ACTUALIZACIN EN

SENSIBILIDAD ANTIFNGICA

Buenaventura Buenda
Servicio de Microbiologa
H. U. de la Princesa
6 de marzo de 2014

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
ANTIFNGICA
- Mayor incidencia de infecciones
- El espectro de patgenos fngicos a su vez
est creciendo
- El reconocimiento temprano de especies
resistentes intrnsecamente a antifungicos
garantiza un tratamiento ptimo
- Mayor utilizacin de antifngicos
- Ms frmacos disponibles
- Aparicin de resistencias

MTODOS DE SENSIBILIDAD PARA

LEVADURAS
-1982: subcomit de la NCCLS
- 1992: documento M27-P

European Society of Clinical

Microbiology and Infectious
Diseases (ESCMID)

MTODOS DE REFERENCIA
LEVADURAS

HONGOS FILAMENTOSOS

CLSI: Clinical and Laboratory

Standards Institute

CLSI
- M38-A2: microdilucin
No hay puntos de corte
Abril-2009

- M27-A3: microdilucin
M27-S4: tablas
Diciembre-2012

- M51-A: difusin
M51-S1: tablas
Mayo-2010

- M44-A2: difusin
M44-S3: tablas
Agosto-2009
EUCAST
- E.DEF 7.2: 2012
Puntos de corte: V.6.1 (3-2013)

European Committee
for Antimicrobial Susceptibility
Testing
- E.DEF 9.1: 2008
Puntos de corte: V.6.1 (3-2013)

Diferencias CLSI/EUCAST

EFECTO TRAILING
(CRECIMIENTO RESIDUAL)
- Crecimiento reducido, pero persistente, a
concentraciones por encima de la CMI
- Causa desconocida: depsitos, pH, T
- Dificulta la lectura
- Se produce con frmacos fungistticos
- Puede ser S a las 24 h y R a las 48
- Diferentes interpretaciones:
*No crecimiento o turbidez (ANB)
*Reduccin prominente del crecimiento
(azoles)

EUCAST
- La industria no tiene voto en la toma de decisin sobre
puntos de corte
- Los documentos y guas tcnicas son de acceso libre y
gratuito a travs de su pgina web (ww.eucast.org)
- La SEIMC, en sintona con la ESCMID, ha venido
trabajando en los ltimos aos en la implantacin de
los criterios de EUCAST en Espaa
- Propuso la creacin (2012) del denominado Comit
Espaol del Antibiograma (COESANT)
- La implantacin de los criterios EUCAST en Espaa es
insuficiente, en torno al 40% (CC-SEIMC)

COESANT: OBJETIVOS
1) Implantacin de la normativa de EUCAST
2) Implicacin de las autoridades en el proceso de
implantacin de EUCAST

3) Revisin de los documentos cientficos SEIMC ajustando

su contenido a la normativa EUCAST
4) Desarrollo de un programa de educacin en antibiograma
5) Revisin crtica de los documentos EUCAST
6) Propuestas sobre documentos para su presentacin al
Comit Ejecutivo de EUCAST
7) Traduccin al espaol de los documentos ms relevantes
de EUCAST para su inclusin en su pgina web

EUCAST.2008
- ndice farmacodinmico: ABC/CMI=DOSIS/CMI
- Es deseable que DOSIS/CMI100
- Puntos de corte basados en estos principios:

SDD

EUCAST

CLSI

16-32

64

- C. glabrata: insuficientes evidencias para su uso (salvo ITU)

- C. krusei: intrnsecamente resistente

MTODOS BASADOS EN LA
DIFUSIN: DISCOS
- Mtodo no cuantitativo
- NCCLS: en 2004 M44-A: slo para especies de Candida
- CLSI: agosto 2009 M44-A2
- Medio Mueller-Hinton suplementado con:
* 2% de glucosa: mejora el crecimiento
* 0,5mcg/mL de azul de metileno: desaparece el trailing

- Preparacin a partir de medio deshidratado

*Azul: 0,1 g en 20mL de agua: aadir 100 mcl a un litro
*Aadir 20 g de glucosa por litro
*Autoclavar
*Ph 7,2-7,4

MTODOS BASADOS EN LA
DIFUSIN: M44-A2
- Preparacin con placas comerciales de MH:
*Solucin stock de glucosa: 40 g en 100 mL de agua
*Aadir 200 mcl del stock anterior a los 100mL de G
*Autoclavar
*Dispensar 1,5 mL en cada placa de MH y extender

*Dejar que se seque (4-24 h)

- Placas listas para su uso: MHAG-AM (IZASA)
- Inculo: 0,5 de McFarland: 1-5X106 ufc/mL
- Torunda extender tres veces sobre la superficie

MTODOS BASADOS EN LA
DIFUSIN: M44-A2
- Incubacin: 20-24 h a 35 (48 h si no hay crecimiento)
- Medir el halo en el punto en que se produce una
reduccin prominente del crecimiento (subjetivo)
- Ignorar: *microcolonias en los bordes
*colonias aisladas en el interior del halo
- Interpretacin: M44-S3
DIAMETRO

CMI

S-DD

S-DD

FLUCONAZOL
25 g

14

15-18

19

64

16-32

VORICONAZOL
1 g

13

14-16

17

CASPOFUNGINA
5 g

10 (NS)

11

>2 (NS)

Interpretacin: M44-S3

HONGOS FILAMENTOSOS: DISCOS

DOCUMENTO M51-A (CLSI)

- Medio: Muller-Hinton (sin suplementos)

- Pase a PDA: incubar a 35, 2-7 das
- Aadir 1 ml de suero y una gota (10 mcl) de Tween 20
- Tubo estril y dejar sedimentar 3-5
- Extraer y mezclar el sobrenadante
- Ajustar la DO a 530 nm de 0,09-0,13 (Aspergillus): 0,5 MF

HONGOS FILAMENTOSOS: DISCOS

DOCUMENTO M51-A
- Introducir una torunda
- Sembrar girando la placa tres veces
- Incubar a 35 de 24 a 72 h.
- Medir el dimetro desde el punto con un descenso
prominente del crecimiento (80%)
- No hay puntos de corte clnicos, s epidemiolgicos
(ECV)

HONGOS FILAMENTOSOS: DISCOS

DOCUMENTO M51-A

- Membrana celular:
1. Polienos Unin Ergosterol/Dao oxidativo
2. Azoles Sntesis Ergosterol
3. Alilaminas Sntesis Ergosterol
- Pared celular:
4. Equinocandinas Sntesis Glucano
- cidos nucleicos:
5-fluorocitosina

PUNTOS DE CORTE
- Interpretacin de la CMI mediante puntos de corte
epidemiolgico, farmacodinmico y clnico
1. Epidemiolgico: separa la poblacin que no posee
mecanismos de resistencia adquiridos (poblacin salvaje)
del resto
2. Farmacodinmico: se elige a travs de los ndices
farmacodinmicos que predicen la eficacia in vivo
(ABC/CMI, Cm/CMI o T/CMI)
3. Clnico: se derivan de estudios clnicos prospectivos en
humanos comparando la evolucin con la CMI del
patgeno separa las cepas en dos grupos: aquellas con
una alta o baja probabilidad de xito teraputico

PUNTOS DE CORTE
- Tras la estandarizacin, el objetivo de ambos comits (EUCAST y
CLSI) ha sido establecer puntos de corte
- Actualmente, los procedimientos del EUCAST y del CLSI para definir
puntos de corte son similares basados en:
*anlisis poblacional de las CMI
*aplicacin de variables farmacocinticas/dinmicas
- Objetivo: relacionar el antibiograma con la respuesta clnica a un
determinado antifngico
- Se han definido los puntos de corte epidemiolgicos, valores que
ayudan a separar la poblacin normal sensible de la resistente
- Estos puntos de corte epidemiolgicos pueden utilizarse para
interpretar los resultados de los estudios de sensibilidad, en casos
en los que no hay suficiente informacin para establecer puntos de
corte clnicos

PUNTOS DE CORTE
- Los primeros puntos de corte se describieron en 1997
(CLSI): para Candida spp
- Los puntos de corte disponibles hoy son especficos para
cada especie

- Eran puntos de corte de fluconazol e itraconazol, basados

en distribuciones de CMI as como en la respuesta clnica
de pacientes con candidiasis orofarngea
- En los ltimos aos se ha modificado el mtodo para
establecer puntos de corte (EUCAST y CLSI)

PUNTOS DE CORTE
1. Se recopilan cientos de CMI de un determinado
antifngico, para cada una de las especies fngicas
2. Se hace un anlisis poblacional y se establecen los valores
de CMI de distribucin central, la denominada poblacin
salvaje
3. Se define un punto de corte epidemiolgico (ECOFF,
epidemiological cut-off), a partir del cual se encuentra una
poblacin con una CMI ms elevada que la de la salvaje,
que se considera resistente
- Algunos de los puntos de corte actuales estn basados solo
en los ECOFF y en datos farmacocinticos, ya que no se
dispone de datos clnicos suficientes para encontrar una
correlacin con los datos de sensibilidad in vitro

PUNTOS DE CORTE
4. El procedimiento para establecer puntos de corte contina con:
* el anlisis de las dosis ms habituales utilizadas
* el estudio de las variables farmacocinticas y farmacodinmicas
* el estudio de modelos experimentales de infeccin

5. Se define cul es el parmetro ms til para predecir la respuesta

(rea bajo la curva/CMI, concentracin mxima/CMI, T/CMI, etc.)

6. Anlisis de probabilidad (simulacin de Monte Carlo), para

comprobar que los datos farmacodinmicos se ajustan a un
modelo predecible

7. Por ltimo se analizan los datos de infecciones fngicas en

pacientes de los que se dispone de datos clnicos y cepas
identificadas a nivel de especie, y con estudio de sensibilidad

PUNTOS DE CORTE
8. Si se encuentra correlacin entre la respuesta clnica y la
farmacodinmica, se establece un punto de corte clnico

9. Si no es as, se recomienda emplear el ECOFF para

interpretar los resultados de los estudios de sensibilidad,
hasta que se disponga de los estudios necesarios para
establecer los puntos de corte clnicos

PUNTOS DE CORTE
- El EUCAST ha establecido puntos de corte de
ANB, anidulafungina, micafungina, fluconazol,
voriconazol y posaconazol para Candida spp
- El CLSI ha definido puntos de corte para
equinocandinas y los azoles (no posaconazol)
- El CLSI ha modificado parte de los puntos de
corte que haba establecido en 1997
- Los puntos de corte de fluconazol coinciden con
los establecidos por el EUCAST

IE: sin evidencias para establecer un punto de corte

NR: no se recomienda realizar estudio de sensibilidad pues la
especie parece ser resistente in vitro
SE: puntos de corte en proceso de definicin

EUCAST

CLSI

IE: sin evidencias para establecer un punto de corte

NR: no se recomienda realizar estudio de sensibilidad pues la especie parece ser
resistente in vitro
SE: puntos de corte en proceso de definicin
*Equinocandinas/Candida parapsilosis: recomendacines en discusin

EUCAST 2014

Aspergillus

MTODOS COMERCIALES
- Las tcnicas comerciales sensibilidad se han
implantado en los laboratorios clnicos
1. Microdilucin: Sensititre (basado en el M-27A)
- Indicador de oxido-reduccin (azul Alamar)
- La lectura visual es ms fcil y objetiva:
* Pocillos con crecimiento: color rosa
* Pocillos sin crecimiento: color azul
- CMI: concentracin ms baja de color azul
- Azoles (efecto trailing): paso de rosa a prpura
(inhibicin parcial del crecimiento)
- Buena correlacin: mayor del 90%
2. Difusin: E-test

SENSITITRE
A
A
M
C
1

5
2

P
V

0,5

I
F

>16
16

MTODOS BASADOS EN LA
DIFUSIN: E-TEST
- Mtodo cuantitativo de difusin
- Correlacin >90% con el M-27A

- Medio: RPMI con 2% de glucosa

- Inculo: 0,5 de McFarland
- Sembrar en tres direcciones
- Lectura a las 24 horas
- Puede ser el ms til para la ANB
- Estudios de sinergia

MTODOS BASADOS EN LA
DIFUSIN: E-TEST

MTODOS BASADOS EN LA
DIFUSIN: E-TEST

MTODOS DE SENSIBILIDAD PARA

HONGOS FILAMENTOSOS: E-TEST
- Medio: RPMI con 2% de glucosa
- Incubacin: 48 h para Aspergillus
- Inculo igual al M38-A (0,5 MF)
- Sembrar en tres direcciones
- Buena correlacin con el M38-A2

MTODOS DE SENSIBILIDAD PARA

HONGOS FILAMENTOSOS: E-TEST
- Incubacin: 48 h para Aspergillus
- Buena correlacin con el M38-A2

SENSIBILIDAD: INDICACIONES
1. Identificacin al nivel de especie
2. No ordinariamente a todos los aislamientos
3. Estudios de sensibilidad peridicos
4. Candidiasis mucosas: no respuesta a tratamiento
5. En candidiasis profundas

6. Screening con disco de fluconazol

7. IFI por hongos filamentosos: E-test

CANDIDA Y AZOLES
- C. krusei:

*menor afinidad de la diana por el fluconazol

- C. glabrata: *sensibilidad variable a fluconazol,

dependiente de la dosis, a priori sensible
*elevada tasa de mutacin
*CMI altas
*bombas de expulsin

*afectan a otros azoles

*slo en ITU

CANDIDA Y OTROS
ANTIFNGICOS
- C. guillermondii y lusitaniae:
*pueden adquirir resistencia a ANB
- C. guillermondii y parapsilosis:
*Mutacin intrnseca en las subunidades Fks1 y 2
de la glucan-sintetasa
*CMI elevada frente a equinocandinas
*Repercusin clnica por determinar
*Vigilar la respuesta del paciente, sobre todo si
CMI previa es alta

OTRAS LEVADURAS
- Saprochaete capitata (Blastoschizomyces capitatus)
*datos contradictorios
*Poco sensible o resistente a fluco y equinocandinas
*S a ANB y voriconazol (tto combinado)

BASIDIOMICETOS
- Dficit de B-glucano: resistencia a candinas
- C. neoformans:
*Sensible a los azoles y a la ANB
- Malassezia
*Retirada del catter o infusin
*Fluconazol o ANB
- Trichosporon
*T. asahii: resistente a ANB
*Fluconazol: variable

Trichosporon spp.

*Vori e itra son los ms potentes frente a todos

TRATAMIENTO DE LA
CANDIDEMIA
1. Especie no identificada: equinocandina
2. Formas leves, sin azol previo, no colonizacin por C.
krusei o C. glabrata: Fluconazol (600-800 mg/d)
3. Si la especie identificada es S a Fluconazol (CANALB,
CANTRO o CANPAR) seguir con 400 mg/d
4. CANKRU: Vori, equinocandina o ANB liposomal
5. CANLUS: Equinocandina o Fluconazol
6. CANPAR y CANGUI son menos S a equinocandinas: F, V
7. CANGLA y CANFAM: puede desarrollar R a Fluconazol
8. CANKRU y CANNOR: son R a fluconazol
9. Basidiomicetos (Criptococo, Trichosporon): R a EQC

ASPERGILLUS
- A. terreus:
*resistente a ANB
*sensible a voriconazol y
candinas
- A. flavus:
*algunas cepas son R a ANB

MUCORALES (M38-A)
- No existen puntos de corte
- Anfotericina B: presenta las CMI ms bajas
*CMI: 0,5-2
*Antifngico de eleccin
- Equinocandinas (CMI>128): inactivas
*Sinrgicas con ANB y posaconazol
- Fluconazol: inactivo frente a hongos
filamentosos
- Vori e itraconazol: inactivos
- Posaconazol (CMI: 0,25-2): alternativa a la ANB

HONGOS EMERGENTES

Fusarium

Acremonium

Scedosporium

Scopulariopsis

HONGOS EMERGENTES:
FUSARIUM
- Elevadas CMI frente a la mayora de antifngicos
(ANB)
- Equinocandinas (CMI>32): inactivas
- Poca experiencia en el tratamiento
- F. solani (50%): CMI elevadas a azoles y ANB
- F. oxysporum: ms sensibles a vori y posaconazol
- Respuesta del 40% en series pequeas:
*ANB + otros antifngicos
*Voriconazol en casos refractarios (45%)

HONGOS EMERGENTES:
Scedosporium
- S. apiospermum:
*Voriconazol es el ms activo CMI90: 0,25
* Caspofungina CMI90:1-4

*ANB: CMI elevadas. Se debe evitar

*Recuperacin de la neutropenia
- S. prolificans: resistente a la mayora
*ANB, voriconazol, candinas
*Voriconazol + terbinafina

PATRN HABITUAL DE SENSIBILIDAD: HONGOS

FILAMENTOSOS
ANB

ITRA

VORI

POSA CANDINAS

A. fum

A. terr

F. solani

S. api

S. pro

Mucorales

CONCLUSIN
ANB

FLUCO

ITRA

VORI

POSA

CANDINAS

Candida sp

+++

+++

+++

+++

+++

+++

C. Glabrata

+++

0/+

++

++

+++

C. Krusei

+++

++

+++

+++

+++

C. Lusitaniae

+/0

+++

+++

+++

+++

+++

C. Parapsilosis

+++

+++

+++

+++

+++

+/++

Aspergillus

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Mucorales

+++

++

Cryptococcus

+++

+++

++

+++

+++

Emergentes

+/++

0/+

++

+?

A. terreus

Muchas gracias