2

DIAGNÓSTICO
Etapa crítica en el manejo de un
paciente, que implica decisiones
médicas que definirán el progreso del
cuidado de un individuo

Área fundamental en laboratorios clínicos

 Requieren espacios con una infraestructura

adecuada para dar un servicio de calidad
 3

BIOLOGÍA MOLECULAR
En la actualidad, la biología molecular es el
área diagnóstica de mayor dinamismo y
crecimiento dentro los laboratorios clínicos

1. Revolucionando el sistema de salud

2. Liderando la investigación biomédica

3. Optimizando los tratamientos médicos

4
 5

DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Término amplio que incluye el empleo de técnicas de
biología molecular en la detección de una variedad de
enfermedades, tanto infecciosas, genéticas, neoplásicas
o de identificación de individuos

Detección y/o cuantificación de algún componente o

molécula: DNA, RNA, Proteína, de un tejido o liquido
corporal
 6

DIAGNÓSTICO MOLECULAR
 7

DIAGNÓSTICO MOLECULAR
I. Prenatal
Enfermedades hereditarias
Predisposición genética (sospecha clínica)

II. Pre-sintomático (Dx. Temprano)

Enfermedades infecciosas (50-60%) en fase temprana
Predisposición a enfermedades autoinmunes,
degenerativas, transtornos afectivos, cáncer (Historial clínico
familiar)
 8

DIAGNÓSTICO MOLECULAR
III. En tiempo real (monitoreo)
Características del patógeno (identificación, virulencia,
resistencia a drogas)
Estado inmunológico (carga antigénica o niveles de
anticuerpos)
Estado de la enfermedad (detección de marcadores)
Monitoreo al tratamiento (marcadores, respuesta al
tratamiento, resistencia, etc.)
 9

DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Las técnicas moleculares aplicadas al diagnóstico ofrecen:
1. Sensibilidad
2. Especificidad
3. Rapidez con requerimientos mínimos de muestra
(en comparación con las pruebas convencionales)

Es considerado un diagnóstico directo ya que permite iniciar

tempranamente con el tratamiento más adecuado,
disminuyendo de esta manera la probabilidad de
complicaciones
 10

LIMITACIONES EN EL
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
1. El costo de los test: superan los valores de los
ensayos comúnmente utilizados en clínica para el
mismo propósito
2. Falta de sistemas de regulación (que fiscalicen y
normalicen la oferta y calidad de los test de
diagnóstico molecular) tanto en los laboratorios que
realizan estas actividades como los insumos
utilizados para el diagnóstico molecular
3. La integración de laboratorios de biología molecular
con el resto de los laboratorios clínicos
 11

DIAGNÓSTICO CONVENCIONAL
 12

MÉTODOS CONVENCIONALES
 13

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
MOLECULAR
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
PCR (convencional, multiplex, anidada, tiempo real)
RT-PCR
Secuenciación de ácidos nucleicos
Inmunofluorescencia
ELISA
Southern Blot, Northern Blot y Western Blot
Microarreglos
 14

DIAGNÓSTICO MOLECULAR
EN EL FUTURO
15
 16

FUNDAMENTOS
 17

GENERALIDADES DEL DNA Y RNA

• El DNA (ácido desoxirribonucleico)
esencialmente localizado en el núcleo
(eucariotas) y en el nucleoide (procariotas),
determina el orden en el cual, un
determinado aa se enlazará a otro en la
síntesis de proteínas

• El RNA (ácido ribonucleico), se localiza

esencialmente en el citoplasma, participa
en la síntesis de proteínas
 18

GENERALIDADES DEL DNA Y RNA

Los ácidos nucleicos como el DNA y RNA son
polímeros de nucleótidos
• Un nucleótido está formado por 3 elementos:
NH2 Bases nitrogenadas
N
O N En los nucleótidos
-
O P O CH2
O
N N
presentan dos tipos de
-
O H H bases nitrogenadas:
H
1. Purinas: Adenina
OH OH
y Guanina
Pentosa Base
2. Pirimidinas:
Fosfato Nucleósido Citosina, Timina
Nucleótido
(Uracilo en RNA)
 19

ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS

NUCLEICOS
 20

NUCLEÓTIDOS
 21

ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS

NUCLEICOS

El complemento de las hebras se debe a la naturaleza de las bases nitrogenadas. La

base adenina siempre interactúa con una timina (AT) en la cadena opuesta a través
de dos enlaces de hidrógeno y la citosina siempre interactúa con la guanina (CG) a
través de tres enlaces de hidrógeno en la cadena opuesta
 22

ESTRUCTURA DEL DNA

Las cadenas principales de

azúcar-fosfato están en el exterior
de la doble hélice y las purinas y
pirimidinas forman los "peldaños"
de la escalera de hélice de DNA
 23

ESTRUCTURA DEL DNA

Cada cadena tiene un

extremo 5‘ (con un grupo
fosfato) y un extremo 3'
(con un grupo hidroxilo)

(b) Las dos cadenas de DNA son antiparalelas entre sí. (c) La dirección de cada cadena se
identifica numerando los carbonos (1 a 5) en cada molécula de azúcar. El extremo 5 'es
aquel en donde el carbono n° 5 no está unido a otro nucleótido; el extremo 3 'es aquel en
donde el carbono n° 3 no está unido a otro nucleótido.
 24

APAREAMIENTO DE BASES EN
EL DNA Y RNA

Las bases nitrogenadas tienen un

patrón de emparejamiento específico
porque la cantidad de adenina es
igual a la cantidad de timina; la
cantidad de guanina es igual a la
cantidad de citosina

La forma de la hélice se estabiliza

mediante enlaces de hidrógeno e
interacciones hidrofóbicas entre las
bases.
 25

CONFORMACIÓN DEL DNA

Esta desviación en las formas se basa en su diversidad estructural

 26

CONFORMACIÓN DEL DNA

 27

CONFORMACIÓN DEL DNA

El diámetro de la doble hélice

es de 2nm y la estructura de
doble hélice se repite a un
intervalo de 3.4nm que
corresponde a diez pares de
bases
 28

SATÉLITES EN EL DNA
 29

COMPLEJIDAD GENÉTICA
Each region of DNA which codes for a single RNA or protein is
called a gene, and the entire set of genes in a cell, organelle or virus
forms its genome

Each gene is located at a particular position along the chromosome,

termed the locus, whilst the particular form of the gene is termed the
allele. In mammalian DNA each gene is present in two allelic forms
which may be identical (homozygous) or which may vary
(heterozygous). It is thought that there are approximately 20 000
genes present in the human genome, although not all will be
expressed in a given cell at the same time. However various
processing events such as alternative splicing or RNA editing can
increase the number of actual proteins found in the cell in relation to
the number of genes to nearly 1 million. The occurrence of different
alleles at the same site in the genome is termed polymorphism
 30

REGIONES DE UN GEN
 31

NOMBRES DE LAS CADENAS

DE DNA
 32

REPLICACIÓN SEMICONSERVADORA

Mecanismo de replicación de DNA en

que cada una de las hebras sirve de
molde o templado para la síntesis de
la hebra complementaria. Así, cada
una de las moléculas hijas tiene una
hebra de origen parental y la otra
recién sintetizada
33
 34

CÓDIGO GENÉTICO

Cada secuencia de tres

nucleótidos se denomina codón.
La lectura comienza en un codón
de inicio (AUG), el cual marca la
pauta de lectura, continúa con los
siguientes trinucleótidos y termina
en un codón de parada (UGA,
UAA o UAG)

La correcta expresión de un gen

puede verse afectada por
modificaciones locales
(mutaciones o polimorfismos)
en la secuencia de DNA del mismo
 35

EJ. TRADUCCIÓN (CÓDIGO GENÉTICO)

AUGUGGUUUUCUGUCCACUUCCCCUAUGCAGGUGUCCAACG
GAUGUGUGAGUAAAAUUCUGGGCAGGUAUUACGAGACUGGC
UCCAUCAGACCCAGGGCAAUCGGUGGUAGUAAACCGAG
 36

RNA DE TRANSFERENCIA
El RNAt es una molecula que participa
en la síntesis de proteínas
Posee dos áreas importantes: una
región de trinucleótidos denominada
anticodón y una región donde se une
un aminoácido específico.

Durante la traducción, cada vez que un

aminoácido se añade a la cadena en
crecimiento, se forma una molécula de
RNAt cuyos pares de bases tienen una
secuencia complementaria con la
molécula del RNAm, asegurando que
el aminoácido adecuado sea insertado
en la proteína
 37

MUTACIONES DEL DNA

• DNA mutations cause errors in protein sequences, creating
partially or completely nonfunctional proteins

• DNA mutation causes abnormal signal transduction, leading to

aberrant activation or loss of function in related pathways

• DNA mutations in drug metabolizing enzymes or cytochromes

alter the response to drugs

• DNA mutations in somatic cells give rise to mutations in germ

cells and gametes that pass to at least 50% of the offspring

– Human beings with a single allele mutation will transmit the

mutation to half of the progeny

– If both alleles are mutated, all progeny will inherit the mutation
 38

PURIFICACIÓN DE DNA
En general los protocolos de purificación se basan en
dos etapas:
1ª Lisis “suave” de las células y solubilización del DNA
2ª Remoción de proteínas contaminantes, RNA y otras
macromoléculas por métodos químicos o enzimáticos

Uno de los métodos más comunes se basa en la

purificación del DNA mediante cromatografía de
intercambio aniónico posterior a la lisis con Proteinasa
K (derivada del hongo Tritirachium album) y pp con
SDS
 39

PURIFICACIÓN DE DNA
 40

AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS

TAREA 1
Métodos: Miniprep y Cromatográfico
con fundamento
Enviar en PDF al correo
Hecha a mano y en equipo
Jueves 26 a la 20:00
 41

AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS
 42

CUANTIFICACIÓN DEL DNA

Cuantificar el DNA usando absorbancia UV
– El pico de absorbancia UV del DNA ocurre a
260 nm
– El pico de absorbancia UV de las proteínas
ocurre a 230 nm (enlace peptídico) y a 280
nm (aminoácidos aromáticos)
– La relación de la absorbancia a 260 nm/280
nm es una medida de la pureza de la muestra
de DNA; esta debe estar entre 1.65 y 1.85
 43

CUANTIFICACIÓN DE DNA
Un valor de A260 de 1 corresponde a 50 μg DNA por mililitro de
agua (en una celda de 1cm3)
Volumen de muestra de DNA = 100 μL
Dilución = 20 μL de muestra de DNA + 180 μL agua destilada
(dilución 1/10)
Medición de absorbancia de la muestra
diluida en una celda de 0.2 mL
A260 = 0.2
Concentración de la muestra de DNA = 50 μg/mL x A260 x factor de dilución
= 50 μg/mL x 0.2 x 10
= 100 μg/mL
Cantidad Total = concentración x volumen de muestra en mililitros
= 100 μg/mL x 0.1 mL
= 10 μg DNA

La razón de lecturas a 260 nm y 280 nm (A260/A280) provee un estimado de la pureza del

DNA con respecto a contaminantes que absorben luz UV, tales como las proteínas
 44

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
PCR
45
 46

PCR
 47

PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una
técnica de biología molecular que en pocas horas
permite la producción de millones de copias a partir
de una cantidad mínima de DNA o RNA extraída de
una muestra.

Estas copias permiten identificar y cuantificar el tipo

de DNA o RNA presente en la muestra y asociarlo
con un organismo o individuo.
 48

PASOS DE LA PCR
Proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un
número específico de veces

Un ciclo de PCR consiste en los siguientes pasos:

 49

CONSIDERACIONES
GENERALES DE LA PCR
• Desnaturalización y alineamiento deben ser de 30seg
• Los tiempos de extensión deben ser de 1min por Kb,
un tiempo de 2-10 min por Kb para la extensión final
• El número de ciclos depende de la abundancia del
DNA blanco, generalmente son de 25-30
• Los primers generalmente se emplean a una
concentración de 25-100pmol
• Al final se programa la máquina para que conserve los
tubos a 4ºC
 50

CONDICIONES ESTÁNDAR
PARA UNA PCR
 51

INICIADORES O PRIMERS

Secuencias sintéticas cortas (de 20 a 30 bases) que

se unen a cada una de las dos hebras simples del
ADN desnaturalizado.
La alineación generalmente ocurre entre 40°C y 65°C,
dependiendo de la longitud y la secuencia de bases
de los iniciadores.
El control preciso de la temperatura y el adecuado
diseño de los iniciadores permite que éstos se unan
a la secuencia diana con alta especificidad
 52

DISEÑO DE PRIMERS
1. Contenido de G+C = 50%

2. Evitar largas secuencias de una sola base*

3. Evitar la complementariedad en cada uno

de los primers y entre ambos primers

4. Tamaño recomendado de 20 a 30 bp

5. Evitar G y C en el extremo 3’
1 2
 53

PRIMERS DEGENERADOS
Primers que tienen un número de opciones en varias posiciones en la
secuencia para permitir el alineamiento y la amplificación de una
variedad de secuencias relacionadas

1) Q L N A T L N H
2) CAG CTG AAC GCG ACG CTG AAC CAC

CAA CTC AAT GCC ACC CTC AAT CAT

CTA GCA ACA CTA

CTT GCT ACT CTT

TTG TTG

TTA TTA
 54

CÁLCULO DE TM DE PRIMERS

Tm= 4(G+C)+2(A+T)
5’-GTGGGGGAGGGGCGTTCT-3’
5’-ATTTTCCACCAACCCCCAGTT-3’

lab314.com/genmol/oligocalc.htm
 55

ANÁLISIS DE PRODUCTOS
DE PCR
PCR 56
 57

RT-PCR
 58

QPCR (O RT-PCR)
Se emplea un agente intercalante que se une al ADN de
doble cadena dando un incremento de la fluorescencia
a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR
(SYBR greenTM)
Permite monitorear el progreso en tiempo real de la
PCR y la cuantificación de DNA y de RNA.
La amplificación de un producto de PCR se detecta
después de un número fijo de ciclos.
Cuanto más alto es el número de copias del blanco,
más pronto se observa el aumento significativo en la
fluorescencia.
 59

QPCR (O RT-PCR)
 60

QPCR
 61

RT-PCRTAQMAN

Se emplea una sonda que tiene unidos un fotocromo

reportero y un fotocromo quencher.
Cuando ambos fotocromos están unidos a la sonda,
el reportero no emite señal. Pero, cuando la sonda
hibrida con la secuencia de interés durante la
reacción de PCR, la actividad exonucleasa de la Taq
polimerasa corta al fotocromo reportero del resto de
la sonda, permitiendo la emisión una señal
fluorescente.
Se monitorea la señal fluorescente del reportero que
se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR.
 62

RT-PCRTAQMAN
 63

RT-PCRTAQMAN
 64

FLUOROCROMOS EMPLEADOS
EN QPCR TAQMAN
 65

FLUOROCROMOS EMPLEADOS
EN QPCR TAQMAN
 66

Es simple y económico, fácil de usar, sensible,

versátil.
 67

Durante la reacción de PCR puede unirse a dímeros de

primers y a otros productos inespecíficos, resultando en
una sobreestimación de la concentración del DNA blanco.
 68

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
• Existen tres tipos diferentes
– Tipo I – Reconoce secuencias
específicas y cortan el DNA en
sitios no específicos > de 1,000 pb
– Tipo II – Reconoce secuencias
palindrómicas y cortan dentro de
la secuencia
– Tipo III – Reconocen secuencias
específicas de 5-7 pb y cortan de
24-27 pb “down stream” del sitio
• Las enzimas de restricción Tipo II son
las mas utilizadas en la biotecnología
ya que reconocen y cortan dentro de
las secuencias específicas
 69

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
• También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces
fosfodiester a partir de una secuencia que reconocen.
• La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica
(secuencia que se lee igual en ambas direcciones).
• Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de
defensa para degradar material genético extraño que entre en la
célula.
• Por ejemplo - BamHI, HindIII, EcoRI, y Kpn I toman el nombre de
las bacterias que la producen:
– EcoRI: E = género Escherichia.
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
 70

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
•Se les llama enzimas de restricción porque restringen la
actividad de bacteriófagos
•“Sistema inmunológico” de las bacterias
•Metilasa reconoce la misma secuencia en el DNA de la
bacteria y lo metila
•Las enzimas de restricción solo “atacan” secuencias no
metiladas
 71

TIPOS DE CORTE
 72

PROBLEMA
Al analizar mediante electroforesis en geles de agarosa el
producto de la digestión de un DNA plasmídico con una enzima
de restricción, se observa la presencia de 4 fragmentos de DNA
de diferentes tamaños.
¿Cuántos sitios de reconocimiento para esa enzima hay en
dicho plásmido?

+ ER
 73

PROBLEMA
Con base en el gel obtenido de la
digestión enzimática, determine
¿Cuál modelo es el correcto?
 74

PROBLEMA
Solución:
 75

ANÁLISIS DE PRODUCTOS
DE PCR
 76

PCR-RFLP
RFLP: Polimorfismo en la longitud de
los fragmentos de restricción
 77

LEISHMANIA
 Leishmania es un protozoario parásito intracelular
obligado de las células del sistema fagocítico
mononuclear

 Se caracteriza por presentar 2 estadios de vida:

promastigote y amastigote

 El género agrupa a 25 especies (incluyendo L. mexicana),

las cuales causan la Leishmaniasis

Ochoa-Díaz y cols., 2012

 78

LEISHMANIASIS
 La leishmaniasis es transmitida a los mamíferos,
incluyendo el ser humano, por dípteros hembra del
género Lutzomyia pudiendo afectar la piel, mucosas o
tejidos y médula ósea (Vélez y col, 2010)

Ganglio
Médula s
ósea linfoide
s

Bazo
Lutzomyia longipalpis

Ochoa-Díaz y cols., 2012; health.allrefer.com

 79

CICLO DE VIDA DE LEISHMANIA

Cecílio y col., 2014; Kumar & Engwerda, 2014; LBM

 80

VARIANTES CLÍNICAS DE
LEISHMANIASIS

Especie de
Leishmania
infectante

Predisposición
Contexto
genética del
inmunológico
hospedero

Chaara y col., 2014; Cecílio y cols., 2014; OMS, 2015; Gurung y cols., 2015; Mignogna y cols., 2015
 81

VARIANTES CLÍNICAS DE
LEISHMANIASIS
Se presentan principalmente 3 formas distintas:

Leishmaniasis Cutánea Leishmaniasis Leishmaniasis Visceral

(LC) Mucocutánea (LMC) (LV)
L. mexicana L. braziliensis L. infantum

Pérez-Vega y cols., 2009; Zea y cols., 2009; www.york.ac.uk

 82

EPIDEMIOLOGÍA DE LA LEISHMANIASIS
 La leishmaniasis es endémica en 98 países, se estima que 350
millones de personas se encuentran en riesgo de infección, se
presentan 2 millones de casos nuevos cada año (Beattie y cols.,
2011)

WHO, 2017
 83

EPIDEMIOLOGÍA DE LA LEISHMANIASIS
En México se encuentra distribuida en
diferentes estados de nuestro país,
incluyendo Sinaloa

 L. mexicana es la
principal especie
etiológica

Leishmaniasis cutánea
Leishmaniasis cutánea y mucocutánea
Leishmaniasis visceral
Sin reporte de casos Pérez-Vega y cols., 2009; Ochoa-Díaz y cols., 2012
 84

LEISHMANIASIS EN SINALOA
 Del año 1994 a la fecha se han reportado más de 120
casos de leishmaniasis cutánea (LC) en el estado de
Sinaloa (SSA Sinaloa, 2013)
85
 86

IMPRONTA

Fijado y
tinción
Giemsa
Observación
 87

CONSIDERACIONES SOBRE LA
IMPRONTA
 El único método diagnóstico de LC es la
impronta, que es específica, pero poco
sensible y está limitado en el tamizaje de
varias muestras, y no permite identificar la
especie, por lo cual es necesario explorar
estrategias alternativas, como el diagnóstico
molecular que permitan identificar género y
especie del parásito
 88

DIAGNÓSTICO MOLECULAR:
PCR-RFLP
LITSR

ITS 1 5.8S ITS 2

18S rRNA rRNA 28S rRNA

L5.8S

LITSR (5’-CTGGATCATTTTCCGATG-3’)

L5.8S (5’-TGATACCACTTATCGCACTT-3’)

El Tai y cols., 2001; Pérez-Vega y cols., 2009; Ochoa-Díaz y cols., 2012

 89

PCR-RFLP
 90

DIAGNÓSTICO MOLECULAR: PCR-RFLP

Digestión Enzimática
HaeIII

Cultivo L. mex Impronta en papel

MHOM/MX/92/UAY68 lesión del paciente RFLP de ITS-1

Purificación
del Amplicón
SECUENCIACIÓN

Extracción de DNA Amplicón ITS-1

ESPECIACIÓN
IN SILICO

El Tai y cols., 2001; Pérez-Vega y cols., 2009

DNA genómico PCR Ochoa-Díaz y cols., 2012
 91

EJEMPLO APLICACIÓN DE PCR-RFLP

1 2 3 4

8000 pb

5000 pb

1. Marcador Ez Load 500 pb BIO-RAD.

1000 pb 2. DNA L. mexicana de cultivo.
3. DNA L. mexicana de cultivo.
500 pb
4. DNA de Paciente con LC.

La detección del DNA proveniente de células de una impronta de un Paciente

con LC y de células de cultivo de Leishmania mexicana, es evidente y se
muestra en la figura de arriba. El peso del DNA genómico que se observa es
de 8000 pb aproximadamente.
 92

EJEMPLO APLICACIÓN DE PCR-RFLP

1 2 3 4

320 pb
200 pb

1. Marcador Ez Load 20 pb BIO-RAD.

2. PCR de agua libre de nucleasas.
3. PCR de Paciente con LC.
4. PCR de L. mexicana de cultivo.

Utilizando los iniciadores LITSR y L5.8S para la amplificación específica de

la región ITS1 del genoma de Leishmania sp. se obtuvo un producto de
320 pb tanto en el empleo de DNA templado de L. mexicana de cultivo, así
como, con el DNA de un Paciente con LC.
 93

EJEMPLO APLICACIÓN DE PCR-RFLP

1 2 3 4
250
200

150

100

50

Figura 2. Leishmania mexicana es el agente causal de la LCL del paciente en estudio.

Productos de RFLP resueltos en un gel de poliacrilamida al 12% teñido con un kit Silver stain
(Sigma) donde se observa en 1) el marcador de DNA de 50pb; en 2) las bandas
correspondientes a 210, 95 y 70pb aproximadamente, correspondientes a los productos de la
digestión enzimática con HaeIII del amplicón ITS1 del paciente en estudio; en 3) el producto
de PCR del ITS1 proviene de la cepa de referencia de L. mexicana MHOM/MX/UAY68; en 4)
digestión enzimática del producto de PCR de β-actina humana empleada como fuente de
DNA irrelevante. Este resultado es representativo de tres experimentos independientes.
 94

EJEMPLO APLICACIÓN DE PCR-RFLP

A B C

Figura 1. Paciente con leishmaniasis cutánea localizada (LCL). En A, se muestra

la cara posterior del brazo derecho del paciente observándose un nódulo ulcerado de
forma circular con un diámetro de 13 X 18mm de diámetro de seis meses de
evolución compatible con LCL. En B, se muestra una micrografía de una sección de
la impronta de la lesión mostrada en A, donde se observa un macrófago parasitado
con al menos cuatro amastigotes de Leishmania sp. En C, se aprecia la evolución del
paciente tratado intralesionalmente con Glucantime.
 95

HIBRIDACIÓN
Es la unión complementaria de ácidos nucléicos (DNA o
RNA) empleadas para detectar una molécula diana (la
que nos interesa conocer) partiendo de una sonda
complementaria a ella.

En las técnicas de hibridación se parte de dos

poblaciones de ácidos nucleicos: un conjunto
homogéneo de ácidos nucleicos de secuencia conocida
que actúa como sonda y otro conjunto heterogéneo de
ácidos nucleicos de secuencia desconocida donde
queremos detectar la secuencia diana.
 96

HIBRIDACIÓN
Puede producirse en medio
líquido o sobre un soporte
sólido, como nitrocelulosa,
al que se encuentra unida
una de las dos poblaciones
de ácidos nucleicos.
 97

SONDAS
La mayoría de los aa están codificados por más de un
codón, por lo tanto, habrá más de una posible secuencia
de nucleótidos que podría codificar un polipéptido.
Entre más residuos de triptófano y metionina en el
fragmento de la proteína, habrá menos secuencias de
bases posibles que podría codificar esa parte de la
proteína, ya que codifican codones únicos.
 98

MARCAJE DE EXTREMO 5’
La forma más simple de marcaje de DNA que implica
una transferencia de fosfato o una reacción de
intercambio en la que se elimina el fosfato 5’ del DNA
que se utilizará como sonda y en su lugar se agrega
un fosfato marcado, generalmente 32P
 99

SONDAS: MARCAJE 5’
 100

MARCAJE DE EXTREMO 3’
Marcaje menos complejo donde un nuevo dNTP que
está marcado (por ejemplo, 32P-adATP o dNTP
marcado con biotina) se agrega al extremo 3’ del DNA
mediante la enzima terminal transferasa
 101

SONDAS: MARCAJE 3’

Problema potencial: se agrega un nuevo nucleótido que

altera la secuencia completa del DNA y puede afectar su
hibridación a su secuencia diana
 102

Métodos de transferencia:
Southern, Northern y Western

La transferencia del DNA, RNA o proteína a una

membrana de nitrocelulosa a partir de un gel permite
indicar la presencia de un fragmento específico
deseado en una muestra.

Dependiendo de la sustancia a separar, las técnicas

de transferencia pueden ser:
1. Southern blot (DNA)
2. Northern blot (RNA)
3. Western blot (Proteína)
 103

Southern Blot
Técnica utilizada para identificar DNA de interés a partir
de una mezcla de muestra de DNA o una secuencia de
bases específica dentro de una cadena de DNA.
1. El gel se empapa en buffer alcalino para que el DNA sea
monocatenario.
2. Se transfiere a la membrana para que el DNA se adhiera
a él exactamente en el mismo patrón que en el gel.
 104

Northern Blot

Permite la identificación de secuencias de RNAm

específicas de una longitud definida por hibridación
a una sonda de gen marcado. Además, puede usarse
para cuantificar los niveles relativos de RNAm
específico.
 105

Southern, Northern y Western

 106

Southern, Northern y Western

 107

Western Blot
Técnica utilizada para detectar proteínas específicas
en una muestra de tejido homogeneizado o extracto,
usando un Ac para detectar específicamente su Ag.
 108

Southern, Northern y Western

 109

Southern, Northern y Western: Problema

Los sueros provenientes de 3 grupos de ratones BALB/c fueron analizados mediante
Western blot, cada grupo de sueros fue mezclado entre sí (intragrupo), al término del
proceso de vacunación con DNA. El primer grupo no fue inmunizado (Naive); el otro
grupo fue inmunizado con el vector solo (Blank; vector pCMVsyn) y el tercer grupo fue
inmunizado con la construcción pCMVsynVW2-1. En el panel de la izquierda (SDS-
PAGE), se muestran los antígenos utilizados en cada uno de los otros páneles. En la
línea 1) se ubica el fragmento aminoterminal (VW 2-1) de la proteína paramiosina de
Taenia solium (TPmy); en la línea 2) la TPmy completa; en la línea 3) extracto antigénico
(EA) de T. solium; en 4) EA de T. crassiceps. Las tenias son helmintos parásitos del
grupo de los cestodos (“gusanos” planos segmentados), que infectan al ser humano y
al ratón, respectivamente. Explique y argumente el resultado.
 110

Identificación de serotipos del DENV

RT-PCR anidada
Con base en los resultados de una RT-PCR para el diagnóstico de DENV
publicado por Lanciotti y cols., 1992 J Clin Microbiol 30(3): 545-551,
describa correctamente el resultado de la figura inferior
 111

Identificación de serotipos del DENV

RT-PCR anidada (o multiplex)
 112

SECUENCIACIÓN DE DNA

Se refiere a métodos para determinar el orden de los

nucleótidos (adenina, guanina, citosina y timina) en
una molécula de DNA
 113

SECUENCIACIÓN DE DNA
 114

SECUENCIACIÓN DE DNA

Los didesoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP)

que son los nucleótidos que terminan la cadena, deben
carecer de un grupo 3'-OH para la formación de un enlace
fosfodiéster entre dos nucleótidos
 115

SECUENCIACIÓN DE DNA

La muestra de DNA se divide en cuatro reacciones de secuenciación

separadas, que contienen los cuatro desoxinucleótidos estándar (dATP,
dGTP, dCTP, dTTP) y la DNA polimerasa.
 116

SECUENCIACIÓN DE DNA

A cada reacción se agrega solo uno de los cuatro didesoxinucleótidos (ddATP,

ddGTP, ddCTP, ddTTP) que son los nucleótidos que terminan la cadena,
terminando así la extensión de la cadena de DNA y resulta en fragmentos de
DNA de longitud variable.
 117

SECUENCIACIÓN DE DNA
 118

SECUENCIACIÓN DE DNA
 119

SECUENCIACIÓN DE DNA

Los fragmentos de DNA sintetizados y marcados se desnaturalizan por

calor y se separan por tamaño mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida-urea con cada una de las cuatro reacciones realizadas en
una de las cuatro pistas individuales (A, T, G, C).
 120

SECUENCIACIÓN DE DNA
 121

SECUENCIACIÓN DE DNA
 122

SECUENCIACIÓN DE DNA
 123

SECUENCIACIÓN DE DNA
 124

PROBLEMA
Deduzca la secuencia de la hebra molde con base en el patrón
electroforético mostrado en la figura
 125

RESPUESTA AL PROBLEMA

5’ GCA GTG TCC TGA TCG3’

 126

ELISA
Sistema enzimático para mostrar la combinación
específica de un Ag con su Ac.
Método que permite cuantificar un Ag inmovilizado en
una superficie sólida. Se usa un Ac específico con una
enzima acoplada covalentemente.
La cantidad de Ac que se une al Ag es proporcional a la
cantidad de Ag presente, que se determina midiendo
espectrofotométricamente la conversión de una
sustancia transparente en un producto coloreado
mediante la enzima acoplada.
127
 128

INMUNOFLUORESCENCIA
La propiedad de ciertos tintes que absorben rayos de
luz a una longitud de onda particular (luz ultravioleta)
y los emiten a una longitud de onda diferente (luz
visible) se conoce como fluorescencia.

Inmunofluorescencia (IF) es el procedimiento para

detectar Ag’s en contextos celulares usando Ac’s.
 129

INMUNOFLUORESCENCIA

+ +

+ +
 130

INMUNOFLUORESCENCIA
IFD e IFI 131
FACS 132
 133

ALGUNOS MARCADORES
CELULARES (CD)
 134

MICROARREGLOS

Las micromatrices de DNA son soportes sólidos

(vidrio o silicio) sobre los que se une el DNA de una
manera organizada y predeterminada.
Permiten analizar la expresión de decenas de miles
de genes simultáneamente.
Cada “mancha” de DNA, llamada sonda, representa
un solo gen.
 135

MICROARREGLOS
 136

MICROARREGLOS
 137

MICROARREGLOS
VENTAJAS DESVENTAJAS
• Proporciona datos para • Caro para crear.
miles de genes en tiempo
real. • La producción de
• Un solo experimento genera demasiados resultados a la
muchos resultados vez requiere mucho tiempo
fácilmente. para el análisis, que es de
• Rápido y fácil de obtener naturaleza bastante
resultados. compleja.
• Prometiendo descubrir
curas para enfermedades y • Los chips de ADN no tienen
cáncer. una vida útil muy larga.
• Diferentes partes del ADN se
pueden usar para estudiar la
expresión génica.
 138

MICROARREGLOS

TAREA 2
Ingresar a la siguiente liga
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/

Entregar un resumen por equipos

Hecho a mano
Lunes 21 de Octubre