Rev. Téc. Ing. Univ. Zulia. Vol.

31, Edición Especial, 107 - 113, 2008

Continue production of single cell protein

of Kluyveromyces marxianus var. marxianus
from diluited cheese whey
Glorymar Buitrago, Laura Soto, Gisela Páez, Karelen Araujo,
Zulay Mármol y Marisela Rincón
Escuela de Ingeniería Química, Laboratorios de Tecnología de Alimentos
y Fermentaciones Industriales, Facultad de Ingeniería, Universidad del Zulia, Apartado 526.
Maracaibo 4001-A, Venezuela.
Telf: 0261-7598746, Fax: 0261-7598800. gpaezr@gmail.com

Abstract
The continuous culture of the nutritious yeast Kluyveromyces marxianus var. marxianus ATCC
8554 was studied on deproteinized and supplemented whey as a function of the dilution rate (D), at pH 5,0
and temperature 30°C. A Bioreactor Bioflo 4000 was used, with a work volume of 3 liters. The dilution rate
was changed between 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 y 0,30 h–1. Whey was characterized, assessing its contents of
nitrogen, lactose, phosphorus, protein, dampness, ash, and pH. Analyses were made in triplicate at lac-
tose concentration of 2,0 ± 0,42%. The maximum specific growth rate (µmáx = 0,44 h–1), saturation con-
stant (KS = 8,55 kg/m3h), maintenance coefficient (m = 0,25 kg lactose/ kg biomass h) and the growth yield
(YC = 0,50 kg biomass/ kg lactose) were determined from continuous culture, Monod model was used. The
maximum production of biomass in continuous culture was 4,0 kg/ m 3 at a dilution rate of 0,15 h–1 and
the maximum productivity was 0,79 kg/ m3 h at a dilution rate of 0,20 h–1. Results from this study proved
that can be obtained biomass of K. marxianus var. marxianus to low concentrations of substrate, which
contribuyes the possibility of establishing a process of the single cell protein and subsequent assessments
as protein concentrates.
Key words: Whey, Kluyveromyces marxianus, continuous culture, dilution rate, productivity.

Producción continua de proteína unicelular

de Kluyveromyces marxianus var. marxianus a partir
de lactosuero diluido
Resumen
Se estudió la producción en cultivo continuo de Kluyveromyces marxianus var. marxianus ATCC
8554 en lactosuero desproteinizado y suplementado en función de la tasa de dilución (D), a pH 5,0 y tem-
peratura de 30°C. Se empleó un Bioreactor marca New Brunswick Scientific modelo Bioflo 4000 con un
volumen de trabajo de 3 litros. Las tasas de dilución fueron 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 y 0,30 h–1. El lactosuero
se caracterizó en términos de nitrógeno, lactosa, fósforo, proteínas, humedad, cenizas y pH. Los análisis
se realizaron por triplicado a una concentración de lactosa de 2,00 ± 0,42%. En el cultivo continuo, se de-
terminaron valores de la tasa específica de crecimiento máximo (µmáx = 0,44 h–1) según el modelo de Mo-
nod, constante específica de consumo de sustrato (KS = 8,55 m3/ kg x h), coeficiente de mantenimiento m
= 0,25 kg lactosa/ kg biomasa x h) y rendimiento real (YC = 0,50 kg biomasa/ kg lactosa). La máxima pro-
ducción de biomasa (4,0 kg/ m3) se obtuvo a una tasa de dilución de 0,15 h–1 y la máxima productividad
(0,79 kg/ m3h) a una tasa de 0,20 h–1. Los resultados demostraron que puede obtenerse biomasa de la K.

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108 Buitrago y col.

marxianus var. marxianus a bajas concentraciones de sustrato, lo que genera la posibilidad de establecer
la producción continua de proteína unicelular como concentrado proteico.
Palabras clave: Suero de leche, Kluyveromyces marxianus, cultivo continuo, tasa de dilución,
productividad.

Introducción [8], indican que se obtiene una mayor producción

microbiana a bajas concentraciones de este azú-
La producción de aislados proteicos de mi- car. De allí el objetivo de esta investigación de
croorganismos tiene como propósito la obtención evaluar la producción de proteína unicelular de
de proteínas de alto valor nutricional con propie- K. marxianus var. marxianus a partir de lactosue-
dades funcionales específicas para sustituir par- ro diluido en cultivo continuo.
cialmente las proteínas de cereales, soya, leche,
huevos y de otras fuentes en la elaboración de he-
lados, quesos, mayonesas, productos de panade- Parte Experimental
ría, entre otros [2], con la finalidad de combatir la
desnutrición que actualmente representa uno de Microorganismo
los problemas más graves a nivel mundial, debi- Se utilizó la levadura Kluyveromyces mar-
do a que fuentes convencionales provenientes de xianus var. marxianus ATCC 8554. Esta fue obte-
áreas como la agricultura, ganadería y pesca, no nida de la American Type Culture Colection
satisfacen completamente los requerimientos (ATCC), activada y mantenida en tubos de cultivo
proteicos de la población [1]. de 25 x150 mm, sobre YM Bacto Agar en forma de
En la producción de proteína unicelular cuña.
para consumo humano y animal, se utilizan mi-
croorganismos como: Saccharomyces cerevisiae, Medio de cultivo
Candida utilis, Fusarium graminearum y Kluyve-
Se utilizó suero de leche ácido desnatado,
romyces marxianus. Este último, es un microor-
proveniente de la producción de queso requesón,
ganismo que fermenta rápidamente la lactosa,
suministrado por la industria láctea PACOMELA
azúcar que constituye la parte esencial del ex-
ubicada vía Palito Blanco, Maracaibo, Estado Zu-
tracto seco de los sueros [3], en una concentra-
lia.
ción de 4 a 5% p/v [4].
Para la preparación del medio de cultivo se
El suero de leche es de alto valor nutritivo,
siguieron las siguientes etapas:
contiene además de lactosa, proteínas, elemen-
tos minerales, grasa, ácido láctico y agua. Estos 1. Tratamiento Termoácido: Etapa principal
componentes, hacen del lactosuero una materia para precipitar toda la proteína contenida
prima para la obtención de productos con diver- en el medio de cultivo. Para ello se calentó el
sas aplicaciones en biotecnología [5] y [6], desta- suero de leche hasta 90°C ajustando pH a
cándose su uso como medio de cultivo para ob- 4.5 utilizando HCl (concentrado) por 15 mi-
tención de proteína unicelular [2]. Al utilizar el nutos aproximadamente para después de-
lactosuero como sustrato se evita su vertimiento jar enfriar hasta una temperatura de 40°C y
en cuerpos de agua, disminuyendo el potencial someterlo al proceso de prefiltrado, para
contaminante del mismo, ya que este es conside- garantizar una desproteinización eficiente.
rado como el contaminante más abundante de la 2. Prefiltrado: Se utilizó tierra de diatomea
industria láctea [2]. (compuesto de sílice rosa calcinado) como
La proteína unicelular puede obtenerse a medio filtrante para separar los grumos de
partir de un bioproceso continuo, en el que se caseína que precipitaron luego del trata-
cultivan células en un sistema abierto hasta al- miento termoácido. Este período tuvo una
canzar el estado estacionario, lográndose una duración de 5 horas aproximadamente.
mayor productividad que en el bioproceso por 3. Dilución: Se procedió a diluir el suero de le-
carga [7]. Estudios realizados en cultivos por car- che con agua destilada, a una proporción
ga con diferentes concentraciones de lactosa [5] y de 1:1,2. Se utilizó un Refractómetro

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Producción continua de proteína unicelular de K. marxianus 109

Bausch & Lomb para determinar el porcen- Proceso de fermentación

taje de sólidos solubles, luego se midió y se
Preparación del inóculo. Se preparó aña-
ajustó la concentración de lactosa con el
diendo a cada 100 ml de medio la suspensión de
método de Dubois y Col [11], al 2,00%. Una
células obtenidas de una cuña de mantenimien-
vez obtenida la concentración deseada de
to. Posteriormente el inóculo se incubó a 30°C y
éste azúcar se filtró empleando papel de fil-
200 r.p.m. durante 7 horas en una incubadora
tro Whatman Nº 1 con embudo de porcela-
New Brunswick Scientific INNOVA 4300, para ga-
na y Tierra de Diatomea.
rantizar la fase logarítmica del crecimiento.
4. Suplementación: El suero de leche se su-
Bioprocesos. Se realizó un cultivo por car-
plementó con extracto de levadura al 0,75%
ga a una temperatura de 30°C, 200 r.p.m., y pH
p/v (Merck), sulfato de magnesio 0,05%
de 5,00, por triplicado durante 14 horas. La ma-
(Fisher) y sulfato de amonio (Merck y Bian
yor concentración de biomasa se obtuvo a las 7
Chemical) al 0,84% p/v. Todos los reactivos
horas considerándose éste como el tiempo de
químicos utilizados como suplemento fue-
preparación del inóculo. El tamaño del inóculo se
ron de grado analítico. El pH se ajustó a 5,0,
determinó con la cámara de Neubauer (New York,
con HCl 6 N y NaOH al 10%.
11101) y con el método estándar de dilución en
5. Esterilización: Se utilizó un autoclave Feli- placa [12]. El cultivo continuo se realizó por tri-
sa FE-339 a 115°C y 24,6 psi durante 20 plicado a tasas de dilución 0,10; 0,15; 0,20; 0,25
minutos. y 0,30, iniciándose como un cultivo por carga en
un fermentador New Brunswick Scientific, mo-
Métodos de análisis delo Bioflo 4000 (New Jersey, USA). La tempera-
Nitrógeno. El contenido de nitrógeno se de- tura y la agitación se mantuvieron constantes y el
terminó por el método de Kjeldahl [9]. pH se controló automáticamente con soluciones
de HCl 6 N y NaOH al 10%. Se utilizó un volumen
Proteínas. Se determinó como el porcenta-
de trabajo de 3 litros con un inóculo del 10%. En
je de nitrógeno multiplicado por el factor 6.25
la etapa inicial del bioproceso se realizaron medi-
para el caso de la levadura y por 6.38 para el caso
ciones analíticas horarias durante 7 horas. En el
del suero de leche [9].
cultivo continuo, se evaluaron durante hora y
Lactosa. Se determinó utilizando el método media antes y después de alcanzar el estado esta-
espectrocolorimétrico de Dubois y col. [10], a una cionario (todos los parámetros antes menciona-
longitud de onda de 490 nm. dos), en intervalos de media hora.
Humedad. Se determinó siguiendo el méto-
do 16.192 de la A.O.A.C. [9]. Resultados y Discusión
Fósforo. Se determinó mediante el método La caracterización del suero de leche fresco,
espectrocolorimétrico del molibdovanadato de desproteinizado y diluido se muestra en la Ta-
amonio 16.115 de la A.O.A.C. [9], a una longitud bla 1. Los valores de pH obtenidos (5,43 ± 0,09)
de onda a 440 nm. indican que se utilizó un suero ácido [13].
Cenizas. Se determinó las cenizas por el La concentración de lactosa, 5,00%, así
método 16.196 de la A.O.A.C. [9]. como la concentración de cenizas (2,3 ± 0,1%) y
Biomasa. Se determinó por medio de la algunas trazas de sales se corresponden con los
densidad óptica obtenida a través del espectrofo- valores característicos reportados por Gonzaléz
tómetro Cary 50 a una longitud de onda de 650 [14] para este tipo de suero. El contenido de pro-
nm. Se relacionó la densidad óptica con el peso teínas del suero fresco disminuyó un 38% al des-
de biomasa por unidad de volumen a través de proteinizarlo, indicando la eficiencia del proceso
una curva de calibración (LDD: 0,51) construida de desproteinización empleada.
previamente [5]; adicionalmente se calculó la ve- En la Figura 1 se muestra la cinética de cre-
locidad específica de crecimiento (µ), el rendi- cimiento de la levadura Kluyveromyces marxia-
miento (Y) y la constante de saturación de sustra- nus var. marxianus y el consumo de sustrato pro-
to (Ks) para las condiciones establecidas [11]. medio a 30°C, pH 5,0 y 200 rpm. La concentra-

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110 Buitrago y col.

Tabla 1
Caracterización promedio del suero de leche

Parámetros Suero Fresco Suero Desproteinizado Suero Diluido

Lactosa (%) 5,62 ± 0,09 5,69 ± 0,85 2,07 ± 0,42
Nitrógeno (%) 0,08 ± 0,03 0,05 ± 0,01 0,02 ± 0,01
Proteínas (%) 0,54 ± 0,02 0,332 ± 0,00 0,11 ± 0,00
pH 5,43 ± 0,10 4,500 ± 0,01 4,50 ± 0,01
Fósf oro (%) 0,004 ± 0,001 0,005 ± 0,002 0,006 ± 0,0010
Cenizas (%) 2,31 ± 0,10 2,610 ± 0,11 2,59 ± 0,12
Humedad (%) 92,12 ± 0,10 92,26 ± 0,10 97,51 ± 0,02

8 25

20
6

Lactosa (kg/m 3)
15
Biomasa (kg/m 3)

10
3

2
5

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tiempo (h)
Biomasa lactosa

Figura 1. Cinética del crecimiento y consumo de sustrato utilizando suero diluido a pH 5,00 a
temperatura de 30°C y 200 r.p.m. en la etapa inicial del cultivo continuo.

ción de biomasa y de sustrato corresponden a los la máxima velocidad específica de crecimiento

valores promedios obtenidos durante las prime- (0,31 ± 1,27), mientras que el rendimiento en bio-
ras 7 horas, etapa inicial del cultivo continuo, a masa fue mayor (0,50). Este comportamiento po-
las diferentes tasas de dilución empleadas. El dría explicarse a las diferencias en las condicio-
crecimiento del microorganismo estuvo caracte- nes de operación del cultivo y del tipo de microor-
rizado por una fase exponencial de 6 horas, obte- ganismo utilizados.
niéndose la máxima concentración de biomasa El valor promedio de la velocidad específica
en la hora 7, (7,26 ± 0,34) con un rendimiento de de crecimiento obtenido sirvió para establecer las
0,50 ± 0,001. tasas de dilución (D) empleadas en el cultivo con-
Los parámetros de crecimiento: Xmáx, µmáx, tinuo (0,10; 0,15; 0,20; 0,25 y 0,30 h–1).
Yx/s,% de lactosa consumida, se muestran en la El efecto de la tasa de dilución sobre la con-
Tabla 2 y se comparan con los resultados repor- centración de biomasa, concentración de lactosa
tados por Chinappi y Sánchez [5], Cori y col. [8] y y productividad en el estado estacionario se
Sánchez y Castillo [15]. El porcentaje de lactosa muestra en la Figura 2. La concentración de bio-
consumida (80,75 ± 0,100) fue menor, así como masa disminuyó a medida que aumentó la tasa

Rev. Téc. Ing. Univ. Zulia. Vol. 31, Edición Especial, 2008
Producción continua de proteína unicelular de K. marxianus 111

Tabla 2
Parámetros determinados en la etapa inicial al cultivo continuo

Parámetros Este estudio Chinappi y Sánchez y Cori y col.

Sánchez (2000) Castillo (1986) (2006)
% de lactosa inicial 2,07 ± 0,42 1,50 2,00 1,50
X (kg/m3) 7,26 ± 0,34 6,50 5,03 4,65
% de lactosa consumida 80,75 ± 0,10 97 87 93,21
–1
µmáx (h ) 0,31 ± 1,27 0,42 - 0,42
Yx/s (kg biomasa/kg lactosa) 0,50 ± 0,001 0,44 0,40 0,33

0,9
20
0,8
18
Biomasa (kg/m3), Lactosa(kg/m3)

Productividad (kg/m3h)
16 0,7

14 0,6

12 0,5
10
0,4
8
0,3
6
0,2
4

2 0,1

0 0
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

D (h -1 )

Biomasa exp (kg/m3) Lactosa exp Biomasa Cal

Lactosa Cal Productividad exp Productividad Cal

Figura 2. Efecto de la tasa de dilución en la producción de biomasa de Kluyveromyces marxianus var.

marxianus ATCC 8554, productividad y consumo de sustrato en suero diluido a temperatura de 30°C,
200 r.p.m. y pH 5,0.

de dilución, manteniéndose constante entre 0,10 culados a partir de la Figura 3, es importante

h–1 y 0,20 h–1, a partir de esta última el cultivo en mencionar que dichos parámetros dependen del
el bioreactor se encontró en condiciones de lava- microorganismo y medio de cultivo por lo que su
do. El comportamiento del microorganismo se evaluación debe realizarse en cada caso en parti-
ajustó al modelo de Monod, así mismo se calcula- cular.
ron valores de µmáx y Ks.
La máxima concentración de biomasa (4,00 Conclusiones
kg/m3) se obtuvo a una tasa de dilución de 0,15
h–1 y la máxima productividad (0,79 kg/m3h) se A baja concentración de lactosa (2%) y a
alcanzó a las 0,20 h–1, por lo cual esta última se una tasa de dilución de 0,15 h–1, se obtuvo la ma-
consideró la tasa de dilución óptima. En la Ta- yor producción de biomasa (4,00 kg/m3), mien-
bla 3 se presentan valores tanto experimentales tras que la mayor productividad (0,79 kg/m3h) se
como calculados según el modelo de Monod. El alcanzó a 0,20 h–1, por lo que se define como tasa
coeficiente de mantenimiento (0,25 kg lactosa/ de dilución óptima. La velocidad específica de
kg biomasa h) y rendimiento celular real (0,50 kg crecimiento, µmáx fue de 0,44 h–1 con rendimiento
biomasa/ kg de lactosa consumida), fueron cal- real, (Yx/s)C de 0,50 kg biomasa/kg de lactosa uti-
lizada y un coeficiente de mantenimiento celular,

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112 Buitrago y col.

Tabla 3
Parámetros cinéticos del cultivo continuo

Parámetros Suero Diluido

Experimental Calculados
–1
µmáx (h ) - 0,44
–1
Dcrítico (h ) - 0,31
–1
Dóptimo (h ) 0,20 0,20
3
Ks (kg/m ) - 8,55
3
Productividad (kg/m h) 0,79 0,80
3
X máx (kg/m ) 4,00 4,00
ms (kg lactosa/kgbiomasa.h) - 0,25
(Yx/s)C (kg biomasa/ kg lactosa consumida) - 0,50

4
1/Yt

1/D= 0,2481*1/Yt + 2,0124

1 R 2 = 0,935

0
0 2 4 6 8 10 12 14
1/D

Figura 3. Cálculo del coeficiente de rendimiento y mantenimiento celular.

ms igual a 0,25 kg lactosa/ kg biomasa x h. El la- proteína unicelular para su uso como concentra-
vado del cultivo del bioreactor se produjo a una do proteico.
tasa mayor de 0,20 h–1, mientras que el creci-
miento microbiano durante las tasas de dilución Agradecimiento
entre 0,10 y 0,20 h–1 se mantuvo estable.
Se obtuvo una máxima producción micro- Los autores agradecen al Consejo de Desa-
biana de 7,26 kg/m3, el tiempo de inoculación rrollo Científico y Humanístico (CONDES) por el
fue de 7 horas a partir del cual comenzó el cultivo financiamiento a esta investigación y al personal
continuo, con un consumo de sustrato de de los Laboratorios de Tecnología de Alimentos y
80,75%. Fermentaciones Industriales.

Los resultados demuestran que se puede

obtener biomasa de K. marxianus var. marxianus
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