VALIDACION DE METODOS

ANALITICOS EN EL
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA

JOHANNA ROJAS
Microbiologa MSc.
 AGENDA
• 1. VALIDACION –Conceptos claves

• 2. METODOS DE ANALISIS
– Clasificación

• 3. PARAMETROS DE VALIDACION

• 4. VALIDACION
– METODOS CUALITATIVOS
– METODOS CUANTITATIVOS
 OBJETIVOS

1. Dar a conocer los criterios de aceptación

adecuados para ejecutar actividades de validación
de métodos microbiológicos de acuerdo a lo
establecido en la resolucion 3619 de 2013 en
cuanto a BPL según OMS

2. Proporcionar herramientas que permitan

establecer un programa de validación y control de
los métodos microbiológicos en forma eficaz.
 INTRODUCCION
• Control microbiológico Industria Farmacéutica
y Biofarmacéutica
MATERIAS
PRIMAS

PROCESO PRODUCTO
INFRAESTRUCTURA TERMINADO

PERSONAL
 VALIDACION DE LOS
METODOS
 QUE ES??? Serie de acciones ORGANIZADAS a demostrar que un proceso,
método, análisis, es ADECUADO para la finalidad a la que se
destina.

– VISION :
• Conocer cual es el objetivo del proceso
• Analizar las características diferenciales de cada
método
• Adaptaciones en casos de cambios al método
– MISION:
• Diseño del proceso
• Pasos para realizar a cabo la validación
• Selección de actividades y metodología
 INFORME OMS
VALIDACION
• Accion de verificar de acuerdo a BPL, que
cualquier procedimiento, proceso, equipo, o
actividad genera los resulatdos esperados.

VERIFICACION
• Garantizar que la aplicación de métodos,
procedimientos, y otras evaluaciones se
ejecutanm de acuerdo a lo establecido en los
principios de BPL.
 DOCUMENTOS BASICOS
1. Plan de validación:
Guia
– Describe los pasos a realizar
– Personal que interviene
– Responsabilidades
– Parámetros a utilizar Unico
– Márgenes de aceptación.
– Documentación de referencia.
Claramente
descrito
 ELEMENTOS DEL PLAN
DE VALIDACION
• a)Una identificación apropiada de los métodos de ensayo.
• b) El alcance.(intervalo de concentración del analito)
• c) La descripción del tipo de Ítem a ensayar.
• d) Los parámetros o las magnitudes; y los rangos a ser
determinados.
• e) Los aparatos y equipos, incluidos los requisitos técnicos
• de funcionamiento.
• f) Los patrones de referencia y los materiales de referencia
• requeridos.
• g) Las condiciones ambientales requeridas y cualquier
periodo de estabilización que sea necesario
ELEMENTOS DEL PLAN
DE VALIDACION
• h) La descripción del procedimiento incluida la siguiente información:
– -diagrama de flujo
– -marcas para identificación durante la manipulación,
– - el transporte, el almacenamiento y la preparación de los ítems.
– - las verificaciones a realizar antes de comenzar el trabajo
– - la verificación del correcto funcionamiento de equipos y, cuando corresponda, su
calibración y ajuste antes de cada uso;
– - el método de registro de las observaciones y de los resultados;
– -las medidas de seguridad a ser observadas.
• i) Los criterios o requisitos para la aprobación o rechazo.
• j) Los datos a ser registrados y el método de análisis.
• k) La incertidumbre o el procedimiento para estimar la incertidumbre.
 DOCUMENTOS BASICOS
2. Documentación del proceso:

Registros
– Protocolos de análisis
– Cuadro de matrices
– Registros de los resultados
– Tratamiento estadistico Soporte

Evidencia
objetiva
DOCUMENTOS BASICOS
3. Informe de Validación:

– Documento de certificación Completo

– Refleja resultados
– Describe los tratamientos estadísticos
– Observaciones y Hallazgos
– Plazo de validez de la validación Claro

Codificado
 METODOS
MICROBIOLOGICOS
Normalizados
CONVENCIONALES
No
Normalizados
METODOS DE
ANALISIS
Desarrollados
por proveedores
ALTERNATIVOS O
RAPIDOS Modificaciones
métodos
normalizados
MÉTODOS CONVENCIONALES COMPENDIALES, O NORMALIZADOS

Son métodos oficiales, (de compendios), métodos

normalizados o métodos de organismos nacionales o
internacionales reconocidos.

• Pharmacopeas
• ISO

Estos métodos no requieren validación total, pero si llevan

adecuación de acuerdo a las características de las muestras
a analizar.
MÉTODO DE REFERENCIA. (Normalizado)

• Método investigado a fondo, que describe con claridad y

exactitud las condiciones y los procedimientos necesarios
para medir los valores de una o más propiedades.

• Que ha demostrado tener una exactitud y una precisión

apropiadas para el uso que pretende hacerse del mismo,
de
manera que puede utilizarse para evaluar la exactitud de
otros métodos empleados para realizar la misma medición
y, en particular, para caracterizar un material de referencia.
 MÉTODO CONVENCIONALES NO NORMALIZADOS.
• Los métodos no normalizados o no compendiales son
aquellos que no están descritos en normas o
compendios.

• Son adoptados o seleccionados de manuales,

artículos o desarrollados en el laboratorio para un fin
particular.

• Estos métodos requieren de una validación completa

respecto a un método de referencia.
MÉTODO ALTERNATIVO

• Un método de análisis que demuestra o estima, para una

categoría determinada de productos, el mismo
mesurando tal y como es medido, empleando el método
de referencia correspondiente.

• Es indispensable que el laboratorio cuente con la

información técnica necesaria aportada por el fabricante.

• Estos métodos requieren de una validación completa

respecto a un método de referencia.
MÉTODO MICROBIOLÓGICO RÁPIDO (RMM).

• Método de análisis microbiológicos de nueva generación.

• Permite alcanzar los mismos resultados que los métodos
convencionales dentro de un período de tiempo más corto.
– (Menos de 7 días para las pruebas de esterilidad, 24 horas o
menos para los recuentos microbianos y la identificación, 3 días
para los Hongos)
• Las pruebas rápidas optimas, se completan en un tiempo
total de 1 a 3 horas.

• Estos métodos requieren de una validación completa

respecto a un método de referencia.
Como se elige un método?

Marco regulatorio Intereses prácticos

vigente y económicos

Independiente del tipo de método que se adopte,

todos requieren de estudios de validación.
El alcance varia en función del método seleccionado.
 • No requieren de validación completa
• Métodos estandarizados
NORMALIZADOS
• Parámetros específicos
• Validación secundaria o Verificación

“El laboratorio debe confirmar que puede aplicar

correctamente el método antes de utilizarlo”

• Validación primaria
ALTERNATIVOS
• Completa y exhaustiva

“El laboratorio debe validar las modificaciones de los métodos

Normalizados para confirmar su aptitud para el fin previsto”
 Validación de métodos de ensayo
• Los metodos segun Farmacopea se consideran validados, sin
embargo cada laboratrorio debe demostrar que para un
producto especifico el método es adecuado para la
recuperacion de bacterias, hongos y levaduras.

• El laboratorios debe demostar que el desempeño del metodo es

adecuado antes de introducirlo dentro de las pruebas de rutina
de sus productos y que la implementacion de controles
positivos y negativos en presencia de producto es satisfactoria.
 Validacion de metodos de ensayo

• Los metodos no basados en referencias reconocidas,

deben ser validados antes de su uso y esto significa
comprobar Precision, ecatitud, especificidad, límite de
detección, límite de cuantificación, robustez y
linealidad.

• Los resultados deben ser validados por métodos

estadisticos apropiados.
 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN
Exactitud:
Es el grado de aproximación entre los resultados obtenidos por el
método alternativo y los obtenidos por el método de la Farmacopea

Precisión:
• El grado concordancia entre los resultados individuales del ensayo
cuando se aplica el procedimiento de forma repetida a múltiples
muestras de suspensiones homogéneas de microorganismos.
• Se expresa generalmente como varianza, desviación típica o
coeficiente de variación de una serie de medidas.

• Se puede expresar como Repetibilidad o reproducibilidad

REPETIBILIDAD
• Precisión determinada bajo condiciones en las que los
resultados de una medición se obtienen con:
– Mismo método,
– Mismo operario,
– Mismo instrumento de medida
– Durante un corto intervalo de tiempo.

REPRODUCIBILIDAD
• Precisión determinada bajo condiciones en las que los
resultados de una medición se obtienen con:
– Mismo método en la misma muestra
– Distinto operario,
– Distinto instrumento de medida
– Diferentes laboratorios
– Durante intervalos de tiempo diferente.
• El grado de precisión, junto con la exactitud son las
medidas de la CONFIABILIDAD del método, lo cual
corresponde al error aleatorio y el error sistemático.

• La falta de precisión es el error aleatorio, es decir que

es propio del método bioanalítico.

• El error sistemático es el del laboratorio, o de los

factores operativos (Falta de calibración en el material,
resultados de contaminación por falta de limpieza en el
área, etc)
 Como se realiza?
Intraensayos (repetibilidad)
• Se realiza tomando N medidas de la misma muestra o
preparación estándar realizada en una misma serie de
ensayos, en las mismas condiciones.
• Este ensayo en la misma muestra permitirá valorar un
grupo de fuentes de error que son aquellos no
dependientes de condiciones externas.
• El error sistemático introducido es idéntico para todas
las medidas, y por lo tanto es calculable el aleatorio
propio del ensayo.
 Como se realiza?
Interensayos (reproducibilidad)
• Se realiza tomando N medidas de la misma
muestra o preparación estándar realizada en
ensayos diferentes, en condiciones similares.
• Este ensayo incluye un mayor porcentaje de
errores no propios del ensayo, sino de la
operación.
• Corresponde error aleatorio y no es el mismo
en todos los ensayos.
Exactitud o Certeza
• Es el grado de aproximación del resultado del ensayo a un
valor conocido de referencia.
• La certeza evalúa todos los errores analíticos, y por
eliminación, requiere de un alto numero de repeticiones para
calcular el error sistemático con significancia estadística
aceptable.
• Por facilidad, se puede expresar como un porcentaje de
aciertos del análisis para clasificar en una preparación de
referencia dentro de un intervalo de concentración conocida.
• Por ejemplo: 10 a 100 ufc/g
Especificidad
• La habilidad del método para detectar un rango de
determinados microorganismos. (Medios selectivos)

• Se realiza con un ensayo sobre seis muestras

representativas con mayor posibilidad de
contaminación.
• Se utilizan inoculaciones en diferentes niveles del
microorganismo target y no target.
• Determina los interferentes que podrían causar una
reacción cruzada en el análisis de una muestra.
Límite de detección (sensibilidad)
Menor número de microorganismos en la muestra
que pueden ser detectados, pero no necesariamente
cuantificados, (presencia o ausencia en la cantidad de
muestra ensayada, por ejemplo: 1 ufc/25 g).

• Se establece utilizando el procedimiento de

diluciones seriadas para construir una serie de
preparaciones con concentración conocida del
inoculo y un blanco.
• Se determina con la señal mínima de detección del
microorganismo target.
• Límite de cuantificación : El más bajo nivel de
microorganismos cuantificados, con exactitud
y precisión en la muestra específica, bajo las
condiciones experimentales establecidas.
Linealidad: Es la habilidad de obtener resultados proporcionales a la
concentración de microorganismos presente en la muestra dentro de un
rango dado.
Se realiza en dos aspectos:

• Respuesta a la mezcla de muestras

Se realiza utilizando diferentes concentraciones de diferentes
microorganismos en mezclas controladas y permite evaluar la correcta
respuesta del ensayo a variaciones de concentración y su independencia
respecto a los componentes de la muestra-

• Respuesta a la dilución
Se realiza con diluciones de la muestra para determinar como se
mantiene la linealidad del ensayo, es decir en que medida actúa la
concentración de la muestra y el analito.
• Rango: Es el intervalo del mayor al menor
nivel de microorganismo que puede ser
detectado con exactitud, precisión y linealidad

• Fortaleza: Grado de reproducibilidad de los

resultados obtenidos de las mismas muestras
bajo diferentes condiciones, tales como
diferentes analista, instrumentos, lote de
reactivos, etc.
• Robustez: Es la capacidad del método de no afectarse
por un pequeños cambios deliberados en sus
parámetros

• Equivalencia: La medida de que tan similar son los

resultados obtenidos con el nuevo método, con
respecto al método de referencia que se pretende
sustituir.

• Estabilidad: La estabilidad del método esta dada por la

• Robustez y Fortaleza del mismo.
• La validación de un método de control microbiológico
consiste en la inoculación de una serie de
microorganismos al producto, los cuales deben
recuperarse después de aplicar el método seleccionado.

• Que se requiere para garantizar los ensayos

– Buenas prácticas de laboratorio
– Equipos validados, calibrados o calificados según corresponda
– Medios de cultivo con certificados de calidad y pruebas de
promoción de crecimiento
– Cepas estandarizadas de microorganismos referencia
– Analistas calificados en la técnica
– Contar con una método estandarizado y documentado
ESTANDARIZACION DEL
METODO
MUESTRAS
 MATRICES
• Selección por grupos
• Muestras de formulas especiales debes ser evaluadas
• Incluir los diferentes tipos de presentación
• Incluir representantes de todos los tipos
de muestras que analiza el laboratorio
• Incluir Materias primas si el método
se utiliza para estas
Las muestras serán contaminadas de manera
artificial, al menos con los microorganismos
descritos en las farmacopeas de acuerdo al método, (límite microbiano,
esterilidad, etc.)

Las muestras serán lo más homogéneas posible.

 FORTIFICACION DE LAS MATRICES
• Uso de muestras naturalmente contaminadas y
preparación de muestras artificialmente contaminadas
en estudios de validación
(Anexo C EN ISO 16140:1999)
• • 1ra opción: Muestras naturalmente contaminadas
• • 2da opción: Contaminación por mezcla.
• • 3ra opción: Muestras inoculadas (el nivel de
microbiota debe representar la contaminación de las
muestras naturalmente contaminadas).
• • 4ta opción: Materiales de referencia
ESTANDARIZACION INOCULO
 RECOMENDACIONES
• La validación se debe realizar como mínimo en tres lotes de
fabricación del producto o de la materia prima.
• Todos los productos usados en la validación deben ser
controlados microbiológicamente previo al proceso
• En paralelo siempre se debe realizar el ensayo en ausencia del
producto (Blanco)
• Es necesario validar si la presencia del producto puede afectar la
efectividad de los medios de cultivo.
• Cualquier cambio de diluyente o medio de cultivo debe verificarse
previamente con inóculos en presencia y ausencia del producto.
• Se recomienda revalidación bianual o cuando se incorpore un
cambio significativo del método.
 VALIDACION METODOS
CUALITATIVOS
• Los métodos cualitativos son aquellos que detectan la
presencia de un microorganismo determinado en la muestra,
desde la menor cantidad posible.

• PRESENCIA O AUSENCIA

– Pueden requerir procedimientos extensos y sucesivos que

garanticen estimular el crecimiento de cualquier
microorganismo por mínima que sea la cantidad presente
en la muestra.
– Requiere identificaciones finales que confirmen la
presencia del microorganismo blanco.
Calificación del desempeño –
ENSAYOS CUALITATIVOS
• Técnica de Duplicados.
• a. Serie de valores obtenidos por el metodo de referencia y por duplicado.
• b. Calcular los logaritmos de los resultados obtenidos
• d. Agruparlos por niveles de contaminación (logaritmos con igual parte
entera). Se analizaran al menos 10 muestras por nivel.
Valor Referencia Valor Validación Diferencia

Log X1 Log Y1 LogX1 – LogY1=d1

Log X2 Log Y2 LogX1 – LogY1=d1
Log Xn Log Yn LogX1 – LogY1=d1
El mètodo es preciso cuando su RSD relativa es
inferior a su RSD teorica
1. Se realizarán diluciones hasta la obtención de suspensiones de entre
20 – 50 ufc.
• Seguir diluyendo hasta obtener suspensiones de 1 – 10 ufc

2. Tomar una alícuota de cada rango de suspensiones y sembrarla por

duplicado en un medio no selectivo, para obtener el valor de
referencia por recuento.
3. Inocular una alícuota de cada dilución en un mínimo de 10 muestras
no contaminadas con el microorganismo diana, para asegurar un
límite de detección con el 90%.
4. Tras la inoculación, se homogeneízan las muestras y se aplica el
método a validar.
5. Se tabulan los resultados obtenidos (presencia / ausencia) y se
comprueba a que concentración (valor de recuento) el numero de
presencias es superior al 90% (9 presencias).
• Calculo de la Sensibilidad: VP/(VP+FN)
• Cálculo la Especificidad: VN/(FP+VN)
• Cálculo de la Certeza: (VP+VN)/(VP+FP+FN+VN)
• Cálculo del valor predictivo positivo:VP/(VP+FP)
• Cálculo del valor predictivo negativo: VN/(FN+VN)
 VALIDACION METODOS
CUANTITATIVOS
• Los métodos cuantitativos son aquellos que indican
el numero de microorganismos presentes en la
muestra.

– En algunas ocasiones, pueden utilizar medios

específicos para la selección y recuento de un
microorganismo.

– También puede usarse un medio nutritivo general

que permite la enumeración del total de
microorganismos presentes en la muestra.
ENSAYOS CUANTITATIVOS
QUE PUEDE INFLUIR EN
LA VALIDACION?
Cada laboratorio establecerá los requisitos que debe
cumplir el método, con objeto de demostrar que son
adecuados para la finalidad establecida.