Guia Practica Citogenetica 2017

GUÍA DE PRÁCTICAS
FACULTAD DE MEDICINA ALBERTO HURTADO

ESCUELA PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MÉDICA
LABORATORIO CLINICO
CITOGENETICA HUMANA
Docentes
Lic. Héctor Herrera Reynoso
Lic. Rosmery Mena León
2017
1
2
CARATULA
1
INTRODUCCION 3
PRACTICA 01:
Preparación de medios de cultivo, reactivos y soluciones 4
PRACTICA 02:
Estudio de la cromatina sexual 9
PRACTICA 03:
Interpretación del estudio de la cromatina sexual 13
PRACTICA 04:
Preparación de medios de cultivo celular
18
PRACTICA 05:
Cultivo de cromosomas: cultivo de linfocitos 14
PRACTICA 06:
CULTIVO DE LINFOCITOS: Cosecha y Preparado Cromosómico. 16
PRACTICA 07:
Analisis convencional de cromosomas. 18
SEMANA N° 08 PRIMER EXAMEN ESCRITO

PRACTICA 09:
Técnicas de bandeo cromosómico
21
PRACTICA 10:
IDENTIFICACION DE CROMOSOMAS CON BANDAS GTG: Grupos A,B,F y G
23
PRACTICA 11:
IDENTIFICACION DE CROMOSOMAS CON BANDAS GTG: Grupos C, D y E
25
PRACTICA 12:
Identificacion de cromosomas en microfotografias de cariotipos normales
28
PRACTICA 13:
Identificacion de cromosomas en microfotografias de cariotipos anormales
30
PRACTICA 14:
Sistema Internacional de Nomenclatura Cromosómica
33
3
INTRODUCCION
El desarrollo de la ciencia y la Tecnología en estos últimos años ha tocado al
mundo de las ciencias de la salud. Tanto así que una de las áreas que más se ha
desarrollado gracias a los nuevos adelantos tecnológicos es la Genética Humana,
en especial la Citogenética.
La escasa bibliografía especializada y textos de consulta en esta área motivo al
autor ver conveniente elaborar la presente GUIA DE PRACTICA que servirá como
una guía básica para comprender los principales Métodos de estudio Citogenético
que se realizan en la práctica clínica. El esquema y contenidos de la presente
guía están ordenados en función al Programa de la asignatura de Citogenética
Humana que forma parte de la curricula del estudiante de la Escuela Académico
Profesional de Tecnología Médica en la Especialidad de Laboratorio Clínico y
Anatomía Patológica.
Con las prácticas diseñadas en esta guía los estudiantes podrán aprender y
adquirir las competencias que les permitan aplicar estas metodologías en un
laboratorio de citogenética clínica , así mismo permitirá a los estudiantes tener
una formación práctica importante que podrá aplicar en la realización de
trabajos de investigación que involucren procedimientos de diagnóstico de las
alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales que ocurren en un gran
número de patologías que aquejan al ser humano.
4
PRÁCTICA No. 1:
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y SOLUCIONES
1.1 MARCO TEÓRICO
La cálidad de los cromosomas para sus correspondiente análisis va a depender de

muchos factores, entre ellos se encuentran la buena preparación de los reactivos,
soluciones y medios de cultivo con sus respectivos volúmenes, tiempos y
concentraciones que a continuación se detallan:
MEDIOS DE CULTIVO
Comercialmente los medios de cultivo se consiguen en polvo e hidratados, la
presentación en polvo viene en frascos o sobres para la preparación de un litro. Se
recomienda el empleo de medios en polvo ya que son más estables y de mas fácil
almacenamiento.
Las especificaciones para la rehidratación de los diferentes medios (MEM, RPMI, TC 199)
vienen claramente definidos en las instrucciones proporcionadas por las casa
productoras.
Una vez rehidratado el medio,debe ser esterilizado por filtración a través de una
membrana de celulosa de 0.22 micras y empacado en frascos de 100 o 200 ml
previamente numerados para realizar el control de esterilidad, posteriormente se
procede a su almacenamiento en nevera.
FITOHEMAGLUTININA
La fitohemaglutinina M se consigue comercialmente liofilizada para rehidratar en 5 ml
de agua destilada estéril y usar directamente a partir de esta preparación.
La fitohemaglutinina P es mucho mas pura y concentrada, que la fitohemaglutinina M,
por lo cual se debe calcular la solución apropiada para que su concentración final en el
cultivo no sea mayor de 10 mg/ml , concentración que corresponde al tope de su
actividad mitogénica sin llegar a ser aglutinante.
COLCHICINA
Se prepara una Solución Madre al 0.16 % en agua destilada estéril. Congelada y
protegida de la luz es estable por más de un año.
La Solución se prepara a partir de la Solución Madre diluyendo 1/10 y se aplica 0.1 ml
por cada 5ml de cultivo.
CÁLCULOS
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SOLUCIÓN MADRE
0.16 grs. 100 ml
X 50 ml X = 0.08 grs
SOLUCIÓN DE USO DIARIO
1 ml de Solución Madre + 9 ml de agua destilada 0.16 mg/ml
SOLUCIÓN HIPOTÓNICA
La precisión en la preparación y el tiempo de tratamiento hipotónico son fundamentales

para la obtención de metafases óptimas para su estudio: abiertas, fáciles de contar y
con bajo número de cromosomas sobrepuestos.
Existen varios tipos de soluciones hipotónicas que incluyen: suero diluido al 20 %, citrato
de sodio al 1% o cloruro de potasio 0.075 M; el KCL es el más recomendado.
CÁLCULOS
KCL 0.075 M
74.56 grs. 1M
X 0.075 M X = 5.592 grs. 1000 ML
COLORANTE GIEMSA
Muchos laboratorios producen el colorante Giemsa en solución lista para su uso, sin
embargo también es frecuente disponer del reactivo en polvo. Para la preparación de un
litro de Giemsa se requiere:
 Colorante de Giemsa certificado en polvo 7.5 grs.

 Metanol 650 ml
 Glicerina 350 ml
Mezclar el metanol y la glicerina hasta obtener una solución homogénea, agitar

constantemente y adicionar el colorante. Para homogenizar la solución se recomienda el
empleo de perlas de vidrio. Se puede agilizar la disolución mediante un calentamiento
aproximadamente a 55-60 ºC con agitación constante.
Una vez solubilizado el colorante se filtra en papel Whatman y se conserva en frasco
oscuro cerrado herméticamente para evitar su deterioro.
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TAMPÓN GIEMSA PH 6.8
Consiste en una mezcla de Na2HPO4 0.06 M y KH2PO4 0.06M.
CÁLCULOS
SOLUCION A: KH2PO4 0.068M (Potasio Fosfato monobásico)
P.M. 136.09 grs. 1M
X 0.068M X= 8.165 grs. 1000 ML
SOLUCIÓN B: Na2HPO4
P.M. 142.O2 GR 1M
X 0.068MX= 8.52 grs. 1000Ml
TRIPSINA 1/250
Se prepara una solución al 1 % en agua destilada 100ml.Se agita manualmente o en
agitador magnético durante 10 minutos. Se filtra con papel Whatman No 1 y se separa
en alícuotas de 5 ml para almacenar congelada.
CALCULOS
1 grs. Tripsina 100 ml de agua destilada

Agitar 10 minutos antes de envasar, filtrar y
guardar en el congelador.
FIJADOR CARNOY
Este fijador está compuesto por metanol y ácido acético glacial en una proporción de
3:1. Ejemplo:
Metanol ------------------- 75ml
Acido acético glacial------25 ml.
POTASIO FOSFATO MONOBASICO (KH2PO4 0.025M)

Este fosfato se utiliza para preparar la bateria de bandeo GTG.
Se debe ajustar el pH a 7.0.
7
1.2 COMPETENCIAS:
 Contribuir a mejorar sus conocimientos en el contexto del ámbito científico,
sentando las bases para su formación docente e investigadora.
 Los alumnos adquirirán conocimientos sobre preparación de soluciones normales,
molares.
 Capacidad de aplicar los conocimientos en la práctica.
 Capacidad de resolución de problemas.
 Trabajar en equipo
1.3 MATERIALES Y EQUIPOS
a. Materiales:
 Matraz 250ml y 500 ml
 Probeta 100ml y 250 ml
 Fiola de 100 ml y 250 ml
 Pipetas Volumétricas de 5ml y 10ml
 Embudo de vidrio
 Baguetas
 Papel filtro
 Propipetas
b. Reactivos:
Alcohol etílico absoluto 200 ml

Cloruro de Potasio 6 gr
Fosfato Monopotásico (KH2P04) 9 gr
Agarosa 4 gr
Tripsina Porcina 1/250 (Gibco) 2 gr
Timidina 1 gr
Agua destilada 1000 ml
c.- Equipos:
 Balanza Analítica
1.4. PROCEDIMIENTO
Según la aplicación de las fórmulas y cálculos aplicados para la preparación de
soluciones normales, molares, porcentuales.
1.5 RESULTADO
 Aplicación correcta de las fórmulas y cálculos para la preparación de reactivos,

soluciones y colorantes.
 Preparación correcta de las soluciones, reactivos y colorantes
 Discusión de los problemas presentados en la realización de la práctica que
influyan en el resultado
 Numeración de las posibles soluciones.
1.6 CUESTIONARIO
1.- Qué criterios utilizaría para la preparación de soluciones normales y molares sin
utilizar una fórmula química?
8
2.- En qué procedimientos de los estudios citogenéticos se utiliza Fitohemaglutinina,
solución hipotónica, fijador carnoy. Mencione la función que cumplen.
3.- En que procedimientos de los estudios citogenéticos se utiliza el colorante
Giemsa, Tripsina 1%. Mencione la función que cumplen.
1.7 FUENTES DE INFORMACION

1.- Resumen de la evolución de las técnicas de citogenética y genética molecular para
la identificación de las alteraciones genéticas del desarrollo embrionario. M.L.
Martínez- Fernández, M.D. Sánchez-Izquierdo. Semergen.2010;36(9):520–525
2.- Robert F. Muller, Ian Young. EMERY’S GENÉTICA MÉDICA. Editorial Marban. 2009
3.- J. Solari y Col. GENÉTICA MÉDICA. Ed. Manual Moderno. 2010.
4.- Thompson J. Thompson M. GENÉTICA MÉDICA. Ed. Salvat. 2010
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PRÁCTICA No. 2
ESTUDIO DE LA CROMATINA SEXUAL
2.1 MARCO TEÓRICO

Es bien sabido que las mujeres poseen dos cromosomas X y los hombres solo tienen
uno. Durante la mayor parte de este siglo sabemos que el cromosoma X contiene
muchos genes codificadores de proteínas importantes. Así, las mujeres tienen dos
copias de cada gen ligado al cromosoma X, mientras que los hombres únicamente
poseen una copia.
Se sabe desde los comienzos de este siglo que las células masculinas difieren de las
femeninas normales por su complemento de cromosomas sexuales, pero no se verificó
hasta 1921 con el descubrimiento de una diferencia entre las células masculinas y
femeninas, visibles en la interface. El Dr. Barr de la universidad de Westeer Ontario y
su alumno E. G. Bertram, observaron la existencia de una pequeña masa de
cromatina, reconocida ya previamente, pero mal interpretada, que se situaba en el
núcleo de algunas células nerviosas; esta masa era muy frecuente en las mujeres y en
cambio, muy rara en los hombres; se conoce en la actualidad con el nombre de
Cuerpo de Barr.
2.2 COMPETENCIAS:
 Contribuir a mejorar sus conocimientos en el contexto del ámbito científico,
sentando las bases para su formación docente e investigadora.
 Los alumnos adquirirán conocimientos sobre el manejo de técnicas citogenéticas
que los pueden servir para integrarse en grupos de investigación de Servicios de
Genética de Hospitales, institutos de investigación, salud pública, etc.
 Trabajar en equipo
2.3 Materiales y Equipos
a. Materiales:
 Matraz 250ml
 Probeta 100ml
 Pipetas Volumétricas de 5ml y 10ml
 Pipetas Pasteur de 3 ml
 Frascos color caramelo 100 ml
 Baguetas
 Papel Filtro
 Embudo
 Espátulas
10
b. Reactivos
Alcohol etílico absoluto 200 ml

Éter etílico 100 ml
Acido Clorhídrico qp 100 ml
Fucsina básica 3g
Ácido fenico 5% 200 ml
Ácido Acético glacial 10 ml
Formol 40% 10 ml
Agua Destilada 200ml
c.- Equipos:
 Balanza Analítica
2.4 PROCEDIMIENTO
TÉCNICA DEL CARBOL FUCSINA:
a.- Toma de Muestra :
Se recomienda que se haga un enjuague bucal, o se haga una higiene bucal
utilizando una gasa, previa al momento de toma de muestra.
Utilizando una lámina portaobjetos limpia se hace un raspado de la mucosa
oral, y luego se hace un frotis sobre una lámina portaobjetos, evitando retornar
la lamina por el mismo lugar del extendido
b.- Fijación:
Una vez tomada, la muestra colocar la lámina en un frasco (Koplins) que contenga al
fijador durante 15 minutos como tiempo mínimo, aunque lo podemos dejar por más
tiempo (1 semana) sin que la muestra se deteriore.
c.- Hidrólisis:
Dejar secar, y luego colocarlo en un frasco (Koplins) que contenga el HCl 5N por un
tiempo de 10 segundos o más, dependiendo del tiempo de fijación.
d.- Lavado:
Una vez retirada la muestra de la Solución de Hidrólisis, pasar al frasco (Koplins) que
contenga Agua Destilada o Agua simple para detener la acción del HCL.
e.- Coloración:
Luego del lavado, la lámina es cubierta por el colorante Carbol Fucsina. El tiempo
de coloración dependerá fundamentalmente del grado de madurez y/ o tiempo de
preparado el colorante. Tiempo promedio 5 a 10 minutos.
f.- Decoloración:
Luego la lamina deberá ser pasada sucesivamente en dos frascos (Koplins) que
contenga Alcohol Etílico 70% y Alcohol Etílico 100%, a manera de lavados rápidos.
g.- Observación al Microscopio:
11
Una vez seca la lámina se procede a observar en el microscopio primero con objetivo
de 10X para seleccionar el campo a estudiar y luego se pasa a objetivo de 100X para
realizar el recuento de corpúsculos de Barr siguiendo un criterio el conteo
preestablecido.
2.5 RESULTADOS
CRITERIOS PARA EL RECUENTO DE CORPÚSCULOS DE BARR

 Se considera como cromatina X (Corpúsculo de Barr) solamente el corpúsculo
Heteropicnótico que se encuentra situada periféricamente y pegado a la cara
interna de la membrana nuclear (carioteca).
 Se debe contar solo los núcleos que tengan membrana nuclear completa y cuya
cromatina este finalmente distribuida así presente o no el corpúsculo de Barr,
para luego sacar el porcentaje de CB observados en a muestra. Para esto se
deberá contar no menos de 100 núcleos.
 No entran en el recuento los núcleos que estén superpuestos o plegados.
 No entran en el recuento los núcleos cuya cromatina sea heteropicnótica y
distribuida de forma irregular.
 No entran en el recuento los núcleos vacuolizados, ni núcleos que estén
contaminados por gérmenes.
NOTA: En el recuento de los CORPÚSCULOS DE BARR no solo se deberá tener en cuenta

el numero de corpúsculos presentes si no también se deberá poner especial interés en la
morfología y el tamaño del corpúsculo. Las formas de corpúsculo pueden ser
redondeados, triangulares, trapezoidales, barra, etc. Pero siempre pegados a la
membrana nuclear. Se pondrá atención también al tamaño, si es demasiado pequeño o
demasiado grande ya que en estos casos se asocian con una deleción o isocromosoma
del X, que deberá ser necesariamente confirmado con el estudio de cariotipo.
VALORES NORMALES
Mujeres: 20 – 40%
Varones: 0%
2.6 CUESTIONARIO:
¿Existen Metodologías alternas para la observación del CB, mencione las ventajas y cual
es el tipo de muestra a utilizar?
¿Cuáles son las Hipótesis de Mary Lyon?
¿Cómo se produce la Inactivación molecular del Cromosoma X?
12
2.7 FUENTES DE INFORMACIÓN
Martínez-Fernández, M.D. Sánchez-Izquierdo. Semergen.2010;36(9):520–525
13
PRÁCTICA No. 3
INTERPRETACION DEL ESTUDIO DE LA CROMATINA SEXUAL
3.1 MARCO TEÓRICO:
En 1949 Barr y Bertram descubrieron una masa de cromatina sexual en células en

interfase femenina y no masculina que inicialmente las mal denominaron SATELITES
DE NUCLEOLO. A esta observación le siguió el desarrollo de una técnica sencilla que
permitía detectar los Cuerpos de Barr en células de mucosa oral. Lo que llevo a la
conclusión que las mujeres son CB positivas y los varones CB negativos en condiciones
normales.
Actualmente se sabe que el corpúsculo de Barr representa uno de los cromosomas X

de las células de las hembras, el X que contempla su replica, mas tarde que su
homólogo y queda condensado e inactivo genéticamente a lo largo de las interfaces.
En 1959 Ohno, Kaplan y Kinosita demostraron que la cromatina X corresponde a la

condensación de uno solo de los cromosomas X en la mujer. Cuando un cromosoma
o parte de este difiere de la mayoría en un ciclo de condensación, se dice que
exhibe heteropicnosis, por lo tanto, el cuerpo de Barr es el resultado de la
heteropicnosis positiva de un cromosoma X durante la interfase.
La INACTIVACION EL CROMOSOMA X fue explicada en 1961 por Mary Lyon quien detalla
lo que se denomina en general "LA HIPÓTESIS DE LYON", basa su hipótesis en parte
sobre observaciones genéticas de los genes ligados al cromosoma X que determinan el
color de la piel del ratón y en parte sobre datos citológicos.
 En las células somáticas de las hembras de los mamíferos, solo un cromosoma X

es activo. El segundo cromosoma X esta condensado e inactivo y aparece en las
células en la interfase como cromatina sexual.
 La inactivación se origina al comienzo de la vida embrionaria (14avo día).
 El cromosoma X INACTIVO puede ser indistintamente un X paterno o materno (Xp
y Xm) en células diferentes del mismo individuo; pero una vez inactivado un
cromosoma X en una célula, este permanecerá inactivo en todos los descendientes
de dicha célula. En otros términos, la inactivación es ALEATORIA, pero FIJA.
Como consecuencia de la inactivación del cromosoma X, todas las mujeres tienen dos
poblaciones distintas de células: una población posee un cromosoma X activo
procedente del padre y la otra posee un cromosoma X activo de la madre. Al tener dos
poblaciones de células, las mujeres son mosaicos para el cromosoma X.
14
Aunque la inactivación es aleatoria entre las células que constituyen el embrión, en las
células que formaran el tejido extraembrionario sólo se inactiva el cromosoma X
procedente del padre. Aunque la inactivación del cromosoma X es permanente en todas
las células somáticas de la mujer, el cromosoma X inactivo debe reactivarse en la línea
germinal de las mujeres, de modo que cada óvulo recibirá una copia activa del
Cromosoma.
XIST codifica para un RNA de 17kb poliadenilado que no se traduce y es inestable (200 a
1000 / célula). También se transcribe Tsix.
XIST es un gen localizado dentro de una región denominada XIC (Xq13.2). Unos
pocos genes del cromosoma X inactivo, 15% permanecen activos, incluyendo el gen
XIST.
15
3.2 COMPETENCIAS:
 Observar la evidencia citológica del cromosoma X inactivo
 Capacidad de resolución de problemas y Trabajar en equipo.
3.3 MATERIALES Y EQUIPOS

a.- Materiales
 Puente de coloración
 Embudo de vidrio
 Koplins
b.- Reactivos
 Colorante Carbol-Fucsina (solución de trabajo)
 Alcohol- Eter etílico v/v
 HCl 5N
 Alcohol Etílico 96°
 Papel Filtro
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 Láminas Portaobjetos
 Marcador de vidrio
c.- Equipos
 Microscopio Binocular
 Aceite de inmersión
 Equipo de limpieza de microscopio
3.4 PROCEDIMIENTO:
. Observación al Microscopio:
Una vez seca la lámina se procede a observar en el microscopio primero con objetivo
de 10X para seleccionar el campo a estudiar y luego se pasa a objetivo de 100X para
realizar el recuento de corpúsculos de Barr siguiendo un criterio el conteo
preestablecido.
3.5 RESULTADOS
Los corpúsculos de Barr se identificarán como una masa heteropicnótica pegada a la
membrana nuclear. Ver esquemas (abajo)
Podemos observar en el PMN, el de la derecha presenta el corpúsculo CB en la forma de

Palillo de Tambor, mientras que el de la izquierda no.
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3.6 CUESTIONARIO:
a. Paciente con fenotipo femenino con corpúsculo barr positivo 12%. Escriba usted
el o los probables cariotipos. Así como su Dx. citogenético.
b. Paciente con fenotipo femenino con corpúsculo barr únicos 25% y corpúsculos
barr dobles 15%. Escriba usted el ó los probables cariotipos. Así como su Dx.
citogenético.
c. Paciente con fenotipo femenino con corpúsculo barr positivo 10%, pero estos
corpúsculos son pequeños. Escriba usted el o los cariotipos probables, así como su
diagnóstico citogenético.
d. Paciente con fenotipo femenino con corpúsculo de barr positivo 28%, pero estos
corpúsculos son grandes. Escriba usted el o los cariotipos probables, así como su
Dx. citogenético.
e. Paciente con fenotipo femenino con corpúsculo barr doble 25% y corpúsculo barr
triple 22%. Escriba usted el o los cariotipos probables, así como su Dx citogenético.
f. Recién nacido con genitales ambiguos con corpúsculo barr positivo 30%. Escriba
usted el o los probables cariotipos, así como sus Dx citogenético.
g. Recién nacido con genitales externos femeninos, con ecografía que evidencian
testículos, presenta corpúsculo barr negativo. Escriba usted el o los probables
cariotipos, así como los Dx. citogenéticos.
h. Recién nacido con genitales externos masculinos, con ecografía que evidencian
ovarios, presenta corpúsculo barr positivo 25%. Escriba usted el o los probables
cariotipos, así como los Dx. citogenéticos.
i. Paciente con fenotipo masculino presenta corpúsculo barr único positivo 26%
pero además presenta doble corpúsculo Y. Escriba usted el o los probables
cariotipos, así como los Dx citogenéticos.
3.7. FUENTES DE INFORMACIÓN

Martínez-Fernández, M.D. Sánchez-Izquierdo. Semergen.2010;36(9):520–525
18
PRÁCTICA No. 4
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO CELULAR
4.1. Marco Teórico

Para el estudio Citogenético (Estudio Cromosómico) es necesario que las células estén
en división celular (Mitosis) ya que los cromosomas sólo podrán ser analizados, de
acuerdo a su morfología y patrón de bandas, cuando las células estén en el estadio de
metafase.
Algunas células de nuestro organismo normalmente pueden estar en un proceso de

proliferación y diferenciación por lo que no es necesario estimularlos para que entren
en división celular; pero otras células como los linfocitos de sangre periférica como son
células ya diferenciadas requieren de un estimulante mitógeno para que entren en
mitosis.
MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo celular son compuestos que contienen: Aminoácidos,
vitaminas y cofactores, enzimas y coenzimas, sales, iones, indicadores de pH. Todo
lo necesario para que la célula pueda dividirse in vitro.
Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionaran dependiendo del

tipo de muestra o tipo de célula a cultivar y lograr que estos respondan
adecuadamente con un crecimiento celular, así tenemos:
a. MEDIO McCoy's 5 MODIFIED: Utilizado con más frecuencia para

• Sangre periférica (Linfocitos).
• Cultivo de Médula Ósea
b. MEDIO Tc 199: Utilizado en condiciones especiales
• Deficiencia de ácido fólico.
Para el estudio de Cromosoma X frágil.
• Utilizado también para el cultivo de sangre periférica (Linfocitos).
c. MEDIO Ham F10 o Ham F12: Utilizado con más frecuencia para:
• Cultivo de piel.
• Cultivo inicial de líquido amniótico (células fetales)
• Cultivo de tumores (células neoplásicas)
d. MEDIO RPMI 1640: Utilizado para:
• Sangre periférica (Linfocitos)
e. MEDIO DE CULTIVO CHANG B + CHANG C: Utilizado para:
• Cultivo de vellosidades coriales.
• Cultivo de liquido amniótico (células fetales)
f. MEDIO AMNIOMAX: Utilizado para:
• Cultivo de vellosidades coriales.
19
• Cultivo de liquido amniótico (células fetales)
SUPLEMENTOS:
Además del medio de cultivo base las células requieren para su crecimiento y
división celular de suplementos, los cuales serán utilizados dependiendo del tipo de
células que se desea cultivar. Así tenemos:
a. SUERO BOVINO FETAL (SBF): Se utiliza a diferentes concentraciones:

• Para el estudio de X frágil al 5%
• Para Cultivo de Sangre Periférica y cultivo de Medula Ósea al 20%.
• Para Cultivo de Liquido Amniótico (células fetales) al 30%.
b. PENICILINA + ESTREPTOMICINA: utilizado como antibiótico para impedir la
contaminación bacteriana.
c. FUNGIZONA: Utilizado como antimicótico en caso que fuera necesario.
d. L - GLUTAMINA: Utilizado para mejorar el crecimiento celular.
e. FITOHEMAGLUTININA (PHA): Utilizado solo en caso de cultivo de sangre
periférica (linfocitos) como un estimulante mitogénico.
4.2. Competencias:
4.3. Materiales y Equipos
a.- Equipos:
.- Balanza analítica
.- Agitador mecánico
.- pH metro
b. Materiales:
 Probeta 100 ml
 Matraz 250 ml
 Pipeta de 5 ml y 10 ml
 Bagueta
 Filtro millipore estéril 0,22 micras
 Jeringas de 20 ml
c. Reactivos:
 Colchicina
 Cloruro de Potasio
 Fosfato Monopotásico: KH2PO4
 Tripsina 1/250
 Metanol qp
 Acido Acético Glacial qp
 Medio de Cultivo RPMI 1640 (Gibco Lab)
 Suero Bovino Fetal (Gibco Lab)
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 Penicillina + estreptomicina (Gibco Lab)
 L-Glutamina (Gibco Lab.)
 Fitohemaglutinina (Gibco Lab)
 Colorante Giemsa
 Agua destilada
 Alcohol etílico absoluto
 NaOH qp (perlas)
4.4 Procedimiento
PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Este procedimiento se sigue cuando el Medio de Cultivo base (McCOY'S 5A Modified,
RPMI 1640, F1O, F12, etc.) está en polvo.
a. Pesar la cantidad de gramos de medio a preparar. Ejemplo: Preparación del

Medio McCOY's 5A Modified. Pesar 12gr Para un volumen de 1000ml.
b. Disolver lo pesado en el volumen respectivo de agua bidestilada y agitar en un vortex
por 10 minutos o agitar manualmente.
c. Se pesa Bicarbonato de Sodio CO3HNa. Cada medio de cultivo requiere una cantidad
adecuada de CO3HNa. Ver lista de preparación de reactivos.
d. Se adiciona el CO3HNa al frasco y seguir con la agitación.
e. Se adiciona el Suero Bovino Fetal al medio en la concentración necesaria para cada
cultivo. Ej.: Para 1000ml McCOY's se le adiciona 250ml (SBF 20%).
f. Adicionar al medio 2cc de Penicilina + Estreptomicina por cada 100ml de medio a
preparar y continuar con la agitación por 5 minutos.
g. Ajustar el pH del medio a 7.0 ± 0.2 utilizando HCl 1N o OHNa 1N. Generalmente se
utilizan los medios a este pH, pero en algunos casos como cultivo de células fetales (LA)
se usa pH ácido 6.0 ± 0.2.
h. Para el caso de cultivo de Sangre (linfocitos) se adicionará la PHA tipo M en
proporción de 2cc/100ml de medio preparado. Se recomienda adicionar la
PHA después de esterilizado el medio y en el momento de su uso.
i. La esterilización del Medio de Cultivo: Se realiza solamente por filtración al vacío
utilizando Filtros Millipore de 0.22µm.
j. Control de Esterilidad: Una vez filtrado todo el medio se recomienda alicuotar en
frascos de 50ml o 100ml y se controla la esterilidad colocando los frascos en estufa a
370C por 24 a 48hrs. NOTA: Si el Medio cambia de color (amarillo) o se observa una
turbidez o flóculos es mejor desechar los frascos porque probablemente están
contaminados.
k. Finalmente, los medios de cultivo se guardan en congelación a -4.0 o -20.0 hasta su
uso.
4.5 Resultados
 Los medios de cultivo, reactivos y colorantes deberán prepararse de acuerdo a
como esté indicado para cada tipo de cultivo.
 Se deberá realizar la siembra con la mayor esterilidad posible.
 No deberán ser modificados los tiempos o rangos de centrifugación ni las
temperaturas incubación inadecuadamente.
21
 Deberá tenerse en cuenta que son muchas las causas que interfieren con el
normal desarrollo de la mitosis y que incluso producen alteraciones cromosómicas.
Estos agentes interferentes pueden ser de naturaleza física como los rayos X, la Luz
Ultravioleta, cambios bruscos de temperatura, campo magnético u ondas sonoras.
4.6 Cuestionario
.- ¿Qué otros inhibidores mitóticos se pueden utilizar en el cultivo de linfocitos?
.- ¿Qué otros estimulantes mitogénicos se pueden utilizar en el cultivo de linfocitos?
.- ¿Cómo actúan específicamente los estimulantes mitogénicos?
.- ¿Qué otras soluciones hipotónicas se pueden utilizar en el cultivo de células para el
estudio cromosómico?
4.7 Fuentes de Información

la
identificación de las alteraciones genéticas del desarrollo embrionario. M.L.
Martínez-
Fernández, M.D. Sánchez-Izquierdo. Semergen.2010;36(9):520–525
5.- Estudio del cariotipo humano. Aplicación en la vida prenatal y postnatal en una
clínica de
reproducción asistida. Tesis para optar Título Bióloga. María de Jesús Gaytán García.
UNAM.
México. 2009
22
PRÁCTICA No.5
CULTIVO DE CROMOSOMAS: CULTIVO DE LINFOCITOS
5.1. Marco Teórico
Una de las alteraciones genéticas frecuentes, se debe a un defecto en los

cromosomas ya sea por una alteración del número o una alteración en su estructura
(deleciones, translocaciones, inserciones, etc.); esta causa de alteración genética
motivó a los investigadores a desarrollar técnicas de cultivo que permitieran el estudio
de los cromosomas. Así desde la década del 50 se desarrollaron técnicas de cultivo
celular lo cual permitió a Soe Thio y Albert Levan en 1956 demostrar una preparación
a través del cual se podía observar separadamente cada uno de los cromosomas.
Este descubrimiento hizo posible hacer el recuento del número de cromosomas y
estudiar su configuración individual. Como resultado de estas investigaciones se
concluyó que el humano tenía un número diploide de cromosomas, (46) puesto que
antes se consideraba que eran 48 cromosomas. Esta observación fue confirmada por
Ford y Hamerton.
Más tarde reportes de otros investigadores presentaron técnicas que aumentaban

grandemente la fineza de la preparación de los cromosomas. Un ejemplo de estos
hallazgos es la adición de Phitohemaglutinina (PHA) en el medio de cultivo celular. La
PHA es un extracto salino de un tipo de fríjol rojo llamado Phaseolus vulgaris. La
PHA fue originalmente utilizada dentro de su capacidad para producir
hemoaglutinación. Más tarde, Nowell descubrió su propiedad mitógenica.
Para el estudio Citogenético es necesario que las células estén en división celular
(Mitosis) ya que los cromosomas sólo podrán ser analizados, de acuerdo a su morfología
y patrón de bandas, cuando las células estén en el estadio de metafase.
Por ello aprenderemos la metodología para la obtención de metafases a partir de un

Cultivo de Sangre Periférica (Linfocitos), para luego hacer la observación directa de los
cromosomas
5.2. Competencias:
 Capacidad de identificación y diferenciación cromosómica.
 Capacidad de aplicación e implementación en un Laboratorio
a.- Equipos:
.- Cámara de Flujo Laminar
23
.- Mechero de Bunsen
.
b. Materiales:
 Pipeta estéril de 5 ml y 10 ml
 Jeringa de 1 ml
 Agujas descartables 21 X 1”
 Ligadura
 Gradillas de tubos
 Tubos Estériles Falcon de 15 ml
 Frascos de cultivo estéril Falcon de 50 ml 1
c. Reactivos:
 Medio PB- Max Kariotyping Medium
 Medio RPMI Completo
 Suero Bovino Fetal
 Fitohemaglutinina
 Algodón
 Heparina sódica 2,500 UI
5.4 Procedimiento:
5.4.1 TOMA DE LA MUESTRA:
Se obtiene 5ml de sangre venosa teniendo en cuenta todas las medidas de bioseguridad,
con una jeringa previamente cargada con 0.1 ml de heparina sódica.
Tomada la muestra se deja la jeringa en posición vertical con la aguja hacia abajo el
tiempo necesario para que sedimente el paquete globular.
5.4.2 SIEMBRA DE LA MUESTRA:

Se elimina el paquete globular de la jeringa, dejándose la interfase entre el paquete
globular y el plasma, donde se encuentra la mayor cantidad de glóbulos blancos que
se utilizaran para la siembra.
Se adiciona al frasco de cultivo 1 a 1.5ml de la muestra (plasma + elementos

celulares). Mezclar suavemente y cerrar herméticamente el frasco de cultivo. Se deja
en incubación en una estufa a 37oC por 72 horas. Todo el procedimiento de la siembra
se debe realizar en absoluta esterilidad, diariamente se debe de mezclar el frasco de
cultivo y observar si hay cambios de color del medio o turbidez que nos indicaría una
probable contaminación.
5.5 Resultados.
Los cultivos luego de la siembra e incubación deberán permitir un crecimiento
adecuado de los linfocitos. La división celular de los linfocitos puede ser evaluada
subjetivamente por el cambio de color del medio (ligeramente amarillo) por cambio de
pH del medio.
24
5.6 Cuestionario
1.- ¿Qué pasaría si las muestras son tomadas con otro anticoagulante (EDTA, Citrato,
Oxalato,etc). Por qué?
2.- ¿Cómo se debe transportar ó enviar las muestras a los laboratorios de citogenética
si están a distancias de 24 ó 48 horas?
3.- ¿Qué pasaría si los cultivos se cosechan a las 24 ó 48 horas de la siembra?
1.- Resumen de la evolución de las técnicas de citogenética y genética molecular para la

identificación de las alteraciones genéticas del desarrollo embrionario. M.L. Martínez-
5.- Estudio del cariotipo humano. Aplicación en la vida prenatal y postnatal en una clínica de
reproducción asistida. Tesis para optar Título Bióloga. María de Jesús Gaytán García. UNAM.
México. 2009
25
PRÁCTICA No.6
CULTIVO DE LINFOCITOS: Cosecha y Preparado Cromosómico.
6.1. Marco Teórico
En estos cultivos las células crecen libres en el medio (en suspensión), sin adherirse a las
paredes del recipiente en que se encuentran. Las condiciones de cultivo varían de
acuerdo al tipo de anomalía sospechada y a las características que se deseen observar.
Se pueden utilizar diferentes clases de medio, los más apropiados incluyen: RPMI 1640,
Medio Esencial Mínimo (MEM) y medio TC 199; a los cuales se les adiciona suero fetal
bovino (SFB) inactivado, que proporciona enriquecimiento al medio; como estimulante
mitogènico se adiciona fitohemaglutinina (PHA).
En presencia de la PHA, los linfocitos pequeños se transforman en células

indiferenciadas grandes, denominadas blásticas, que tienen núcleo redondo uno o dos
nucleolos, citoplasma basófilo y entran en la primera mitosis a las 48 horas de cultivo.
Otro hallazgo fue el uso de Colchicina, una sustancia derivada del Autumn Crocus
que tiene un efecto especifico de inhibición mitótica deteniendo la división en el
estadio de metafase. Esto permite la acumulación de células en metafase en el
cultivo. Hughes y Hsu reportaron que el pre-tratamiento de las células en mitosis con
una solución hipotónica causaba la absorción de líquido y el hinchamiento de la célula,
facilitando la separación de los cromosomas. Moorehead y colaboradores fueron los
primeros en describir el método del cultivo de linfocitos de sangre periférica.
6.2. Competencias:
 Capacidad de identificación y diferenciación cromosómica.
 Capacidad de aplicación e implementación en un Laboratorio
a.- Equipos:
.- Centrifuga de tubos
.- Estufa a 37°C
.- Baño María
.- Vortex
.- Refrigeradora
.
b. Materiales:
26
 Pipeta pasteur de vidrio de 3 ml
 Pipetas de 5 ml
 Propipetas
 Micropipeta de 10-100 ul
 Puntas amarillas
c. Reactivos:
 Metanol absoluto qp
 Acido Acético Glacial qp
 Cloruro de Potasio
 Colchicina
6.4 Procedimiento:
6.4.1 COSECHA DE LA MUESTRA :
.- Cumplida las 72 horas se saca el frasco de cultivo de la estufa y se agregar

100µl de Colchicina al 0.1µgr/ml. Mezclar suavemente e incubar en estufa a 37°C
por 50 minutos.
.- Centrifugar a 1000rpm por 10min. Luego utilizando una pipeta Pasteur, decantar o
eliminar el sobrenadante y homogenizar el sedimento o Pellet..
.- Luego agregar 6ml de Cloruro de Potasio 0.075M (solución Hipotónica) y agitar

bien el Pellet usando la pipeta Pasteur por 2 ó 3 minutos. Se colocará el tubo en
la estufa a 37oC durante 10 minutos.
NOTA: El tiempo de exposición en la solución Hipotónica no deberá exceder en

ningún caso más de 15minutos.
.- Sacar el tubo de la estufa y agregar de 5 a 8 gotas de fijador Carnoy (recién
preparado), para detener la acción de la solución Hipotónica. Mezclar suavemente
usando una pipeta Pasteur.
.-Luego se centrifuga a 1000rpm por 10min. Utilizando una pipeta Pasteur eliminar el
sobrenadante y resuspender el Pellet. Agregar 5ml de fijador Carnoy, el 1er ml
agregarlo gota a gota, el resto puede hacerse más rápido.
.-Utilizando una pipeta Pasteur agite y deje fijándolo por 30 minutos a To ambiente.
NOTA: En este paso puede dejarse fijando el cultivo por 24h (o más tiempo si
fuera necesario) a To de refrigeración. Luego se centrifuga a 1000rpm por 10min y
se procede con los siguientes pasos.
.-Eliminar el sobrenadante y resuspender el Pellet usando una pipeta Pasteur. Se

adicionará 5ml de fijador y nuevamente centrifugar a 1000 RPM. Se repite este
paso 3 veces a manera de lavados con fijador.
27
.-El Pellet obtenido finalmente se debe resuspender con 1 a 2 ml. de fijador (esta
cantidad puede variar dependiendo de la cantidad de Pellet) hasta obtener una
suspensión opalescente.
6.4.2 PREPARACION DE LAMINAS :
Las láminas portaobjetos son limpiadas previamente con una mezcla de alcohol y
acetona, se almacenaran en la nevera hasta el momento de su empleo
La preparación de las láminas se obtiene añadiendo 3 ó 4 gotas de la suspensión
final sobre las laminas portaobjetos a una distancia de 20 a 30cm de altura y soplar
para obtener un extendido homogéneo. Secar la lámina usando un mechero de
alcohol.
6.5 Resultados
COLORACIÓN Y OBSERVACIÓN DE LAMINAS:

 Se prepara la solución colorante de Giemsa al 4% en un Koplyns.
 Se introducen las láminas y dejarlo por espacio de 6 minutos.
 Enjuagar con agua destilada y secarlo usando papel filtro.
La metafase seleccionada deberá ser una metafase aislada y que presente los
cromosomas separados, no sobrepuestos, para lograr una fácil visualización
6.6 Cuestionario
6.1 ¿Que sucederá si nuestra muestra es incubada por más de 15 minutos (30
minutos o más) con la Solución Hipotónica?
6.2 Que sucederá si nuestra muestra es incubada por más tiempo (1h30 m ó mas)
o menos tiempo (15 a 30 minutos) con la colchicina?

México. 2009
28
PRÁCTICA No.7
ANALISIS CONVENCIONAL DE CROMOSOMAS.
7.1. Marco Teórico

Las primeras observaciones de cromosomas humanos se remontan a 1956, en que Tjio y
Levin por primera vez determinaron que el número de cromosomas humanos era de 46 y
no 48. Poco tiempo después Lejeune describió la primera anomalía citogenética: trisomía
21. Para ponerse de acuerdo respecto a cómo nombrar cada cromosoma, etc, se
realizaron sucesivas Conferencias en los años 1960 (Denver), 66 (Chicago), 71 (París) y
75 y 78 y posteriormente varios Complementos de la de París, conforme aparecen
nuevas técnicas, que han dejado determinado un sistema universal de nomenclatura de
los cromosomas y sus regiones.
La clasificación de los cromosomas por grupos no permite identificar cada cromosoma

individualmente; por eso, en la literatura de hace algunos años se encuentran referencias
a trisomías o monosomías etc. “del grupo tal”. A partir de la década del 70 se
desarrollaron técnicas que coloreaban a los cromosomas de una manera especial, en
bandas.
7.2. Competencias:
 Capacidad para identificar cromosomas
a.- Equipos:
.- Microscopios con objetivo 100X
.- Centrifuga de Tubos
.- Refrigeradora
.
b. Materiales:
 Propipetas
 Mecheros de alcohol
 Encendedor o fosforo
 Jeringa de 1 ml
 Laminas portaobjetos nuevas
 Koplins
29
 Gradilla de láminas de plástico o metal
c. Reactivos:

 Algodón
 Acetona
 Agua destilada
 Material de limpieza de microscopios
7.4. Procedimiento:
Coloración Convencional:
Una vez preparadas las láminas se procederá a colorear, para la observación de
cromosomas de modo convencional.
5.1. Colocar en un Koplins Colorante Giemsa al 4% por 10 minutos

5.2. Enguadar con Agua Destilada y dejar secar
5.3. Observa al microscopio primero a 10X, 40Xy finalmente a 100X
7.5 Resultados
7.6. Cuestionario:
7.6.2 Revisión de la morfología y tipos de cromosomas humanos

7.6.1 Revisión de la Clasificación de los Cromosomas Humanos
7.7 Fuentes de información

México. 2009
6.- J. L. Serre. DIAGNOSTIC TECHNIQUES IN GENETICS. Wiley-liss. 2009
30
PRÁCTICA No.8
TECNICAS DE BANDEO CROMOSOMICO
8.1. Marco Teórico

Hasta antes del año de 1970 no era posible estudiar los cromosomas bandeados sino
sólo de manera convencional. Pero en la actualidad se conocen varias técnicas de
bandeo cromosómico que permiten identificar individualmente los cromosomas, lo
cual facilita la identificación de una alteración cromosómica numérica y
especialmente demostrar la presencia de alteraciones cromosómicas estructurales.
8.2. Competencias:
que les sirve para la identificación de cromosomas.
 Capacidad de identificación y diferenciación cromosomica.
 Capacidad de aplicación e implementación en el laboratorio.
 Capacidad de trabajar en equipo.

.
Equipo- Materiales – Reactivos:
a.- Equipos:
.- Baño María
.- Estufa incubadora 37°C
.- pH metro
.- Refrigeradora
.
b. Materiales:
 Propipetas
 Probeta de 50 ml
 Koplins de vidrio ó plástico
 Gradilla de láminas de plástico o metal
c. Reactivos:
 KH2P04 (Fosfato monopotásico)
 NaOH (hidróxido de sodio) qp (perlas)
 Indicador de pH
 Solucion Salina Fisiológica ClNa 0.9%
 Agua destilada
31
8.4. Procedimiento:
8.4.1 TECNICA DE BANDAS Q:
Primera metodología utilizada, desarrollada por Casperson, en 1970 quien utilizo

mostaza de quinacrina para luego observar la distinta emisión de fluorescencia
cuando eran observados en el microscopio de fluorescencia (utilizando luz
ultravioleta). Este método fue posteriormente denominado como las técnicas de
bandas Q (Paris, Conferencia de 1971).
Esta metodología tiene como principal desventaja que la fluorescencia desaparece

progresivamente por lo que la observación y análisis cromosómico así como la toma
de microfotografía debe ser lo más rápido posible.
Las bandas obtenidas con esta técnica son características para cada cromosoma;
pero tienen mayor utilidad para demostrar la porción distal del brazo largo del
cromosoma Y, que se tiñe más intensamente que los demás cromosomas. Las
regiones pericentromericas de los cromosomas 3 y 4, y las regiones satélites y
pericentromericas de los cromosomas acrocéntricos muestran variaciones
significativas conocidos como Polimorfismos o Heteromorfismos, que pueden ser
demostrados con esta técnica.
Soluciones :
1. Buffer Sorensen’s a pH 5.6
2. Colorante Dihidrocloruro de Quinacrina al 1%
Procedimiento:
1. Se tiñen las láminas con el Colorante de Quinacrina por 15 - 20 minutos en
oscuridad.
2. Se lavan las láminas con el Buffer Sorensen's.
3. Se monta con una laminilla cubreobjetos con el Buffer.
Examinar al microscopio de fluorescencia utilizando una luz de longitud de onda de
450 – 550nm
8.4.2 TECNICA DE BANDAS G:
Es la más utilizada en el Laboratorios de Citogenética para el análisis rutinario de

los cromosomas, esta técnica es descrita o conocida como GTG (Bandas G por
tripsina usando Giemsa).
Un rol directo de la tinción con Giemsa es producir bandas G (Mc Kay, 1973; Shuh et
al, 1975). Clark y sus colegas (Clark y Felsenfeld, 1975) sugirieron que las Histonas
ricas en argininas están involucradas en las bandas GTG y no tanto la pérdida de
DNA y las proteínas de los cromosomas, durante el tratamiento con la tripsina. Esta
hipótesis que diferencia entre bandas G positivas (oscuras) y bandas G negativas
(claras) puede ser debido a la distribución de las proteínas cromosómicas y el DNA.
32
También se ha sugerido que las bandas G positivas son relativamente ricas en
proteínas disulfuro, mientras que las bandas G negativas contienen sulfhidrilos.
Soluciones :
1. Solución Tripsina 1%
2. Solución Salina Fisiológica
3. Colorante Giemsa 4%
Procedimientos:
1. Se coloca en Baño María a 37 o C el frasco Nro 1 de Solución de tripsina 1% (5ml de
Tripsina + 22.5 Buffer Fosfato + 22.5m de SSF)
2. Se colocan las láminas con la preparación cromosómica (menos de 1 semana)
en el frasco Nro 1 por 10 segundos.
3. Se enjuaga las láminas en el frasco Nro 2 de Solución salina fisiológica.
4. Se colocan las láminas en el frasco Nro 3 de Colorante Giemsa 4% por 10 minutos.
5. Lavar con agua corriente y Examinar al microscopio
8.4.3 TECNICA DE BANDAS R:
El principio básico de esta técnica es el tratamiento de las láminas a altas temperaturas en

varios buffer, seguido por la tinción con Acridina Orange (RFA) o en Giemsa (RHG, bandas R,
por calor usando Giemsa). Las bandas que produce está técnica en los cromosomas humanos
son el reverso de las bandas G o bandas Q, es decir que las bandas claras en Q o G son
bandas oscuras en R y viceversa. (Dutrillanx and Lejeune 1971; Sehested, 1974; Bobrow and
Madan, 1973).
33
Una de las más importantes ventajas de la Técnica de bandas R, es que las regiones
teloméricas de los cromosomas son teñidas, a diferencia de las Técnicas bandas Q y G en las
que no son tan claras. El mecanismo de las bandas reversas no esta totalmente conocido.
(Coming's 1978).
El tratamiento con calor induce denaturación de las proteínas cromosómicas así como de las
secuencias del DNA ricas en nucleótidos A-T, mientras que el DNA rico en G-C de las bandas R
en una configuración nativa (SUMMER 1982). Coming s (1978) detalla que a temperaturas
altas el DNA rico en A-T de las bandas G es denaturada y parcialmente extraída mientras que
el DNA nativo de las bandas R no lo es.
8.4.4 TECNICA DE BANDAS C:
La técnica de bandas C produce una tinción selectiva de la Heterocromatina

constitutiva. Estas bandas están localizadas en la región pericentromerica de los
cromosomas humanos.
El método original descrito por Arrighi y Hsu (1971) involucra primero un tratamiento
con álcali, (OH)Na, para denaturar el DNA Cromosómico y subsiguiente incubación
en una Solución Salina. Posteriormente se describe un método por SUMMER (1972)
en la que el álcali usado es el (OH) 2 Ba. Ambos métodos producen un patrón
característico similar de bandas C.
El tratamiento de denaturación con el álcali (OH)2 Ba es crítico y debe ser óptimo para
obtener mejor calidad bandas C. La duración del tratamiento depende de la edad
(vejez) de la preparación cromosómica y del tejido de origen. Un tratamiento
inadecuado con álcali produce una pobre diferenciación de bandas C, mientras que
un tratamiento excesivo resulta en la pérdida de la morfología cromosómica.
Las bandas C requieren de dos pasos sucesivos para la pérdida del DNA
cromosómico, primero una depurinación y denaturación sucesiva durante el
tratamiento con un ácido (HCl) y un álcali (Ba(OH) 2 ). La denaturación del DNA es
seguida de una remoción de los pequeños fragmentos y eliminación de ellos durante
la incubación en la solución 2xSSC.
La principal aplicación de la técnica de bandas C es para demostrar la variación de

tamaño de la región de Heterocromatina Constitutiva presente en las regiones
pericentromérica de los cromosomas, en especial de los cromosomas 1, 9, 16 y los
brazos largos del cromosoma Y. Estas variaciones constituyen los llamados
Polimorfismos. Además esta técnica es útil para demostrar la presencia de una
inversión pericentromerica.
34
Bandas C
8.5. Resultados
Se observan los cromosomas bandeados de acuerdo a un patrón de bandas claras y
oscuras característico de cada uno de los cromosomas que permitirán su identificación.
Ver figura abajo:
35
8.6. Cuestionario:
1.- Revisión del patrón de Bandas GTG de los Cromosomas Humanos
2.- Encuentre 5 diferencias entre las bandas G y las bandas R
3.- Que técnica de bandeo cromosómico aplicaría para evaluar las deleciones
teloméricas, los polimorfismos cromosómicos y las regiones NOR.
8.7. Fuente de Información

México. 2009
PRÁCTICA No.9
IDENTIFICACION DE CROMOSOMAS CON BANDAS GTG: Grupos A,B,F y G
9.1. Marco Teórico

Los cromosomas cambian ligeramente de forma según la etapa de la división celular; son
más alargados en profase y alcanzan el máximo de condensación en la metafase; por lo
cual es el momento ideal para observarlos.
En esa etapa podemos observar que cada cromosoma tiene una zona que es como una
constricción, y se llama el centrómero (constricción primaria). El centrómero determina en
el cromosoma los brazos cortos (p) y los brazos largos (q).
Según la posición del centrómero, los cromosomas se clasifican en:

 Metacéntricos: el centrómero se localiza a mitad del cromosoma y los dos brazos
presentan igual longitud.
 Submetacéntricos: la longitud de un brazo del cromosoma es algo mayor que la del
otro.
 Acrocéntrico: un brazo es muy corto (p) y el otro largo (q).
36
 Telocéntrico: sólo se aprecia un brazo del cromosoma al estar el centrómero en el
extremo (este tipo de cromosomas no se encuentran en el cariotipo humano).
Los pares cromosómicos se ordenan de forma decreciente de tamaño, y luego se

clasifican en grupos, de acuerdo al tamaño y a la ubicación del centrómero. Estos grupos
se nombran con las letras: A, B, C, D, E, F, G. La representación ordenada de los
cromosomas constituye el cariotipo.
Grupo A: Metacéntricos grandes. Cromosomas 1, 2, 3, excepto el 2, el cual es un

cromosoma submetacéntrico grande.
Grupo B: Submetacéntricos grandes. Cromosomas 4 y 5.
Grupo C: Submetacéntricos medianos. Los cromosomas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y el

cromosoma X
Grupo D: Acrocéntricos medianos. Cromosomas 13,14 y 15, presentan satélites en sus

brazos cortos.
Grupo E: Submetacéntricos pequeños. Los cromosomas 16, 17, 18,
Grupo F: Metacéntricos pequeños. Los cromosomas 19 y 20.
Grupo G: Acrocéntricos pequeños. Los cromosomas 21 y 22 y el cromosoma
37
9.2. Competencias:
38
a.- Equipos:
b. Materiales:
 Preparado cromosómico con bandas GTG
c. Reactivos:
 Alcohol absoluto l
9.4. Procedimiento:
.- Buscar y seleccionar metafases completas y abiertas con el objetivo 10X
.- Observar con objetivo 100X la metafase seleccionada y confirmar que los
cromosomas estén bien bandeados de tal modo que permita su identificación.
.- Identificar los cromosomas según el patrón de bandas características: los
cromosomas de los grupos A,B,F y G
9.5 Resultados
9.6. Cuestionario:
1.- Qué diferencias hay entre los cromosomas del Grupo A, B, F y G
2.- Por qué el cromosoma Y no es un cromosoma Acrocéntrico
3.- Cómo definiría una banda marcadora?

México. 2009
39
PRÁCTICA No.10
IDENTIFICACION DE CROMOSOMAS CON BANDAS GTG: Grupos C,D y E
10.1. Marco Teórico



cromosoma X

brazos cortos.
40
10.2. Competencias:
a.- Equipos:
b. Materiales:
 Preparado cromosómico con bandas GTG
41
c. Reactivos:
 Alcohol absoluto l
10.4. Procedimiento:
.- Buscar y seleccionar metafases completas y abierta con el objetivo 10X
.- Observar con objetivo 100X la metafase seleccionada y confirmar que los
cromosomas estén bien bandeados de tal modo que permita su identificación.
.- Identificar los cromosomas según el patrón de bandas características:los
cromosomas de los grupos C,D y E.
10.5 Resultados
10.6. Cuestionario:
1.- Qué diferencias existe en el patrón de bandas de los cromosomas del Grupo C, D y E

México. 2009
7.- S. L. Gersen, M. Keagle. THE PRINCIPLES OF CLINICAL CYTOGENETICS. Humana Press. Second Edition.
2009
42
PRÁCTICA No.11
IDENTIFICACION DE CROMOSOMAS EN MICROFOTOGRAFIAS DE
CARIOTIPOS NORMALES


43
cromosoma X

brazos cortos.
44
11.2. Competencias:
a. Materiales:
 Fotografías de cromosomas de cariotipos normales
 Tijeras
 Hojas de Cariograma
l
.- Identificar los cromosomas en las microfotografías
.- Recortar los cromosomas con una tijera.
.- Realizar el Cariograma de las metafases analizadas
11.5 Resultados
11.6. Cuestionario:
1.- Revisión de Cariogramas Normales
11.7Fuentes de información
2009
México. 2009
45
PRÁCTICA No.12
IDENTIFICACION DE CROMOSOMAS EN MICROFOTOGRAFIAS DE
CARIOTIPOS ANORMALES


46
cromosoma X

brazos cortos.
12.2. Competencias:
47
a. Materiales:
 Fotografías de cromosomas de cariotipos anormales
 Tijeras
 Hoja de Cariograma
l

12.5 Resultados
12. 6. Cuestionario:
1.- Revisión de Sistema Internacional de Nomenclatura de Cromosomas
2009
México. 2009
8.- An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Lisa G. Shafffer. Karger. 2013.
48
PRÁCTICA No.13
SISTEMA DE NOMENCLATURA CROMOSOMICA
13.1. Introducción:
Cada cromátide de un cromosoma está formada por una molécula de ADN en un soporte
de proteínas. La cromátide está constituida por cromatina; que es el conjunto del ADN
con las proteínas de soporte, formadas fundamentalmente por histonas y otras.
Los cromosomas cambian ligeramente de forma según la etapa de la

división celular; son más alargados en profase y alcanzan el máximo de
condensación en la metafase; por lo cual es el momento ideal para
observarlos.
En esa etapa podemos observar que cada cromosoma tiene una zona que es como una
constricción, y se llama el centrómero (constricción primaria). El centrómero determina en
el cromosoma los brazos cortos (p) y los brazos largos (q).
13.2. Competencias:
que les sirve para la identificación de cromosomas.
13.3. Contenidos:
 Ciclo Celular.
 Sistema Internacional de nomenclatura cromosomica.
13.4. Metodología:
49
La metodología a usar será únicamente práctica, cada alumno procesara su propia
muestra y trabajara con fotografías al final de la práctica identificara cada uno de los
cromosomas.
13.5. Definiciones:
Según la posición del centrómero, los cromosomas se clasifican en:
 Metacéntricos: el centrómero se localiza a mitad del cromosoma y los dos brazos

presentan igual longitud.
 Submetacéntricos: la longitud de un brazo del cromosoma es algo mayor que la del
otro.
 Acrocéntrico: un brazo es muy corto (p) y el otro largo (q).
 Telocéntrico: sólo se aprecia un brazo del cromosoma al estar el centrómero en el
extremo (este tipo de cromosomas no se encuentran en el cariotipo humano).

se
nombran con las letras: A, B, C, D, E, F, G. La representación ordenada de los



cromosoma X

brazos cortos.
Grupo G: Acrocéntricos pequeños. Los cromosomas 21 y 22 y el cromosoma Y
50
5.1 ANOMALÍAS ESTRUCTURALES DE LOS CROMOSOMAS
Delección: Cuando se pierde un fragmento de cromosomas. Puede ser

Terminal o intersticial.
Translocación: Cuando hay cambio de posición de un fragmento, el

cual va a parar a otro cromosoma, generalmente implica una ruptura en
cada cromosoma.
Recíproca: Cuando hay intercambio de fragmentos entre dos

cromosomas;
Robertsoniana: Unión entre los brazos largos de dos cromosomas
acrocéntricos. Se dice que una translocación es balanceada o
51
equilibrada cuando no hay pérdida ni ganancia de material genético en
la misma (las Robertsonianas se consideran balanceadas).
Inversión: Implica dos rupturas dentro del cromosoma. Puede ser

pericéntrica o paracéntrica, según el segmento involucrado comprenda
o no al centrómero.
Es anomalía balanceada, pero, mediante el fenómeno de
“entrecruzamiento desigual”, puede originar gametos con cromosomas
que contengan regiones duplicadas o faltantes.
52
Duplicación: Es un fenómeno más difícil de explicar; cuando no ha sido
consecuencia de una inversión en cromosomas paternos,
probablemente se debe a translocación entre dos cromosomas
homólogos, durante la meiosis que originó uno de los gamentos
paternos o maternos.
La duplicación puede ser en serie o en espejo.
Cromosoma en anillo: Se origina por ruptura en ambos extremos del

mismo cromosoma.
5.2 NOMENCLATURA EN ANOMALIAS ESTRUCTURALES DE LOS

CROMOSOMAS
De acuerdo a la Conferencia de París (1971) y posteriores (hasta ISCN

1995) hay dos sistemas de nomenclatura: El breve y el detallado.
El breve solamente indica cuáles son los cromosomas involucrados y
los puntos de ruptura de un rearreglo.
El detallado describe cada uno de los cromosomas resultantes.
SIMBOLOS:
p brazo corto q brazo largo
53
 de...... hasta : ruptura
:: Ruptura y unión cen centrómero
chi quimera mos mosaico
del deleción der
cromos. derivado
dic dicéntrico fra lugar frágil
dup duplicación dir directo
i isocromosoma mar cromosoma marcador
inv inversión ins inserción
mat de origen materno pat de origen
paterno
r anillo t translocación
rob translocación robertsoniana ter telómero
add material adicional de origen desconocido
Deleción terminal
46,XX,del(8)(p12)
46,XX,del(8)(qterp12):
Deleción intersticial
46,XX,del(8)(q21q23)
46,XX,del(8)(pter21::q23qter)
Isocromosoma del brazo largo

46,X,i(X)(q10)
Isocromosoma del brazo corto

46,XY,i(5)(p10)
Inversión pericéntrica
46,XY,inv(4)(p15q13)
46,XY,inv(4)(pterp15::q13p15::q13qter)
Inversión paracéntrica
46,XY,inv(13)(q13q32)
46,XY,inv(13)(pterq13::q32q13::q32qter)
Cromosoma en anillo
46,XX,r(18)(p11q22)
46,XX,r(18)(p11q22)
Translocación recíproca
46,XY,t(2;8)(p13;q12)
46,XY,t(2;8)(2pter2p13::8q128pter;2qter2p13::8q128qter)
Trisomía y monosomía parciales por herencia de cromosomas

derivados
46,XY, der(8)t(2;8)(p13;q12)pat
54
46,XY, der(8pter8q12::2p132pter)pat
Translocación robertsoniana balanceada

45,XX,der(14;21) (q10;q10)
45,XX,der(14;21)(14qtercen21qter)
Translocación robertsoniana desbalanceada

46,XX,+13,der(13;14)(q10;q10)
46,XX,+13,der(13;14)(13qter13q10::14q1014qter)

13.5 Resultados
13. 6. Cuestionario:
1.- Revisión de Sistema Internacional de Nomenclatura de Cromosomas
2009
55
México. 2009
8.- An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Lisa G. Shafffer. Karger. 2013.
56
57
58
59

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GUÍA DE PRÁCTICAS

FACULTAD DE MEDICINA ALBERTO HURTADO

SEMANA N° 08 PRIMER EXAMEN ESCRITO

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y SOLUCIONES

1.1 MARCO TEÓRICO

La cálidad de los cromosomas para sus correspondiente análisis va a depender de

0.16 grs. 100 ml

SOLUCIÓN DE USO DIARIO

1 ml de Solución Madre + 9 ml de agua destilada 0.16 mg/ml

La precisión en la preparación y el tiempo de tratamiento hipotónico son fundamentales

X 0.075 M X = 5.592 grs. 1000 ML

 Colorante de Giemsa certificado en polvo 7.5 grs.

Mezclar el metanol y la glicerina hasta obtener una solución homogénea, agitar

P.M. 136.09 grs. 1M

X 0.068M X= 8.165 grs. 1000 ML

X 0.068MX= 8.52 grs. 1000Ml

1 grs. Tripsina 100 ml de agua destilada

POTASIO FOSFATO MONOBASICO (KH2PO4 0.025M)

1.3 MATERIALES Y EQUIPOS

Alcohol etílico absoluto 200 ml

 Aplicación correcta de las fórmulas y cálculos para la preparación de reactivos,

1.7 FUENTES DE INFORMACION

ESTUDIO DE LA CROMATINA SEXUAL

2.1 MARCO TEÓRICO

2.3 Materiales y Equipos

Alcohol etílico absoluto 200 ml

g.- Observación al Microscopio:

CRITERIOS PARA EL RECUENTO DE CORPÚSCULOS DE BARR

NOTA: En el recuento de los CORPÚSCULOS DE BARR no solo se deberá tener en cuenta

INTERPRETACION DEL ESTUDIO DE LA CROMATINA SEXUAL

3.1 MARCO TEÓRICO:

En 1949 Barr y Bertram descubrieron una masa de cromatina sexual en células en

Actualmente se sabe que el corpúsculo de Barr representa uno de los cromosomas X

En 1959 Ohno, Kaplan y Kinosita demostraron que la cromatina X corresponde a la

 En las células somáticas de las hembras de los mamíferos, solo un cromosoma X

3.3 MATERIALES Y EQUIPOS

Podemos observar en el PMN, el de la derecha presenta el corpúsculo CB en la forma de

3.7. FUENTES DE INFORMACIÓN

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO CELULAR

4.1. Marco Teórico

Algunas células de nuestro organismo normalmente pueden estar en un proceso de

Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionaran dependiendo del

a. MEDIO McCoy's 5 MODIFIED: Utilizado con más frecuencia para

a. SUERO BOVINO FETAL (SBF): Se utiliza a diferentes concentraciones:

4.3. Materiales y Equipos

PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

a. Pesar la cantidad de gramos de medio a preparar. Ejemplo: Preparación del

4.7 Fuentes de Información

CULTIVO DE CROMOSOMAS: CULTIVO DE LINFOCITOS

5.1. Marco Teórico

Una de las alteraciones genéticas frecuentes, se debe a un defecto en los

Más tarde reportes de otros investigadores presentaron técnicas que aumentaban

Por ello aprenderemos la metodología para la obtención de metafases a partir de un

5.3. Materiales y Equipos

5.4.1 TOMA DE LA MUESTRA:

5.4.2 SIEMBRA DE LA MUESTRA:

Se adiciona al frasco de cultivo 1 a 1.5ml de la muestra (plasma + elementos

5.7 Fuentes de Información

1.- Resumen de la evolución de las técnicas de citogenética y genética molecular para la