BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

TALLER No 2

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y SUS APLICACIONES

1. Escriba el organismo de origen, las secuencias de reconocimiento, el tipo de corte y tipo de las
enzimas de restricción EcoRI, BamHI, HindIII, PstI, PvuI, BglIII, SmaI.

Secuencia de Tipo de
Enzima Organismo de origen Tipo de corte
reconocimiento enzima
Escherichia coli RY
EcoRI Cohesivo Tipo II
13.
Bacillus
BamHI Cohesivo Tipo II
amyloliquefaciens

HindIII Haemopilus influenzae Cohesivo Tipo II

PstI Providencia stuartii Cohesivo Tipo II

PvuI Proteus vulgaris Cohesivo Tipo II

BglIII Bacillus globigii Cohesivo Tipo II

SmaI Serratia marcescens Romo Tipo II

2. En la siguiente secuencia sencilla de ADN encuentre y señale todas las potenciales secuencias
de reconocimiento de enzimas de restricción, en la forma de doble hélice de ADN.

5’ TAGAATTCGACGGATCCGGGGCATGCAGATCATTCGCGTTAAGGCCTT 3’
3. El sistema inmune bacteriano emplea endonucleasas de restricción, las cuales reconocen
secuencias cortas de DNA exógeno con alta especificidad, clivando ambas hebras del DNA
blanco. Las enzimas de restricción son herramientas indispensables en biología molecular y
biotecnología (1). Más de 3000 enzimas de restricción han sido identificadas, las secuencias del
DNA reconocido por estas enzimas se denominan sitios de restricción. Los sitos de restricción
están aleatoriamente distribuidos por el genoma y se pueden encontrar en o alrededor de genes
particulares. Sin embargo, debido a que más del 95% del DNA humano no codifica para
proteína, la mayoría de los sitios de restricción son localizados en porciones no codificantes de
genes (2).

Las enzimas de restricción han sido ampliamente usadas en el diagnóstico de diferentes

tipos de alteraciones de interés médico. Entre estas cabe mencionar la detección fetal de
mutaciones asociadas a enfermedad. Para ello se ha usado la enzima de restricción Hpa I
para digerir DNA fetal (3). Como se mencionó previamente, cada enzima reconoce una
secuencia especifica donde quiera que esta se presente y produce un patrón de corte; estos
fragmentos podían identificarme mediante el empleo de sondas radiomarcadas.

De esta manera, se presenta una técnica que permite discriminar un individuo que presenta
la enfermedad, un portador y uno sano. Kan y colaboradores encontraron que el gen de la
Beta globina normal, al usar la enzima Hpa I genera un fragmento de DNA de 7 o 7.6 Kb,
en el 97% de las veces, el resto de las veces se encontraba en un fragmento de 13Kb.
Mientras que el gen defectuoso se encontraba sobre un fragmento de 13 Kb el 87% de las
veces (figura 1). Aparentemente, el gen con la mutación se asocia con la pérdida del sitio de
reconocimiento para Hpa I, cerca de 5kb a partir del final del gen, generando así el
fragmento largo al usar la enzima.
 Figura No.1. En la figura se presentan los tres tipos de fragmentos de DNA humano, en el gen
de la Beta globina, que se pueden generar a partir de la digestión con la enzima Hpa I. Las
barras rellenas representan el gen normal y las vacías el gen con la alteración. Las flechas
indican los sitios de corte.

El anterior es un ejemplo real de aplicación el mecanismo de acción de las enzimas de

restricción, en la detección de mutaciones asociadas a una enfermedad específica, en este caso
la anemia de células falciformes. A continuación, se muestra el patrón de corte de la enzima
HpaI.

Punto de corte

A) Alelo silvestre

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTT-AACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCAA-TTGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

B) Alelo mutado Se pierde el punto de corte

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTA-AACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Genera un patrón combinado

C) Alelo heterocigoto

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTT-AACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

a. Teniendo en cuenta lo antes expuesto, usted debe determinar a qué tipo de individuos
corresponden los siguientes perfiles:
PM
1 2 3 4
 De izquierda a derecha indique
13 Kb
 Línea 1.
 7.6 Kb Línea 2.
 7.0 Kb Línea 3
 Línea 4
 Línea 1: Homocigoto anormal
 Línea 2: Homocigoto normal
 Línea 3: Heterocigoto con un gen normal y otro anormal
 Línea 4. Heterocigoto normal

Posteriormente, en 1982 Chang y Kan, presentaron un nuevo método que permite detectar la
mutación causante de la enfermedad directamente, sin necesidad de realizar cultivo previo (4). La
secuencia CCTGAGG es reconocida por la enzima MstII, dicha secuencia se encuentra en la región
que codifica para los amino ácidos 5 a 7 en la Beta globina normal. Este clivaje genera múltiples
fragmentos, incluyendo dos que abarcan esta región uno de 200 y otro de 1150pb. La Beta globina
de los individuos afectados contiene la secuencia CCTGTGG, la cual no es reconocida por MstII.
Por lo tanto el clivaje del gen de la Beta globina afectado genera un solo fragmento de 1350pb (ver
figura 2). Esta diferencia en los patrones de digestión enzimática, permite diferenciar individuos no
afectados (normales), heterocigotos para la mutación y el genotipo homocigoto (4,5).

Figura No.2. Las flechas indican los puntos de corte de MstII. En la figura se puede apreciar el corte
que se genera en el genotipo de Beta globina normal βA y el patrón de corte del genotipo afectado
Beta globina βS.

b. A partir de lo anterior, identifique los genotipos correspondientes en los siguientes perfiles

de digestión enzimática:

1 2 3 4 PM
De izquierda a derecha indique
1.35 Kb Línea 1.
1.15 Kb
Línea 2.
Línea 3.
Línea 4.
0.2kb

Línea 1: Homocigoto βA
Línea 2: Heterocigoto βA y βA
Línea 3: Heterocigoto βA y βS
Línea 4: Homocigoto βA
4. Describa a que corresponde la figura anterior, descríbala y que puede destacar de esta.

Los vectores de clonación o vector molecular son moléculas transportadoras que transfieren y
replican fragmentos de ADN que llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante.
Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de
ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la
inserción del fragmento de ADN a clonar.

Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes.

Todo vector de clonación debe contener los siguientes elementos:

 Origen de Replicación: Es la región que codifica para el inicio de la síntesis de DNA, el

cual le da la cualidad de poder replicarse de manera independiente al DNA cromosómico,
ya sea en un sistema bacteriano o en un sistema de expresión en levaduras.

 Agente de Selección: Son genes contenidos en la secuencia del vector, los cuales le
confieren características adicionales al sistema de clonación (bacterias, levaduras, etc.), que
permiten la identificación y selección de las clonas recombinantes, es decir, clonas que
contienen el fragmento de DNA de interés. Ejemplos de esto son los genes que codifican
para la resistencia a antibióticos, como lo son los de resistencia a la ampicilina o a la
tetraciclina, o por el contrario, pueden ser marcadores metabólicos como el gen Lac Z, que
codifica para la síntesis de la enzima beta galactosidasa o marcadores auxotróficos, como lo
es el gen que codifica para la síntesis de histidina (muy utilizado en los sistemas de
expresión y clonación en levaduras).

 Polilinker o Sitio de Multiclonación: Región contenida dentro de las secuencias de los

genes que codifican para los marcadores, que contienen múltiples sitios de restricción, es
decir, múltiples sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción, que permiten la
inserción de los fragmentos de DNA que se desea clonar en un sistema.
5. En bioinformática, el formato FASTA es un formato para representar secuencias de nucleótidos
o amino ácidos mediante códigos que emplean letras. El formato permite describir nombres de
secuencias y comentarios de dichas secuencias. El formato tiene su origen del software FASTA,
pero que ahora se ha convertido en un estándar en bioinformática.

Para usar el formato FASTA, se debe tener en cuenta que tiene dos bloques fundamentales:
el primer bloque está formado por una sola línea que comienza con '>' y consiste en una
descripción de la secuencia; el segundo bloque está formado por los nucleótidos de la
secuencia e incluye tantas líneas de acuerdo a la extensión de la secuencia

A continuación, encontrará una secuencia de mRNA del gen Adiponectina humano, en formato
FASTA.

GenBank: EU420013.1

>ATGCTGTTGCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTAGCTCTGCCCGGTCATGACCAGGAAACCACGACTCAAG
GGCCCGGAGTCCTGCTTCCCCTGCCCAAGGGGGCCTGCACAGGTTGGATGGCGGGCATCCCAGGGCATCC
GGGCCATAATGGGGCCCCAGGCCGTGATGGCAGAGATGGCACCCCTGGTGAGAAGGGTGAGAAAGGAGAT
CCAGGTCTTATTGGTCCTAAGGGAGACATCGGTGAAACCGGAGTACCCGGGGCTGAAGGTCCCCGAGGCT
TTCCGGGAATCCAAGGCAGGAAAGGAGAACCTGGAGAAGGTGCCTATGTATACCGCTCAGCATTCAGTGT
GGGATTGGAGACTTACGTTACTATCCCCAACATGCCCATTCGCTTTACCAAGATCTTCTACAATCAGCAA
AACCACTATGATGGCTCCACTGGTAAATTCCACTGCAACATTCCTGGGCTGTACTACTTTGCCTACCACA
TCACAGTCTATATGAAGGATGTGAAGGTCAGCCTCTTCAAGAAGGACAAGGCTATGCTCTTCACCTATGA
TCAGTACCAGGAAAATAATGTGGACCAGGCCTCCGGCTCTGTGCTCCTGCATCTGGAGGTGGGCGACCAA
GTCTGGCTCCAGGTGTATGGGGAAGGAGAGCGTAATGGACTCTATGCTGATAATGACAATGACTCCACCT
TCACAGGCTTTCTTCTCTACCATGACACCAACTGA

Acceda a la página http://nc2.neb.com/NEBcutter2/, la cual corresponde a la herramienta cutter

Versión 2, de la casa New England Biolabs. Ingrese la secuencia antes mencionada, conserve los
parámetros de corte por defecto (no introduzca cambios en la configuración) y escoja dos enzimas
que corten diferentes partes del gen. A partir de su elección responda las siguientes preguntas:

a. Secuencias de reconocimiento
b. Tipo de corte
c. Tipo de enzima
d. Organismo proveniente
Organismo de Tipo de Tipo de
Enzima Secuencia de reconocimiento
origen corte enzima
BspHI Bacillus species 5'... T C A T G A ... 3'
Cohesivo Tipo II
H 3'... A G T A C T ... 5'

Bacillus 5'... C A Y N N N N R T G ... 3'

MslI Romo Tipo II
amyloliquefaciens 3'... G T R N N N N Y A C ... 5'

e. A partir del patrón de corte para este gen que tiene un tamaño de 735pb, cuál sería
el patrón electroforético (bandas) que usted esperaría en los siguientes casos (haga
un dibujo hipotético del gel):
- Grafique como seria el corte con cada enzima por separado
-Grafique como seria el corte si se usan ambas enzimas cortando al mismo tiempo.

Realizado por: Diana Catalina Prieto Martínez

Grupo: E
Mesa: 4