AMILASAS (Hidrolasas)

INTRODUCCIÓN

De acuerdo a Dixon y Webb, se puede decir que una enzima es “una

proteína dotada de actividad catalítica debida a su capacidad de
activación específica”. Actúan como catalizadores de reacciones
químicas especificas en los seres vivos o sistemas biológicos. Se
clasifican de acuerdo a su especificidad, las cuales se organizan en 6
grupos: 1. Oxidorreductasas; 2. Transferasas; 3. Hidrolasas; 4. Liasas;
5. Isomerasas; y 6. Ligasas. [1]

Las amilasas son enzimas que se clasifican en las hidrolasas, las cuales
tienen la función de hidrolisis en los sustratos que intervienen,
presentan la siguiente reacción:

https://lidiaconlaquimica.wordpress.com/tag/almidon/

Dentro del grupo de las hidrolasas se tienen subdivisiones como 3.1. Los rompimientos de la estructura del almidón por acción de agua a
hidrolizan enlaces éster, 3.2. glicosidasas, 3.3. péptido hidrolasas, 3.6
alta temperatura tienen tres etapas en las cuales la primera se refiere a
hidrolizan acil-anhidridos, entre otras; las amilasas pertenecen a las
glucosidadasas las cuales tienen acción en los enlaces de los la absorción de agua, ligero hinchamiento de los gránulos, y no
glucósidos, son importantes en la industria del almidón, de la celulosa aumenta la viscosidad retiene la birrefringencia; para la segunda etapa
y otros productos naturales. Se clasifican en tres subgrupos: 3.2.1, se incrementa la viscosidad de la suspensión, los gránulos se alteran,
rompen O-glucósidos; 3.2.2 rompen N glucósidos; 3.2.3, rompen S- pierde estructura y la birrefringencia y por último en la tercera etapa
glucósidos. El mecanismo de acción de todas ellas es similar, los gránulos se tornan en sacos deformados [4]
presentando dos residuos de aminoácidos di carboxílicos (aspártico o
glutámico) en el centro activo. [1].
PRODUCCION DE AMILASAS
Las amilasas tienen gran importancia en el desarrollo biotecnológico,
Para la obtención de las α-amilasas se puede realizar por medio
en la producción de jarabes con contenido de maltosa y glucosa. En los
microbiano a través de hongos y bacterias, que tiene ventajas: fácil
últimos años se está realizando la degradación enzimática del almidón
disponibilidad, volumen de producción, estabilidad de operación,
por acción de la amilasa reemplazando el proceso del a catálisis ácida.
modificación y optimización del proceso. Las α-amilasas bacterianas
Muchos productos son elaborados a través de procesos enzimáticos por
del género Bacillus como B. subtilis, B. stearothermophilus, B.
medio de α-amilasa, β-amilasa, como son los jarabes y la dextrosa.
licheniformis y B. amyloliquefaciens, han encontrado una extensa
Estas enzimas actúan sobre el almidón hidrolizando enlaces
aplicación en diversos procesos industriales debido a sus amplios
glucosídicos α-(1,4) y/o α-(1,6) [4]
rangos de operación de temperatura (25-90°C), resistencia a pH
extremos (1.0-11.5) y altos niveles de expresión (Montor, Olvera
Caranza , & Reyes Duarte, 2014)
ALMIDON COMO SUSTRATO
La producción de la α-amilasas se realiza por medio de fermentación
El almidón es un polisacárido que se encuentra en vegetales y raíces, sumergida (SmF) y fermentación en estado sólido (SSF) se ha
en semillas de cereales y tubérculos como la papa y la yuca. El almidón investigado y depende de una variedad de factores fisicoquímicos. SmF
tiene estructura granular debido a las fuerzas de atracción entre largas se ha utilizado tradicionalmente para la producción de enzimas de
cadenas carbohidratos, se forma una malla molecular y evita que se importancia industrial debido a la facilidad de control de diferentes
disuelva en agua fría. Los polímeros más cortos se disuelven cuan el parámetros como el pH, la temperatura, la aireación y la transferencia
agua llega a 60°C y a temperaturas más altas se gelatinizan y pierde su de oxígeno y la humedad. [8]
poder de birrefringencia, se desintegra y forma aun pasta de acuerdo la
origen y concentración del almidón. [4]

Para los sistemas de SSF poseen muchas ventajas en las cuales tiene
una similitud al hábitat natural de los microorganismos por lo tanto se
producen mejores productos. Para el SmF se puede decir que no cumpa
con a las especificaciones sobre todo para los hongos. Para
microorganismos como los hongos es aconsejable usar SSF y las respectivamente. Después de incubar la solución de enzima bruta
bacterias no son muy recomendables, sin embargo, estudios realizados durante 24 h a pH 5,0 - 10, se observó una disminución de
se han obtenido buenos resultados. aproximadamente 5% de su actividad original a pH 7,5. A pH 10.0, la
disminución fue del 44%. Así, la -amilasa de Bacillus sp. la cepa
En comparación entre SSF y SmF, el primero tiene una productividad SMIA-2 parece ser activa en un rango de pH muy amplio. [6]
superior, su técnica es más sencilla de aplicar, menos costo, menor
consumo de energía, menor producción de agua, mejor recuperación Otro estudio realizado se hizo la extracción de la enzima termoestable
de producto, para la producción de las enzimas se ha encontrado que por medio de la bacteria Geobacillus (K1C) , se aisló de las aguas
el metido mejor es el SSF. [8] termales de Manikaran, India. La temperatura y el pH óptimos para la
actividad de la α-amilasa fueron 80ºC y pH 6,0. La actividad de amilasa
La α-amilasa se puede obtener por medio de Aspergillus oryzae, las de la enzima purificada fue independiente de Ca2 +, mientras que la
enzimas que se obtienen por medio microbiano tienen ventajas en inhibición completa de la actividad se observó en presencia de Cu 2 +,
ahorro de tiempo de generación, requerimiento de espacio menor, se Pb2 + y Hg2 +. La α-amilasa purificada era estable en presencia de
caracterizan por la actividad particular de la enzima deseada, por el detergentes, disolventes orgánicos y Proteinasa K. Además, exhibía la
efecto del pH, temperatura, tiempo de reacción, concentraciones de la capacidad de hidrolizar almidones crudos (por ejemplo, arroz, trigo,
enzima del sustrato y el efecto de los inhibidores o activadores , que maíz, patata) de manera eficaz; por lo tanto, esta enzima tiene el
pueden presentarse en las aplicaciones industriales: por medio de la potencial de ser utilizada para aplicaciones industriales. [7]
fermentación del hongo. [2]

La amilasa (E.C. 3.2.1.1) de Bacillus amyloliquefaciens JJC33M DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y

(AmiJ33) fue producida por fermentación sumergida. Se probó el CUANTIFICACION DE PROTEINAS
efecto de peptona, extracto de levadura, Ca+2 y glicina en la producción
de AmiJ33. El extracto de levadura y Ca+2 tuvieron un efecto positivo Para medir la actividad a-amilasa se utilizó el método de Nelson-
sobre la síntesis de AmiJ33. La enzima fue recuperada mediante Somogyi (Determinación de azúcares reductores). La mezcla de
precipitación a saturación al 60% con (NH4)2SO4. El peso molecular reacción contiene 1 mL de solución de almidón soluble al 1% (p/v),
aproximado de la enzima purificada fue de 50 kDa. Así mismo, se 200 mL de una dilución apropiada de la muestra que contiene la
evaluó el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática, enzima, y 800 mL de CaCl2 5mM. Luego de 20 min de reacción a 37
concluyendo que los valores más altos de actividad se observaron a pH °C, se adicionan 500 mL del reactivo de Somogyi y se lleva la mezcla
a un baño María a temperatura de ebullición. Pasados 10 min, se retira
6.0 y 80°C, respectivamente. En condiciones ligeramente ácidas (pH
la mezcla del baño y se adicionan 500 m L del reactivo de Nelson, se
4.0 y 5.0), AmiJ33 mantuvo el 72% de su actividad. AmiJ33 fue estable
completa el volumen a 10 mL con agua destilada y se realiza la
por 3 h a 40°C, y por 30 min a 45 y 50°C, conservando el 88 y 82% de determinación colorimétrica a 500nm. Una unidad de actividad
actividad residual. A 60°C, la actividad disminuyó 40%. La actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que libera 1mg de
de AmiJ33 se incrementó 50.27% con β-mercaptoetanol, no fue glucosa por minuto bajo las condiciones del ensayo, 37 °C, pH 6,0. La
inhibida por EDTA y se inhibió totalmente con SDS. [3] actividad específica se define como las unidades de actividad por
miligramo de proteína.
Las a-amilasas producidas por diferentes especies de Bacillus varían La concentración de proteínas fue determinada por el método
no solo en sus tipos sacarificante y en el rango de pH y temperatura colorimétrico de Bradford, empleando albúmina sérica bovina como
para su actividad óptima. La fuente bacteriana de la enzima suele ser proteína patrón. [9]
Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus licheniformis, siendo esta última
de mayor importancia industrial. PURIFICACION DE LA ENZIMA
Para la producción de las α-amilasas El medio de cultivo utilizado en El extracto crudo fue sometido a precipitación fraccionada con sulfato
este trabajo para la producción de a-amilasa contenía (g / L): de amonio. La fracción con la proteína de interés precipitó entre 50 y
NaH2PO4.2H2O-1.56, NH4Cl-5.35, KCl-0.745, Na2SO4.10H2O- 80% de saturación. Este precipitado se disolvió en el mínimo volumen
0.644, Ácido cítrico-0.42, MgCl2.6H2O-0.25, CaCl2-2.2x10-3, ZnO- de agua destilada, se dializó 24 h contra agua destilada y se liofilizó.
2.5x10-3, FeCl3.6H2O-2.7x10-2, MnCl2.4H2O-1.0x10-2, Se disuelve en un buffer fosfato 50 mM, pH 6,0, y se aplicó a una
CuCl2.2H2O-8.5x10-4, CoCl2.6H2O-2.4x10-3, NiCl3.6H2O-2.5x10- columna de un cromatógrafo de intercambio aniónico, la elusión se
4, H3BO3-3.0x10-4, Na2MoO4-1.0x10-3, Bacto-triptona-10.0, realizó por medio de un gradiente discontinuo de fuerza iónica (NaCl
Extracto de levadura-2.5 y Almidón soluble-5. El pH se ajustó a 6,9- 0,1 a 0,5 M). A cada fracción (5 ml) se le midió la absorbancia a 280
7,0 con NaOH 1,0 M y este medio basal se esterilizó mediante nm y la actividad enzimática. Las fracciones que contenían la proteína
autoclave a 121ºC durante 15 minutos. El extracto de levadura, bacto- de interés, se mezclaron en un pool (pool DEAE-pico II), que se dializó
con agua destilada y se liofilizó. El pool DEAE-pico II se disolvió en
triptona y almidón soluble se esterilizaron por separado y se añadieron
NaCl al 1% y fue sometido a cromatografía de filtración por gel sobre
asépticamente a los matraces que contenían el medio líquido, después
Sephadex G-75 (2,5 X 30,0 cm). La elusión de las proteínas se realizó
de enfriar. El medio anterior (50 ml en matraces Erlenmeyer de 250 con NaCl al 1%. La velocidad de flujo fue de 27 mL/h. A cada fracción
ml) se inoculó con 1 ml de un cultivo de una noche y se incubó a 55ºC (4,5 mL) se le midió la absorbancia a 280 nm y la actividad enzimática.
con aireación vigorosa en un agitador rotatorio a 150 rpm durante 144 Las fracciones que mostraron mayor actividad enzimática, se
h. A intervalos de tiempo, la turbidez de los cultivos se determinó mezclaron en un pool (pool G-75-pico II) que se dializó contra agua
midiendo la densidad óptica a 470 nm en un espectrofotómetro Hitachi destilada y se concentró por liofilización.[9]
Modelo U-2000. Antes del ensayo, las células se separaron por
centrifugación a 13,000 rpm durante 15 min y el sobrenadante El pool G-75-pico II se disolvió en buffer fosfato 0,05M, pH 7,0 y fue
transparente se usó como preparación enzimática bruta. [6] sometido a cromatografía de intercambio catiónico sobre CM
Sephadex C-50 (2,5 x 30,0 cm). La elusión se realizó por medio de un
De acuerdo al estudio realizado el pH optimo 7.5. La actividad de la gradiente discontinuo de fuerza iónica (NaCl 0,1 a 0,5 M). La velocidad
enzima a pH 5,5 y 10,0 fue del 73% y 55% de la de pH 7,5, de flujo fue de 27 mL/h. A cada fracción (4,5 mL) se le midió la
absorbancia a 280 nm y la actividad enzimática. Las fracciones que almidones para la industria del papel, la remoción del almidón en la
contenían la proteína de interés, se mezclaron en un pool (pool CM- fabricación de textiles y como aditivos en detergentes. [11]
pico I) que se dializó contra agua destilada y se liofilizó. [9]
Las α-amilasas bacterianas, y pertenecientes a Bacillus como B.
CARACTERIZACION DE LA ENZIMA subtilis, B. stearothermophilus, B. licheniformis y B.
amyloliquefaciens, tiene una gran aplicación en procesos debido a la
Se corrieron electroforesis con geles de poliacrilamida al 12%, los resistencia a altas temperaturas de 25 a 90°C y tolerancia a pH de 1 a
cuales se tiñeron con azul de Coomassie. Los marcadores de peso 11,5. En especial la cepa nativa Bacillus sp. BMM1 productoras de este
molecular empleados fueron de la marca Bio-Rad, con las siguientes tipo de enzimas termoestables. En el estudio realizado en la
proteínas como estándares: fosforilasa B (104 kDa), albúmina de suero Universidad de Medellín aislaron el microrganismo del suelo, su
bovino (83 kDa), ovoalbúmina (49 kDa), anhidrasa carbónica (37 caracterización molecular se realizó mediante la secuenciación del gen
kDa), inhibidor de la tripsina de soya (29 kDa) y lisozima (20 kDa). [9] ribosomal 16S, la aplicación de este gen se llevó mediante PCR con los
cebadores pA (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’) y pC5B
(5’TACCTTGTTACGACTT 3’). [11]
EFECTO DE LA TEMPERATURA
Los microorganismos industriales pueden ser aislados de la naturaleza
La temperatura a la cual se alcanza la máxima actividad y, por tanto, o comprados como líneas puras, genéticamente estables y aptas para el
corresponde a la temperatura óptima de reacción, es 70°C. Cuando se cultivo en gran escala, en Bancos y Colecciones de cultivos. Las
sobrepasa este valor, la actividad disminuye rápidamente porque la fuentes más importantes son los suelos, los lodos. El método clásico
enzima se va desnaturalizando. [9] involucra la selección de microorganismos en diversos medios de
enriquecimiento selectivos, con el objetivo de encontrar líneas
EFECTO DEL INHIBIDOR productoras de enzimas, metabolitos diversos, antibióticos, etc. [12]

El análisis cinético (gráficos de Lineweaver-Burk y Dixon) indicó que

los diferentes inhibidores exhiben diferentes patrones de inhibición, ya
que el EDTA mostró una inhibición competitiva (11). Para investigar CONCLUSIONES
el efecto de los inhibidores sobre la actividad enzimática, se preparó
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a una concentración de 1 mg Las amilasas son las enzimas utilizadas en la industria de las bebidas,
/ ml y se añadió en diferentes concentraciones (0,538 mM, 1,07 mM, son capaces de hidrolizar moléculas complejas como el almidón hasta
1,61 mM, 2,15 mM y 2,69 mM) al Ensayar la mezcla y medir la unas más sencillas que son capaces por medio de la fermentación
actividad de amilasa, se observa que al incremento de la concentración producir alcohol.
del inhibidor la actividad de la enzima decrece. [10]
En la actividad enzimática los factores más importantes son la
EFECTO DEL pH temperatura y el pH, cada vez se está en busca de organismos capaces
de producirlas con la resistencia a estos dos factores, por tal razón se
Las amilasas producidas por diferentes bacilos pueden tener pueden llamar termoestables.
diferente perfil de pH, estudio realizados sobre diferentes
buffers, el ensayo enzimático determinación de azucares (DNS), Hay na gran variedad de bacterias en especial Bacillus, aunque de los
hongos (especies fúngicas) también se puede producir de las cuales se
muestran un pH máximo de 7 y un aumento adicional de pH de
pueden producir las amilasas, los cuales pueden aislados de diferentes
muestra una disminución de la actividad enzimática. [10] sitios del medio ambiente.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFIAS

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https://bibliotecavirtual.unad.edu.co:2538/lib/unadsp/reader.action?pp
g=1&docID=3219453&tm=1528751984230
Figura 2. Actividad enzimática vs pH [10]
En la industria del almidón este tipo de enzimas son utilizadas no [2] Guadarrama, A., Orozco, J., & Morales , M. (2017). Obtención de
solamente para su hidrólisis sino como modificación de materia prima amilasa a partir de Aspelligius oryzae. Obtenido de
con el fin de obtener glucosa, maltosa y oligosacáridos, que pueden ser https://smbb.mx/congresos%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III
convertidos en jarabes de fructosa y dextrosa. La glucosa obtenida, /Carteles/CIII-24.pdf
también puede ser fermentada para producir etanol, aminoácidos y
[3]Montor, A., Olvera Caranza , c., & Reyes Duarte, D. (2014).
ácidos orgánicos. Para este tipo de procesos es necesario utilizar
Caracterización bioquímica de AmiJ33, una amilasa de Bacillus
enzimas termoestables, ya que son adicionadas después de la
amyloliquefaciens aislada de suelos cultivados con caña de azúcar en
gelatinización que requieres temperaturas entre 70 °C y 110 °C, su
la región del Papaloapan. Obtenido de
objetivo es reducir la viscosidad de la solución mediante la hidrólisis
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2007-
parcial del almidón. También pueden ser utilizadas como una 07052014000200003
alternativa a la adición de malta en la industria cervecera, en el
mejoramiento de harinas en la industria panadera, la producción de
 [10] Divakaran, D., Chandran, A., & Chandran , P. (2011).
Comparative study on production of α-amylase from. Obtenido de
[4]Vargas, A., & Silver, L. (2007). Selección y evaluación de bacterias http://www.scielo.br/pdf/bjm/v42n4/v42n4a22.pdf
del género. Obtenido de
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/tesis/salud/vargas_as/antec [11] Quintero , M., Montoya , O., & Gutierrez, P. (2009). Purificación
_fund_cientif.pdf y caracterización de una a- amilasa producida por la cepa nativa
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[5]Montor, A., Olvera Caranza , c., & Reyes Duarte, D. (2014). http://www.scielo.org.co/pdf/dyna/v77n162/a04v77n162.pdf
Caracterización bioquímica de AmiJ33, una amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens aislada de suelos cultivados con caña de azúcar en [12] Maljovich, M. (2018). Producotres de amilasas/ el origen de los
la región del Papaloapan. Obtenido de microorganismos industriales. Obtenido de
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2007- https://bteduc.com/guias_es/88_Mos_productores_de_amilasas.pdf
07052014000200003.

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