“CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD DE AMILASAS,

EVALUACION DEL EFECTO DE LA CONCENTRACION DE

ENZIMAS”
Hernández Soza Rocío del Carmen; Tapia Poveda María José.

Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos,

Modulo de Ingeniería de las Enzimas

Resumen

Las enzimas llevan a cabo un papel primordial dentro del metabolismo celular, la
velocidad con la que se dan las reacciones catalizadas por las ellas puede variar con
respecto a diferentes factores entre ellos la concentración de enzima. Para poder
comprobar el planteamiento anterior en este ensayo se ha trabajado con soluciones de
enzima -amilasa diluida a concentraciones de 1/50, 1/100 y 1/200. Para cada
dilución de enzima se numero 6 tubos microbiológicos colocando 0,25 ml de solución
de enzima y a intervalos de 30 segundo 0,25 ml de solución de sustrato de almidón al
1%, dejando que se lleve a cabo la reacción por unos minutos y deteniéndola con 0,5
ml de solución DNS. Las velocidades de reacción de la enzima obtenidas para la
dilución 1/50 fue de 0,733 (mgMal/ml*min), para dilución 1/100 fue de 0,489
(mgMal/ml*min) y para la dilución 1/200 de 0,193 (mgMal/ml*min), y con
Actividad Enzimática promedio de 2225,883 U/g.

Palabras clave: Actividad enzimática, maltosa, velocidad de reacción, -amilasa.

Abstract intervals of 30 seconds 0.25ml starch

substrate solution 1%, allowing it to
Enzymes perform a key role in
carry out the reaction for a few
cellular metabolism, the rate at which
minutes and stopping with 0,5 ml of
reactions catalyzed by the enzymes
DNS solution. The reaction rates of
may vary on several factors including
the enzyme obtained for 1/50 dilution
the concentration thereof are given.
was 0.733 (mgMal/ml* min) to 1/100
To check the above approach in this
dilution was 0,489 (mgMal/ml*min)
paper we have worked with dilute
and for dilution 1/200 of 0,193
solutions of -amylase enzyme at (mgMal/ml* min), and average
concentrations of 1/50, 1/100 and
enzyme activity 2500.987 U/g.
1/200. For each enzyme dilution
tubes 6 microbiological number Keywords: Enzyme activity, maltose,
placing 0,25 ml of enzyme solution at reaction rate, - amylase.
 Sabiendo que las enzimas son
aceleradoras de reacciones y son
I. INTRODUCCIÓN
dependientes de factores como pH,
Todas las reacciones químicas que temperatura, fuerza iónica,
configuran el metabolismo celular son concentración de sustrato, presencia
catalizadas por enzimas. Estos de inhibidores, etc., se puede estimar
biocatalizadores son específicos y la capacidad catalítica de la enzima,
activos en condiciones moderadas basada en la velocidad de reacción de
para cada enzima, lo que les confiere la enzima sometida a cualquiera de
un gran potencial de uso como estos factores (González, 2004). Dado
catalizadores de procesos. Son de esta aclaración se ha planteado como
naturaleza proteica y su capacidad Reactivos Materiales
catalítica reside en el sitio activo - Ácido acético glacial - Medidor de pH o papel para
(González, 2004). - Acetato de sodio medir pH
- Almidón soluble - Pipetas serológicas de 1, 5 y
Las amilasas constituyen una clase de - Ácido 3, 5 dinitrosalicílico 10 ml
enzimas industriales correspondiente - Tartrato de sodio y - Pipeta automática de 1 ml
potasio - Gradillas
al 25% de las enzimas del mercado. - Hidróxido de sodio - Tubos de ensayo resistentes
Estas enzimas hidrolizan moléculas - Maltosa al calor
de almidón, para obtener diversos - β-amilasa de soya (sólida) - Estufa a 60°C
- Agua destilada - Desecador
productos como la dextrina, y
- Balanza analítica
progresivamente polímeros más - Espectrofotómetro de visible
pequeños compuestos por unidades objetivo de la práctica, la
de glucosa (Rubiano, 2006). Entre las cuantificación de la actividad
amilasas conocidas se encuentra la enzimática de la -amilasa y el efecto
beta-amilasa (E. C. 3. 2.1.2), presente de la concentración de enzima.
en plantas y bacterias. Su función es
actuar en la reacción de hidrólisis de II. MATERIALES Y
los enlaces alfa-1,4-glucosidicos del METODOS
a.) Materiales
almidón con inversión en la
configuración del carbono 1 b.) Método
pasándolo de la configuración alfa a
la beta; así como de remover las Método (Bernfeld, 1959)
unidades de maltosa continuas
presentes en los terminales no-
reductores de la cadena polisacárida
(Durango, et.al, 2008).
Este método se basa en la Se preparó este sustrato
cuantificación de los oligosacáridos suspendiendo 0,25 g de almidón
reductores liberados a partir de soluble en 25 ml de la solución
almidón los cuales se miden mediante tampón. Se calentó hasta ebullición
la reducción del ácido 3,5- para disolver el almidón. Se enfrío y
dinitrosalicílico. llevo a volumen con agua destilada.
Para el ensayo se incubo el almidón a
Unidad de actividad 25°C al menos por 5 minutos (el
tiempo dependerá del volumen de
Una unidad libera una micromol de sustrato que se termostatice).
grupos reductores calculados como
maltosa por minuto a partir del Solución madre de maltosa
almidón, a 25°C y pH 4,5 bajo las
Se calentó la maltosa por 4 h a 60°C
condiciones especificadas.
en una caja petri. A continuación se
Tampón acetato de sodio 0,02M de tapó la caja y se enfrío en un
pH 4,5 (100 ml). desecador. Se pesó la cantidad
necesaria para obtener una solución
Se preparó 50 ml de las soluciones de que contenga 2 mg/ml.
acetato de sodio y de ácido acético. Se
mezcló las soluciones anteriores hasta Enzima
obtener el pH deseado. Se preparó 10 ml de una suspensión
al 10% de β-amilasa de soya en
Solución de ácido 3,5-
tampón de actividad. Se mantuvo la
dinitrosalicílico (50 ml)
suspensión en agitación suave
Se pesó 0,5 g del ácido 3,5- durante 1 h para extraer la enzima. A
dinitrosalicílico y se disolvió en 20 ml continuación se centrifugo la
de agua destilada (con agitación suspensión a la máxima velocidad
magnética). Se añadió 10 ml de disponible en la centrífuga (5950 rpm)
hidróxido de sodio 2 M, se mezcló por 10 min y se retiró
bien. Se agregó lentamente 15 g de cuidadosamente el sobrenadante. Se
tartrato de sodio y potasio y se aforo a mantuvo en refrigeración la solución
50 ml con agua destilada. de enzima que se utilizó en la práctica
y el resto se congelo.
Se mantuvo el reactivo protegido del
dióxido de carbono en un frasco Se realizó varias diluciones de la β-
opaco bien cerrado. amilasa: 1/50, 1/100 y 1/200 con el
tampón de actividad.
Solución de almidón al 1% (25 ml)
Curva estándar de maltosa
Se ajustó el espectrofotómetro a 540 0.5 ml de solución de DNS para
nm. Con la solución madre de detener la reacción. Se incubo los
maltosa se preparó la curva estándar tubos en un baño de agua hirviente
de la siguiente manera: por 5 min EXACTOS, enfriarlos, se
Se numero 6 tubos lavados y secos. Se añadió 5 ml de agua destilada, se
colocó en cada uno la solución madre mezcló bien y se leyó la absorbancia a
de maltosa con cantidades de (0.0, 540 nm vs el blanco preparado de
0.10, 0.20, 0.30, 0.40. 0.50) idéntica manera pero invirtiendo el
respectivamente, se registró los pesos orden de mezcla de los reactivos, esto
de cada alícuota. Se añadió agua es 1° Enzima, luego DNS y finalmente
destilada para completar 0,5 ml. Se sustrato. Se determinó la cantidad de
registró el peso de la mezcla estándar- maltosa liberada a partir de la curva
agua. Se calculó con estos datos la estándar.
concentración de maltosa de cada
estándar. Se añadió a cada tubo 0,5
ml de solución de DNS y se incubo en
un baño de agua hirviente por 5 min
exactos, se enfrió a temperatura
ambiente (20C). Se añadió 5 ml de
agua destilada y se mezcló bien. Se
leyó la absorbancia frente a un blanco
preparado con 0,5 ml de agua
destilada. Se elaboró una curva III. RESULTADOS
graficando Absorbancia vs
concentración (mg/ml) de maltosa. Tabla 1: Datos de la solución
estándar de Maltosa
Determinación de la actividad

Se pipeteo 0.25 ml de cada dilución Peso total de Maltosa seca a 0,9952

utilizar (g)
de enzima en una serie de 6 tubos
Peso Maltosa (g) 0,0505
numerados. Se incubo los tubos así
Peso maltosa +agua (g) 24,2146
como el sustrato a 25C hasta llegar Vol. (ml) 0,242146
a la temperatura de ensayo. A FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las
intervalos de 30 s, se añadió 0.25 ml Enzimas de la FCIAL- 2014
ELABORADO POR: Hernández, Tapia
de sustrato y a los tiempos previstos
(0.5, 1, 2, 3, 6 y 12 min para la dilución
1/50 y a los 1, 2, 4, 8 y 12 min para la Concentración del estándar de
dilución 1/100; y a los 2, 4, 8, 12 y 16 maltosa
min para la dilución 1/200) se agregó
 Peso maltosa(g)∗1000 1
[ MALTOSA ] =
Vol(ml)
|¿|
( 0,4337 )∗[Mal]−( 0,0213
0,4337 )

0,0505(g)∗1000 [Mal ]=2,305∗|+0,0491|

[ MALTOSA ] =
24,2146(ml)

g Determinación de la Concentración de
[ MALTOSA ] =2,085
ml Maltosa para las diferentes diluciones
[Mal ]=2,305∗|+0,0491|

Tabla 2: Datos para la obtención de [Mal ]=2,305∗(0)+0,0491

la curva estándar de Maltosa
[Mal ]=0,0491

Vol Vol Peso ( Peso ( g )∗[ MALTOSA ] )

Tubo Malt.
Peso
agua T. Abs. [ Maltosa ] =
(g) Tabla
Peso3:TValores
( g) para la el cálculo de
(ml) (ml) (g)
(mg/ml)
actividad de la -amilasa, dilución
Blanco 0,00 0,00 0,50 0,58 0,000 0,0000
1/50
Std. 1 0,10 0,184 0,40 0,66 0,262 0,5810
Std. 2 0,20 0,2845 0,30 0,66 0,426 0,8941 Tiemp
N° Absorbanci [Mal ]=2,305∗|+0,0491|
Std. 3 0,30 0,3847 0,20 0,67 0,573 1,2014 o Rx
tubo a (mg/ml)
Std. 4 0,40 0,4866 0,10 0,67 0,703 1,5146 (min)
Std. 5 0,50 0,583 0,00 0,58 0,886 2,0855 1 0,0 0,000 0,0491
FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las 2 0,5 0,249 0,623
Enzimas de la FCIAL- 2014 3 1,0 0,318 0,782
ELABORADO POR: Hernández, Tapia 4 2,0 0,496 1,193
5 3,0 0,651 1,550
GRAFICO 1: Curva estandar de Maltosa 6 6,0 0,687 1,633
7 12,0 0,865 2,044
1.000
FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las
0.800 f(x) = 0.43x + 0.02 Enzimas de la FCIAL- 2014
Abs. (540nm)

0.600 R² = 0.99 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

0.400
CURVA ESTANDAR DE
0.200 MALTOSA GRAFICO 2: Curva de Dilución 1/50
0.000
0.0000 0.5000 1.0000 1.5000 2.0000 2.5000 1.000
[Maltosa] (mg/ml)

[Maltosa] (mg/ml) 0.800

f(x) = 0.73x + 0.12
0.600 R² = 0.9
FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las 0.400
Enzimas de la FCIAL- 2014
0.200 Linear ()
ELABORADO POR: Hernández, Tapia
0.000
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Ecuación obtenida a partir de la curva
Tiempo de reación (min)
estándar de Maltosa:

y=0,4337 x−0,0213 FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las

Enzimas de la FCIAL- 2014
Ec. 1 ELABORADO POR: Hernández, Tapia
 Tabla 4: Valores para la el cálculo de 5 12,0 0,759 1,799
actividad de la -amilasa, dilución 6 16,0 0,742 1,760
FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las
1/100 Enzimas de la FCIAL- 2014
ELABORADO POR: Hernández, Tapia
N° Tiemp
Absorbanci [Mal ]=2,305∗|+0,0491|
tub o Rx
a (mg/ml) GRAFICO 4: Curva de Dilución 1/200
o (min)
2.000
1 0,0 0,000 0,0491

[Maltosa] (mg/ml)
1.500
2 1,0 0,209 0,531 f(x) = 0.19x + 0.13
R² = 0.98
3 2,0 0,424 1,027 1.000
4 4,0 0,548 1,313 0.500 Li nea r
()
5 8,0 0,717 1,702
0.000
6 12,0 0,702 1,668 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Tiempo de reación (min)
Enzimas de la FCIAL- 2014
ELABORADO POR: Hernández, Tapia FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las
Enzimas de la FCIAL- 2014
GRAFICO 3: Curva de Dilución 1/100 ELABORADO POR: Hernández, Tapia
1.200
[Maltosa] (mg/ml)

1.000 GRAFICA 5: Curvas de las Diluciones 1/50, 1/100 y 1/200

0.800
f(x) = 0.49x + 0.05
R² = 1 2.500
0.600
2.000
[Maltosa] (mg/ml)

0.400
Dilución 1/100
0.200 1.500 Polynomial (Dilución
Linear ()
0.000 1.000 1/100)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Dilución 1/200
0.500
Tiempo de reación (min) Polynomial (Dilución
0.000 1/200)
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
Dilución 1/50
FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Tiempo (min)
Enzimas de la FCIAL- 2014
ELABORADO POR: Hernández, Tapia
FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las
Enzimas de la FCIAL-2014
ELABORADO POR: Hernández, Tapia
Estimación de la velocidad de
Tabla 5: Valores para la el cálculo de
formación de maltosa
actividad de la -amilasa, dilución
1/200 Dilución 1/50

Tiempo mgMal
N°
Rx
Absorbanci v enz =0,7332
[Mal ]=2,305∗|+0,0491|
tubo a (mg/ml) ml∗min
(min)
1 0,0 0,000 0,0491 Dilución 1/100
2 2,0 0,216 0,547
4,0 0,409 0,992
mgMal
3 v enz =0,4888
4 8,0 0,671 1,596
ml∗min
Dilución 1/200 Dilución 1/100

mgMal mgMal
v enz =0,1911
ml∗min U
0,488 ( ml∗min )∗10 ∗0,5 ml ∗100
3

Actividad
g
=( )
342mg∗0,09952 g∗0,2421 ml
GRAFICO 6: Velocidades de la enzima para las diluciones 1/50, 1/100 y 1/200
0.6
0.5
Actividad ( Ug )=2961,137 Ug
0.4 f(x) = 0.24x - 0.26
V(mgMal/ml*min)

0.3 R² = 0.98 Dilución 1/200

Velocidad
0.2
(mg mgMal
0.1 Mal/ml*mi 0,191 ( ml∗min )∗10 ∗0,5 ml ∗200
3

0
0.5 1 1.5 2
Dilución de la enzima
n)
2.5 3 3.5 Actividad ( Ug )= 342mg∗0,09952 g∗0,2421 ml
FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las
Actividad ( Ug )=2317,939 Ug
Enzimas de la FCIAL- 2014
ELABORADO POR: Hernández, Tapia Tabla 6: Resumen de los valores de
concentración de glucosa,
Calculo de la actividad enzimática velocidades de reacción y actividad
de la -amilasa enzimática obtenidos.
Peso de enzima por ml de volumen de
tampón de actividad
Concentración del g
0,9952 g estándar de Maltosa [ MALTOSA ] =2,085
P enzima= ml
10 ml

P enzima=0,09952 g/ml
Dilución Dilución Dilución
Actividad enzimática de la β-amilasa
1/50 1/100 1/200
Mal
U (
v enz mg
ml∗min
3
)
∗10 ∗V Treacción
Velocidad
es de 0,733
mgMal
0,488
mgMal
0,191
mgMal
Actividad
g
= ( ) reacción
∗FD
PM Mal∗P Enz∗V Enz(sol. madre)Actividad
ml∗min
U
ml∗min
U
2223,887 2961,137 2317,939
ml∗min
U
enzimática g g g
Dilución 1/50
Promedio de la actividad U
enzimática
2500,98
mgMal g
U
0,733 ( ml∗min )∗10 ∗0,5 ml 50
3
FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las
Actividad ( )
g
=
342mg∗0,09952 g∗0,2421 ml Enzimas de la FCIAL- 2014
ELABORADO POR: Hernández, Tapia

Actividad ( Ug )=2223,887 Ug
IV. DISCUSION
La velocidad de reacción de una glucosa. Obteniendo como velocidad
enzima depende de varios factores, media 0,2444 (mgMl/ml*min).
uno de ellos es la concentración de
Se calculó también la actividad
enzima, puesto que un mayor
enzimática para cada dilución, los
concentración de enzima permite la
datos de actividad se presentan en la
transformación de una mayor
tabla 6 de resultados, aquí se puede
cantidad de sustrato, en menor
observar que la mayor actividad
tiempo (Durango, et.al, 2008).
2961,137 U/g, es para la dilución
En la presente practica se llevó a cabo 1/100, estimando así que la actividad
la reacción de sustrato de almidón al enzimática no depende tanto de la
1%, en diferentes diluciones de concentración de enzima con la que se
enzima, comprobando que velocidad trabaje sino más bien al tiempo de
catalítica depende la concentración de reacción o a algún factor exógeno que
enzima, los valores de velocidad se no se ha podido establecer en la
presentan en la tabla 6 de resultados, práctica. Además se reporta la
en donde se muestra que para la actividad media para las tres
dilución de menor concentración de diluciones siendo esta de 2500,987
enzima 1/50 tiene una velocidad de U/g.
0,733 (mgMal/ml*min), siendo
superior a las otras dos velocidades V. CONCLUSIONES
reportadas. Se realizó cuantificación de la
La concentración de maltosa obtenida actividad enzimática de la -amilasa a
para cada dilución se obtuvo a partir diferentes concentraciones de enzima,
de la ecuación linealizada (Ec. 1) de la reaccionando sobre sustrato de
curva estándar de maltosa presentada almidón al 1% en diferentes tiempos,
en el Grafico 1 de resultados. Todos obteniendo una actividad mayor de
los datos de concentración de maltosa 2931,137 U/g para la dilución de
para las diluciones se presentan en las 1/100, y como actividad media entre
tablas 3, 4 y 5 y a cada tabla le las tres diluciones (1/50, 1/100 y
corresponden los gráficos 2, 3 y 4 de 1/200) de 2225,883 U/g. Además se
resultados. A partir de estos gráficos determinó el efecto de la
se obtuvo la velocidad de reacción de concentración de enzima sobre la
la enzima para cada dilución, velocidad de reacción en el sustrato
graficando solamente la parte lineal de almidon obteniendo la mayor
de los datos. Se presenta en la gráfica cantidad de miligramos de maltosa
6 la variación de velocidades con por ml y por tiempo (0,733), en
respecto a la concentración de comparación con las demás
diluciones.
VI. REFERENCIAS biotransformación de residuos
organicos procedentes de la
- Corao, G. 2004. Métodos Industrialización de papa
cualitativos para la congelada. Proyecto de Grado
identificación de carbohidratos para optar al Título de
(monosacáridos, disacáridos y Ingeniero de Producción
polisacáridos). Disponible en Agroindustrial. Universidad
http://webdelprofesor.ula.ve/ Politécnica de Valencia. 6-9 pp.
farmacia/gmendez/manuales - Rubiano, C. 200oyaca). 6.
%20PDF/EXPERIMENTO Aislamiento y caracterización
%204%20IDENT%20CARB de microrganismos Termófilos
%2006-05.pdf. 10/05/14. anaerobios lipolíticos y
- Durango, E., Batista, A., amilolíticos de manantiales
Cepeda, I. y Tobón, H. 2008. termominerales de Paipa Iza
Producción de enzimas (Boyacá). Trabajo de Grado
amilasa microbiana, mediante como requisito parcial para
fermentación en estado optar por el Titulo de
líquido. Universidad Pontificia Microbióloga Industrial. 22-24
Bolivariana. Centro de pp.
Investigaciones. Monteria – - Wikipedia. 2013. Diastasa.
Cordoba. 6-9 pp. Disponible en
- González, C. 2004. Evaluación http://es.wikipedia.org/wiki/
de la actividad amilásica como Diastasa. 10/05/14.
indicador del grado de
 VII. ANEXO

ANEXO 1: CUESTIONARIO

1. Presente las características más relevantes de β-amilasa de soya y sus

aplicaciones

Enzima presente en la malta que se activa durante la fase de degradación de

almidón y proteínas en la etapa de maceración. Origen de β -amilasa: cereales, soya
y camote. La β-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarogénica, pues
actúa sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la
amilopectina actúa en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su acción a
distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-1,6. Se trata de
una exo-amilasa, ya que actúa sobre el terminal de la molécula; mientras la amilosa
es transformada totalmente en maltosa, la cadena ramificada de la amilopectina se
conserva en un 40-45% sin hidrolizar.
La β-amilasa no necesita de activador para actuar, pero es menos estable al calor,
inactivándose a 70 °C por 15 min. El pH óptimo de la beta-amilasa es de 4,5
(Wikipedia, 2013).

2. ¿Cuál debería ser la concentración de enzima a utilizar si cambiamos la

relación de la mezcla enzima: sustrato de 1:1 (utilizada en la práctica) a 1:5
para obtener valores de velocidad de reacción equivalentes?.

La solución madre corresponde a la dilución 1/10, si se quiere obtener una relación

1:5 se debe aumentar la concentración de la solución madre 5 veces para obtener
valores de reacción equivalentes.
c) ¿En qué consiste el método para cuantificar específicamente maltosa?.

Prueba Procedimiento Volumen (ml)

Sustancia problema 1
Reactivo de Barfoed.
Acetato de cobre
cristalizado 13,3 g en 200 2,5
B ml de H2O destilada.
A Filtrar si es necesario.
R Añadir 1.8 ml de ácido
F acético glacial
O (CH3COOH).
E Mezclar y calentar en
D baño de agua hirviente,
contando los minutos y
sacar del baño cada tubo
inmediatamente después
que haya aparecido el
precipitado rojo ladrillo
de Cu2O. Anotar el
tiempo que corresponda a
cada carbohidrato. La
aparición de un
precipitado rojo, antes de
los 6 min indica la
presencia de un
monosacárido. La
aparición de un escaso
precipitado rojo, entre 9 y
12 min indica la presencia
de Lactosa o Maltosa.
(Carao, 2004).