Quito - Ecuador

NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 1529-13:2013

Primera revisión

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS.

ENTEROBACTERIACEAE. RECUENTO EN PLACA POR
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

Primera edición

MICROBIOLOGICAL CONTROL OF FOODS. ENTEROBACTERIACEAE. PLATE COUNT FOR PLANTING IN DEPTH

First edition

DESCRIPTORES: Microbiología de los alimentos, análisis microbiológico, contaje, enterobacteriaceae

AL 01.058-310
CDU: 614.31:579.67:579.84
CIIU: 9320
ICS: 07.100.30
 CDU: 614.31 :579.67 :579.84 CIIU: 9320
ICS: 07.100.30 AL 01.05-310

Norma Técnica CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS NTE INEN

Ecuatoriana ENTERIOBACTERIACEAE 1529-13:2013
Voluntaria RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD Primera revisión
2013-09

1. OBJETO

1.1 Esta norma establece el método de recuento en placa por siembra en profundidad para
determinar el número de células viables de Enterobacteriaceae presentes en un gramo o centímetro
cubico de muestra.

2. ALCANCE

2.1 Este método es indicado para productos que contengan una alta carga de Enterobacteriaceae.

3. DEFINICIONES

3.1 Para efectos de esta norma, se adoptan las siguientes definiciones:

3.1.1 Enterobacteriaceae. Familia de microorganismos, cuyos miembros son bacilos Gram negativos
móviles por flagelo peritricos o inmóviles, capsulados o no, no esporulados, aerobios y anaerobios
facultativos; fermentan la glucosa generalmente con producción de gas, reducen los nitratos a nitritos;
son catalasa positivos, excepto un serotipo de Shiguela; son oxidasa negativos, comensales,
saprofitos, o patógenos intestinales. Microorganismos que forman colonias características en agar
glucosa bilis rojo violeta.

3.1.2 Recuento de Enterobacteriaceae. Es la determinación del número de colonias típicas de

Enterobacteriaceae que se desarrollan a partir de un gramo o cm³ de muestra, utilizando medios
selectivos.

4. MÉTODO DE ENSAYO

4.1 Resumen

4.1.1 Este método se basa en la capacidad de las Enterobacteriaceae, de producir ácidos a partir de
la glucosa, y utiliza la técnica del recuento en placa por siembra en profundidad, en agar cristal
violeta-rojo neutro- bilis- glucosa (VRBG) o similar, y una temperatura de incubación 37 ± 1ºC.

4.2 Reactivos y materiales

4.2.1 Materiales. La vidriería debe resistir esterilizados repetidas y todo el material debe estar
perfectamente limpio y estéril.

4.2.1.1 Pipetas serológicas de punta anchas de 1,5 y 10 cm³ graduadas en 1/10 de unidad

4.2.1.2 Incubador regulable, rango de temperatura de 25 a 70 ± 1ºC

4.2.1.3 Autoclave

4.2.1.4 Balanza de capacidad no inferior a 2.500g y de sensibilidad

4.2.1.5 Contador de colonias

4.2.1.6 Frascos de boca ancha de 250, 500 y 1000 cm³ con tapa de rosca autoclavable

4.2.1.7 pH-metro

4.2.1.8 Erlenmeyer de 500 y 1000 cm³

(Continúa)
DESCRIPTORES: Microbiología de los alimentos, análisis microbiológico, contaje, enterobacteriaceae.

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4.2.1.9 Papel whatman No.2 en cuadrados o tiras pequeñas

4.2.1.10 Placas de Petri, de vidrio o de plástico, de diámetro 90 mm a 100 mm.

4.2.1.11 Asa de platino; níquel o cromo no deben ser utilizados.

4.2.2 Medios de cultivo y reactivos: ver NTE INEN 1529-1. Preparación de medios de cultivo.

4.2.2.1 Caldo triptona soya (CTS)

4.2.2.2 Medio glucosa sal

4.2.2.3 Agar nutritivo

4.2.2.4 Agar cristal violeta-rojo neutro- bilis- glucosa (VRBG)

4.2.2.5 Solución acuosa al 1%de dihidrocíoruro de tetrametil – parafenilen – diamina

4.2.2.6 Vaselina liquida estéril

4.3 Procedimiento

4.3.1 Revitalización de las Enterobacteriaceae. Agitando de vez en cuando, mantener los tubos de las
diluciones decimales a temperatura del laboratorio 20°C a 25ºC, por dos horas. Esta etapa aplicar a
alimentos que han sufrido tratamientos de conservación (químicos o físicos).

4.3.1.1 ¹); utilizar

una nueva pipeta estéril para cada dilución.

4.3.2 Siembra. Tomar dos placas de Petri estériles. Usando una pipeta estéril, transferir a cada placa
1ml de la muestra si el producto es líquido, o 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros
productos. Tomar las dos placas Petri estériles. Usando una pipeta estéril, transferir a cada placa 1ml
de la primera cifra decimal de la dilución (10-1) de la muestra si el producto es líquido, o 1 ml de la
primera dilución decimal de la suspensión (10-2) en el caso de otros productos. Repetir el
procedimiento descrito con las otras diluciones, utilizando una pipeta estéril para cada dilución.

4.3.2.1 Verter en cada placa Petri inoculada aproximadamente 10 ml de medio de VRBG previamente
fundido y templado a 44 ° C a 47 ° C en el baño María.

4.3.2.2 El tiempo transcurrido entre la inoculación de las placas de Petri y el momento en que se vierte
el medio en las placas no debe exceder los 15 min. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio
de cultivo con movimientos de vaivén, 5 veces en una dirección; hacerla girar cinco veces en sentido
de las agujas de reloj; repetir este proceso, pero en sentido contrario.

4.3.2.4 Este paso se realiza para evitar el crecimiento y propagación, para lograr condiciones
anaeróbicas. Dejar que se solidifique.

4.3.2.5 Invertir las placas Petri e incubarlas a 37 ° C durante 24 h ± 2 h.

4.3.3 Recuento de colonias

4.3.3.1 Contar las colonias características que son de color rosa a rojo o púrpura (con o sin halos de
precipitación).

4.3.3.2 Si en la mitad o en más de la mitad de la superficie de las placas hay crecimiento invasivo
desechar la placa. Si menos de la mitad de la superficie está cubierta, contar las colonias en la parte
clara y extrapolar de tal manera que el número corresponda a la superficie total de la placa.

4.3.3.3 Si las placas de todas las diluciones contienen más de 150 colonias, contar en las placas
inoculadas con la menor cantidad de muestra.

4.3.4 Selección de colonias. Siempre que se requiere de ensayos confirmatorios, estos deben ser
realizados a partir de colonias previamente seleccionadas y purificadas.
(Continúa)
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4.3.4.1 Del total de colonias típicas, presuntas, seleccionar las bien aisladas, en un número
equivalente a la raíz cuadrada, con un mínimo de cinco.

4.3.4.2 A cada una de estas colonias inocularlas individualmente, en tubos que contengan agar
nutritivo inclinado o PCA. Incubar a 37ºC por 24h ± 1 h.

4.3.4.3 Hacer extensiones de éstos sub cultivos, comprobar su pureza (solo bacilos Gram negativos)
y utilizarlos para realizar pruebas complementarias.

4.3.5 Pruebas complementarias

4.3.5.1 Prueba de la oxidasa: sobre un vidrio o dentro de una placa Petri colocar un cuadrado o tira
de papel filtro, humedecerlo con unas gotas de la solución de dihidrocloruro de tetrametil para
fenilendiamina. Cuidadosamente sobre este papel frotar un asa del cultivo, haciendo una pequeña
raya. Es positiva si aparece un color púrpura oscuro en 5 a 10 segundos. Las enterobacterias tienen
reacción negativa.

4.3.5.2 Prueba de utilización de la glucosa: en un tubo de medio glucosa sal, con aguja sembrar por
picadura el subcultivo en agar nutritivo; luego, cubrirlo con vaselina líquida estéril. Incubar a 37ºC por
24 h. la reacción es positiva si el color del medio cambia a amarillo. Las enterobacterias tienen
reacción positiva. La mayoría de las cepas producen gas.

4.3.5.3 Cuando se desea conocer otras propiedades de las cepas de enterobacterias aisladas se
debe realizar las respectivas pruebas bioquímicas.

4.4 Cálculos

4.4.1 Caso se realicen pruebas complementarias, calcular basándose en el número de colonias

confirmadas en relación al número total de las colonias típicas contadas (presuntas enterobacterias) y
si por lo menos, el 80% de las colonias típicas sometidas a las pruebas complementarias son
confirmadas como Enterobacteriaceae, tomar el número de colonias típicas contadas ver en 4.3.3
como el número de enterobacterias por placa.

4.4.2 Cálculo del número (N) de unidades formadoras de colonias (UFC) de Enterobacteriaceae por
centímetro cúbico o gramo de muestra. Utilizar la siguiente fórmula:

(1)

(2)
En donde:

= suma de las colonias enterobacterias contadas o calculadas en todas las placas elegidas;

n1 = número de placas contadas de la primera dilución seleccionada;

n2 = número de placas contadas de la segunda dilución seleccionada;

d ²;

V = volumen del inóculo sembrado en cada placa.

Ejemplo:

Volumen sembrado = 1 cm³

Dilución = 160 y 140 colonias
Dilución = 33 y 28 colonias
Número =

4
= 16 409 expresar como 1,6 x 10
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4.4.3 Redondeo de números. El valor obtenido redondeara dos cifras significativas, de la siguiente
manera (NTE INEN 52)

4.4.3.1 Si el tercer dígito, empezando por la izquierda es menos de cinco, mantener inalterado el
segundo dígito y remplazar por ceros restantes. 4 Por ejemplo, si el valor calculado fuere 16 409, y
redondearlo a 16 000 y expresar como 1,6 x 10. Si el tercer dígito, empezando por la izquierda es
superior a cinc, añadir una unidad al segundo dígito. 4 Por ejemplo, si el valor obtenido fuere 16 900,
redondearlo a 17 000 y expresar como 1,7 x 10.

4.4.3.2 Si el tercer dígito, empezando por la izquierda es igual a cinco y es seguido de por lo menos,
un dígito, añadir una unidad al segundo dígito y remplazar por ceros los restantes. Por ejemplo, si el
4
valor obtenido fue 16,540, redondearlo a 17.000 y expresar como 1,7 x 10 . Si el tercer dígito es
igual a cinco y no le sigue otro (s) dígito (s), ó lo es solo por ceros, añadir una unidad al segundo
dígito, si éste es impar; si es par ó cero, conservarlo inalterado. Ejemplo, 175 redondear a 180 y
4
expresar como 1,8 x 10²; 16 500 redondear a 16000 y expresar como 1,6 x 10 .

4.4.4 Informe de resultados

4.4.4.1 Presentar el resultado como número N de unidades formadoras de colonias UFC de

Enterobacteriaceae por cm³ o g de muestra utilizando solo dos cifras significativas multiplicadas por
donde x es la respectiva potencia de 10.

4.4.4.2 Si no hay desarrollo de colonias de enterobacterias en las placas de la dilución más

concentrada, presentar el resultado como número estimado de UFC de Enterobacteriaceae
menor que (<) 1,0 multiplicado por el respectivo factor de dilución “ ”. (Valor inverso de dilución de la
muestra). Ejemplo, si la dilución más concentrada corresponde a , el resultado se representará
así:

(3)

4.4.4.3 Si no hay desarrollo de colonias de enterobacterias en las placas sembradas con 1 cm³ de
muestra no diluida (producto original líquido), expresar el resultado de la siguiente manera:

(4)

4.4.4.4 Si las placas sembradas con la dilución menos concentrada (productos sólidos o líquidos)
presentan más de150 colonias, expresar el resultado de la siguiente manera:

(5)

4.4.4.5 Indicar entre paréntesis la dilución utilizada. Este resultado sirve como guía para decidir el
número de diluciones que se han de realizar en ensayos posteriores y, la decisión de aceptación o
rechazo de una partida de alimentos debe basarse solo en valores N.

(Continua)

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4.5 Errores de método

4.5.1 Repetibilidad del recuento de colonias y error personal

4.5.1.1 Los resultados obtenidos por la misma persona al contar por segunda vez las colonias de una
misma placa, no deben variar en más del 5% y del 10%cuando es realizado por otra persona.

4.5.1.2 El método de cálculo relacionado el número total de colonias contadas en las placas de dos
diluciones consecutivas con el total de la muestra sembrada, aumenta la precisión del resultado. Sin
embargo solo por razones estadísticas, en el 95% de los casos los límites de confianza para la
técnica del recuento en placa varia de ± 16% a ± 52%, este intervalo se amplía par los recuentos de
colonias menores de 15 por placa. En la práctica, se puede contar una mayor variación,
especialmente entre resultados obtenidos por diferentes analistas.

5. INFORME DE RESULTADOS

5.1 En el informe del ensayo indicar la norma de referencia, la temperatura de incubación, los
resultados obtenidos, todas las condiciones operativas no especificadas en esta norma en el
resultado. Además, se debe incluir toda la información necesaria para la completa identificación de la
muestra.

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NTE INEN 1529-13 2013-09

APÉNDICE Z

Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 52 Reglas para redondear números

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-1 Control microbiológico de los alimentos.
Preparación de medios de cultivo

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-2 Control microbiológico de los alimentos. Toma y
preparación de muestras
.

Z.2 BASES DE ESTUDIO

Norma internacional. ISO 21528-2 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal
methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae -- Part 2: Colony-count method.
Ginebra, 2004.

Norma internacional. ISO 21528-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal
methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae -- Part 1: Detection and
enumeration by MPN technique with pre-enrichment. Ginebra, 2004.

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 INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA

Documento: TÍTULO: CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS Código:

NTE INEN ALIMENTOS. ENTEROBACTERIACEAE. RECUENTO EN AL 01.05-310
1529-13 PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
Primera revisión
ORIGINAL: REVISIÓN:
Fecha de iniciación del estudio: Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo 1995-.01-10
Oficialización con el Carácter de Voluntaria
por Acuerdo No. 0426 de 1997-12-29
publicado en el Registro Oficial No. 229 de 1998-01-06

Fecha de iniciación del estudio: 2012-07-30

Fechas de consulta pública: 2012-12-03 a 2013-01-02

Subcomité Técnico de:

Fecha de iniciación: Fecha de aprobación:
Integrantes del Subcomité:

NOMBRES: INSTITUCIÓN REPRESENTADA:

Mediante compromiso presidencial N° 16364, el

Instituto Ecuatoriano de Normalización – INEN, en vista
de la necesidad urgente, resuelve actualizar el acervo
normativo en base al estado del arte y con el objetivo de
atender a los sectores priorizados así como a todos los
sectores productivos del país.

Para la revisión de esta Norma Técnica se ha

considerado el nivel jerárquico de la normalización,
habiendo el INEN realizado un análisis que ha
determinado su conveniente aplicación en el país.

La Norma en referencia ha sido sometida a consulta

pública por un período de 30 días y por ser considerada
EMERGENTE no ha ingresado a Subcomité Técnico.

Otros trámites: Esta NTE INEN 1529-13:2013 (Primera revisión), reemplaza a la NTE INEN 1529-13:1998

La Subsecretaría de la Calidad del Ministerio de Industrias y Productividad aprobó este proyecto de norma

Oficializada como: Voluntaria Por Resolución No. 83 de 2013-08-13

Registro Oficial No. 83 de 2013-09-18
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN - Baquerizo Moreno E8-29 y Av. 6 de Diciembre
Casilla 17-01-3999 - Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 - Fax: (593 2) 2 567815
Dirección General: E-Mail:direccion@inen.gob.ec
Área Técnica de Normalización: E-Mail:normalizacion@inen.gob.ec
Área Técnica de Certificación: E-Mail:certificacion@inen.gob.ec
Área Técnica de Verificación: E-Mail:verificacion@inen.gob.ec
Área Técnica de Servicios Tecnológicos: E-Mail:inenlaboratorios@inen.gob.ec
Regional Guayas: E-Mail:inenguayas@inen.gob.ec
Regional Azuay: E-Mail:inencuenca@inen.gob.ec
Regional Chimborazo: E-Mail:inenriobamba@inen.gob.ec
URL:www.inen.gob.ec