Guion Microbiologia Medica I

Republica Bolivariana de Venezuela
Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”

Decanato de Ciencias de la Salud
Programa de Medicina
Departamento de Medicina Preventiva y Social
Sección de Microbiología
Lapso Académico 2019-1
GUIONES PRÁCTICOS
MICROBIOLOGÍA
MEDICA I
V SEMESTRE DE
MEDICINA
Coordinación:
Lcdo. Emilio Martínez
PRESENTACION
El presente compendio está elaborado con la finalidad de proporcionar el material

práctico y ordenado y de fácil acceso para ser aplicado en estudiantes del quinto semestre
de medicina de la UCLA, capacitándolos en la teoría y en la práctica de la asignatura
Microbiología Medica I, mediante el desarrollo de clases magistrales y prácticas de
laboratorio, adquiriendo las competencias necesarias para su optimo desarrollo en el área
de formación profesional.
El compendio se realizó mediante la recopilación y comisión de cuatro prácticas que

se imparten en la asignatura, cada una de ellas se inicia con el titulo, las normas y objetivos
que se persiguen además de un cuestionario de autoevaluación elaborado en el aspecto
introductorio y el resultado experimentales de cada práctica.
GUÍA PRÁCTICA Nº1

MORFOLOGÍA
BACTERIANA
UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO”
DECANATO CIENCIAS DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA Y SOCIAL
SECCIÓN DE MICROBIOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA MÉDICA I
CÓDIGO: VB
GUIA DE PRACTICA Nº.1
MORFOLOGIA BACTERIANA
NORMAS INTERNAS DE CONDUCTA EN LAS PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA

MÉDICA.
1. Está prohibido fumar y comer en laboratorio, ambientes y servicios hospitalarios.

2. Use una bata larga siempre que ingrese al laboratorio o a un servicio en áreas hospitalarias.
3. No permita que ningún implemento de laboratorio toque su cara o la boca.
4. Si usted, ingiere por cualquier circunstancia material infeccioso, notifíquelo de inmediato al
profesor.
5. En caso de derramarse un cultivo o quebrarse un recipiente con cultivo, notifique al
profesor inmediatamente.
6. No se movilice de un lugar a otro cuando esté trabajando.
7. Los papeles, algodones, fósforos y otros objetos similares se descartan en el pipote de la
basura, nunca en el suelo ó en otros sitios no destinados para ellos.
8. Al terminar el periodo de la práctica, limpie su área de trabajo y deje los materiales
utilizados ordenadamente. Del mismo modo, coloque los bancos o taburetes en el lugar
donde estaban al comienzo de la práctica.
9. Antes de salir del laboratorio lávese las manos con agua y jabón y siempre que lo requiera
la manipulación del material biológico y/o manejo de pacientes.
10. Los bolsos y objetos personales debe mantenerse fuera del área de trabajo.
11. Los dispositivos electrónicos deberán permanecer apagados y guardados.
12. Cada grupo aportará por cada práctica un (1) paquete o rollo de papel absorbente (toallin).
NORMAS DE TRABAJO Y DISCIPLINA EN EL LABORATORIO

1. El estudiante revisará la clase teórica, la guía y la bibliografía recomendada antes de la
práctica.
2. El estudiante traerá su guía de trabajos prácticos al laboratorio nueva y lápiz bicolor (azul-
rojo).
3. La hora de entradas a las prácticas será señalada en el horario respectivo y no se permitirá el
ingreso después de la hora señalada.
4. Una vez comenzadas las prácticas los estudiantes no podrán salir del laboratorio.
5. Las prácticas no son recuperables.
6. No está permitido cambiarse de grupo.
7. El comportamiento debe ser respetuoso, hablar en tono bajo.
8. No será permitida la entrada de personas ajenas al grupo.
9. Las situaciones de orden de funcionamiento será resuelta solamente por el jefe de la
Sección de Microbiología.
AUTOEVALUACIÓN
1) ¿Cuáles son los objetivos del microscopio de luz que se utilizan con más frecuencia en
Microbiología?
2) ¿Cuál es la solución de elección que se utiliza en la interface entre el objetivo de 100X y el
extendido?
3) En un examen al fresco ¿Cómo se diferencia el movimiento Browniano de la movilidad
bacteriana?
4) ¿Cuál es la utilidad del examen al fresco?
5) ¿Cómo debe realizarse el extendido de una preparación?
6) ¿Qué diferencia hay en el procedimiento para hacer un extendido a partir de material
líquido y de material sólido?
7) ¿Qué condición debe tener el extendido para fijarse?
8) ¿Cuál es la finalidad de fijar el extendido?
9) ¿Cuáles son los fijadores de uso más corriente en Microbiología?
10) Describa la técnica para fijar por calor.
11) Describa la técnica para fijar por agentes químicos.
12) ¿Por qué las bacterias se colorean mejor con los colorantes básicos (acidófilos)?
13) Describa los pasos para realizar la coloración de Gram.
14) ¿Cuál es la función de un mordiente?
15) ¿Qué función realiza el alcohol acetona en la coloración de Gram?
16) ¿Cómo se comportan las bacterias frente a la coloración de Gram?
17) En la coloración de Gram ¿a qué se debe la Gram positividad de las bacterias?
18) Explique por qué las bacterias Gram negativas se tiñen de rojo.
19) ¿Qué importancia tiene en Medicina la coloración de Gram?
20) Señale las morfologías bacterianas básicas y su disposición.
OBJETIVO GENERAL:
Al finalizar la actividad teórica-práctica el estudiante estará en capacidad de aplicar los

procedimientos que se utilizan para el estudio de la morfología bacteriana.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1) Realizar un examen al fresco entre lámina y laminilla.

2) Realizar extendidos a partir de un cultivo bacteriano en medio sólido y líquido.
3) Diferenciar los métodos de fijación de extendidos.
4) Realizar la coloración de azul de metileno a un extendido previamente fijado.
5) Realizar la coloración de Giemsa a un extendido previamente fijado.
6) Aplicar la coloración de Gram a un extendido previamente fijado.
7) El estudiante deberá diferenciar las bacterias según morfología, disposición y clasificarlas
según la coloración de Gram.
8) Explicar la importancia de la coloración de Gram en Microbiología.
REQUISITO PARA REALIZAR LA ACTIVIDAD TEORICA-PRÁCTICA:
 Antes de asistir a la actividad, el estudiante tiene la responsabilidad del manejo de

microscopio de luz.
 El estudiante revisara la bibliografía correspondiente al tema.
 Debe asistir con bata al laboratorio, guía practica nueva, lápiz bicolor.
ACTIVIDADES DEL DOCENTE:
Exposición demostrativa de:
1) Manejo de instrumental usado en el laboratorio de Microbiología: asa y aguja bacteriológica,

cultivos bacterianos en medio líquido y sólido.
2) Preparación del examen al fresco entre lámina y laminilla para la observación microscópica.
Explicar su importancia.
3) Preparación de extendidos a partir de cultivos bacterianos en medios líquidos y sólidos para
ser teñidos.
4) Explicación de las técnicas de fijación y realización de las mismas.
5) Explicar y realizar la técnica de coloración de azul de metileno.
6) Explicar y realizar la técnica de coloración de Giemsa.
7) Explicar y realizar la técnica de coloración de Gram.
ACTIVIDADES QUE REALIZA EL ESTUDIANTE
Al finalizar la exposición demostrativa del docente, el alumno realizara:
1) Observación microscópica del examen en fresco entre lámina y laminilla con objetivo 40x.
2) Elaboración de extendidos.
3) Fijación de extendidos.
4) Aplicación de las coloraciones: azul de metileno, Giemsa y Gram a los extendidos
elaborados.
5) Observación microscópica, dibujar e interpretar lo observado.
6) Observación microscópica del examen al fresco con microscopio de campo oscuro.
EVALUACIÓN
Prueba escrita teórica-practica de selección y de respuestas cortas.
CONSIDERACIÓN TEORICAS
Pasos para el diagnóstico Microbiológico:
1. Toma de Muestra.
2. Examen Directo.
3. Cultivo.
4. Pruebas Bioquímicas.
EXAMEN DIRECTO:
En el diagnóstico Microbiológico, el primer paso a realizar es la toma de muestra clínica y el

segundo paso es la observación microscópica. Esta permite identificar la morfología, disposición,
movilidad, presencia de cápsula, esporas, gránulos metacromáticos y flagelos (coloraciones
especiales).
Existen dos métodos mediante la cual los microorganismos presentes en muestras clínicas
pueden ser observados en el microscopio:
 Examen microscópico en fresco.

 Examen previa coloración.
Examen microscópico al fresco
Este método permite la observación de las bacterias vivas y estudiar principalmente su

movilidad. La visualización se logra al existir una diferencia del índice de refracción entre las
bacterias y en el medio en que están suspendidas. No debemos confundir los movimientos de
locomoción debido a la presencia de flagelos, con los movimientos brownianos que presentan las
partículas sólidas, menores de 3 micras, suspendidas en un liquido. Además, permite observar la
morfología, tipos de células, cantidad de la misma, predominio de algún tipo celular. Puede
realizarse según las siguientes técnicas.
 Examen al fresco entre lámina y laminilla.

 Examen al fresco con microscopio de campo oscuro. Es de gran utilidad en el estudio de
espiroquetas y bacilos curvos, las bacterias que no se tiñen con Gram, el fondo oscuro
permite visualizar bacterias espiraladas como Treponemas, Leptospiras, Borrelias y
Campylobacter. Un método equivalente, con iguales indicaciones y resultados es el
microscopio de contraste de fases, usando oculares, objetivos y condensadores de fase.
Permite visualizar microorganismos y su movilidad.
Técnica del examen en fresco entre lámina y laminilla
1. Utilizando el asa bacteriológica, previamente esterilizada en la llama de mechero,

coloque dos gotas de la mezcla de bacterias en cultivo líquido sobre una lámina
porta-objeto.
2. Coloque una laminilla o cubre-objeto, procurando no tocar con los dedos en el
material.
3. Enfoque la preparación con objeto 40x, inicie el enfoque con objeto 10x, luego
observe con 40x. Baje el condensador y cierre el diagrama hasta lograr
luminosidad apropiada que permita observar las bacterias.
DESCRIBA LO OBSERVADO
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Examen microscópico de preparaciones teñidas con colorantes
Las células bacterianas son observadas nítidamente cuando son teñidas. La coloración
permite además de observar morfología, tamaño, disposición, presencia de cápsula, flagelos y
gránulos metacromáticos, esto se debe a las reacciones bioquímicas de las bacterias a los diferentes
colorantes.
En microbiología los colorantes mas frecuentemente usados son los colorantes básicos
(acidófilos). Ejemplo: azul de metileno, cristal violeta de genciana, fucsina básica. Mientras que los
colorantes ácidos (basófilos) son utilizados generalmente como colorante de contraste. Ejemplo:
eosina, safranina.
Todos estos colorantes pueden ser favorecidos en su poder de penetración y fijación a la
bacteria mediante sustancias conocidas como mordientes. Estos aumentan el poder de fijación del
colorante a los elementos morfológico. Los mordientes más utilizados son: solución yodo o
yodurada de lugol, acido fénico.
a. Preparación del frotis o extendido:

1. Medios líquidos.
2. Medios sólidos.
En el primer paso a realizar cuando se va a aplicar cualquier técnica de coloración.

Utilizando láminas portaobjetos previamente desgrasadas y secas se extiende el material o
muestra problema, en el centro de portaobjetos valiéndose del asa bacteriológica o aguja
bacteriológica, cuidando que el material no se extienda hasta los bordes y extremos de la
lámina. De acuerdo a la consistencia será necesario o no su dilución con una gota de
solución salina fisiológica. Debe dejar de secar la preparación de temperatura ambiente
para proceder a la fijación. Un buen extendido debe ser delgado y homogéneamente
distribuido.
b. Fijación:
Una vez que el extendido este seco a temperatura ambiente se procede a la fijación, que tiene
por finalidad hacer que las bacterias se adhieran al vidrio manteniendo su morfología. Coagula la
albúmina de la célula bacteriana y se puede realizar por algunos de los siguientes métodos:
 Físico: mediante el calor, pasando dos a tres veces la lámina por la llama de mechero en la
zona calórica (cortando la llama) y controlando el calor con la piel del dorso de la mano.
No se debe calentar el frotis encima de la llama porque ocurre distorsión de la morfología
bacteriana, debido a las altas temperaturas. Una vez fijada se procede a la coloración; este
tipo de fijación es el más empleado, se utiliza en las coloraciones de Gram, Ziehl-Neelsen,
Simple.
 Químico: mediante el empleo de alcoholes (etílico o metílico). Se cubre el frotis o extendido
de material patológico con el alcohol (metílico de preferencia) y se deja actuar por unos
tres minutos. Escurrir y dejar secar a temperatura ambiente, para luego proceder a la
coloración. Este tipo de fijación es empleado en la coloración de Giemsa, que se utiliza
para ver la morfología de algunas espiroquetas.
NOTAS: 1. El alcohol metílico o metano es toxico, evite el contacto con la piel.
2. Para el transporte de un extendido se requiere que previamente haya sido fijado.
ACTIVIDADES PRÁCTICAS:
Observación de los extendidos teñidos.
METODOS DE COLORACIÓN
COLORACIONES SIMPLES:
1) 1. COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO:

En este tipo de coloración se emplea un único colorante y solo permite determinar la
presencia de la bacteria y su morfología. El azul de metileno es un colorante básico.
Técnica:
 Identifique el extendido ya realizado y fijado.
 Vierta sobre el extendido el colorante azul de metileno. Deje actuar durante un minuto.
 Descarte el colorante y lave suavemente la lámina con agua de chorro.
 Deje secar la lámina en posición inclinada.
 Observe el microscopio con objetivo de inmersión (100x) y usando aceite de inmersión
sobre la preparación.
1)
 2. COLORACIÓN DE GIEMSA:
 Es una técnica de tinción que se utiliza para la observación de morfologías bacterianas que
son difícil de ver con la coloración de Gram contiene eosina y azul de metileno, estos colorantes se
encuentran en estado no ionizado mientras se mantienen en solución de alcohol metílico pero al
añadir agua se ioniza y se une selectivamente a los constituyentes celulares.
 Técnica:
 *Fije la lámina con alcohol metílico por 3 minutos.
 *Realice una dilución de 1/10 del colorante de Giemsa
 *Agregue por 10 minutos el colorante a la lámina fijada con alcohol metílico.
 * Lavar, secar a temperatura ambiente.
COLORACIONES COMPUESTAS
Coloración de GRAM:
Es una coloración compuesta (actúa mas de un colorante) y diferencial que permite la

identificación y clasificación de las bacterias en GRAM positivas y GRAM negativas. Se
fundamenta en la composición de la pared celular bacteriana que esta constituida en las GRAM
positivas por un mucopeptido o peptidoglicano que ocupa alrededor del 80% de la envoltura celular
y constituye una especie de barrera para la extracción del complejo cristal violeta-yodo por el
solvente orgánico (alcohol-acetona). En las bacterias GRAM negativas la capa de peptidoglicano es
menor y el contenido de lípidos es mayor, debido a la presencia de la membrana externa, el
descolorante (alcohol-acetona) remueve dicho lípidos y aumente el tamaño de los poros de la pared,
incrementando su permeabilidad y arrastrando el colorante primario. De tal manera que al colocar
el colorante safranina (rojo) la célula se tiñe con este último.
Esta coloración tiene gran utilidad en Microbiología, permite seleccionar el medio de

cultivo apropiado según sean Gram positivo o Gram negativo y pueda orientar al medico en la
selección primaria de antibióticos.
Técnica: Coloración de Gram
Primer Paso: Cubra la preparación ya fijada con la solución violeta de genciana por un
minuto. Lave con agua corriente.
Segundo Paso: Cubra con la solución de lugol y déjelo actuar por un minuto.
En este paso el lugol actúa como mordiente. Formación del complejo
violeta-yodo. Lave con agua corriente.
Tercer Paso: haga la decoración con alcohol-acetona, vertiéndolo con un gotero durante
unos pocos segundos hasta que deje de desprender el colorante. Esta es la
fase critica de la coloración y debe realizarse teniendo cuidado de no
excederse. Lave inmediatamente con agua de chorro.
Cuarto Paso: Cubra la preparación con safranina (colorante rojo) durante un minuto.
Este paso tiene por objeto teñir las bacterias descoloradas por el alcohol-
acetona. Lave con agua y deje secar. Observe con objetivo 100x colocando aceite
de inmersión.
De acuerdo a la coloración de GRAM, designamos como:
GRAM POSITIVA: Bacterias que retienen el colorante primario (violeta de genciana) a lo largo de
todo el proceso. Se tiñen de color azul-violeta.
GRAM NEGATIVO: Las que se decoloran con alcohol-acetona.

Se tiñen de color rojo-rosado, evidenciándose el colorante de contraste
(safranina)
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
Haga un extendido con el cultivo que se le proporciona y aplique la coloración indicada de

cada uno de los cultivos entregados. Anote los resultados de su observación.

1. Staphylococcus spp. (cultivo sólido)
Coloración de Gram
2)
3)
Describa la morfología y comportamiento ante el GRAM:
2. Streptococcus spp. (cultivo líquido)
Coloración de Gram
Describa morfología y comportamiento ante coloración de GRAM:
3. Escherichia spp. (cultivo líquido)
Coloración de GRAM
4. Mezcla de bacterias. (cultivo líquido)
Coloración Azul de Metileno Coloración Gram
Observe la diferencia entre ambas coloraciones:
5. Diplococo tipo Neisseria. (observación de láminas coloreadas)
Coloración de GRAM
Describa la morfología y comportamiento ante el Gram.
6. Diplococo tipo Neumococo. (observación de láminas coloreadas)
Coloración de GRAM
7. Borrelia spp.
Coloración Giemsa
Describa la Morfología:
8. Observación microscópica del examen al fresco de ESPIROQUETA (Lestospira spp)

con microscopio de campo oscuro.
Leptospira spp
Ejercicio: Indique con colores (Rojo o Azul) la reacción a cada uno de los diferentes reactivos de la
coloración de Gram, según corresponda a cada morfotipo bacteriano.
ESTAFILOCOCO BACILO GRAM DIPLOCOCO DIPLOCOCO

NEGATIVO TIPO NEISSERIA TIPO
NEUMOCOCO
PASO
II
PASO
III
PASO
IV
PASO
EJEMPLO:
GENERO:
ESPECIE:
BIBLIOGRAFIA:
 Microbiología, Murray. Edición 5ta. 2006.

 Microbiología Médica, Jawez. Edición 18. 2005.
 Microbiología Médica, Lange. 2010
 Microbiología Médica, Sherris. 2005


ESTERILIZACIÓN
DECANATO DE CIENCIAS DE LA SALUD
CÓDIGO: VB
GUIA DE PRÁCTICA No. 2
ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN
NORMAS INTERNAS DE CONDUCTA EN LAS PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA.
1. Está prohibido fumar y comer en laboratorio, ambientes y servicios hospitalarios.

2. Use una bata larga siempre que ingrese al laboratorio o a un servicio en áreas
hospitalarias.
3. No permita que ningún implemento de laboratorio toque su cara o la boca.
4. Si usted, ingiere por cualquier circunstancia material infeccioso, notifíquelo de inmediato
al profesor.
basura, nunca en el suelo ó en otros sitios no destinados para ellos.
8. Al terminar el periodo de la práctica, limpie su área de trabajo y deje los materiales
utilizados ordenadamente. Del mismo modo, coloque los bancos o taburetes en el lugar
donde estaban al comienzo de la práctica.
10. Los bolsos y objetos personales debe mantenerse fuera del área de trabajo.
11. Los dispositivos electrónicos deberán permanecer apagados y guardados.
12. Cada grupo aportará por cada práctica un (1) paquete o rollo de papel absorbente (toallin).
10.El estudiante revisará la clase teórica, la guía y la bibliografía recomendada antes de la

práctica.
11.El estudiante traerá su guía de trabajos prácticos al laboratorio nueva y lápiz bicolor (azul-
rojo).
12.La hora de entradas a las prácticas será señalada en el horario respectivo y no se permitirá
el ingreso después de la hora señalada.
13.Una vez comenzadas las prácticas los estudiantes no podrán salir del laboratorio.
14.Las prácticas no son recuperables.
15.No está permitido cambiarse de grupo.
16.El comportamiento debe ser respetuoso, hablar en tono bajo.
17.No será permitida la entrada de personas ajenas al grupo.
18.Las situaciones de orden de funcionamiento será resuelta solamente por el jefe de la
AUTOEVALUACIÓN.
1. Defina esterilización, desinfección, asepsia, antisepsia, microbicida, bactericida, fungicida,

viricida, septicemia, bacteriemia, faena limpia y faena sucia.
2. Describir la función del agua destilada en el lavado y preparación de materiales, equipo de
madera, vidrio y metálicos a ser guardados.
3. Explique el fundamento en el que se apoya el funcionamiento del autoclave, parámetros que
deben ajustarse, materiales que se pueden esterilizar en este equipo, ventajas y desventajas.
4. Explique el fundamento en el que se apoya el funcionamiento del horno de Pasteur
parámetros que deben ajustarse, materiales que se pueden esterilizar en este equipo, ventajas
y desventajas.
5. Diferencie los procesos de tindalización y pasteurización.
6. Diferencie los jabones de los detergentes.
7. Indique para qué se usa: a.- Alcohol al 70%, b.- Alcohol al 90% , c.- Alcohol-Yodado
8. Señale con ejemplos prácticos, tanto en el hogar, como en el área hospitalaria los usos más
frecuentes de agentes químicos y físicos en la desinfección.
9. ¿Cómo se deben esterilizar los equipos metálicos, de goma, termómetros, gasas, hisopos, baja
lenguas, sondas, equipos de endoscopio, cristalería.
10. Diferencie el mechero de Bunsen del mechero de Humboldt.
11. Explique el efecto sobre los microorganismos de las radiaciones.
12. Explique el efecto sobre los microorganismos de los agentes alquilantes.
13. Explique el efecto sobre los microorganismos de los agentes oxidantes.
14. Indique los tipos de envoltura utilizados durante el proceso de esterilización.
OBJETIVOS GENERALES:
Al finalizar la actividad teórico-práctica el estudiante estará en capacidad de:
1. Diferenciar los procedimientos de esterilización y desinfección que se pueden aplicar a

muestras biológicas y distintos materiales contaminados.
2. Conocer las medidas de prevención que impiden la propagación de agentes infecciosos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
El estudiante después de haber adquirido los conocimientos y destrezas podrá:
1. Aplicar correctamente el lavado de manos y el uso adecuado de la bata.

2. Aplicar correctamente los métodos de esterilización y desinfección de muestras patológicas,
equipos, instrumentos, ambientes y superficies contaminadas.
3. Identificar los factores que alteran el logro de esterilización o desinfección en el manejo de
aparatos, equipos, instrumentos, de acuerdo a los valores adecuados de uso de los mismos y
la naturaleza del material a esterilizar o desinfectar.
4. Implementar una conducta adecuada para lograr antisepsia y preservar la asepsia, aplicando
medidas correspondientes en el uso correcto de vestimenta, mascarillas, gorro, lavado de
manos y manipulación de material estéril o contaminado.
5. Del autoclave: Señalar sus componentes y partes, describir el fundamento, acción sobre los
microorganismos, operar su funcionamiento, materiales a esterilizar, cuidados, mantenimiento
y limitaciones.
6. Del horno de Pasteur: Señalar sus componentes y partes. Describir su fundamento, cuidados,
operar su mantenimiento, acción sobre los microorganismos, material a esterilizar y
limitaciones.
7. De la tindalización: Describir su fundamento, procedimiento, acción sobre los
microorganismos, su mantenimiento, material a esterilizar y limitaciones.
8. De las radiaciones: Describir radiaciones de uso más frecuentes en microbiología, riesgos,
acción sobre los microorganismos, limitaciones y cuidados.
9. De la filtración: Describir tipos de filtros, fundamento, procedimiento, material a esterilizar y
limitaciones.
10. De los agentes químicos: Describir usos, acción sobre los microorganismos, cuidados y
limitaciones del: óxido de etileno, cloro, yodo, flúor, mercurio, alcoholes, fenol, peróxido de
hidrógeno, formaldehído, jabones y detergentes.
ACTIVIDADES QUE REALIZA EL DOCENTE:
1. Discusión socializada de los conceptos de esterilización, desinfección, asepsia, antisepsia,

microbicida, bactericida, fungicida, virícida, septicemia, bacteriemia, faena limpia y faena
sucia.
2. Explicar los procedimientos de esterilización por medios físicos y desinfección por medios
químicos. Usos y limitaciones.
3. Explicar la forma correcta de utilizar los antisépticos y desinfectantes.
4. Demostración de los elementos que integran el autoclave y horno de Pasteur.
5. Describir los tipos de envolturas para la esterilización y la forma de realizarlas.
6. Demostrar la técnica de lavado de manos, materiales que deben disponerse para un buen
lavado de de manos.
ACTIVIDADES QUE REALIZA EL ESTUDIANTE:
1. Revisión previa de la bibliografía.

2. Discusión de los conceptos de esterilización, desinfección, asepsia, antisepsia, microbicida,
bactericida, fungicida, viricida, septicemia, bacteriemia, viremia, faena limpia y faena sucia.
3. Describir el uso adecuado de la bata.
4. Explicar los procedimientos para esterilización con calor húmedo y calor seco.
5. Explicar los procedimientos de esterilización por filtración y radiaciones.
6. Explicar la clasificación de los agentes químicos utilizados en la desinfección, composición,
acción sobre los microorganismos, usos, cuidados, limitaciones.
7. Describir los tipos de mecheros, diferencias, su uso correcto, ventajas y desventajas.
8. Describir los tipos de envoltura utilizados, la forma de realizarlas y requisitos a cumplir.
METODOS FISICOS
CALOR
1. CALOR SECO
1.1. MECHERO
El mechero es un instrumento utilizado con mucha frecuencia en la práctica de
Microbiología. El calor generado por la combustión de gas (propano y metano) en una
proporción con aire que entra por las ventanillas de 1 a 9 ó 1 a 10% v/v. Es aplicado en
forma directa sobre algunos instrumentos y objetos a fin de esterilizarlos a la llama
directa con lo cual se produce la incineración de los microorganismos. Se utiliza para
preservar la esterilidad mientras se manipulan tubos, cajas de Petri y otros materiales
durante la práctica Microbiológica.
El mechero simple o mechero de Bunsen, produce una llama donde se pueden observar
tres (3) zonas típicas, una zona fría, una zona calórica (750ºC) y una zona de oxidación;
en la zona calórica es donde se coloca el instrumento a esterilizar. El Mechero de
Humboldt posee una rejilla a través de la cual se producen pequeñas llamas que se unen
produciendo una gran zona calórica ( 1350ºC).
MECHERO DE BUNSEN MECHERO DE HUMBOLT
1.2. EL HORNO DE PASTEUR:

1.2.1 FUNDAMENTO:
Es una forma de aplicación del aire caliente para esterilizar algunos materiales y objetos
que no sean deteriorados por el calor; su aplicación está restringida a la cristalería y
otros materiales resistentes. Su principio está basado en las corrientes de convección que
se forman en el horno, al calentarse el aire por efectos del calor generado por las
resistencias eléctricas que se encuentran alrededor de las paredes internas del horno.
Su funcionamiento se basa en que al estar el aire en contacto con las resistencias, al
calentarse se hace más liviano, menos denso y además se expande, al ser menos denso
sube y este espacio dejado es ocupado nuevamente por aire de mayor densidad, que al
calentarse repite el ciclo hasta que la temperatura adquiere el valor deseado para la
esterilización. Este proceso es lento porque la transferencia de calor a través del aire
seco es poco efectiva por no tener poder de penetración, es decir, que el aire es mal
conductor del calor. Una vez alcanzada la temperatura de esterilización, se comienza a
contar el tiempo de duración de este proceso.
1.2.2 EFECTO SOBRE LOS MICROORGANISMOS

El efecto de la temperatura sobre los microorganismos aplicada en el Horno de Pasteur
es la oxidación de los constituyentes intracelulares.
1.2.3 COMPONENTES:
El cuerpo del horno está formando por paredes dobles en forma de caja entre las cuales
se encuentran un aislante de dimensiones reducidas en función de la transferencia de
calor y economía de la energía calórica. La fuente de energía calórica formada por
resistencias eléctricas adosadas a las paredes internas del horno.
 Un termómetro: Registrador de la temperatura interna.
 Un termostato: Aparato estabilizador de temperatura y conectado al circuito

de las resistencias.
 Un bombillo piloto: Indicador del encendido del aparato.
 Un bombillo monitor: Indicador de cuando hay pase de electricidad hacia las

resistencias.
1.2.4. PARAMETROS DE USO:

CICLO CORTO CICLO LARGO
Tiempo: 1 hora Tiempo: 1 hora y media
Temperatura: 180ºC Temperatura: 160ºC

1.2.5 CUIDADOS Y MANTENIMIENTO:
Debido a las altas temperaturas para esterilización en el Horno de Pasteur no deben
introducirse materiales y/u objetos que sean susceptibles al deterioro por efecto del
calor o la oxidación. Así, no deben esterilizarse mediante este procedimiento los
instrumentos de madera al perder humedad la fibra vegetal, permite que se vuelven
quebradizos y se astillan. Los instrumentos con filo o puntas agudas como pinzas,
separadores, ganchos, curetas, tijera, bisturí, pierden el filo y el temple y se forman
pequeños puntos de oxidación, que deterioran a la larga el equipo. Los plásticos y gomas
se funden y deterioran con facilidad.
El material debe disponerse dentro del horno de tal manera que el aire caliente pueda
circular entre los objetos a ser esterilizados. Los materiales deben estar con sus
envolturas de papel adecuadas para evitar su posterior contaminación. Así mismo, se les
debe colocar sobre la envoltura un indicador químico de esterilidad en cada uno de ellos
(cinta testigo) o el control biológico y una vez finalizado el procedimiento se coloca la
fecha en la que se realiza.
Mientras el horno esté caliente (por encima de 50ºC) no debe abrirse, ya que la
cristalería puede fracturarse por efecto de un enfriamiento brusco.
2. CALOR HUMEDO
2.1. EL AUTOCLAVE
Uno de los métodos de esterilización más eficientes, no solo por la economía en tiempo, sino
también en energía, es la realizada en el autoclave. Es un equipo que permite la esterilización
de casi todos los materiales y equipos utilizados tanto en microbiología como en la práctica
médica, a excepción de los plásticos y algunas sustancias y/o medios que se deterioren por
efecto del calor generado en este aparato.
2.1.1 FUNDAMENTO:
Su funcionamiento está basado en la ley general de los gases, manteniendo un volumen

constante (volumen del cilindro del autoclave), se trabaja con dos variables: la presión y la
temperatura, y es posible alcanzar temperatura superiores a los 100º C sin ebullición del agua.
El vapor de agua que ocupa el espacio libre sirve de vehículo para transferir el calor hacia los
objetos colocados en él, teniendo un alto poder de penetración.
2.1.2 EFECTOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS:

El autoclave es una forma de aplicación del calor húmedo bajo presión, su efecto sobre los
microorganismos es traducido en la coagulación de las proteínas constituyentes de la
estructura de los microorganismos.
2.1.3 COMPONENTES: Un cilindro o cuerpo del autoclave. Una fuente de energía calórica,
generalmente una resistencia eléctrica que suministra el calor necesario para alcanzar la
temperatura deseada bajo presión de vapor. En centros hospitalarios de gran volumen de
demanda de materiales esterilizados se utiliza el vapor que genera la caldera central como
fuente de energía calórica lo que reduce el tiempo para alcanzar la temperatura necesaria para
esterilizar.
El termostato: Es un estabilizador de la temperatura en un valor deseado. El gas contenido en

un bulbo al dilatarse por efecto del calor presiona una válvula eléctrica cuya sensibilidad es
regulada a los valores deseados y está conectada al circuito de la resistencia en el interior del
equipo.
El termómetro: Indicador de la temperatura interna.
El manómetro: Indicador de la presión interna.
La válvula manual: Abre y cierra la comunicación al exterior o voluntad.
La válvula de seguridad: Regulada a determinados valores de presión, se dispara

automáticamente al sobrepasar los valores de seguridad.
El bombillo piloto: Conectado al circuito termostato y resistencia, en la mayoría parámetros de

uso de los equipos se enciende cuando hay suministro de energía a la resistencia.
VALVULA DE
SEGURIDAD
VÁLVULA
MANUAL
BOMBILLO
PILOTO Y
TERMOSTATO
2.1.4 PARAMETROS DE USO:
VARIBLE VALOR
Temperatura: 121 ºC
Presión: 15 Lb/Pul2 (15 libras de presión sobre pulgada al cuadrado)
Tiempo: 15 minutos (después de alcanzada la presión y la temperatura)
2.1.5 CUIDADO, MANTENIMIENTO Y PROCEDIMENTTO PARA SU USO:

 La resistencia debe estar cubierta con agua destilada 2 a 3 cm por encima de ella.
 Los materiales y objetos que van a esterilizar, deben estar debidamente envueltos y
luego colocarlo en un recipiente para evitar que estos caigan al fondo del cilindro; para
ello se utiliza una olla en la que se introduce en material a esterilizar y ésta se coloca
sobre la rejilla interna.
 La tapa debe colocarse con cuidado, sin dejarla caer o tirarla de tal manera que los
relojes indicadores y válvulas se deterioren.
 El ajuste y desajuste de la tapa cuando son varios tornillos o clavas, deben hacerse en
pares opuestos, así asentará el borde de la tapa con el borde del cuerpo del autoclave y
hará un sellado hermético; de otra forma se producirán escapes de vapor, lo cual
impediría que se alcance la temperatura y presión requerida.
 Antes de comenzar el proceso de esterilización es necesario eliminar todo el aire seco
del cuerpo del autoclave a través de la válvula manual, porque de lo contrario no se
podrán alcanzar las condiciones de esterilización requeridas debido a que la cámara
interna del equipo no podrá ser saturada por el vapor de agua. A este proceso se
denomina purgado.
 Una vez purgado el autoclave se cierra la válvula manual y se espera hasta alcanzar los
valores de temperatura y presión para esterilización: 121º C y 15 lb/Pul2 se ajustan el
termostato hasta que se apague la luz del bombillo piloto y a partir de este momento
se cuenta el tiempo de esterilización: 15 minutos.
 Al finalizar la operación se apaga, se espera que se enfríe, se abre luego la válvula
manual para compensar la presión y se desajustan los tornillos de la tapa en pares
opuestos para abrirlo.
2.2. TYNDALIZACIÓN O CALOR HÚMEDO DISCONTÍNUO
Es un método que consiste en el calentamiento sucesivo a temperaturas y tiempo adecuado

para destruir formas vegetativas de las bacterias; seguido de incubación que permite la
germinación de las esporas, estas fases se repiten a intervalos de 24 horas por 3 días sucesivos.
Cuando se expone el material a una temperatura de 80° C por media hora cada día, se
destruyen todas las formas vegetativas pero no las esporas bacterianas. En la segunda fase el
material se incuba en una estufa a 37° C durante 24 horas, las esporas germinan produciendo
formas vegetativas vulnerables, que se destruyen con el próximo calentamiento, repitiendo este
ciclo 3 veces. Se utiliza muy poco en microbiología, se usa cuando se necesita preparar medios
de cultivo que son hechos a base de proteínas lábiles son susceptibles a daño al someterse a
altas temperaturas. Por ejemplo: medio de Lowenstein Jensen, medio de Pai.
2.3. PASTEURIZACIÓN
Fue introducido por Pasteur en 1860 para la preservación del vino. Es más bien un
método de desinfección, porque sólo destruye algunos microorganismos patógenos no
esporulados, que pudieran adquirirse a través del consumo de leche, ejemplo: Brucella,
Mycobacterium bovis, algunas especies de Streptococcus, Salmonella, etc. Se puede
lograr por dos modalidades:
Método clásico: Sometiendo el producto a calentamiento a 62,8° C durante 30 minutos, luego
la muestra se somete a un enfriamiento inmediato.
Método rápido: Se logra con un calentamiento a 71,6° C por 15 segundos, sometido a un

enfriamiento inmediato.
Con esta técnica se logra destruir rápidamente a los microorganismos, sin alterar mucho el
sabor de los alimentos. Además permite el procesamiento de grandes volúmenes de leche. La
pasteurización también se emplea para la preparación de vacunas constituidas por
microorganismos inactivados por el calor.
3. FILTRACIÓN:
Método de gran utilidad para esterilizar sustancias termolábiles (líquidos que se alteran por
calor). Es un procedimiento que consiste en hacer pasar una solución a través de una
membrana o filtro de un material (generalmente ésteres de celulosa) que presenta poros de
un tamaño inferior al de cualquier célula bacteriana e incluso de algunos virus.
Para que la filtración sea eficaz deben tomarse en cuenta varios factores: la porosidad y
carga eléctrica del filtro, la carga eléctrica de los microorganismos y la naturaleza de los
líquidos que se van a filtrar.
Se emplean varios tipos de filtros elaborados a partir de varios materiales, y los más
utilizados son las membranas filtrantes, los cuales consisten en discos porosos de ésteres de
celulosa (Millipore®), empleados con gran frecuencia ya que poseen un amplio rango de
tamaño de los poros, que varían entre 0,2 m y 0,45m, sobre todo son útiles en las
pruebas de esterilidad de medicamentos como colirios, antibióticos o líquidos biológicos
como: suero, plasma, úrea, entre otros.
4. RADIACIONES IONIZANTES:
Las radiaciones son las diferentes formas como se transmite la energía a través del espacio. Para
nuestro propósito como método de esterilización, estudiaremos: Las radiaciones gamma y los
rayos ultravioleta.
4.1. RAYOS GAMMA

Son radiaciones ricas en energía que se obtienen principalmente emitidas por isótopos
radioactivos, por ejemplo Cobalto 60. Tienen aplicación en medicina y la industria farmacéutica,
para la esterilización de materiales como Catgut (hilo quirúrgico), materiales desechables como:
inyectadoras, agujas, catéteres, hojillas de bisturíes, guantes quirúrgicos, guantes de goma,
tubos de material plástico y equipos para transfusión de sangre, entre otros.
Debido al gran poder de penetración de las radiaciones, las técnicos que operan los reactores
nucleares deben cumplir una serie de normas y controles de seguridad estrictos como la
utilización de placas protectoras de plomo y revisiones médicas periódicas estrictas.
4.1.1 FUNDAMENTO:
Son radiaciones cargadas de energía, con una longitud de onda muy corta (0,1 a 40 nm), que al
penetrar en la célula producen liberación de electrones desde los átomos, quedando estos
cargados positivamente; el electrón liberado se une a otros átomos, los cuales se cargan
negativamente. Este efecto de perder o adquirir electrones se conoce como ionización.
Los efectos de las radiaciones ionizantes dependen de la dosis de exposición, es decir, de la
cantidad de radiación al que es sometido el material. Suele medirse en unidades Roentgen (R).
Las radiaciones ionizantes son muy efectivas debido a su alto poder de penetración. La
esterilización mediante este método se consigue con poca producción de calor por eso se llama
“Esterilización en frío”.

Los efectos de las radiaciones ionizantes, tanto directos como indirectos, son letales y
mutagénicos y actúan alterando las nucleoproteínas de los ácidos nucleicos. Además cuando
los electrones liberados son absorbidos por el agua, se forman radicales OH ¯, H +, peróxidos
que actúan como agentes oxidantes.
Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiación, actuando específicamente sobre
el ADN, ocasionando roturas y entrecruzamientos de las cadenas en forma irreversible,
mientras que los letales indirectos y mutagénicos, se consiguen a menores dosis.
4.2. RADIACIONES ULTRAVIOLETA (UV)
4.2.1. FUNDAMENTO:
La luz ultravioleta se puede producir artificialmente en lámparas de vapor de mercurio a baja

presión, que emiten el 90% de su radiación a 254nm. La radiación ultravioleta, tiene efecto letal
y mutagénico, dicho efecto depende de la longitud de onda, la cual es más efectiva entre 240 a
280nm, con un óptimo aproximado de 260nm, correspondiente a la máxima absorción de ADN
que tiene efecto bactericida.
Este tipo de radiación tiene la desventaja de ser poco penetrante, por tanto se aplica sólo para
la desinfección de aire y superficies lisas, por ejemplo: cuando se quiere eliminar
microorganismos en áreas como hospitales, quirófanos, cuarteles, laboratorios de
experimentación, laboratorios farmacéuticos, industrias de alimentos, etc. También utilizan
lámparas artificiales de mercurio en restaurantes, panaderías, café, etc. para la desinfección de
vasos, cubiertos y otros utensilios.

En particular, el efecto sobre los microorganismos se produce cuando los rayos UV son
absorbidos por el ADN, alterando los dímeros de pirimidina, modificando el ADN de las células e
interfiriendo con el apareamiento normal de las bases; este efecto es IRREVERSIBLE.
MÉTODOS QUÍMICOS
Comprende todos los agentes químicos con los cuales se logra la desinfección y en ocasiones
la esterilización de algunos materiales. Para la selección del método adecuado, es importante
conocer algunas características que deben reunir dichos agentes para ser efectivos.
La selección de un procedimiento o reactivo en particular depende de si se quiere

realizar la esterilización o una desinfección del material.
CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS
Según su mecanismo de acción sobre los microorganismos, los desinfectantes suelen

agruparse como sigue a continuación:
1. AGENTES QUE DAÑAN LAS MEMBRANAS CELULARES:
La membrana celular es esencial para la vida de la bacteria, su principal función es la
permeabilidad selectiva y cualquier alteración de su estructura, conduce a la pérdida de esa
selectividad, permitiendo la entrada de sustancias tóxicas a la célula, o la salida de componentes
esenciales para la vida.
Los agentes químicos, capaces de lesionar la membrana actúan principalmente sobre las proteínas
y lípidos constituyentes de las mismas. Se denominan, agentes tensoactivas o surfactantes, ya que
disminuyen la tensión superficial. Aquí se incluyen:
1.1. Jabones: Constituidos por sales de sodio y potasio más ácidos grasos generalmente de
cadena larga. Se comportan como compuestos aniónicos; su acción antimicrobiana se relaciona a
su poder limpiador y a la liberación de ácidos grasos muy tóxicos para las bacterias. Algunos se
usan como vehículos de desinfectantes (cresoles y hexaclorofeno).
1.2 Detergentes: Los hay aniónicos, catiónicos y no iónicos.

1.2.1. Detergentes aniónicos:
Son compuestos con acción antibacteriana, debido a la liberación de una porción de la molécula
cargada negativamente (anión). Estos agentes son más activos a pH ácido. Son efectivos contra
microorganismos Gram positivos, pero son ineficaces contra especies Gram negativas, debido a
su membrana externa constituidas por lipopolisacáridos.
1.2.2 Detergentes catiónicos:

Son los agentes tenso activos más importantes. Están constituidas por un ion cargado
positivamente (catión) que pudiera ser el ion amonio y una cadena alifática biológicamente
activa. Los más conocidos son los compuestos de amonio cuaternario.
Su actividad es mayor a pH alcalino. Son bactericidas para un amplio espectro de

microorganismos en su forma vegetativa, tanto Gram positivos, como Gram negativos, pero los
Gram positivos son más susceptibles. Algunos pueden destruir esporas. También actúan sobre
especies de hongos, su actividad antimicrobiana disminuye en presencia de materia orgánica,
jabones y detergentes aniónicos. Tienen gran solubilidad, baja toxicidad y falta de poder
corrosivo, el más conocido es el Cloruro de Benzalconio.
1.2.3 Detergentes no iónicos:

Son compuestos con grupos polares no ionizados, tienen poca actividad antimicrobiana,
algunos de ellos favorecen el desarrollo bacteriano. Ejemplo: TWEEN 80.
1.3. Compuestos fenólicos:

El Fenol (ácido fénico o ácido fenólico) fue el desinfectante que utilizó Lister en 1860, dando
inicio al desarrollo de las técnicas de antisepsia en cirugía.
Los compuestos fenólicos pueden actuar como bacteriostáticos o bactericidas, según la

concentración en que se empleen. Son muy activos sobre los hongos y las formas vegetativas de
las bacterias, menos sobre los virus. No son esporicidas. En la actualidad su uso se ha restringido
debido a su actividad tóxica para los tejidos y sólo se utilizan sus derivados, como desinfectantes.
Entre los derivados del fenol, más utilizados tenemos:
 Los cresoles: Son efectivos bactericidas, pero son irritantes, por lo tanto no se emplean como
antisépticos. Se usan en forma de sal acuosa a concentraciones de 1 a 5% para desinfectar
pisos, muebles, mesones de laboratorio, etc. En algunos casos se usan emulsiones con
jabones como en el caso de Lisol y de la Creolina.
 Bifenoles (Hexaclorofeno, diclorofenol, etc): Se emplean mezclados con jabones, son
bacteriostático a bajas concentraciones, útiles para el lavado de piel y manos, y en caso de
infecciones superficiales de la piel. En la actualidad ha dejado de usarse, debido a su
absorción por la piel, ya que puede causar neurotoxicidad, incluso toxicidad sistémica.
1.4. Alcoholes:
Por ser solventes orgánicos, actúan sobre las bicapas lipídicas de las membranas celulares
alterando su organización y penetrando a las regiones hidrocarbonadas de los lípidos, aunque su
mecanismo de acción más importante es la desnaturalización de proteínas (ver punto 2).
Los alcoholes más frecuentemente empleados como antisépticos son: el etílico y el Isopropílico.
Generalmente se recomienda usarlos a una concentración de 70% para la desinfección de
termómetros clínicos y antisepsia de la piel. El alcohol absoluto (98%) es menos efectivo como
antiséptico por ser menos diluido, no penetra los tejidos, fija las proteínas y es irritante para la
piel.
2. AGENTES QUE DESNATURALIZAN PROTEÍNAS
Las proteínas son compuestos esenciales para la estructura y función de la célula y además son
constituyentes de enzimas. Normalmente las proteínas se encuentran en una conformación
característica, estructura primaria, secundaria y terciaria, la cual se requiere para su
funcionamiento adecuado. El proceso de desnaturalización por la acción de agentes químicos
cambia la conformación de las proteínas perdiendo funcionalidad.
Entre los agentes químicos, que desnaturalizan proteínas celulares se encuentran: ácidos, álcalis,
alcoholes, acetonas, fenoles y otros solventes orgánicos.
Los ácidos y álcalis: ejercen su actividad antibacteriana (bactericida), a través de sus iones H+ y
OH-, es decir, alterando el pH del medio, el cual cuando alcanza valores extremos provoca la
desnaturalización de las proteínas.
Los ácidos orgánicos, pueden emplearse como preservativos en las industrias procesadoras de
alimentos; ejercen su efecto antibacteriano, como moléculas intactas (sin disociar), penetrando a
la célula. El ácido Benzóico y el ácido sórbico, se usan ampliamente como conservantes de
alimentos. Los ácidos inorgánicos, como el clorhídrico y sulfúrico, son poco utilizados por su alto
poder corrosivo.
3. AGENTES MODIFICANTES DE PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS
Algunos agentes químicos pueden reaccionar directamente con los grupos funcionales de las
proteínas y otros compuestos orgánicos esenciales como: grupos carboxilo (-COOH), hidróxilo (-
OH) amino (-NH2) y sulfidrilo (-SH), alterándolos y cambiando la configuración proteica y actividad
enzimática.
Entre estas sustancias se encuentran:
3.1. Agentes oxidantes:

3.1.1 Halógenos:
El cloro y el yodo se encuentran entre los desinfectantes más útiles, tanto el yodo como el cloro,
deben su efecto microbicida a procesos de oxidación. Su actividad es casi exclusivamente
bactericida, el yodo se usa como desinfectante de la piel y el cloro como desinfectante del agua.
3.1.2 Peróxido de Hidrógeno:
Anteriormente se utilizó mucho en solución al 3% como desinfectante, pero actualmente se usa

poco ya que su poder es muy débil, sobre todo por la resistencia que ofrecen las bacterias que
producen catalasa y peroxidasa (enzimas capaces de descomponer el peróxido, inactivándolo).
Además, en desinfección de heridas abiertas, su efecto es muy pobre, porque el agua oxigenada
es descompuesta por la catalasa tisular. Se emplea en desinfección de algunas superficies
inertes (ejemplo lentes de contacto) y equipos quirúrgicos.
3.1.3 Permanganato potásico:
Al 1% se usa como antiséptico uretral.
3.2. Tintura de colorantes:

Tienen actividad bacteriostática, bactericida y algunos fungicidas.
Los colorantes con conocida acción antimicrobiana son los derivados de:
 Anilina o trifenilmetano (verde brillante, verde de malaquita, cristal violeta de genciana y

fucsina básica).
 Acridina o flavina (proflavina y acriflavina).
Su mecanismo de acción se debe principalmente a la capacidad de combinarse con las
nucleoproteínas o a la interferencia en la síntesis de peptidoglicano de la pared celular
bacteriana, especialmente de las Gram positiva.
La membrana externa de las bacterias Gram negativas, impide la penetración del

colorante. Por eso se utilizan en Microbiología para preparación de medios selectivos para aislar
bacterias Gram negativas.
3.3 Sales de metales pesados:

Las sales solubles de mercurio, arsénico, plata, cobre y otros metales pesados alteran la actividad
enzimática al actuar sobre los grupos sulfidrilos (-SH) de residuos de cisteína, frecuentemente
en forma reversible, por tanto su principal efecto es inhibitorio. También pueden interactuar con
los grupos amino (-NH2) carbóxilo (-COOH) y radicales fosfato. Los más efectivos son los derivados
del mercurio y de la plata, actúan a menos de una parte por millón (ppm).
3.4 Agentes alquilantes:

Son agentes esterilizantes activos tanto sobre células vegetativas, como sobre esporas. Su efecto
antimicrobiano se debe a la alquilación de grupos funcionales de las proteínas, enzimas y ácidos
nucléicos. Los grupos carboxilos, hidróxilo o sulfídrilo de las proteínas, son alquilados por
reemplazo directo de un átomo de hidrógeno por un grupo hidroximetilo. Su acción es
irreversible. Los más usados son:
3.4.1. Formaldehído:
-Como gas en la descontaminación de habitaciones, telas e instrumentos.

-Como formalina (solución acuosa al 37%). Su uso como desinfectante es limitado por su alto
poder irritante. La formalina a concentración de 0,2 a 0,4% se usa en la preparación de vacunas,
ya que mata bacterias y la mayoría de virus sin alterar su poder antigénico.
-Como Paraformaldehido: polímero sólido de 91 – 99% de pureza.
3.4.2. Glutaraldehido:
Es menos tóxico y mas activo que el formaldehído, tiene mayor poder bactericida y es por eso
que ha venido reemplazándolo. Se utiliza en forma liquida.
No se afecta en presencia de materia orgánica, se emplea como esterilizante frío de

instrumental quirúrgico. Es el único recomendado para esterilizar equipamiento de terapia
respiratoria endoscópica y otros materiales que sean susceptibles a daño por el calor.
3.4.3. Óxido de Etileno.
Agente alquilante ampliamente usado en la esterilización gaseosa. Es un gas muy efectivo para
destruir los microorganismos y las esporas, aunque su acción es lenta, tiene gran capacidad de
penetración. Se emplea cuando no se puede esterilizar por calor, como por ejemplo: material
de plástico, instrumentos y equipos ya envasados, drogas, ciertos productos biológicos,
equipamiento electrónico, óptico, etc.
Es un método costoso que implica ciertos riesgos, ya que forman mezclas explosivas cuando se
combina con el aire. Es mutagénico y carcinogénico. Produce alquilaciones en las proteínas y
ácidos nucleicos de los microorganismos.
BIBLIOGRAFIA:
- Microbiología, Murray. Edición 6ta. 2008.

- Microbiología Médica, Jawez. Edición 19. 2008.
- Guía de actividades teórico prácticas de Microbiología. II Semestre de Enfermería.
Dra. Deisy Herrera, 2012
Modificado: Enero 2015


MICROBIOTA
NORMAL

DECANATO CIENCIAS DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA MÉDICA I
V SEMESTRE – MEDICINA
PRÁCTICA No. 3
MICROFLORA NORMAL
1. Está prohibido fumar y comer en el laboratorio, ambientes y servicios hospitalarios.

hospitalarias.
3. No permita que ningún implemento de laboratorio toque su cara o la boca, excepto el
material esterilizado.
4. Si Ud., ingiere por cualquier circunstancia material infeccioso, notifíquelo de inmediato al
profesor.
basura, nunca en el suelo ó en otros sitios no destinados para ello.
8. Al terminar el período de la práctica, limpie su área de trabajo y deje los materiales
utilizados ordenadamente, incluyendo los taburetes o bancos, con la colaboración del
resto del personal.
10. Se recomienda al alumno no trasladar la bata fuera del laboratorio, sino hasta finalizar los
trabajos prácticos, por lo cual en lo posible debe disponer de dos batas.
11. Los bolsos y objetos personales deben mantenerse fuera del área de trabajo.
1. Traiga su guía nueva de trabajos prácticos al laboratorio nueva y lápiz bicolor (azul
– rojo).
2. La hora de entrada a las prácticas será la señalada en el horario respectivo y no se
permitirá el ingreso después de la hora señalada.
3. Una vez comenzada la práctica los estudiantes no podrán salir del laboratorio.
5. No está permitido cambiarse de grupo
6. Las situaciones de orden de funcionamiento será resueltas solamente por el jefe de la
7. El estudiante tiene la obligación ó responsabilidad de revisar la bibliografía
correspondiente a la teoría desarrollada en clase antes de asistir a práctica.
AUTOEVALUACIÓN
1. ¿Qué se entiende por Microflora normal?

2. ¿Cuales son las áreas anatómicas que albergan la Microflora normal?
3. ¿Cómo llegan los microorganismos a las áreas anatómicas que albergan Microflora?
4. ¿Cómo se explica la afinidad de géneros y especies microbianas por determinadas áreas
anatómicas del cuerpo humano?
5. ¿Cuáles son las áreas anatómicas estériles o libres de Microflora normal?
6. ¿Cuáles son los géneros de bacterias Gram Negativas de la Microflora normal y cuál es el
área anatómica donde residen?
7. ¿Cuáles son los géneros de bacterias Gram positivas de la Microflora normal y cuál el área
donde residen?
8. ¿Cuáles son los géneros de hongos de la Microflora normal y cuáles son las áreas donde
residen?
9. Haga un listado con diez (10) especies bacterianas que NO pertenezcan a la Microflora
normal.
10. ¿Cuál es la función de la Microflora normal del organismo?
11. ¿Cuáles son las desventajas de la Microflora normal?
12. ¿Cuáles son los factores que potencian la patogenicidad de la Microflora normal?
13. ¿Cómo se evita la patogenicidad de la Microflora normal?
14. ¿Cuáles son los pasos para lograr el aislamiento e identificación de las especies de la
microflora?
15. ¿Cuáles son los medios de cultivos a utilizar en el estudio de la Microflora normal?
16. ¿Cuáles pruebas bioquímicas primarias se utilizan para el diagnóstico de bacterias Gram
positivas?
17. ¿Cuáles pruebas bioquímicas primarias se utilizan para el diagnóstico de bacterias Gram
negativas?
I.- INTRODUCCIÓN:
El cuerpo humano sano alberga millones de microorganismos en piel (alrededor de 1 x 10 12

x cm2), boca, ojos, oídos, vías genitourinarias e intestino (1 x 10 11 x gr.) en todas las
superficies que están en contacto con el medio exterior, por eso se le considera un ecosistema
completo. El conjunto de estos gérmenes presentes regularmente en el organismo, se conoce
como Microflora (Microbiota) normal, Microbioma del organismo humano. Es probable que la
función más valiosa que desempeñan estos microorganismos “comensales” sea la de excluir por
competencia a otros que pueden ser patógenos o potencialmente patógenos, además de estimular
al sistema Inmunológico contra los antígenos microbianos. La mayor parte de estos
microorganismos raramente provocan enfermedades en un hospedador inmunocompetente, pero
en determinadas circunstancias, ya sea por pérdida de la integridad de las superficies corporales
(por ejemplo heridas o posterior a una cirugía) pueden penetrar y producir daños (patógenos
oportunistas). Cada área anatómica que esté en contacto con el exterior normalmente alberga
microorganismos. Esto se debe a la colonización de las bacterias mediante mecanismos de
adherencia, entre ellos los receptores del epitelio, además por medio de estructuras propias de las
bacterias, los microorganismos ingresan por contacto o inoculación (piel), por inhalación (vías
respiratorias) o por ingestión (tracto digestivo).
II.- OBJETIVOS:
Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de:
1. Conocer los diferentes medios de cultivos.

2. Manejar los diferentes medios de cultivo, observando las medidas necesarias para
mantener la esterilidad.
3. Adquirir la destreza en la manipulación de los cultivos bacterianos en tubos y placas y en el
uso del asa y aguja bacteriológicas.
4. Explicar las funciones que cumplen los medios sólidos, semisólidos y líquidos en los
estudios bacteriológicos.
5. Aplicar las técnicas de siembra empleadas en el laboratorio para el cultivo de bacterias
procedentes de diferentes áreas anatómicas del cuerpo humano, en los diferentes medios
de cultivo.
6. Desarrollar métodos de diferenciación de grupos taxonómicos de microorganismos
mediante criterios de cultivo y fisiológicos.
7. Interpretar los hallazgos y resultados obtenidos en los medios de cultivo utilizados.
8. Realizar las diferentes pruebas bioquímicas para el diagnostico de la Microflora Bacteriana.
9. Demostrar la presencia de la gran variedad de flora bacteriana residente en distintas áreas
del cuerpo humano.
III.- METODOLOGÍA:
Demostración de las técnicas empleadas en el manejo de medios de cultivo:
1) Cultivo en tubo:
1.1) Tubo con medio líquido, por ejemplo: caldo de soya tripticasa, caldo de cerebro
corazón de buey, agua peptonada, caldo nutritivo, etc., estos medios pueden ser
sembrados utilizando pipeta o el asa bacteriológica.
1.2) Tubo con medio sólido; ejemplo: citrato de Simmons, agar nutritivo, agar
inclinado. Se utiliza el asa o aguja bacteriológica, haciendo la siembra en forma de
estría a lo largo de la superficie del agar.
1.3) Tubo de medio semi-solido, ejemplo: medio agar movilidad, para lo cuál se utiliza
la aguja bacteriológica, por punción única en el centro del taco hasta la mitad.
1.4) Combinación de la técnica de siembra por punción y estría en el mismo medio. De
esta manera se puede sembrar por ejemplo, el medio de Kligler (sólido) TSI. (Triple
azúcar hierro). Usar aguja bacteriológica.
2) Cultivo en placa:
2.1) Existen varios métodos de siembra en placa que pueden ser utilizadas. Un
método es el conocido como siembra por agotamiento. (Fig. 1).
2.2) Técnica de siembra de aislamiento por agotamiento:
Se sugieren los pasos siguientes:
1) Esterilice el asa bacteriológica flameando en el mechero. Deje enfriar.
Puede utilizar en lugar del asa una varilla de vidrio estéril (No flamear la
varilla).
2) Tome con el asa o varilla de vidrio el inóculo a ser sembrado, debe ser
colocado en el borde del medio de cultivo en placa.
3) Toque la superficie del agar cerca del borde de la placa y comience un
trazado en estrías, continuo y descendente como se indica en el diagrama
(haga los trazados sobre la superficie del medio moviendo el asa
suavemente para evitar romper el agar), a medida que desciende separe
las estrías
4) Una vez finalizada la siembra esterilice de nuevo el asa bacteriológico, o
descarte la varilla en un recipiente con jabón.
Fig. 1: Diagrama de siembra de aislamiento por agotamiento

Inoculo
Fig. 1
El propósito de esta siembra es obtener el crecimiento de colonias bacterianas aisladas

(acúmulos de bacterias, que a simple vista pueden verse en la superficie del agar). Cada
colonia está formada por los descendientes de una misma célula bacteriana, con la
finalidad de estudiar su morfología, acción sobre los constituyentes del medio, producción
de pigmentos (cromogénesis) tamaño y otras características para poder lograr su
diferenciación e identificación.
3) Desarrollo de la práctica
Primer Día
1.1) Un grupo de alumnos, trabajará con muestra de exudado faríngeo.

a) Con un hisopo estéril previamente sumergido en solución fisiológica estéril y
un baja lengua, tomará un hisopado faríngeo a su compañero.
b) Con este hisopo siembre una placa de: Agar sangre de Carnero, Mac Conkey y
Agar Salado Manitol. Luego introdúzcalo en un medio de cultivo líquido: caldo
de soya tripticasa al colocarlo, corte y descarte la punta de madera del hisopo
que ha estado en contacto con sus dedos, (parte contaminada).
c) Continúe la siembra de la placa con el asa bacteriológica o con varilla según la
técnica de siembra por agotamiento.
NOTA: La siembra de la muestra problema, se hace simultáneamente en placa
y en medio líquido (caldo), este último con la finalidad de salvar la muestra si
no hay crecimiento en la placa y poder repicar de este caldo a nuevas placas
para tener mayor seguridad en el crecimiento del germen problema, ya que
los caldos pueden permanecer en incubación a 37ºC por más tiempo que las
placas.
d) Con otro hisopo estéril tome muestra del exudado faríngeo, realice un frotis y
tiña con GRAM.
e) Dibuje lo Observado.
Coloración:___________
Morfología: __________
Disposición: __________
GRAM directo de la muestra
1.2) Otro grupo de alumnos sembrará una muestra de la superficie de la piel (yema y
pliegues de los dedos), tomada con un hisopo estéril, previamente humedecido en
solución fisiológica estéril, siembre en placas de Agar Sangre, Mac Conkey y Agar
Salado Manitol, siguiendo la técnica descrita, luego introdúzcalo en un medio de
cultivo líquido: caldo de soya tripticasa. Dibuje lo observado.
1.3) Otro grupo de alumnos trabajará con una muestra de hisopado del conducto auditivo
externo, con un hisopo estéril previamente humedecido en caldo o solución fisiológica
estéril y la sembrará en los medios de cultivo en placa: Agar Sangre, Mac Conkey y
Agar Salado Manitol, siguiendo la metodología explicada, luego introdúzcalo en un
medio de cultivo líquido: caldo de soya tripticasa. Dibuje lo observado.
1.4) Se suministrará a otro grupo de alumnos una muestra de hisopado rectal en un medio
de transporte para ser sembrada por la técnica ya descrita, luego introdúzcalo en un
medio de cultivo líquido: caldo de soya tripticasa. Dibuje lo observado.
Coloración: ___________
4) Todos los medios se identifican y se incuban a 37ºC por 24 horas, para la próxima sesión
práctica. Las placas de Petri deben incubarse invertidas para prevenir que el agua de
condensación que se forma en la tapa no caiga sobre el trazado y contamine el
aislamiento.
Segundo Día: Observación de los cultivos y siembra de las bacterias en medios
diferenciales.
4.1) Agar sangre de carnero. Es un medio enriquecido, donde pueden crecer todas
aquellas bacterias poco exigentes, además de poder observar los distintos tipos de
hemólisis de los glóbulos rojos.
Interpretación: Observar si hay crecimiento bacteriano y la hemólisis de los glóbulos rojos.

Dibuje lo observado.
Agar sangre de carnero Agar sangre de carnero

Sin inocular Inoculado e Incubado
4.2) Agar salado manitol:
Ciertas especies de estafilococos tiene la propiedad de fermentar el manitol. Este

medio que contiene, además del azúcar nombrado, una proporción elevada (7,5 %) de
cloruro de sodio, la cual inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas. Se usa para
aislar estafilococos presentes en las muestras sospechosas.
Interpretación: Observa si hay crecimiento bacteriano. La fermentación del manitol se

pone de manifiesto porque el medio cambia de rojo o amarillo. Anote lo observado.
Agar Salado Manitol (Inoculado e incubado)
(Medio sin Inocular)
4.3) Agar Mac Conkey.
Es un medio selectivo que se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos,

además de que algunos de estos bacilos pueden fermentar la lactosa. Contiene sales
biliares que inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas.
Interpretación: Las colonias lactosa positiva se observan de color rosado o rojas; las
colonias no fermentadoras de la lactosa se observan claras.
Reporte lo observado.
Mac Conkey Agar Mac Conkey Agar

Sin inocular inoculado e incubado
5) Describa las características de los diferentes tipos de colonias bacterianas aisladas que
crecieron en los medios de cultivos. (llene los datos de cuadro 1).
MUESTRA: HEMOLISIS
COLONIAS TAMAÑO FORMA BORDE ELEVACIÓN COLOR AGAR
DESARROLLADAS SANGRE
AGAR SANGRE
COLONIA A
COLONIA B
COLONIA C
AGAR MAC
CONKEY
COLONIA A
COLONIA B
COLONIA C
AGAR SALADO
MANITOL
COLONIA A
COLONIA B
COLONIA C
CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIA
Cuadro # 01
5.1) Realice la coloración de GRAM para cada colonia aislada descrita.
5.2) Correlacione la morfología, coloración y disposición de las bacterias con las

características de sus colonias.
6) PRUEBAS BIOQUÍMICAS UTILIZADAS PARA EL DIAGNÓSTICO SEGÚN LOS RESULTADOS DEL

GRAM DE LAS COLONIAS:
6.1) Para bacterias GRAM negativas, inocule (siguiendo la técnica explicada anteriormente)
los siguientes pruebas diferenciales: citrato de simmons, kligler, agar movilidad, agua
peptonada y oxidasa.
6.2) Para bacterias GRAM positivas siembre las siguientes pruebas diferenciales: caldo
manitol, un caldo nitratado y caldo de soya tripticasa.
6.3) Incube a 37ºC por 24 horas para usarlos en el próximo ejercicio práctico.
Tercer Día:
7) El profesor explicará y demostrará ejemplos de las reacciones bioquímicas que pueden ser
producidas por las bacterias.
7.1) Compare sus resultados con la demostración. Interprételos y anótelos en su práctica.
8) Pruebas Bioquímicas:
Gram negativas
8.1) Producción de Indol:
Fundamento:
Es una prueba diagnóstica para identificar ciertos bacilos GRAM negativos. El indol
es formado como un producto degradativo del amino ácido triptófano que está
presente en la peptona, por acción enzimática (triptofanasa).
Técnica:
La producción de indol se demuestra al agregar al tubo del agua peptonada

sembrada con la bacteria, el reactivo de Kovacs (p-amino-dimetil benzaldehido),
formándose un anillo rojo (Indol +). En la reacción negativa el anillo permanece
amarillo (indol negativo).
Anote los Resultados: Indol - +

8.2) Utilización del Citrato:
Fundamento: Esta prueba sirve para determinar si una bacteria es capaz de utilizar el
citrato como única fuente de carbono para sus procesos metabólicos. Para ello se utiliza el
citrato de Simmons, medio que contiene citrato de sodio como única fuente de carbono,
Las bacterias que utilizan el citrato, lo pueden desdoblar mediante una enzima, citratasa o
citrato desmolasa; dichas bacterias capaces de desdoblar el citrato también pueden utilizar
las sales de amonio presentes en el medio como fuente única de nitrógeno, produciendo
alcalinidad, lo cual es evidencia por el cambio de color del indicador de azul de bromotimol
(verde en neutro, azul en alcalino).
Técnica: Siembre un tubo con agar citrato de Simmons, (verde) usando un inóculo ligero.
Incube a 37ºC por 24 horas. Si la bacteria metaboliza el citrato alcaliniza al medio: (color
azul, citrato positivo), mientras aquellas que ni lo metabolizan no crecen en el medio el
cual permanece con su color original, verde (citrato negativo).
Resultado: - +
8.3) Interpretación del Kligler
Es el medio diferencial en tubo más útil en el estudio de bacilos GRAM

negativos intestinales (enterobacterias) permitiendo su diferenciación, sobre la base
de la habilidad de fermentar la glucosa o lactosa y la capacidad para producir
hidrógeno sulfurado (H2S) y gas. Este medio contiene en su preparación: rojo fenol
como indicador de la producción de ácido y sulfato ferroso para detectar la
producción de hidrógeno sulfurado.
Resultado:
Un cambio amarillo en el fondo (taco) del tubo indica fermentación de la

glucosa y si se observa en el bisel, indica fermentación de la lactosa. La producción
de gas en la fermentación se observa por presencia de burbujas entre el medio y la
pared del tubo, la producción de H 2S se demuestra con un ennegrecimiento del
medio.
Anote los resultados
LECTURA
GLUCOSA _______________
LACTOSA _______________
GAS _______________
H2 S _______________
Kligler Kligler
(Medio sin inocular) (Medio inoculado)
8.4) Movilidad:
Para detectar la presencia o ausencia de flagelos, se usa un medio semisólido

(contiene agar en una proporción de 0,3 %). Se siembra por punción única con la
aguja, sin tocar el fondo. La movilidad se manifiesta macroscópicamente, por una
zona difusa de crecimiento diseminada a lo largo de la línea de inoculación.
Reporte lo observado:
+ -
Sin inocular inoculado Agar movilidad
Agar movilidad
8.5) Pruebas de la oxidasa:
Fundamento:
Es una prueba para determinar si las bacterias producen las citrocromos c

oxidasa, se utiliza papel de filtro impregnado con el reactivo n- tetrametil -p-
fenilendiamina, el reactivo pasa a un color purpura al ser oxidado y transparente al
ser reducido.
Técnica:
Al papel de filtro impregnado con el reactivo n- tetrametil -p-

fenilendiamina, se le transfiere una porción del crecimiento bacteriano y se observa
el filtro de papel por unos minutos, si presenta color purpura el resultado es positivo
y si no presenta color la prueba es negativa.
9. Pruebas Bioquímicas
Gram positivas:
9.1) Reducción de los nitratos. La habilidad de una bacteria de reducir los nitratos a
nitritos es una característica que tiene un valor diferencial en la identificación de los
grupos y géneros bacterianos. Esto se debe a la presencia de la enzima nitrato reductasa
en las bacterias.
Técnica: Se siembra usando el asa la bacteria en estudio en caldo nitrato (caldo nutritivo +
1% de KNO3, se incuba a 37ºC por 24 horas. Después de la incubación se observa
crecimiento bacteriano y se le agrega igual número de gotas de los reactivos A (ácido
sulfanilico) y de reactivos B (naftilamina), los cuales reaccionan con los nitritos derivados
de la reducción de los nitratos.
Resultado:
La formación de un color rojo ladrillo indica la reducción de nitratos a nitritos (reacción
positiva).
Reporte los resultados:
Negativo Positivo
9.2) Fermentación del caldo manitol.
La fermentación de este carbohidrato es característica de Staphylococcus aureus,

raro en otros estafilococos.
Interpretación:
Una reacción positiva se observa cuando el medio inoculado cambia de rojo a

amarillo (indicador rojo de fenol) por acidificación. Una reacción negativa, se reporta
cuando el medio permanece del mismo color. Anote los resultados.
A B
Caldo manitol Después de inoculación
(sin inocular) e inoculación (24h – 37ºC)
- +
9.3) Producción de catalasa:
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de las bacterias

aerobias facultativas que contienen citocromo c (a excepción del género
Streptococcus). Dicha enzima descompone el peróxido de hidrógeno (H 2O2) en oxígeno
y agua, las bacterias que carecen del sistema citrocomo no producen catalasa por lo
cual no descomponen el peróxido de hidrógeno el cual es tóxico para la bacteria, tal es
el caso de ciertos organismo anaerobios (Clostridium). La producción de catalasa se
usa para diferenciar cocos Gram positivos de los géneros Streptococcus (catalasa
negativa) del Staphylococcus (catalasa positiva).
Técnica:
Incube un tubo con caldo tripticasa con una o varias asadas de un crecimiento
bacteriano, incube por 24 horas a 37ºC. Finalizada la incubación, agregue a cada tubo
cinco gotas de solución de agua oxigenada (peróxido de hidrógeno). La reacción
positiva se manifiesta por el desprendimiento de burbujas de gas (oxígeno
desprendido del H2O2.) En lugar del caldo puede usarse también agar nutritivo.
Caldo de soya tripticasa Caldo de soya tripticasa
sin inocular inoculado positivo

PRUEBAS BIQUIMICAS SECUNDARIAS
9.4) Prueba de la Coagulasa:
Es el más importante criterio en el laboratorio para diferenciar Staphylococcus

aureus (produce la enzima coagulasa que coagula el plasma citratado de conejo) de
otras especies de estafilococo, que no la producen (coagulasa negativos)
Técnica:
A un tubo contentivo de 0,5 ml de plasma de conejo citratado diluido 1/10, colóque

0,5 ml de crecimiento bacteriano. Incube a 37ºC y revise después de 3 horas hasta
24 horas, para la observación de la formación de coágulo o no. Reporte lo
observado.
A B (-) (+)
Inoculado +
Plasma
citratado de
conejo.
Resultado
CONCLUSIONES
1) MUESTRA____________________________________
2) EXAMEN DIRECTO:_________________________________________________
___________________________________________________________________
3) CULTIVO:
3.1) AGAR SANGRE:
COLONIA A __________________
COLONIA B __________________
COLONIA C __________________
3.2) AGAR SALADO MANITOL:

COLONIA A __________________
COLONIA B __________________
COLONIA C __________________
3.3) MAC CONKEY AGAR:

COLONIA A __________________
COLONIA B __________________
COLONIA C __________________
4) PRUEBAS BIOQUIMICAS PRIMARIAS

GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA
4.1) P. CATALASA _____ P. INDOL _____

4.2) R. NITRATOS _____ KLIGLER _____
4.3) F. MANITOL _____ MOVILIDAD _____
4.4) CITRATO _____
4.5) OXIDASA _____
5) PRUEBAS BIOQUIMICAS SECUNDARIAS

5.1) _____________________ _____________________
GÉNERO_________________________ ESPECIE ___________________


ACTINOMYCETALES
DECANATO DE CIENCIAS DE LA SALUD
V SEMESTRE- MEDICINA
CÓDIGO: VB
GUIA DE PRÁCTICA No. 4
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA Y CULTIVO DE BACTERIAS DEL ORDEN
ACTINOMYCETALES
1. Está prohibido fumar y comer en el laboratorio, ambientes y servicios hospitalarios.

hospitalarias.
3. No permita que ningún implemento de laboratorio toque su cara o la boca, excepto el
material esterilizado.
4. Si Ud. ingiere por cualquier circunstancia material infeccioso, notifíquelo de inmediato al
profesor.
basura, nunca en el suelo ó en otros sitios no destinados para ello.
8. Al terminar el período de la práctica, limpie su área de trabajo y deje los materiales
utilizados ordenadamente con la colaboración del resto del personal.
10. Se recomienda al alumno no trasladar la bata fuera del laboratorio, sino hasta finalizar los
trabajos prácticos, por lo cual en lo posible debe disponer de dos batas.
11. Los bolsos y objetivos personales deben mantenerse fuera del área de trabajo.
1. Traiga su guía de trabajos prácticos al laboratorio nueva y lápiz bicolor (azul –

rojo).
2. La hora de entrada a las prácticas será la señalada en el horario respectivo y no se
permitirá el ingreso después de la hora señalada.
3. Una vez comenzada la práctica los estudiantes no podrán salir del laboratorio.
5. No está permitido cambiarse de grupo
6. Las situaciones de orden de funcionamiento será resueltas solamente por el jefe de la
7. El estudiante tiene la obligación ó responsabilidad de revisar la bibliografía
correspondiente a la teoría desarrollada en clase antes de asistir a la práctica.
OBJETIVO GENERAL:
Al finalizar la actividad práctica el estudiante estará en capacidad de diferenciar

microscópicamente los microorganismos pertenecientes a los géneros Actinomyces,
Corynebacterium, Nocardia, Streptomyces, Actinomadura y Mycobacterium del Orden
Actinomycetales y sistematizar los requerimientos esenciales para lograr su cultivo en el
laboratorio.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
El estudiante, durante el desarrollo de la actividad práctica, deberá:

1) Realizar la coloración simple de azul de metileno sobre extendidos previamente fijados de
cultivos bacterianos de cepas de Corynebacterium.
2) Aplicar la coloración de Gram sobre extendidos, previamente fijados, de cultivos
bacterianos de cepas de Nocardia, Corynebacterium y Mycobacterium.
3) Aplicar la coloración de Ziehl-Neelsen a extendidos de cultivo de bacterias del género
Mycobacterium.
4) Observar microscópicamente los extendidos teñidos y dibujar lo observado.
5) Identificar los medios de cultivos, componentes y condiciones fisiológicas requeridas por
las bacterias de los géneros Actinomyces: Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium,
Streptomyces y Actinomadura.
6) Explicar el fundamento de la coloración de Ziehl-Neelsen y el valor de su aplicación en
Medicina.
CONSIDERACIONES TEORICAS:
Las familias comprendidas en el Orden Actinomycetales constituyen un diverso grupo de

bacilos Gram positivos, cortos o con tendencia a formar filamentos o cadenas, genéricamente son
conocidos como actinomicetos.
La mayoría son aerobias estrictas, excepto los géneros Corynebacterium y Actinomyces. En

algunas especies la multiplicación es lenta y tienden a no separarse después de la división celular,
formando cadenas de 1µm. de ancho e incluso filamentos ramificados, hasta 50 micras de largo.
La pared celular de estas bacterias contiene los componentes básicos del peptidoglicano:
N-acetilglucosamina, ácido murámico, alanina y ácido glutámico; sin embargo, los géneros del
Orden Actinomycetales, pueden diferenciarse por la presencia o ausencia de algunos aminoácidos,
lípidos o azúcares. Por ejemplo, las bacterias del género Mycobacterium poseen una pared celular
constituida por lípidos complejos que le confieren la propiedad de ser ácido resistente, y se tiñen
con la fucsina fenicada de Ziehl y se tiñen débilmente con la coloración de GRAM.
Las propiedades metabólicas y requerimientos nutricionales varían entre los géneros y

tiene importancia su conocimiento para el aislamiento e identificación de las diferentes especies.
Los géneros bacterianos, del orden Actinomycetales, a tratar en la actividad práctica

agrupan especies de importancia médica por ser agentes causales de enfermedades, tales como la
Actinomicosis, Difteria, Nocardiosis pulmonar, Micetomas, Tuberculosis y Lepra o Enfermedad de
Hansen.
CARACTERISTICAS GENERALES
GÉNERO: Actinomyces
Son bacilos Gram positivo, ramificados, delgados, mide entre 0,5 µ de diámetro y una
longitud entre 10 hasta 50 µ, son inmóviles, no esporulados, no capsulados y pertenecen a la
Microflora Normal. Se cultivan a temperatura optima de 37ºC y los requerimientos de oxigeno
son variables según las especies y en su mayoría son anaerobias estrictas. Se conocen mas de 100
especies bacterianas de las cuales las más importantes son: Actinomyces israelii, Actinomyces
naeslundii, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces viscosus.
La pared celular contiene N-acetilglucosamina, ácido muramico, alanina y ácido glutámico,

lisina, ornitina, galactosa y ácido aspártico. Carece de ácido diaminopimélico, ácidos micólicos y
arabinosa. Crecen en medios enriquecidos como el caldo de tioglicolato o el agar de infusión
cerebro corazón blando (medio semisólido), donde las microcolonias aparecen en las primeras 48
horas como “aracniformes” y al cabo de una semana se convierten en colonias blancas como
“dientes molares, en aproximadamente 7 días. La especie A. israelii es anaerobio obligado siendo
anaerobios facultativos las especies: Actinomyces naeslundi, Actinomyces odontolyticus y
Actinomyces viscosus
Forman parte de la flora normal de orofaringe y tracto gastrointestinal, crecen en nichos
anaeróbicos, en caries dentales, criptas amigdalinas e intestino distal. La infección es denominada
Actinomicosis y ocurre por rotura del epitelio mucoso a consecuencia de traumatismos o heridas.
Observe con objetivo 100x (inmersión) el extendido de un cultivo de Actinomyces, teñido

con coloración de Gram y dibuje lo observado.
Coloración de Gram
Género Corynebacterium
Está integrado por bacilos de 1 a 6 µ de longitud por 0,3 a 0,8 µ de diámetro, rectos o
ligeramente curvos, con los extremos redondeados, suelen estar agrupados en ángulos, X, Y,
configurando “letras chinas” o en empalizada. Son Gram positivo, a menudo contienen gránulos de
polimetafosfato o granulaciones de Babes-Ernst, los cuales aparecen teñidos intensamente en
tinciones con azul de metileno o por tinciones especiales como las de Albert y Neisser.
Son inmóviles, no esporulados, a pesar de considerarse anaerobios facultativos crecen

mejor en aerobiosis, a temperatura de 37ºC y pertenecen a la Microflora Normal.
La pared celular contiene arabinosa, galactosa y ácidos micólicos de cadena corta (22-36
átomos de carbono), sin embargo no presentan ácido alcohol resistencia.
Crecen en medios de agar sangre de carnero y medios selectivos como: suero coagulado
(medio de Loeffler), en medio de Pay y en el medio de agar cisteina-telurito de potasio. En este
último, las colonias toman una coloración negruzca debido a que el telurito es reducido
intracelularmente.
La especie tipo más importante en la patología humana es Corynebacterium diphtheriae,
agente causal de la Difteria, enfermedad prevenible por vacuna. Otras especies de importancia
médica que causan enfermedad en el hombre: Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium
pseudotuberculosis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium jeikeium (grupo JK),
Corynebacterium urealyticum. Las especies comensales de nasofaringe (Corynebacterium
haemolyticum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium striatum) y de piel
(Corynebacterium minutissimum) pueden producir enfermedad en pacientes con factores de
riesgo.
1) Realice la coloración de Gram y coloración con azul de metileno a extendidos previamente

fijados, procedentes de una colonia de Corynebacterium y observe con objetivo de 100x
Dibuje lo observado
Coloración de Gram Coloración Simple
(Azul de Metileno)
2) Observe las colonias en los medios de cultivo. Describa y dibuje lo observado.
Medio de Pay Medio de Agar sangre Telurito de potasio

Género Nocardia
Son bacilos Gram positivo que forman filamentos ramificados que pueden fragmentarse en
formas bacilares o cocoides. Produce filamentos de 0,5 a 1,2 µ de diámetro y una longitud hasta 50
µ. Son no capsulados, no esporulados e inmóviles. Su pared celular posee los componentes
básicos del peptidoglicano y ácido meso-diamino-pimélico, arabinosa y galactosa. Además
presenta los ácidos micólicos: ácidos grasos largos beta-hidroxilados y alfa-ramificados, saturados,
que poseen entre 40 a 60 átomos de carbono. En este género bacteriano son denominados ácidos
nocárdicos, lo cual les confiere parcial ácido resistencia. Las especies de importancia médica: N.
brasiliensis, N. asteroides, N. otitidis caviarum. Su habitat es el suelo y no forman parte de la
microbiota del hombre.
De escasa exigencia nutritiva, crecen en los medios ordinarios de laboratorio y se obtienen

mejores resultados en el medio utilizado para el cultivo de hongos como agar-sabouraud-dextrosa
sin antibióticos. Producen colonias con pigmentación desde blanco hasta naranja. Son aerobios
estrictos y crecen a temperatura entre 27 – 37ºC, generalmente a partir de 72 horas.
1) Observe el cultivo de Nocardia brasiliensis en medio agar sabouraud sin antibióticos.

Realice la coloración de Gram al extendido previamente fijado y dibuje lo observado.
Coloración de Gram
Géneros:
 Streptomyces.
 Actinomadura.
Género Mycobacterium
Comprende numerosas especies de bacilos Gram positivo, aunque con la coloración de

Gram se tiñen con dificultad debido a la estructura de su pared; no formadores de esporas, sin
flagelos ni cápsula. Son bacilos ligeramente curvos o rectos de 0,2-0,6µ de diámetro x 1,0 a 10 µ de
longitud, que pueden aparecer solos o agrupados, algunas especies son de la Microflora Normal.
La estructura celular consta de una gruesa pared: la más interna es el

peptidoglicano con moléculas de N-acetiglucosamina y ácido N-glucolilmurámico (en lugar
del N-acetilmurámico). Por encima de ésta hay otras tres capas compuestas: una, por
polimeros de arabinosa y galactosa (arabino-galactano), otra formada por lípidos
característicos de las micobacterias como son los ácidos grasos betahidroxilados alfa,
ramificados, de elevado peso molecular, de cadena larga (hasta 90 atomos de carbono)
denominados ácidos micólicos. En la parte más externa, asociados con la matriz de ácido
micólicos se encuentran lípidos superficiales como micósidos y sulfolípidos. Esta capa
lipídica representa un 60% de la pared celular y tambien se le atribuye la propiedad de
ácido resistencia. Son aerobios estrictos, de crecimiento lento y una sola especie,
Mycobacterium leprae no es cultivable en medios artificiales. Entre las especies de
importancia médica se encuentran: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae,
Mycobacterium bovis y las Micobacterias atípicas.
Estructura de la pared celular de Mycobacterium
Lipidos Superficiales
Ácidos micólicos
Arabinogalactano
Peptidoglicano
Membrana Celular
Coloración de Ziehl-Neelsen
Aunque las micobacterias son bacilos GRAM positivo, se tiñen irregularmente con esta
coloración, para su visualización al microscopio óptico se emplea la coloración de Ziehl-Neelsen. En
esta coloración son utilizados dos colorantes: Fucsina fenicada de Ziehl y Azul de metileno
(colorante de contraste) y alcohol clorhídrico, como decolorante.
La fucsina penetra en la pared bacteriana por acción del calor y se forma un complejo
estable entre la fucsina acidos micólicos de cadena larga y lípidos de la pared; este complejo se
mantiene unido cuando se aplica el alcohol-clorhidrico, de tal manera que los bacilos se mostraran
teñidos de color rojo sobre un fondo azul, este último debido a la coloración con azul de metileno,
que adquieren los demás microorganismos y células que no resisten la decoloración.
Debido a la estructura de su pared celular los bacilos del género Mycobacterium

presentan la relevante característica de ácido resistencia.
ACTIVIDAD PRÁCTICA:
Realice la coloración de Ziehl-Neelsen a un extendido previamente fijado. Es de suma

importancia que el extendido o frotis de la muestra clínica sea realizado debe en láminas porta-
objetos nuevas y desgrasadas, e identificar la lámina.
Técnica:
1) Cubra toda la lámina con fucsina fenicada de Ziehl, caliente pasando el mechero por
debajo de la lámina hasta la emisión de vapores (evite inhalar estos vapores) durante 10
minutos, el colorante debe mantenerse caliente durante los diez minutos, evitando la
ebullición. Elimine el colorante y lave abundantemente con agua de chorro.
2) Coloque la lámina en cubeta de decoloración y agregue solución de alcohol-clorhídrico
cubriendo toda la preparación. Deje actuar durante 5 minutos. Si es necesario cambie la
solución decolorante a mitad de tiempo. Finalizando los cinco minutos, lave con agua de
chorro.
3) Contraste: azul de metileno. Cubra toda la lámina con azul de metileno durante 1 minuto.
Descarte el colorante y lave con agua de chorro. Una vez seca la preparación observe al
microscopio con objetivo de inmersión.
Dibuje lo observado
Coloración de Ziehl – Neelsen
Observe el medio de cultivo de Lowenstein-Jensen e investigue su composición
Composición
AUTOEVALUACIÓN
1) ¿Cómo se comportan las bacterias del Orden Actinomycetales ante la coloración de GRAM
y que otras características comparten todos los géneros pertenecientes a este Orden?
2) ¿Cuáles son los requerimientos de oxígeno, temperatura y medios de cultivo del genero
Actinomyces?
3) ¿Cuáles son los requerimientos de oxigeno, temperatura y hábitat de las bacterias del
género Corynebacterium?
4) ¿En cuáles medios de cultivo se logra el crecimiento de Corynebacterium?
5) ¿El agar Sabouraud-dextrosa sin antibióticos es utilizado para aislar cuales géneros
bacterianos?
6) ¿Cuáles son los requerimientos de oxigeno, temperatura y hábitat de las bacterias del
género Nocardia, Actinomadura y Streptomyces?
7) ¿Por qué la coloración de GRAM no es de escogencia para teñir las Micobacterias?
8) ¿Cual es la composición de la pared bacteriana de las bacterias del género

Mycobacterium?
9) ¿Cuáles son los requerimientos de oxígeno, temperatura y medio de cultivos de las

bacterias del género Mycobacterium?
10) ¿Cuáles elementos permiten diferenciar la pared de las bacterias del género
Mycobacterium?
11) ¿Cuál es la tinción de elección para teñir las Micobacterias y por qué?
12) ¿En que se fundamenta la coloración de Zielh-Neelsen?
13) ¿Por qué es imprescindible utilizar laminas nuevas en los extendidos que se van a teñir
con Ziehl-Neelsen?
14) ¿Cómo observaría las bacterias no ácido-alcohol resistente después del último paso de la
coloración?
15) Seleccione una especie de cada género bacteriano, estudiado en esta actividad practica y
mencione las características de tinción, cultivo y requerimientos de temperatura y oxigeno.
BIBLIOGRAFÍA
 Microbiología Murray 6ª edición 2008.

 Microbiología Médica. Jawetz 19ª edición 2008.
 Microbiología Médica. García Rodríguez J.A. Picazo J.J.

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Republica Bolivariana de Venezuela

Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”

Lapso Académico 2019-1

El presente compendio está elaborado con la finalidad de proporcionar el material

El compendio se realizó mediante la recopilación y comisión de cuatro prácticas que

GUÍA PRÁCTICA Nº1

NORMAS INTERNAS DE CONDUCTA EN LAS PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA

1. Está prohibido fumar y comer en laboratorio, ambientes y servicios hospitalarios.

NORMAS DE TRABAJO Y DISCIPLINA EN EL LABORATORIO

Al finalizar la actividad teórica-práctica el estudiante estará en capacidad de aplicar los

1) Realizar un examen al fresco entre lámina y laminilla.

REQUISITO PARA REALIZAR LA ACTIVIDAD TEORICA-PRÁCTICA:

 Antes de asistir a la actividad, el estudiante tiene la responsabilidad del manejo de

ACTIVIDADES DEL DOCENTE:

Exposición demostrativa de:

1) Manejo de instrumental usado en el laboratorio de Microbiología: asa y aguja bacteriológica,

ACTIVIDADES QUE REALIZA EL ESTUDIANTE

Al finalizar la exposición demostrativa del docente, el alumno realizara:

Prueba escrita teórica-practica de selección y de respuestas cortas.

Pasos para el diagnóstico Microbiológico:

En el diagnóstico Microbiológico, el primer paso a realizar es la toma de muestra clínica y el

 Examen microscópico en fresco.

Examen microscópico al fresco

Este método permite la observación de las bacterias vivas y estudiar principalmente su

 Examen al fresco entre lámina y laminilla.

Técnica del examen en fresco entre lámina y laminilla

1. Utilizando el asa bacteriológica, previamente esterilizada en la llama de mechero,

Examen microscópico de preparaciones teñidas con colorantes

a. Preparación del frotis o extendido:

En el primer paso a realizar cuando se va a aplicar cualquier técnica de coloración.

Observación de los extendidos teñidos.

1) 1. COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO:

 *Fije la lámina con alcohol metílico por 3 minutos.

 *Realice una dilución de 1/10 del colorante de Giemsa

 *Agregue por 10 minutos el colorante a la lámina fijada con alcohol metílico.

 * Lavar, secar a temperatura ambiente.

Es una coloración compuesta (actúa mas de un colorante) y diferencial que permite la

Esta coloración tiene gran utilidad en Microbiología, permite seleccionar el medio de

Técnica: Coloración de Gram

De acuerdo a la coloración de GRAM, designamos como:

GRAM NEGATIVO: Las que se decoloran con alcohol-acetona.

Haga un extendido con el cultivo que se le proporciona y aplique la coloración indicada de

1. Staphylococcus spp. (cultivo sólido)

2. Streptococcus spp. (cultivo líquido)

Describa morfología y comportamiento ante coloración de GRAM:

3. Escherichia spp. (cultivo líquido)

4. Mezcla de bacterias. (cultivo líquido)

Coloración Azul de Metileno Coloración Gram

Observe la diferencia entre ambas coloraciones:

5. Diplococo tipo Neisseria. (observación de láminas coloreadas)

6. Diplococo tipo Neumococo. (observación de láminas coloreadas)

Describa la morfología y comportamiento ante el GRAM:

8. Observación microscópica del examen al fresco de ESPIROQUETA (Lestospira spp)

ESTAFILOCOCO BACILO GRAM DIPLOCOCO DIPLOCOCO

 Microbiología, Murray. Edición 5ta. 2006.

Republica Bolivariana de Venezuela

GUÍA PRÁCTICA Nº2

NORMAS INTERNAS DE CONDUCTA EN LAS PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA.