VacciMonitor 2014;23(1):3-10

www.finlay.sld.cu/vaccimonitor.htm
Prez N, et al. VacciMonitor 2014;23(1):3-10

Caracterizacin estructural del factor estimulador de colonias de los

granulocitos, Hebervital
Natacha Prez,* Ya Cruz, Galina Moya, Lourdes Costa, Lzaro Betancourt, Vladimir Besada, Joel Ferrero, Jorge
Luis Lpez
Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB), PO Box 6162, Cdigo Postal 10600. La Habana. Cuba. Telef: (537)-
271 6022.
email: natacha.perez@cigb.edu.cu

El factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) es un medicamento que pertenece a un grupo de

protenas hematopoyticas. Se obtiene por va recombinante en el Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa,
de Cuba, desde el ao 2000 y es comercializado como Hebervital. Se indica a pacientes con neoplasias afectados
de neutropenia febril, con tratamiento mielosupresor, seguido de trasplante de la mdula sea, entre otros.
Induce alteraciones en la actividad biolgica de los neutrfilos maduros que pudieran aumentar la defensa del
husped en respuesta a patgenos, como bacterias y hongos. En este trabajo se realiz un anlisis especfico del
G-CSF para determinar su pureza y caracterizacin; adems, se demostr su posible comparabilidad con productos
de otras firmas comerciales. El patrn de bandas de las muestras en la electroforesis, as como el porcentaje del
rea y los perfiles cromatogrficos bajo la curva en la cromatografa lquida de alta resolucin, fueron similares
entre los diferentes productos. La digestin enzimtica y la separacin proteoltica de los pptidos generaron
mapas peptdicos reproducibles y de elevada similitud con el Neupogen.

Palabras clave: factor estimulador de colonias de granulocitos, G-CSF, neutropenia, Hebervital.

Introduccin

Los factores estimuladores de colonias hematopoyticas se estudios cristalogrficos refieren que estas modificaciones
utilizan en diferentes tratamientos mdicos y se encuentran estn fsicamente muy alejadas de los sitios que influyen en
en curso ensayos clnicos donde se utilizan como adyuvantes la actividad biolgica (9).
en vacunas antitumorales (1) y para mejorar los efectos de la
vacunacin, por ejemplo, contra la hepatitis B (2). El factor El G-CSF es una hormona glicoproteica producida por
estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) humano monocitos, fibroblastos y clulas endoteliales, polipptido
recombinante es uno de los ms aplicados en estudios de una sola cadena de 175 aminocidos y peso molecular de
clnicos que se efectan por diferentes laboratorios y 18800 daltons. Su pH isoelctrico es de 6,1. Su estructura
hospitales, en los que se verifica su amplio espectro de uso est formada por cuatro alfa hlices antiparalelas, con dos
en pacientes con cncer (3), sepsis abdominal, sepsis puentes disulfuro en las cistenas C37-C43 y C65-C75. La
neonatal y neumona (4), entre otras afecciones. reduccin de alguna de estas uniones disulfuro causa una
disminucin de la actividad. Contiene una cistena libre en la
Este medicamento estimula la activacin, diferenciacin y posicin 18, la cual no se requiere para su actividad biolgica
proliferacin de las clulas hematopoyticas en el organismo y 5 histidinas (10).
(5), al aumentar la defensa del husped en respuesta a
patgenos, puesto que tiene, adems, efecto antiinflamatorio En este trabajo se realiz una caracterizacin del G-CSF que
e inmunomodulador (6, 7). se obtuvo en el Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa
de La Habana, Cuba (CIGB), Hebervital, teniendo en cuenta
El G-CSF se obtiene por va recombinante en la bacteria los requisitos y exigencias de las regulaciones
Escherichia coli desde 1986 (8). Tiene una secuencia internacionales y las tcnicas especficas para la verificacin
aminoacdica idntica a la G-CSF humano endgeno, solo de la estructura primaria; adems, se compara este producto
diferente en la presencia de un residuo metionina N-terminal, con muestras de G-CSF de una firma comercial (Neupogen),
necesario para la expresin del gen G-CSF en la bacteria con el objetivo de demostrar su integridad y similitud.
E. coli y la ausencia de glicosilacin, porque el sistema de
expresin en bacterias carece de esa capacidad. Los

* Licenciada en Biologa; MSc Tecnologa y Control de Medicamentos; Investigador Agregado; Tecnlogo de Primer Nivel. Jefe del Departamento de Produccin de GCSF. Direccin de
Produccin.

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Materiales y Mtodos Cromatografa lquida de alta eficacia en fase

reversa (CLAR)
Obtencin de G-CSF La pureza de las muestras se determin por un
procedimiento modificado del mtodo desarrollado por Carr
El proceso fermentativo se realiz utilizando la cepa de E.
(15).
coli BL21 (DE3) transformada con el plsmido que contiene
la informacin gentica que codifica para esta protena bajo Equipamiento: Inyector Rheodyne 7725i con "loop" de 1 mL,
el control del promotor T7. La protena de inters se expres desgasificador, Knauer; Bomba: L-7100, Merck-Hitachi;
intracelularmente en el precipitado del cultivo. La obtencin Detector: UV de longitud de onda variable Knauer; Horno
de los cuerpos de inclusin se realiz por un proceso de Knauer, Columna: C8 4,6 x 250 mm, Vydac;
ruptura de las clulas del precipitado (11), en homogenizador microcomputadora COMPAQ DESKPRO con el programa de
de alta presin. Los cuerpos de inclusin se separaron de las adquisicin y procesamiento de datos Model D-7000,
protenas citoplasmticas solubles por centrifugacin, se Chromatography Data Station Software, HPLC System
recolect el sedimento y se someti a diferentes pasos de Manager, Versin 3.1 Merck-Hitachi.
lavado para su semipurificacin. La extraccin de la protena
se realiz con un agente desnaturalizante, renaturalizada Procesamiento de datos: Se realiz mediante el sistema
por filtracin en gel y se purific por cromatografa de LaCrom. El reporte incluy datos de identificacin,
intercambio catinico. Al material eluido se le realiz una cromatogramas, tiempo de retencin (tr) para cada uno de
cromatografa de filtracin en gel para llevar la protena a la los picos detectados, rea y por ciento (%) del rea total de
solucin tampn final NaAc 20 mM pH 4. Los lotes obtenidos las diferentes muestras. A partir del tiempo de retencin de
se formularon, llenaron y envasaron, a una concentracin la muestra control se identific el pico de G-CSF de la muestra
30 MUI/bulbo, para dar lugar a los lotes de Hebervital 6V3011 a analizar. El criterio de aprobacin fue 295% de pureza. El
y 6V3021, de los cuales se tomaron muestras para este criterio de aprobacin fue 295% de pureza.
estudio comparativo.
Anlisis estadsticos: Con los resultados de pureza obtenidos
se realiz un anlisis de varianza (ANOVA, factor simple) entre
Determinacin de la concentracin de protenas
las muestras de Hebervital y Neupogen, para comparar por
A las muestras procedentes de los pasos de fermentacin, estadstica bsica utilizando el programa Minitab 15, los
ruptura y lavados se les determin la concentracin de resultados dentro de grupos, dos muestras de un mismo
protenas por modificacin de la tcnica de Lowry (12). A las producto, y entre grupo, muestras de cada producto, para
muestras de los ingredientes farmacuticos activos (IFA) y determinar diferencias entre las purezas por cromatografa
del producto terminado se les determin la concentracin al lquida de alta resolucin.
leer la absorbancia a 280 nm en espectrofotmetro (Genesys)
a travs del coeficiente de extincin porcentual (0,86 en este Actividad biolgica
caso), se utiliz para ello la ley de Lambert-Beer de forma
similar a la caracterizacin que se le realiz al Neupogen Se realiz teniendo en cuenta las pautas que establece la
(13). European Pharmacopea (16), se bas en la proliferacin de
la lnea celular Gnfs-60 (leucemia mieloide murina
retroviralmente inducida) mediada por G-CSF. Las muestras
Determinacin de pureza por electroforesis en
y el material de referencia de laboratorio se analizaron por
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
duplicado en una placa de 96 pocillos de fondo plano. La
Se realiz segn procedimiento modificado del mtodo curva dosis-respuesta comenz a 1 ng/mL. Control negativo
descrito en el Manual (14). (clulas no tratadas con G-CSF). Se cuantific la actividad
biolgica de las muestras, al utilizar un programa de clculo
Muestras analizadas de lneas paralelas (PARLIN). Las muestras se analizaron en
1-Neupogen B1054, 2-Neupogen B1055, 5-Hebervital paralelo con el material de referencia que se realiz en el
(6V3011/0), 6-Hebervital (6V3021/0) CIGB, al calibrar contra el material de referencia internacional
88/502 del NIBSC. Se repiti este ensayo al menos en cuatro
Preparadas empleando tampn de tratamiento reductor das diferentes para las mismas muestras, se calcul la media
(2XR). Se aplic 20 g para todos los lotes; para leer las geomtrica, que se corresponde con el valor final de potencia
bandas se utiliz el Software "Molecular Analyst" versin 1.4.1 asignado para cada muestra. Criterio de aprobacin: Intervalo
Bio-Rad y un scanner Imagingdensitometer Model GS-700. de confianza para una probabilidad del 95%, la cual no debi
El material de referencia que se utiliz en el anlisis fue MRG- ser menor o igual de 74% y no mayor de 136%.
CSFe-01-0301, producido en el CIGB. El criterio de
aprobacin de la muestra fue 295% de pureza.

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Deteccin de ADN de E. coli contaminante por diaminobenzidina (15 mL de PBS; 0,0075 g de

tcnica de hibridacin diaminobenzidina; 15 L de perxido).
Se determin en las muestras de IFA. El ADN de E. coli se
purific segn el mtodo de Sambrook (17) y se aplic sobre Comparacin de la estructura primaria de los G-
un filtro de nylon Hybon N (Amersham, Inglaterra), al utilizar CSF: Hebervital y Neupogen
un equipo Manifold (Biorad, USA), para una curva patrn con Fueron realizados varios ensayos para determinar la
diluciones 1:2, partiendo de 1 ng, as como 100 g de protenas identidad, dentro de ellos el anlisis de la estructura primaria
de la muestra a ensayar y 100 g de BSA Fraccin V como al caracterizar los extremos N y C terminal, para as demostrar
control negativo, que se desnaturalizaron con anterioridad la integridad de la molcula, los ensayos realizados se
durante 5 min a 95 C en un bloque trmico. El filtro de nylon describen a continuacin:
se trat con solucin de NaCl 1,5M, 0,5M NaOH, durante Muestras analizadas
5 min a temperatura ambiente y se dej secar 30 min al aire CIGB: Hebervital 6V3021/0 - Amgen: Neupogen B1054
antes de exponerlo a la luz UV. Envuelto, posteriormente se
coloc en un transluminador (Bioblock, Francia) a 320 nm S-carbamidometilacin de cistenas libres
durante 3 min. El filtro se coloc con solucin prehibridadora La alquilacin de las cistenas libres se realiz por
(0,9M NaCl, 0,12M citrato de sodio, 0,1% Ficoll 400, 0,1% resuspensin de la protena (100 g) en 100 L de una
polivinilpirrolidona, 1 mg/mL BSA Fraccin V, 0,5% SDS, 50% solucin tampn que contena cloruro de guanidinio 6 M, Tris
formamida) y 100 g/mL de tRNA, durante 2 h a 42 C. La 0,3 M, pH 8,6 y iodoacetamida. Este ltimo reactivo se emple
hibridacin se realiz en una sonda marcada con 32P (CIGB, en un exceso de cincuenta veces con relacin a los moles de
Cuba), a razn de 106 cpm/mL, en la solucin de protena presentes (5 nmoles). La mezcla se incub durante
prehibridacin de 14 -16 h a 42 C. El filtro se lav con una 20 min a temperatura ambiente en atmsfera de N2. Al finalizar
solucin de NaCl 0,3M, 0,04M Citrato de Sodio, 0,1% SDS y la reaccin la protena se purific inmediatamente por CLAR.
posteriormente se lav con 0,03M NaCl, 0,0004M y 0,1%. El
Digestin enzimtica y separacin de pptidos
filtro envuelto fue expuesto a un film de rayos X a -70 C
proteolticos
durante 48 h. La cantidad de ADN contaminante presente en
la muestra se determin al comparar la intensidad de su seal Cada muestra de protena carbamidometilada se resuspendi
con diferentes puntos de la curva de ADN de E. coli. en 80 L de solucin NH4HCO3 al 1%, urea 2 M y se digiri
La pureza microbiolgica, as como la pirogenicidad, se durante 4 h con tripsina; posteriormente las muestras se
determin segn modificaciones de mtodos descritos en diluyeron (2 x) y se aadi endoproteinasa Glu-C. La muestra
United State Pharmacopoeia USP 35, vigente (18). se incub seguidamente durante 4 h. Ambas proteasas se
emplearon en una relacin enzima-sustrato de 1:50. Al
trmino de la digestin, la mezcla de pptidos se acidific al
Determinacin de protenas contaminantes por
aadir cido frmico hasta una concentracin de 5% y los
tcnica de Inmunodot
pptidos que se generaron se separaron por CLAR (LKB
Mtodo semicuantitativo que se bas en la identificacin Pharmacia) en columna RP-C18 (Vydac, 4.6 x 250 mm), al
inmunolgica con antisueros especficos contra el patrn de utilizar un gradiente lineal desde 0 % hasta 60% de la solucin
protena de la clula hospedera, se realiz como modificacin B en 90 min. Las soluciones que se utilizaron para generar el
del mtodo descrito como protocolo (19). gradiente fueron:
A: H2O / TFA 0,1% y B: acetonitrilo / TFA 0,05%.
Determinacin de identidad de la protena de Las muestras de protena se purificaron en igual sistema
inters por el mtodo de Western blot cromatogrfico, se emple una columna de RP-C4 (JT Baker,
Se bas en una modificacin de un protocolo original (20). 4,6 x 50 mm), se utiliz un gradiente desde 15% hasta 60%
Se mont una electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% de la solucin B en 20 min.
en presencia de SDS con la protena a transferir. Se Anlisis por espectrometra de masas
electrotransfiri la protena a una membrana de nitrocelulosa
ESI-MS: Los espectros de masas se adquirieron en un
en presencia de buffer de transferencia con SDS durante 1 h.
espectrmetro de masas hbrido con geometra ortogonal
Se incub la membrana en buffer fosfato salino (PBS) 1x +
QTOF-2 (Micromass, UK). El espectrmetro se calibr con
5% de leche descremada durante toda la noche. Se incub la
una solucin salina compuesta por una mezcla de yoduros
membrana con 1 g/mL del anticuerpo policlonal de conejo
de sodio y cesio en el rango m/z de 50-2000 Th y las
anti-G-CSF, diluido en 1% de PBS, durante 1 h a una
mediciones se realizaron en un rango de m/z de 400 hasta
temperatura de 37 oC. Se realizaron tres lavados a la
2000 Th. El software de procesamiento de los espectros de
membrana en tres pasos consecutivos: 1) PBS 0,1% por
masas que se emple fue el MassLynx versin 3,5
5 min, 2) Tween 0,1% por 10 min y 3) PBS 0,1% por 5 min.
(Micromass, UK).
Las membranas con una mezcla de peroxidasa-protena se ESI-MS/MS: Los pptidos se secuenciaron por ESI-MS/MS
incubaron durante 1 h 37 oC y luego se revel el Western con al ajustar el rango de masas para cada caso. Estas mediciones

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se realizaron con el primer cudruplo, al fijarse a una Estudio comparativo por electroforesis
resolucin de 3 a 4 Th para seleccionar el ion precursor a En la Figura 1 se observa la separacin de las muestras de
fragmentar. El gas de colisin fue argn y la energa de colisin G-CSF en una electroforesis en gel de poliacrilamida en
que se emple oscil entre 20 y 45 eV hasta lograr un espectro presencia de SDS al 15%.
de masas con suficiente informacin estructural que permiti
una secuenciacin confiable del pptido.

Resultados y Discusin

Proceso de produccin del IFA de Hebervital

Las fermentaciones del cultivo tuvieron una estabilidad
plasmdica de 90%, una concentracin celular 2 7 g/L de
cultivo y una expresin 28%.

La biomasa celular obtenida, adems de la protena de inters

liber al medio un grupo de componentes de las clulas
hospederas, como protenas y cidos nucleicos. La pureza
del producto de esta etapa fue mayor del 40%, la cual se
determin por el mtodo de electroforesis en gel de
Fig. 1. Electroforesis SDS-PAGE al 15%, en condiciones reducidas
poliacrilamida SDS-PAGE al 15%. donde se separan las siguientes muestras de G-CSF. 1-Neupogen
B1054; 2-Neupogen B1055; 3-Lab 2 M1; 4-Lab 2 M2, 5-Hebervital
El proceso de purificacin posterior elimin los contaminantes (6V3011/0); 6-Hebervital (6V3021/0); 7-MRG-CSFe02-0705 y 8-PPM
derivados de las clulas hospederas y de otras fuentes. Los 06-0701.
ensayos que determinan las caractersticas organolpticas y
las pruebas de seguridad tuvieron resultados satisfactorios Los resultados cualitativos muestran que el patrn de bandas
(Tabla 1). de las muestras ensayadas es similar, la banda principal se
encuentra en todas a la misma altura y por consiguiente
Los lotes cumplieron con las especificaciones establecidas, concuerdan con la talla molecular del GCSF al compararlas
el producto terminado que se elabor a partir de estos se con el material de referencia (procedente del CIGB) empleado
someti a ensayos de identidad comparativos con los lotes en el estudio (carril 7). El carril 8 corresponde a patrones de
de producto de la competencia como se muestra a pesos moleculares, provenientes de la firma SIGMA:
continuacin.
Albmina (BSA) 66 kDa
Caracterizacin del producto terminado
Fumarasa (60 kDa)
A continuacin se muestran los resultados del estudio
comparativo que se realiz con el producto terminado contra Ovoalbmina (45 kDa)
muestras de otro laboratorio.
Lisozima (18,6 kDa)

Alpha-Lactoalbmina (14,2 kDa)

Tabla 1. Resultados de los Ingredientes Farmacuticos Activos utilizados.

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Al procesar la imagen para determinar los porcentajes de otros autores (10), el G-CSF es una protena de
pureza de las muestras de inters se obtuvo que los 175 aminocidos, que consta de cinco cistenas de las cuales
resultados fueron superiores al 99%. cuatro forman puentes de disulfuro (Cys37-Cys43 y Cys65-Cys75),
mientras que la Cys18 se encuentra libre. Este reactivo
Estudio comparativo por cromatografa en fase reacciona especficamente con los grupos tioles libres, lo cual
reversa facilita el anlisis por espectrometra de masas de la protena,
adems de evitar el intercambio de puentes de disulfuro
Tabla 2. Resultados de pureza de cada muestra determinada durante el proceso de digestin enzimtica.
por cromatografa lquida en fase reversa.
Las muestras de protena carbamidometilada se purificaron
por CLAR y se analizaron por ESI-MS. Los espectros de masas
obtenidos se muestran en la Figura 2.

En los perfiles cromatogrficos de las muestras ensayadas,

al realizar la determinacin del porcentaje del rea bajo la
curva, de cada muestra ensayada (Tabla 2) se obtuvo que la
pureza es superior al 97%.

La comparacin estadstica de pureza de los resultados

mostr un valor estadstico de p 20,05; esto fue vlido en la
pureza que se determin en los cromatogramas entre grupos Fig. 2. Espectros obtenidos por ESI-MS de los lotes de IFA de G-
y dentro de grupo, por lo que se puede afirmar que no hubo CSF alquilado con iodoacetamida.
diferencias significativas entre los resultados de pureza de
los 2 productos. Teniendo en cuenta la secuencia del ADN, la formacin de
puentes de disulfuro y la modificacin introducida por la
Actividad biolgica reaccin con iodoacetamida, el peso molecular esperado para
el G-CSF debe ser de 18855,93 Da. Los espectros de masa
Se llevaron a cabo al menos cuatro ensayos diferentes, los
demostraron una alta concordancia de los valores de masas
resultados se muestran en la Tabla 3.
experimentales con el valor de masas esperado para el G-
En el Hebervital los lotes tienen un valor asignado de
CSF carbamidometilado (Tabla 4).
30 millones de unidades/mL. En el Neupogen la presentacin
en jeringuilla es a razn de 30 millones de unidades en
Tabla 4. Masas moleculares obtenidas en el anlisis por
0,5 mL; por tanto, la potencia que se asign es de 60 millones
ESI-MS de G-CSF derivatizado con iodoacetamida.
de unidades/mL. El valor que se obtuvo para todas las
muestras se encuentra entre el 90-110% del valor nominal,
con resultados muy similares entre cada una.

Estudio comparativo de la estructura primaria

El primer paso fue la alquilacin de la cistena libre por
reaccin con iodoacetamida, ya que segn lo planteado por

Tabla 3. Resultados actividad biolgica UI/mL.

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Las muestras de protena carbamidometilada se digirieron En las fracciones 1 y 4 los pptidos eluyeron
con tripsina y endoproteinasa Glu-C. Este tratamiento reproduciblemente de m/z 565,31 y 894,00, los cuales se
permite obtener en pptidos independientes, a la cistena asignaron a los extremos N y C del G-CSF, respectivamente.
carbamidometilada y a las implicadas en la formacin de En la fraccin 2 se obtuvo una seal de m/z de 402,70
puentes de disulfuro. correspondiente al pptido 18Ccm-Arg23 (Ccm: cistena
carbamidometilada) con su masa incrementada en 57 Da,
En la Figura 3 se muestra los perfiles obtenidos por CLAR. Se producto de la alquilacin de Cys18. Las fracciones 3 y 5
observa alta reproducibilidad entre todos los mapas portaron pptidos con los puentes de disulfuro correctamente
peptdicos. formados entre las cistenas 37Cys-Cys43 y 65Cys-Cys75.

En los espectros de masas de las fracciones a y b se

observaron las seales de m/z 392,67 y 378,20, que luego de
su secuenciacin se asignaron a los pptidos 42Leu-Glu47
y 36Leu-Lys 41 que contenan a la Cys 43 y Cys 37
carbamidometiladadas.

La presencia de las cistenas 37 y 43 en forma de

carbamidometilcistena no fue producto de una alquilacin
excesiva de la protena, ya que si se comparan el peso
molecular de la protena no derivatizada (18798,98 Da) y los
valores de masa observados (Tabla 4) se corrobora la
alquilacin de una sola cistena por molcula de protena y
que esta, adems, se encontr en forma de cistena libre.
Fig. 3. Perfiles de RP-HPLC obtenidos de la digestin con tripsina
y endoproteinasa Glu-C de las muestras de G-CSF
En la fraccin se eluyeron los pptidos de m/z 736,33 y 721,86.
carbamidometilado. Muestra A Hebervital 6V3021/0, Muestra B La seal de m/z 736,33 se asign a los pptidos Cys18-Arg23
Neupogen B 1054. y Leu42-Glu47 unidos por un puente de disulfuro entre las
cistenas 18 y 43, mientras que la seal de m/z 721,86 se
asign a los pptidos Cys18-Arg23 y Leu36-Lys41 enlazados
Se sealan las fracciones correspondientes a los pptidos tambin mediante puente de disulfuro entre las cistenas 18
N- y C-terminal, a los puentes de disulfuro entre las cistenas y 37.
37 y 43 y entre las cistenas 65 y 75, y la presencia de la
cistena 18 en forma libre, como corresponde a la estructura Estos resultados indicaron la presencia, en las preparaciones
primaria del G-CSF natural. Las fracciones a, b y c indican la de GCSF analizadas, de puentes disulfuro incorrectamente
presencia de cistenas libres y puentes S-S incorrectamente formados entre las Cys18-Cys37 y Cys18-Cys43. No obstante,
formados. en la explicacin de este fenmeno no se descarta la
posibilidad excepcional de que el proceso de modificacin
Tambin se analizaron por espectrometra de masas las qumica a pH bsico, promueva un intercambio de puentes
fracciones 1-5 y las fracciones minoritarias a, b y c. Los valores de disulfuro y que esta reaccin ocurri ms rpidamente
de m/z obtenidos para cada una y su asignacin a pptidos que la alquilacin con iodoacetamida de la protena.
del G-CSF se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Valores de m/z de cada fraccin cromatogrfica analizada de la digestin con tripsina y Glu-C del G-CSF y su
asignacin a regiones de la protena.

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Los experimentos realizados no permitieron la cuantificacin Referencias

de las especies moleculares con formacin incorrecta de
puentes de disulfuro. Sin embargo, las fracciones 1. Shoemaker CW, Ayres MS, Grenvik GA, Holbrook RP. Factores
cromatogrficas donde se detect esta modificacin son estimulantes de colonias hematopoyticas. En: Tratado de
realmente minoritarias, adems de ser similares en cada mapa Medicina Crtica y Terapia Intensiva. 4ta Edicin. Mxico D.F:
peptdico. Editorial Mdica Panamericana; 2000. p. 531-9.

Este resultado sugiere que la presencia de molculas con 2. Tanwar S, Thursz M. Granulocite colony-stimulating factor as a
formacin incorrecta de puentes de disulfuro corresponde a novel adjunct to improve hepatitis B vaccination. World J
una mnima fraccin de las muestras y que este fenmeno se Hepatol 2010;2(3):136-8.
comporta de manera similar en cada una.
3. Saab BY, Sharaf L, Zeidan I, Bizri A. Filgrastim use: evaluation
Se demostr que el G-CSF que se utiliz en este trabajo in cancer and critically ill non-cancer patients. Cancer Therapy
cumple con las especificaciones establecidas por USP y la 2003;1:191-6.
Pharmacopeia Europea para el Neupogen en cuanto a
pureza, sin diferencias significativas con el mismo. La 4. Bernstein HM, Pollock BH, Calhoun DA, Christensen RD.
digestin con tripsina y endoproteinasa Glu-C del G-CSF Administration of Recombinant Granulocyte Colony-
derivatizado con iodoacetamida y la separacin de los Stimulating Factor to Neonates with Septicemia: A Meta-
pptidos proteolticos gener mapas peptdicos reproducibles Analysis. Journal of Pediatrics 2001;138(6):917-20.
y de elevada similitud entre cada una de las muestras
analizadas. 5. Metcalf D. Hemopoietic regulators. Trends Biochem Sci
1992;17(8):286-9.
La verificacin de los extremos N y C, y la obtencin de los
espectros ESI-MS de la protena carbamidometilada, 6. Hartung T. Anti-inflammatory effects of granulocyte colony-
demostraron la integridad de cada una de las muestras de stimulating factor. Curr Opin Hematol 1998;5(3):221-5.
protena. Se detect los puentes de disulfuro entre las
cistenas 37 y 43 y entre las cistenas 65 y 75, y la presencia 7. Hartung T. Immunomodulation by colony-stimulating factors.
de la cistena 18 en forma libre, como corresponde a la Rev Physiol Biochem Pharmacol 1999;136:1-164.
estructura primaria del G-CSF natural.
8. Souza LM, Boone TC, Gabriole J, Lai PH, Zsebo KM, Murdock
La caracterizacin demostr su integridad ya que la masa DC, et al. Recombinant human granulocyte colony-stimulating
molecular de la protena coincide con el valor esperado, se factor: effects on normal and leukemic myeloid cells. Science
secuenciaron los pptidos N y C y no se encontr 1986;232:61-5.
degradacin por los extremos, lo que tambin demuestra
9. Lieschke GJ, Burguess AW. Granulocyte-Macrophage Colony-
que el proceso que se desarroll genera un producto de
stimulating Factor. New England Journal of Medicine
buena calidad, de acuerdo a la caracterizacin tanto del IFA
como del producto terminado. 1992;327:28-35.

El conjunto de resultados de esta investigacin indica que la 10. Herman A, Boone T, Lu H. Characterization, Formulation, and
estructura primaria del G-CSF producido en el CIGB Stability of Neupogen (Filgrastim), a Recombinant Human
(Hebervital) y el Neupogen, de la compaa Amgen, son Granulocyte-Colony Stimulating Factor. Pharmaceutical
similares. Biotechnology 2002;9:303-28.

11. Georgiou G, Valax P. Isolating inclusion bodies from bacteria.

Agradecimientos Methods Enzimology 1999;309:48-58.

12. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein
El colectivo de autores agradece el trabajo realizado por los
measurement with the follin phenol reagent. J Biol Chem
coautores y colaboradores pertenecientes a los
1951;193:265-75.
departamentos de Produccin, Control de la Calidad, e
Investigaciones Biomdicas en la fabricacin y 13. Herman AC, Boone TC. Characterization, formulation and
caracterizacin estructural del Hebervital, as como a la stability of Neupogen (filgrastim), a Recombinant Human
Direccin General del CIGB y los Departamentos de Negocios
Granulocyte-Colony Stimulating Factor. Pharm Biotechnol
y Comercializacin de la Empresa Heber Biotec S.A., por la
1996;9:303-28.
labor en la obtencin del Neupogen, medicamento innovador
que se utiliz como patrn en el estudio comparativo.

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manual, Ch 9; 3rd edition. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory; 2001.

Structural Characterization of Granulocyte Colony Stimulating Factor, Hebervital

Abstract

Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) is member of haemopoietic proteins group used in medication. It
is obtained by recombination technique since 2000 at the Center for Genetic Engineering and Biotechnology of
Cuba, and it is commercialized as Hebervital. It is recommended for patients with malignant tumors, affected by
febrile neutropenia, bone marrow suppressor treatment followed by bone marrow transplant, among others. It
induces disorders in the biological activity of the mature neutrophils that could increase host defense in response
to pathogens like bacterial and fungal infections. The objective of this project was to perform a specific analysis to
determine G-CSF purity and characterization and to demonstrate its comparability with other commercial products.
The sample bands pattern in SDS-PAGE, the area percentage and the chromatographic profiles under the curves,
in reverse phase high performance liquid chromatographic were similar. The enzymatic digestion and separation
by proteolysis of peptides generated reproduces peptide's maps of great similarity with Neupogen.
Key words
words: granulocyte colony stimulating factor, G-CSF, neutropenia, Hebervital.

Recibido: Mayo de 2013 Aceptado: Julio de 2013

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