimos tcnicas simultneas o
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secuenciales.
> Tcnicas simultneas: un slo paso: mezclar simultaneamente:

[Ag muestra ?] + Ac + Ag* => [Ag-Ac] + [Ag*-Ac] <= medir (previo lavado)
> Tcnicas secuenciales : dos pasos:

1) Ac fijados al soporte + [Ag muestra ?] => [Ag-Ac] + Ac libre?
[Ag-Ac]+ [Ag*-Ac] <= medir (previo lavado)
2) Aadir el Ag*:
Con este mtodo de dos pasos, puede unirse al Ac una cantidad mayor de
Ag no marcado que en la prueba simultanea, especialmente a
concentraciones bajas del antgeno, lo que incrementa la sensibilidad.
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Tcnicas de anticuerpo marcado: --> Mtodos inmunomtricos.

Ag fijados a fase slida + [Ag muestra?] + Ac* => [Ag-Ac*] + [Ag-Ac*] => lavar
para que quede slo los complejos Ag-Ac* unidos a la fase slida <= medir
Los Ac* estn mrcados con una enzima y en cantidad limitada, con lo que los
dos Ag competirn por los Ac*. Se determina la actividad enzimtica (la seal)
que ser inversamente proporcional a la concentracin de antgeno presente en
la muestra.
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5.2. Fluoroinmunoanlisis (FIA).

Emplean los compuestos fluorescentes para el marcaje del Ag del Ac. Las
principales caractersticas que deben poseer los compuestos fluorescentes para su uso en
el FIA son:
- Poseer una intensidad de fluorescencia elevada.
- Que sea posible diferenciar su fluorescencia de la de fondo, producida los
especmenes biolgicos (Ag Ac).
- Que su unin al Ag al Ac no afecte de forma adversa a sus propiedades.
Los compuestos fluorescentes ms utilizados son los derivados de fluorescena (emite
una luz verde) o rodamina.
Existen numerosas tcnicas de FIA, entre las que destacamos:
FA homogneos:
- fluoroinmunoanlisis con sustrato marcado (SLFIA),
- inmunoanlisis de fluorescencia polarizada (FPIA) e
- inmunoanlisis de transferencia de la energa de fluorescencia (FETI).
FIA heterogneos:
- adems del FIA directo, FIA indirecto y tipo sndwich,
- destaca el FIA de disociacin aumentada por lantnidos (DELFIA).
1. FIA con sustrato marcado (SLFIA):
Es un ensayo competitivo simultneo homogneo, donde se utiliza un ligando
marcado (Ag*) y otro no marcado (Ag de la muestra); se basa en una reaccin de enlace
competitivo, porque el Ac est en nmero limitado para enlazar y formar complejos
Ag-Ac.
Ag* + [Ag muestra?] + Ac => [Ag*-Ac] + [Ag-Ac] + Ag* libre
Slo da seal el Ag* libre => por lo que cuanto ms [Ag-Ac] se haya formado, ms
Ag* queda libre y por tanto, ms fluorescencia hay, siendo proporcional a la [Ag
muestra]
La aplicacin de este inmunoanlisis es principalmente para cuantificar frmacos
teraputicos, deteccin de anticuerpos IgG e IgM frente a infecciones virales y para la
determinacin de algunas hormonas.
2. Inmunoensayo de fluorescencia polarizada (FPIA):
Es un ensayo "competitivo simultneo homogneo", donde se utiliza un ligando
marcado (Ag*) y otro no marcado (Ag de la muestra) que combina la reaccin Ag-Ac y
la fluorescencia polarizada, para la determinacin cuantitativa del analito.
Ag* + [Ag muestra?] + Ac => [Ag*-Ac] + [Ag-Ac] + Ag* libre
Slo da seal el Ag* unido al Ac => por lo que cuanto ms [Ag-Ac] se haya
formado, ms Ag* queda libre y menos Ag*-Ac hay: por tanto la intensidad de
fluorescencia es inversamente proporcional a la [Ag muestra]
Las aplicaciones principales del FPIA es la cuantificacin de frmacos teraputicos,
21

abuso de drogas y algunas hormonas.
3. FIA directo:
Es un ensayo "no competitivo", en la que la cantidad de fluorescencia (Ac*), es
directamente proporcional a la cantidad de Ag presente, que debe tener dos eptopos;
suele usarse un ensayo en dos etapas:
1 Ac (fijado a fase slida y en exceso) + [Ag muestra ?] => [Ac-Ag]
2 Aadir el mismo Ac, pero marcado con un fluorocromo (ej. fluorescena):
Ac* => [Ac-Ag] + Ac* => [Ac-Ag-Ac*] <= medir
Se utilizan curvas estndar de [Ag] conocidas.
4. FIA indirecto:
En la prueba indirecta, en una primera fase, se hace reaccionar el Ac*en exceso, con el
Ag en la muestra del paciente (fase lquida) => ensayo "no competitivo"; se forman
complejos Ag-Ac* y queda Ac* libre. La solucin se incuba entonces con Ag adsorbido en
una fase slida, para que se adhiera todo el exceso de Ac* que qued libre; se mide
entonces la fluorescencia, que ser inversamente proporcional a la concentracin de Ag en
la muestra.
22

5.3. Radioinmunoanlisis (RIA):

Utiliza compuestos radiactivos para el marcaje. Pueden ser de dos tipos, segn la
radiacin que emitan:
Radiacin beta: tritio (3H), carbono 14 (4C) y fsforo 32 (32P).
Radiacin gamma: Iodo 125 (125 I), yodo 131 (131I) y cobalto 58 (5~Co)
Los istopos utilizados en el RIA deben tener las siguientes caractersticas:
Actividad especfica alta (emisin de gran actividad)
Una produccin de energa alta.
Vidas medias adecuadas.
Fcil obtencin.
No afecten a la reaccin Ag-Ac.
Los aparatos utilizados para detectar la radioactividad se llaman contadores: contador
gamma, para la radiacin gamma y contador de centelleo para la radiacin beta.
Existen dos mtodos fundamentales de RIA:
1. RIA clsico:
Es un inmunoanlisis competitivo simultneo heterogneo, en el cual una cantidad
fija de Ag marcado radiactivamente y Ag de la muestra compiten por un nmero limitado
de Ac.
Sus aplicaciones principales son: la cuantificacin de hormonas de alto y bajo Pm,
protenas plasmticas normales y anormales, factores de coagulacin, Ac frente a Ag
virales, vigilancia del nivel teraputico de frmacos, etc.
23

2. Anlisis radioinmunomtrico (IRMA):

Es un inmunoanlisis no competitivo heterogneo, en el cual se usa un Ac marcado
(Ac*) para determinar la presencia del analito en lquidos biolgicos. Se utiliza el Ac* en
exceso para detectar todo el analito presente, lo que lo hace un anlisis ms sensible que el
RIA clsico.
Las aplicaciones principales son la determinacin de protenas sricas, factor de
coagulacin VIII, ferritina, Ag carcinoembrionario, a-fetoprotena, IgE, fosfatasa cida
prosttica, Ag prosttico especifico y hormonas como la GH, gonadotropina corinica en
suero y orina, etc.
5.4. Enzimoinmunoanlisis (EIA):

El marcador es una enzima, por lo que utilizamos las propiedades catalticas de las
enzimas para detectar y cuantificar las reacciones inmunolgicas (Ag-Ac).
Una sola molcula de enzima puede catalizar la conversin de millones de molculas
de sustrato, en millones de molculas de producto. Esta capacidad de amplificacin hace
posible detectar la presencia de una pequea cantidad de enzima (que est unida al Ac) al
aadir el sustrato y, como consecuencia, de pequeas cantidades de complejos marcados.
Los EIA constan de dos etapas:
1 etapa: se produce la reaccin entre el Ag y el Ac* marcado con el enzima.
2 etapa: se aade el sustrato y se determina la actividad de la enzima marcadora.
Caractersticas de las enzimas para su uso como marcadores:
Ser de fcil obtencin, con elevado grado de pureza y bajo costo.
Poseer un recambio enzimtico alto (molculas de sustrato transformadas por
unidad de tiempo).
Ser estables en las condiciones de la prueba.
Ser de medida sencilla, sensible y rpida.
No encontrarse en el medio en que se van a medir (fluidos biolgicos), ni ser
inhibidas por sustancias presentes en los lquidos biolgicos. Esto es decisivo, sobre
todo, en ensayos homogneos (no hay lavado).
No perder actividad con la conjugacin (acoplamiento al Ag al Ac).
Conservar la actividad en las condiciones de la prueba.
Las principales enzimas utilizadas en los EIA son: Fosfatasa alcalina, Peroxidasa de
rbano, Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, beta-galactosidasa; la beta-lactamasa y la
pirofosfatasa se estn investigando.
Las enzimas se fijan (acoplan) mediante conjugacin con compuestos que presentan
dos lugares reactivos, uno por el que se fija al Ac y otro a la enzima. El ms utilizado es
el glutaraldehdo.
Determinacin de la actividad enzimtica:
Inicialmente se utilizaban sustratos de las enzimas que producan compuestos
24

medibles fotomtricamente (cromgenos). En los ltimos aos se utilizan sustratos que

dan compuestos fluorescentes o luminiscentes, lo que ha incrementado la
sensibilidad de las pruebas. Esta sensibilidad de los EIA se ve incrementada, adems,
mediante la amplificacin de la actividad enzimtica. Por ejemplo, que el producto de
la enzima marcadora sea el sustrato de una segunda enzima, que genera una gran
cantidad de producto (que es lo que se mide).
Tipos de Enzimoinmunoanlisis:
EIA homogneos: EMIT y CEDIA
EMIT: La tcnica de inmunoanlisis mediada por enzimas (EMIT), es un

mtodo "competitivo simultneo homogneo". En ella se marca la sustancia que
se desea determinar (AgE). Cuando el AgE se une a un Ac especfico contra ella
(AgE-Ac), se produce la inhibicin de la actividad enzimtica, al impedirse el
acceso del sustrato al centro activo del enzima.
El procedimiento sera:
AgE + [Ag muestra ?] + Ac => [AgE -Ac] + [Ag-Ac]
Cuanto mayor sea la cantidad de Ag de la muestra, menos cantidad del AgE se
une al Ac y la actividad enzimtica es mayor. Por consiguiente, la actividad
enzimtica es directamente proporcional a la [Ag] que hay en la muestra.
25

CEDIA: Cloned Enzyme Donor Immuno Assay, es el primer tipo de EIA

diseado y desarrollado con tcnicas de ingeniera gentica. Es un mtodo
"competitivo simultneo homogneo". Su fundamento es el siguiente:
- Se preparan fragmentos inactivos (Ea y Ed) de beta-galactosidasa por
manipulacin del gen que controla su sntesis en el Escherichia coli.
- Estos fragmentos se unen espontneamente para formar el enzima activo
(Ea+d), aunque el fragmento Ed est unido al antgeno.
- Sin embargo, cuando se produce la reaccin AgEd~Ac, ya no pueden unirse
los dos fragmentos y no se forma el enzima activo.
Ag Ed + [Ag muestra?] + Ac => AgEd~Ac + Ag-Ac

La competicin entre el antgeno de la muestra y el que va unido al fragmento Ed
determinar la cantidad de enzima activo que se forme y, por lo tanto, la actividad
enzimtica medida ser proporcional a la concentracin de antgeno libre presente
en la muestra.
Las aplicaciones de los EIA homogneos son, principalmente, la deteccin de

frmacos y hormonas de bajo peso molecular como, por ejemplo, la tiroxina, ya que
debe existir un estrecho contacto entre el anticuerpo y el enzima marcador para que
26

quede afectada su actividad.

EIA heterogneos:
Son adecuados, tanto para compuestos de bajo Pm como para sustancias de Pm
elevado como las protenas. Estas tcnicas estn reemplazando al RIA, entre otros
motivos, por los menores riesgos en el manejo de los reactivos y un mayor tiempo
de conservacin de los mismos (la actividad enzimtica dura aos).
Entre los EIA heterogneos ms utilizados en el laboratorio esta la tcnica ELISA
(Enzyme linked inmunosorbent assay: anlisis inmunoabsorbente con la enzima
ligada). En esta tcnica uno de los componentes de la reaccin (Ag Ac) se adsorbe
(se une) a la superficie de una fase slida (placa de microtitulacin, una partcula
magntica o una bola de plstico).
Los ELISA pueden ser de dos tipos:
1. ELISA competitivos: La seal obtenida (color) tras la actividad enzimtica es
inversamente proporcional a la concentracin del Ag de la muestra.
2. ELISA no competitivo: La seal obtenida (color, fluorescencia...) tras la actividad
enzimtica es directamente proporcional a la concentracin de la sustancia que se
cuantifica. Existen dos mtodos:
ELISA indirecto: se utiliza para medir la concentracin de anticuerpo en las

muestras de lquidos biolgicos.
La aplicacin ms frecuente es la medicin de los anticuerpos IgG e IgM en
diversas infecciones (sarampin, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, V1IH,
etc) y en enfermedades de causa inmunolgica.
27

ELISA
tipo
sndwich:
se
conoce
tambin
como
anlisis
inmunoenzimomtrico. Son los mtodos ELISA ms empleados para detectar
antgenos que tienen por lo menos dos determinantes antignicos (bivalentes o
polivalentes). Permite la cuantificacin de marcadores tumorales (Ag
carcinoembrionario, alfa-fetoprotena, etc), CK-MB, ferritina, FSH, HCG,
prolactina, PAP (fosfatasa cida prosttica), PSA (antgeno especifico de la
prstata), TSH, y muchos otros antgenos incluidos protenas y virus. Un ELISA
tipo sndwich es el MEIA (inmunoensayo enzimtico de microparticulas),
muy utilizado en algunos autoanalizadores (en concreto, en el AXSYM de los
laboratorios Abbott).
5.5. Luminoinmunoanlisis: electroquimioluminiscencia.

La quimioluminiscencia, es la emisin de luz que acompaa a ciertas reacciones
qumicas, como por ejemplo, la oxidacin de un compuesto orgnico.
El luminoimnunoanlisis (LIA) utiliza los compuestos quimioluminiscentes (luminol,
derivados de acridinio, etc.) como marcadores para detectar la reaccin Ag-Ac. Un
tipo especial de LIA es la electroquimioluminiscencia (ECL).
La ECL difiere de la quimioluminiscencia tpica en el hecho de que la especie

quimioluminiscente activa es generada electroquimicamente en la superficie de un
electrodo, a partir de precursores estables, como el quelato de rutenio, es decir, que
no se consumen en la reaccin de emisin de la seal (la lucigenina emite luz al ser
oxidada, pero se consume).
28

La ECL es una tcnica inmunolgica en fase "heterognea" (requiere lavados) que

combina la reaccin inmunolgica convencional Ag-Ac, con la reaccin
electroqumica sobre la superficie de un electrodo, para generar luminiscencia. Se
pueden realizar con la ECL todo tipo de inmunoensayos, "no competitivo"
(indirecto, etc.) y "competitivo".
Esta tecnologa tiene gran capacidad de amplificacin de la seal, lo que
permite obtener inmunoensayos de una gran sensibilidad (podemos detectar
concentraciones de analitos muy bajas).
Ventajas de la ECL en relacin a otros inmunoensayos con marcador son:
- Se amplifica mucho la seal, lo que permite ensayos muy sensibles.
- No se consume el marcador, cosa que si ocurre en la quimioluminiscencia,
donde no se puede obtener ms que un fotn por molcula marcadora.
La quimioluminiscencia es, con el mtodo indirecto, directamente proporcional a
la concentracin de anticuerpo en la muestra. #
29

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CFGS LABORATORIO DE DIAGNSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO.

TEMA 6. INTRODUCCIN A LOS METODOS INMUNOQUMICOS.

TEMA 6. INTRODUCCIN A LOS MTODOS INMUNOQUMICOS

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Inmunoensayos con marcador:

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1.4. Reacciones Ag-Ac:

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2. INMUNOANLISIS POR PRECIPITACIN.

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Los mtodos de precipitacin que a continuacin vamos a describir suelen tener la

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ponen en contacto, despus de un cierto tiempo (18 a 48 h), aparece un arco de

La posicin y forma del arco de precipitacin depende de la concentracin y tamao

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Tcnica de Fahey o mtodo cintico:

2.1.2. Tcnicas electroforticas:

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Se realiza una electroforesis de la muestra, que separa distintas protenas segn su

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donde se va a dar la reaccin inmune.

Tcnicas en medio lquido: inmunonefelometra e inmunoturbidimetra.

Son tcnicas espectrofotomtricas que se emplean principalmente para la

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3. INMUNOANLISIS POR AGLUTINACIN.

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Como la concentracin de antgeno puede ser controlada artificialmente, la

Ejemplos de estas tcnicas son:

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3.3. Inhibicin de la aglutinacin:

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3.4. Test de Coombs o globulina-antiglobulina:

Otra aplicacin del Test de Coombs: deteccin de Ac anti-determinados frmacos, que se

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4. INMUNOANLISIS POR FIJACIN DEL COMPLEMENTO.

Esta tcnica (detecta [ Ac ] inferiores a 1 microgr/ml), se utiliza en el diagnstico de

INMUNOANLISIS CON MARCADOR.

Revelan la reaccin Ag-Ac mediante un marcador ligado a uno de los componentes

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En el caso de los radioinmunoensayos existe una dificultad adicional, que es la

SEGN EFECTO DE LA UNIN, los inmunoanlisis con reactivos (Ag o Ac)

2. SEGN LA FORMA DE UNIN, pueden ser de dos tipos:

Directo: Se fija la muestra (Ag) al soporte slido

Indirecto: Se fija el Ag al soporte slido

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Esta tcnica tiene la ventaja de que el Anti-Ac* es un reactivo universal, es decir,

Tipo Sandwich: Se fija un Ac monoclonal (mc) a una fase slida

Inmunoanlisis competitivo: Pueden ser homogneos o heterogneos. Los

Tcnicas de Antgeno Marcado: El Ag de la muestra y al Ag* compiten por el

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> Tcnicas simultneas: un slo paso: mezclar simultaneamente:

> Tcnicas secuenciales : dos pasos:

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Tcnicas de anticuerpo marcado: --> Mtodos inmunomtricos.

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5.2. Fluoroinmunoanlisis (FIA).

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