PRÁCTICA N° 8: TIROSINASA II

LUSDEY ACEVEDO SANTOS

MARYORY CONTRERAS VASQUEZ
PAOLA RIVERA ÁVILA

Informe de laboratorio

RAMÓN LOZADA

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACIÓN Y CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Y QUÍMICA
PROGRAMA BIOLOGÍA
SINCELEJO
2020
 PRÁCTICA N°8: TIROSINASA II

1. OBJETIVOS:

1.1. OBJETIVO GENERAL:

Determinar el valor de Km para la tirosinasa utilizando diferentes métodos, entre ellos la

curva hiperbólica de Michaelis Menten y la ecuación de los inversos o de lineweaver –burk.

1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Comparar los resultados cinéticos obtenidos, pero en presencia de inhibidores.

2. MARCO TEÓRICO:

¿Qué es la Tirosinasa?
Son proteínas complejas que producen un cambio químico específico en otras sustancias, sin
que exista un cambio en ellas mismas. Por ejemplo, las enzimas pueden convertir los
almidones, proteínas los azúcares en sustancias que el cuerpo pueda utilizar. La coagulación
de la sangre es otro ejemplo del trabajo de las enzimas. Las enzimas son esenciales para todas
las funciones corporales y se encuentran en la boca (saliva), el estómago (jugo gástrico), los
intestinos (jugo pancreático, jugo y mucosa intestinal), la sangre y en cada órgano y célula del
cuerpo. La tirosinasa es una enzima que cataliza la hidroxilación de mono fenoles y la
oxidación de o-difenoles a o-quinoles, reacciones que convierten a la enzima en clave para la
síntesis de pigmentos, como es el caso de la melanina, tanto en eucariotas como en
procariotas. Interviene en tres reacciones diferentes pertenecientes a la vía de síntesis de la
melanina, una de ellas limitante. Está codificada por el gen TYR, gen situado en el brazo
largo del cromosoma 11 que comprende más de 70 Kilobases y cuya región codificante (que
abarca 1,8 Kilobases) está dividida en cinco. La tirosinasa lleva a cabo la oxidación de
fenoles como la tirosina y el catecol usando de oxígeno (O2). En presencia de catecol, se
forma benzoquinona (véase reacción abajo). Los hidrógenos extraídos del catecol se
combinan con el oxígeno para formar agua.Estas han sido aisladas y estudiadas desde una
amplia variedad de plantas, animales y especies de hongos. Las tirosinasas de diferentes
especies son distintas en términos de sus propiedades estructurales, distribución de tejido y
ubicación celular. Se ha insinuado que no hay una estructura de proteínas común que ocurra a
través de todas las especies.
Las enzimas encontradas en plantas, animales y tejidos de hongos frecuentemente difieren
respecto a su estructura primaria, tamaño, patrón de glicosilación características de
activación.
Sin embargo, todas las tirosinasas tienen en común un centro de cobre binuclear tipo 3 dentro
de su sitio activo. Aquí dos átomos de cobre son coordinados individualmente con tres
residuos de histidina. En humanos, la tirosinasa se clasifica en melanosomas (es un orgánulo
que contiene melanina, el pigmento absorbente de luz más común en el reino animal. Las
células que producen melanosomas se denominan melanocitos, mientras que las células que
simplemente han ingerido los melanosomas se denominan melanofagos) y el
dominiocatalíticamente activo de la proteína reside dentro de los melanosomas. Sólo una
pequeña parte de la proteína no esencial enzimáticamente se prolonga en el citoplasma.

¿En qué consiste una Curva hiperbólica?

figura retórica que consiste en la exageración; la hipérbole, figura geométrica, una curva de
dos ramas obtenida al cortar un cono recto por un plano oblicuo al eje de simetría con ángulo
menor que el de la generatriz respecto del eje de revolución.

¿Qué significa Km?

La Km nos da una idea la afinidad que tiene el enzima por su sustrato, cuanto mayor es Km
menor es la afinidad (predominan las formas E y S libres), cuanto menor es Km mayor es la
afinidad (predomina la forma ES).

3. PROCEDIMIENTO:

(Basado en el procedimiento descrito en la guía de laboratorio)

4. DATOS:

Datos experimentales:
Tabla 1.
[s] Vo 1/[s] 1/Vo
3 10,4 0,33333333 0,09615385
5 14,5 0,2 0,06896552
10 22,5 0,1 0,04444444
30 33,8 0,03333333 0,0295858
90 40,5 0,01111111 0,02469136

5. RESULTADOS:

Gráfico de concentración vs velocidades (Gráfico 1):

Gráfico de Linerweaver- burk (Gráfico 2):

Con lo obtenido tendríamos:
y = 0,224x + 0,0224
1 km 1 1
= +
V 0 Vmax [ s ] Vmax
Donde:
1
=¿ y
V0
km
= 0,224
Vmax
1
=¿ x
[s]
1
=¿0,0224
Vmax

Entonces:
Para Vmax tenemos:
1
=¿0,0224
Vmax
1
√ Vmax= = 44,64
0,0224

Para Km tenemos:
Km
=¿0,224
Vmax
Km = 0,224 x 44,64
Km= 9,99936

6. DISCUSIÓN:

Las enzimas son moléculas metabólicas cuya actividad puede ser afectada por factores
externos como la temperatura o la adición de sustancias. Estos factores pueden causar una
disminución o anulación en la actividad enzimática.
La enzima tirosinasa está presente en plantas y animales y es la encargada de catalizar la
oxidación de fenoles. La tirosinasa es una enzima cuprífera presente en tejidos de plantas y
animales que cataliza la producción de melanina y otros pigmentos de la tirosina por
oxidación, como el ennegrecimiento de una patata pelada o cortada expuesta al aire.[1]
Con valores teóricos se calculó la velocidad máxima (Vmax) y Km para tirosinasa usando la
gráfica de lineweaver burk, una recta de regresión obteniendo así valores de 44,64 para
Vmax y 9,99936 para Km. El valor de Vmax teórica fue posible encontrarlo dentro de las
concentraciones de sustrato, por lo que podría decirse que se alcanzó. Y el valor de Km, el
cual podría considerarse relativamente alto puede dar una idea de la afinidad de la enzima
por el sustrato, siendo en caso de que este valor sea alto, menos la afinidad de la misma con
el sustrato.
En la gráfica 1, podemos observar que los valores de V0 se elevan rápidamente a bajas
concentraciones de sustrato y llegan a un punto en el que se vuelven más estables a medida
que la concentración aumenta. La denominada meseta observable en la gráfica 1 se produce
porque la enzima se encuentra saturada. Vmax depende de la concentración de la enzima,
mientras que Km siempre es la misma para una reacción particular en una enzima
determinada y podría modificarse experimentalmente usando inhibidores.

7. CONCLUSIONES:

● La actividad enzimática de las enzimas puede verse afectada b por diferentes factores
ya sea físicos, químicos (sustancias), por los niveles de pH o inhibidores. Además de
estos las concentración y afinidad del sustrato puede llegar a disminuir la actividad
enzimática.
● En la gráfica anterior, los valores de V0 se elevan rápidamente a bajas
concentraciones de sustrato y llegan a un punto en el que se vuelven más estables a
medida que la concentración aumenta. La denominada meseta observable en la gráfica
1 se produce porque la enzima se encuentra saturada.
●

8. CUESTIONARIO:

1. ¿Qué significado tienen Vmáx y Km?

Respuesta:

Km, se considera una constante, es característica de la enzima y el sustrato particular en

condiciones especiales y se refleja la afinidad enzima-sustrato. Es la concentración de sustrato
a la cual, la velocidad de la reacción es igual a ½ de la Vmáx.

Vmáx, velocidad límite que alcanza la enzima a concentración saturada de sustrato.

2. ¿Qué relación existe entre el valor de Km y la Afinidad de la enzima por el sustrato?

Respuesta:

La Km nos da una idea la afinidad que tiene el enzima por su sustrato, cuando mayor es Km,
menor es la afinidad (predominan las formas E y S libres), cuando menor es Km mayor es la
afinidad (predomina la forma ES).
 Km= k-1 + k2
K1
La velocidad máxima Vmáx estima el número de centros activos del enzima, recordar que
hemos definido la Vmáx como la velocidad que obtendríamos cuando todo el enzima se
encuentra unido al sustrato. A la constante K2 (poder catalítico del enzima) se le reconoce
con el nombre de número de recambio, es el número de moléculas de sustrato convertidas en
producto por unidad de tiempo. Por lo que la Vmáx depende de dos cosas, la cantidad de
enzima presente y la capacidad catalítica del enzima, es decir, la velocidad con que
transformar al sustrato.

Vmáx = k2 [ E]

3. ¿Qué importancia tiene conocer los parámetros Vmáx y Km de una enzima?

Respuesta:

La obtención del Km y la Vmáx de una enzima, es importante no solo porque son parámetros
que la identifican, sino también por motivos que, en ocasiones, pueden ser de vital
importancia. Por ejemplo, algunos tipos de leucemia (enfermedad en la que los glóbulos
blancos proliferan anormalmente) pueden evitarse por la administración de una enzima, la
Asparraginasa, que cataliza la reacción de hidrólisis de la asparragina (Asn) a acido aspártico
(Asp).

4. ¿Qué interpretación se puede hacer en caso de que una enzima tiene un valor de Km
de 0,05 mM y otra enzima tiene un valor de Km de 0,01 mM para el mismo sustrato?

Respuesta:

Se puede inferir que la enzima con un Km de 0,01 mM presenta mayor afinidad con el
sustrato (Lo cual podría deberse a la disponibilidad de este en el medio) y la que tiene un Km
de 0,05 Km tiene menor afinidad (También podría estar estrechamente relacionada con la
concentración de sustrato en el medio donde dicha enzima se encuentra).

5. Además de la concentración de sustrato que otros factores afectan la actividad de una

enzima.

Respuesta:
 Efecto del pH sobre la actividad enzimática: los enzimas poseen grupos químicos
ionizables (carboxilos-COOH; amino – NH2 ; Tiol-SH; imidazol, etc) en las cadenas laterales
de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica
positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus
cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la
actividad catalítica. La mayoría de los enzimas so9n muy sensibles a los cambios de pH.
Desviaciones de pocas decimas por encima o por debajo del pH óptico pueden afectar
drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptico de 2, la ureasa lo tiene
a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la
desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas mas o menos
complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiológicos.

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática: en general, los aumentos de la

temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10°C de incremento, la velocidad de
reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin
embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el
calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptica.
Por encima de esta temperatura el aumento de velocidad de la reacción debido a la
temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalíca debida a la
desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.

Efecto de los cofactores sobre la actividad enzimática: a veces, un enzima requiere para su
función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis: los cofactores.
Los cofactores pueden ser iones inorgánicos como Fe++ , Mg++ , Mn++ , Zn++ , etc. Casi un
tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molécula
orgánica se llama coenzima. Muchos de estos coenzimas se sintetizan a partir de las
vitaminas. Cuando los factores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al
enzima se llaman grupos protéticos.

Efecto de los Inhibidores sobre la actividad enzimática: ciertas moléculas pueden inhibir
la acción catalítica de un enzima, son los inhibidores. Estos inhibidores biuen pueden ocupar
temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original (inhibidor
competitivo) o bien alteran la conformación espacial del enzima, impidiendo su unión al
sustrato (inhibidor no competitivo).

Activación proteolítica a la actividad enzimática: algunos enzimas no se sintetizan como

tales, sino como proteínas precursoras sin actividad enzimática. Estas proteínas se llaman
proenzimas o zimógenos. Para activarse, los zimógenos sufren un ataque hidrolítico que
origina la liberación de uno o varios péptidos. El reto de la molécula proteica adopta la
conformación y las propiedades del enzima activo. Muchos enzimas digestivos se secretan en
forma de zimógenos y en el tubo digestivo se convierten en la forma activa. Es el caso de la
a-quimotripsina, que se sintetiza en forma de quimotripsinógeno. Si estos enzimas se
sintetizaran directamente en forma activa destruirían la propia célula que las produce.

BIBLIOGRAFÍAS:
● [1] Cansamola, M. (2013 ) la enzima troumasa 2 Inhibidoras efan natural y sintético.
Centro de información y gestión tecnologica y Medio ambiente.
● ck genaat temologl cas y Aroyor 6 (2009).1nhibidan de la aciidad engimarPca de l
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● Maurice,R. Marshall et al faoma encimatic Browring in Fruits, vegetade and asefoods,
FAO (200).