Caracterización de fosfatasa alcalina

de intestino de ternera
Braulio Coronado e Ignacio Martínez

Resumen :

Introducción:

Las enzimas son proteínas que cumplen un

rol fundamental para la existencia de la vida
misma, ya que permiten que procesos
necesarios para la vida como, por ejemplo, la
transducción de señales, contracción
muscular y transporte activo se lleven a cabo
a una velocidad mayor de lo que se
producirían sin estás. Velocidades más bajas
de estos procesos no permitirían el
funcionamiento celular.

El fósforo es un mineral esencial utilizado por

todos los seres vivos para el crecimiento y el
transporte de energía (1). Está involucrado
en muchos procesos biológicos tales como la
fotosíntesis y la síntesis de ácidos nucleicos
(2) y (3). Las fosfatasas son enzimas
importantes ya que permiten hidrolizar
moléculas con fosfato que sirven como
fuente de fósforo para las plantas o
microorganismos, al ser liberados al suelo (4)
y (5). Este estudio se enfocó en las
fosfatasas alcalinas (EC 3.1.3.1),
particularmente en la fosfatasa alcalina de
intestino de ternera. La estructura y
mecanismo de este tipo de enzimas está
ampliamente estudiado y definido (6), pero se
necesitan muchos estudios cinéticos
producto de la gran variedad de sustrato que
puede hidrolizar esta enzima, como por
ejemplo GMP, fructosa-6-fosfato, p-
nitrofenilfosfato y en general moléculas que
contengan una molécula de fosfato.

En este estudio cinético se utilizó como

sustrato Glicerol-2-fosfato, el cual da como
productos glicerol más fosfato de sodio (7).
La cinética de la fosfatasa alcalina con este
sustrato no está muy estudiada, por lo que la
importancia de este estudio radica en esto, puede medir la absorbancia a 620nm. El
en generar conocimiento sobre los fosfomolibdato de amonio se formó al
parámetros cinéticos de esta reacción. agregar molibdato de amonio al fosfato
(producto de la reacción enzimática) esto
El vasto conocimiento de técnicas de además, detuvo la formación de fosfato, lo
laboratorio nos permite descubrir varios que nos permitió medir la actividad de la
parámetros cinéticos, como por ejemplo la enzima a un tiempo determinado, que en
constante de Michaleis-Menten, la velocidad este caso fue de 10 min. Finalmente
de reacción, el pH óptimo, el efecto de un comparamos la muestra con una solución
inhibidor, entro otros. Todo esto utilizando patrón de fosfato de sodio 1µmol/mL de
métodos que son económicos y fáciles de concentración conocida, para poder estimar
llevar a cabo, como lo es medir la su concentración. Esto lo realizamos en 2
concentración de producto, que en este caso muestras y calculamos la media.
fue fosfato.
2.3 Determinación de la curva de
2. Materiales y métodos progreso.

2.1 Materiales. La curva de progreso nos permitió calcular la

velocidad inicial de la enzima, para esto
Fosfatasa alcalina fue preparada desde medimos la concentración de producto cada
intestino de ternera. En todos los 5 minutos durante un intervalo de una hora.
experimentos se utilizó un Buffer de Para esto preparamos un tubo de incubación
Glicina/NaOH 0,1 M pH 9,4 NaCl 1% (p/v), el cual tenía tampón glicina, sustrato y agua
Beta glicerofosfato de sodio 6 mM como destilada, esto se incubo a 37ºC por 5
sustrato, Molibdato de amonio al 2,5% en minutos para que al agregar la enzima esta
H2SO4 5N para detener la reacción y Acido estuviera en condiciones favorables desde el
1,2,4 amino naftol sulfónico como solución tiempo cero, posteriormente se agregó la
reductora, la cual nos permitió medir las enzima y se dejó incubando por 1 hora. En
absorbancias producto de la coloración que paralelo se prepararon 15 tubos con
otorgaba a las muestras. Para medir las molibdato de amonio, 13 de ellos se utilizaron
absorbancias se utilizó un espectrofotómetro. para medir la concentración de producto
desde el tubo de incubación, otro para
2.2 Cuantificación de proteínas y preparar el patrón fosfato y otro para el
determinación de la actividad enzimática blanco. Para calcular sus concentraciones se
de fosfatasa alcalina. midieron sus absorbancias y luego se
compararon con la del patrón. Para finalizar
Para la cuantificación de proteínas utilizamos
se corrigió la concentración debido al error en
el método de Bradford (1), el cual se basa en
la muestra tiempo cero, restando la
la unión del colorante coomassie blue G250 a
concentración obtenida en este tiempo a
las proteínas. Realizamos una curva de
todas las demás. Calculamos la velocidad
calibración (fig.1.) con una solución estándar
inicial a partir de la pendiente, obtenida por la
de albumina de suero bovino 100 µg/mL
curva de progreso, entre los 0 y 10 min.
preparando 6 muestras diluidas para obtener
distintas concentraciones de proteínas en un 2.4 Curva de saturación y determinación
rango de 1 a 20 µg/mL. Luego preparamos de Km y Vmax de fosfatasa alcalina.
tres muestras de enzimas de
concentraciones distintas y desconocidas a Para realizar la curva de saturación
las cuales medimos sus absorbancias a 595 mantuvimos contantes los valores de pH
nm e interpolamos en la curva de calibración (9,4), el tiempo de incubación (10 min) y la
para conocer sus concentraciones. concentración de la enzima, cambiando la
concentración de sustrato en 8 tubos en un
Para determinar la actividad enzimática rango de 0,1 a 1 mM. Estos se incubaron a
utilizamos el método de Fiske y Subbarow 37ºC para luego agregarles molibdato de
(2), el cual se basa en la formación de amonio y medir su absorbancia a 620nm,
fosfomolibdato de amonio para luego dar luego empleamos la lectura del patrón
lugar al azul de molibdeno al agregar la obtenida en la curva de progreso para
solución reductora, a este compuesto se le
calcular los micromoles de producto en cada concentración de enzima y temperatura.
tubo, para luego dividir estos valores por 10 Preparamos 8 tubos con un rango de pH 5 a
para obtener las velocidades iniciales. Con 11, luego realizamos los mismos pasos que
estos datos creamos una curva de saturación en el experimento anterior.
y estimamos la Vmax y Km. Finalmente
realizamos un grafico de dobles recíprocos 2.6 Efecto de un inhibidor en la actividad
(Lineweaver-Burk) y para obtener un valor enzimática de la fosfatasa alcalina.
exacto de Vmax y Km trabajamos con la
ecuación de Michaelis-Menten y con la Medimos el efecto del inhibidor citrato de
ecuación de la recta obtenida en este grafico. sodio 0,01M usando una curva de saturación.
Mantuvimos contantes los valores de pH
2.5 Efecto de la concentración de enzima (9,4), el tiempo de incubación (10 min) y la
y del pH en la actividad enzimática de concentración de la enzima, cambiando la
fosfatasa alcalina. concentración de sustrato en 8 tubos en un
rango de 0,1 a 1 mM. Estos se incubaron a
Para demostrar el efecto de la concentración 37ºC para luego agregarles molibdato de
de enzima mantuvimos un exceso de la amonio y medir su absorbancia a 620nm,
concentración de sustrato y a la vez luego empleamos la lectura del patrón
mantenemos constante el pH, temperatura y obtenida en la curva de progreso para
fuerza iónica. Preparamos 6 tubos con calcular los micromoles de producto en cada
tampón glicina, sustrato, agua destilada para tubo, para luego dividir estos valores por 10
luego agregar la enzima en un rango de para obtener las velocidades iniciales. Con
concentraciones de fosfatasa alcalina entre estos datos creamos una curva de saturación
0,01 mg/mL y 0,06 mg/mL en intervalos de y estimamos la Vmax y Km. Finalmente
0,01 mg /mL. Incubamos a 37ºC durante 10 realizamos un grafico de dobles recíprocos
minutos y luego detuvimos la reacción con (Lineweaver-Burk) y para obtener un valor
molibdato de amonio. Finalmente agregamos exacto de Vmax y Km trabajamos con la
solución reductora para medir su absorbancia ecuación de Michaelis-Menten y con la
y calculamos la concentración de fosfato ecuación de la recta obtenida en este grafico.
usando nuestra muestra patrón. Posteriormente comparamos la actividad de
la enzima vs la concentración de inhibidor,
Para demostrar el efecto del pH mantuvimos para ello obtuvimos datos de otro grupo, el
constantes los factores de tiempo de cual hizo el mismo experimento, pero con
incubación, concentración de sustrato, citrato de sodio 0,02M
3. Resultados.

3.1. Cuantificación de proteínas y

determinación de la actividad enzimática
de fosfatasa alcalina. Al interpolar las 0.5
absorbancias de las muestras de fosfatasa 0.4

Absorbamcia
alcalina en la curva de calibración (fig.1.)
obtuvimos concentraciones de 3,65 µg/mL, 0.3
10,35 µg/mL y 12,15 µg/mL. Para la actividad 0.2
enzimática obtuvimos en promedio una
concentración de 0,75 µmol/mL de fosfato a 0.1
los 10 min de incubación. 0
0 5 10 15 20 25

Concentración (µg/mL)

Tabla 1 Comparación entre volumen extraído

y concentración de enzima.
0.5

Concentración
(µmol/mL)
Volumen de Concentración de 0.4
enzima extraído enzima
0.3
0.050 mL 3.65 µg/mL
0.2
0.100 mL 10.35 µg/mL
0.150 mL 12.15 µg/mL 0.1
0
Fig.1. Curva de calibración con albumina de 0 5 10 15
suero bovino. Y=0,020x +0,041 En rombos Tiempo (min)
albumina de suero bovino y en cuadrados
fosfatasa alcalina Fig.3. Curva de progreso en los primeros 10 minutos de la
reacción. Ecuación de la recta: Y =0,043x + 0,009

3.3 Curva de saturación y determinación

3.2 Determinación de la curva de progreso. de Km y Vmax de fosfatasa alcalina.
La velocidad inicial de la fosfatasa alcalina es
de 0,043 [µmol/mL]/min], este valor es la Los valores de Vmax y Km estimados a partir
pendiente de la fig.3. de la curva de saturación fueron de 0,0859
(µmol/mL)/min y 0,21 µmol/
respectivamente.
2
1.5
[HPO4] (µmol/mL)

1
0.5
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Fig.2. Curva de progreso para fosfatasa alcalina en
intervalos de 5 minutos hasta llegar a los 60 min.
 0.07
0.1
0.06
Vi [(µmol/mL)/min]

[Enzima](mg/mL)
0.08 0.05
0.06 0.04
0.03
0.04
0.02
0.02 0.01
0 0
0 0.10.20.30.40.50.60.70.80.9 1 1.1 0 0.1 0.2 0.3
[S] mM Vi [(µmol/mL)/min]
Fig. 4. Curva de saturación de la fosfatasa Fig. 6. Efecto de la concentración de la
alcalina. Ecuación de la recta Y = 1,000x + enzima, fosfatasa alcalina, en la
7,564. actividad enzimática.
1.4
Los valores de Vmax y Km calculados a partir

[HPO4] [µmol · mLˉ¹)

del grafico de dobles recíprocos (Lineweaver- 1.2
Burk) de la figura 5 fueron 0,132 1
(µmol/mL)/min y 0,132 µmol/mL 0.8
respectivamente. 0.6
0.4
0.2
20 0
1/V ( 1 · min · µmol ˉ¹)

4 5 6 7 8 9 10 11 12
15
pH
10

5 Fig. 7. pH vs concentración final del

producto fosfato transcurridos 10 minutos
0 de incubación a 37ºC.
-10 -5 0 5 10 15
-5
3.5 Efecto de un inhibidor en la actividad
1/[S] (1 · mmolˉ¹) enzimática de la fosfatasa alcalina. En la
figura 8 vemos un gráfico de dobles
Fig. 5. Gráfico de dobles recíprocos recíprocos a partir del cual calculamos los
valores de Km y V máxima de la enzima en
(Lineweaver-Burk) de la fosfatasa alcalina.
presencia de un inhibidor, los cuales fueron
0,132 µmol/mL y 0,104(µmol/mL)/min.
3.4 Efecto de la concentración de enzima y
del pH en la actividad enzimática de
fosfatasa alcalina. La concentración de
producto fosfato aumenta directamente
proporcional a la concentración de enzima
(Fig.6.) Mientras en nuestro gráfico de pH vs
actividad (Fig. 7) podemos observar una
forma de campana de Gauss en donde el pH
óptimo es de 9,6.
 25 4.3 Curva de saturación y determinación
de Km y Vmax de fosfatasa alcalina.
1/V ( mL · min · µmol ˉ¹) 20
En la curva de saturación (fig. 4) no
observamos una asíntota que nos permita
15
concluir claramente que se haya saturado la
enzima, es sugerible realizar más mediciones
10 en un tiempo más prolongado que nos
permita asegurar en los últimos puntos de la
5 curva que la velocidad no seguirá
aumentando.
0
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 4.4 Efecto de la concentración de enzima y
1/[S] (mL · μmolˉ¹) del pH en la actividad enzimática de
fosfatasa alcalina
Fig. 8. Gráfico de dobles recíprocos (Lineweaver-Burk).
Podemos observar a partir de la fig.6 que en
Los cuadrados representan a la enzima sin inhibidor,
mientras que los rombos a la enzima con inhibidor. En condiciones favorables de sustrato la
la intersección de las líneas de tendencia con el eje de velocidad de reacción es directamente
las abscisas está el valor -1/Km, en la intersección de proporcional a la concentración de enzima.
las líneas de tendencia con el eje de las ordenadas
está el valor 1/Vmáx y la pendiente de cada línea Del efecto del pH en la actividad de fosfatasa
corresponde al valor Km/Vmáx. alcalina: obtuvimos un valor máximo de
actividad en un pH similar al que la literatura
describe como óptimo.(8) y (9).

4.5 Efecto de un inhibidor en la actividad

enzimática de la fosfatasa alcalina.

Vemos en la fig. 8 como cambia el valor de la

velocidad máxima de reacción y que los
valores de Km de fosfatasa alcalina con y sin
presencia de citrato de sodio como inhibidor
son iguales, lo que nos indica que éste es un
Fig.9. Gráfico del efecto de la concentración de inhibidor no competitivo. De la fig. 9 podemos
inhibidor en la actividad enzimática. Barras blancas observar que a mayor concentración de
0,01mM Citrato de Sodio y Barras negras 0,02mM
4. Discusión. inhibidor la actividad enzimática disminuye.
Citrato de Sodio
4. Discusión:

4.1 Cuantificación de proteínas y

determinación de la actividad enzimática
de fosfatasa alcalina.

Los valores de concentración de enzima en

razón con los volúmenes de enzima extraídos
no fueron del todo lineales.

4.2 Determinación de la curva de progreso.

En la curva de progreso obtuvimos un

resultado esperado, en donde la velocidad de
reacción va disminuyendo gradualmente a
medida que la enzima se satura, hasta llegar
a una meseta en donde la velocidad se
mantiene constante.
 Bibliografía:

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relationship to soil microclimate in a semiarid woodland. Soil Biology and
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