PLCL-020 - Análisis Colorantes Art HPLC

Código: PLCL- 020
ANÁLISIS DE COLORANTES Versión: 03

ARTIFICIALES POR Fecha de creación: 2010/01/27
Fecha de modificación: 2016/10/07
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA HPLC Página 1 de 6
1. OBJETIVO
Establecer el procedimiento para llevar a cabo el análisis de colorantes artificiales azul No

1, Amarillo No 5, Rojo No 40, Amarillo No6 y verde menta, en alimentos y materias
primas.
2. ALCANCE
El presente método es aplicable al análisis de colorantes artificiales en multialimentos,

alimentos concentrados para animales, alimentos para humanos, premezclas
multivitaminicas y materias primas.
3. DEFINICIONES
Colorantes artificiales: Son sustancias orgánicas caracterizadas por la presencia de un

grupo peculiar que contiene nitrógeno unido a anillos aromáticos. Todos se obtienen por
síntesis química, no existiendo ninguno de ellos en la naturaleza.
4. MATERIALES Y EQUIPOS
 Cromatografo LC 2010ª HT Liquid Chromatograph SHIMADZU

 Columna cromatográfica Capital HPLC LTD ODS2 Spherisil 25 cm x 4.6 mm 10
micron column o análoga a esta columna
 Filtro SecurityGuard Guard Cartridges (KJO-4282)
 Detector ultravioleta LC-2010 Serial AK 4173 longitud de onda variable
 Programa cromatográfico LC Solution
 Balanza analítica con precisión de ±0.0001g
 Baño ultrasonido
 Balones volumétricos de 5-10 – 25 mL
 Centrifuga PLC SERIES
 Micropipeta graduable de 20-200 µL y 100-1000 µL
Elaboró / Modificó Reviso Aprobó
Analista Químico Director Técnico Gerente Técnico

Fecha: 2016/10/07 Fecha: 2016/10/07 Fecha: 2016/10/07
Código: PLCL- 020
ANÁLISIS DE COLORANTES Versión: 03
ARTIFICIALES POR Fecha de creación: 2010/01/27
Fecha de modificación: 2016/10/07
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA HPLC Página 2 de 6
 Puntas azules para micropipeta

 Jeringas
 Filtros con membrana de o nylon 0.45 µm de poro x 13 mm de diámetro.
5. REACTIVOS Y SOLUCIONES
 Acetonitrilo grado HPLC.

 Fase móvil acuosa Acetato de amonio 0.05M.
 Solución extractora Acetato de amonio 5M.
 Agua Desionizada.
 Estándar o materia prima del o los colorantes a trabajar.
6. SEGURIDAD
6.1 Riesgos
 Irritación por inhalación de vapores.

 Quemaduras en la piel.
6.2 Elementos de protección personal
 Bata
 Lentes de seguridad
 Guantes durante su manejo
6.3 Deberes
 Usar los elementos de protección personal

 Utilizar campana de extracción en su manejo
 No permitir el paso al sistema de desagües
7. PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES, MUESTRA Y BLANCO
7.1. Preparación del estándar o materia prima

 Pesar por duplicado aprox. 0.0200g del estándar en balones de 50.0mL
 Adicionar 1.0mL de acetato de amonio 5M y llevar al ultrasonido por 15 min.
 Aforar con agua Desionizada.
7.2. Preparación de la muestra

 Pesar una cantidad adecuada de muestra en un balón de 25.0mL, Aprox. 1.0g.
 Adicionar 1.0mL de acetato de amonio 5M y llevar al ultrasonido por 15 min.
7.3. Preparación del blanco

 Adicionar a un balón de 25.0mL, 0.5mL de Acetato de amonio 5M.
 Adicionar Aprox. Hasta la mitad del balón, agua Desionizada y colocar al
ultrasonido por 15 min.
La copia impresa de este documento solo se considera copia controlada si cuenta con el sello de
‘’Copia Controlada’’
8. PROCEDIMIENTO
8.1. Procedimiento cromatográfico
 Conectar la columna cromatográfica

 Acondicionar el Cromatógrafo, siguiendo exactamente lo que dice el manual de
operación del equipo
 Asegurar que los reservorios contengan los solventes adecuados
8.2. Estabilización del sistema
 Prepare los reservorios de rinse y lavados de pistones con una solución adecuada
según el tipo de analito a trabajar, en este caso agua Desionizada.
 Purgue las respectivas líneas de trabajo por un espacio de tiempo de 3 min.
 Inicie la programación por fuera de gradiente y deje estabilizar las condiciones de
trabajo por 30 min.
 Inyecte el blanco ya mencionado.
8.3. Programación de las condiciones del equipo fuera del programa de

gradiente
Programar el método con los solventes, flujo, presión y longitud de onda de trabajo,
así:
 Flujo: 1.0 mL / min
 Longitud de onda (modo dual): 428 nm y 484 nm para el amarillo No 5 y 6
respectivamente, 450nm – 600nm para el rojo, 410 nm para el azul y verde menta
 Fase A: Acetonitrilo
 Fase B: solución Acetato de amonio 0.05M
8.4. Programación gradiente del sistema
 Horno (Temperatura de trabajo 23ºC – temperatura máxima 65 ºC)

 Presión (máxima 4500 psi – mínima 100 psi)
 Detector lámpara D2
 Polaridad +
 Longitud de onda modo dual
 Unidad de trabajo Voltios
 Modo de válvula de reciclaje Recircular / drenar
 Thereshold level: 0.0020 AU
8.5. Tabla de programación de gradiente
Tiempo Acción Valor

0.01 Flujo 1.0mL
0.01 Fase B 95%
0.01 Fase C 0
0.01 Fase D 0
3.00 Fase B 90%
3.00 Fase C 0
3.00 Fase D 0
18.00 Fase B 80%
18.00 Fase C 0
18.00 Fase D 0
25.00 Fase B 60%
25.00 Fase C 0
25.00 Fase D 0
27.00 Fase B 10%
27.00 Fase C 0
27.00 Fase D 0
30.00 Fase B 0
30.00 Fase C 0
30.00 Fase D 0
32.00 Fase B 0
32.00 Fase C 0
32.00 Fase D 0
32.10 Fase B 95%
32.10 Fase C 0
32.10 Fase D 0
35.00 Controller Stop
8.6. Inyección de la muestra y estándares
 Filtrar una porción de muestra, si es necesario usando papel No 2.

 Trasladar una porción a una jeringa con filtro de porosidad 0.45μm.
 Llevar al vial. Previamente purgado con la misma, cerrarlo y pasarlo a la bandeja
porta-viales del equipo.
 Programe cada vez que vaya a ingresar las muestras o estándares en la carpeta
del método, según esta establecido en el sistema.
 Ubique el numero de vial en que se halla la muestra o estándar inyectar solo 20 µL
 para el estándar proceder de la misma manera, exceptuando el paso de la
filtración en papel No 2.
9. CÁLCULOS
 Calculo del factor de respuesta
Concentración del estándar

FR =
Área del estándar
 Calculo del factor de dilución

Volumen o peso de enrase
FD =
Peso de la muestra
 Concentración del analito en la muestra
Concentración del analito = FR x FD x Área del analito en la muestra
El factor de dilución de la muestra debe aplicarse cuantas veces haya diluido la

muestra
10. NOTAS
10.1. La estabilización de la fase móvil, se monitorea con el programa cromatográfico

SHIMADZU, usando las respectivas ventanas
10.2. El sistema nunca se debe dejar con agua, (ninguna línea), es necesario purgarla
con metanol o una mezcla de metanol: agua antes de apagarlo
10.3. Cuando se requieren dos líneas acuosas, se deben utilizar las líneas B y D,
previamente purgadas con agua grado HPLC.
11. REFERENCIAS
 AOAC Oficial Method y Norma USP.
 Informe técnico No 40, colorquimica S.A.S
12. HISTORIAL DE CAMBIOS
Fecha Versión Descripción del cambio
2010/01/27 00 *Creación del documento
*Modificación de condiciones cromatográficas cambio de

longitud de onda y Preparación de muestra
2011/04/25 01 *Se define el alcance
*Se coloca en el ítem de definiciones el concepto de
colorantes artificiales
*Se corrigen los deberes y los riesgos
*Se modifica el procedimiento colocando primero la
2015/10/14 02 adecuación del sistema y luego la preparación de las
muestras.
*Al numeral 1 se le adiciono el colorante verde menta y la
aplicabilidad a materias primas.
*Al numeral 2 se le adiciono la aplicabilidad a materias
2016/10/07 03
primas.
*Se elimino el numeral 3.
* Al numeral 5 se cambiaron las soluciones: Metanol grado
HPLC, ácido acético, hidróxido de amonio, solución 10mM
de fosfato di-hidrogeno de amonio, NH4H2PO4, pH: 6.0 por
Acetonitrilo grado HPLC, Acetato de amonio 0.05M, Acetato
de amonio 5M, agua Desionizada y estándar.
*Al numeral 7, se cambio el procedimiento de preparación
de muestras y estándar, ya no se usa como diluente la
solución 10mM NH4H2PO4, pH: 6.0 sino la solución Acetato
de amonio 5M y se afora con agua Desionizada, además se
adiciono la preparación del blanco.
* Al numeral 8.3 se adiciono las longitudes de onda 428 nm
y 484 nm para el amarillo No 5 y 6 respectivamente,
además 410 nm para el azul y verde menta. También el
flujo de 0.6mL/min a 1.0mL/min y las fases A y B por las ya
mencionadas
*Al numeral 8.4 se cambio la temperatura del horno de 40 a
23 ºC
*Al numeral 8.5 se cambio la tabla del gradiente
Tiempo acción Cantidad
0.01 flujo 1.5mL/min
5.0 min Fase B 100%
5.0 min Fase D 0%
5.01 min Fase B 90%
5.01 min Fase D 10%
15.0 min Fase B 50%
15.0 min Fase D 50%
25.0 min Fase B 100%
25.0 min Fase D 0%
25.01 min Fase B 100%
25.01 min Fase D 0%
30.0 min Flujo 1.5mL/min
30.0 min controller stop
Por la actual.
*Al numeral 8.6 se cambio el volumen de inyección de 100
μm a 20 μm.
* Al numeral 11 se adiciono otra fuente bibliográfica:
Informe técnico No 40, colorquimica S.A.S.

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Establecer el procedimiento para llevar a cabo el análisis de colorantes artificiales azul No

El presente método es aplicable al análisis de colorantes artificiales en multialimentos,

Colorantes artificiales: Son sustancias orgánicas caracterizadas por la presencia de un

 Cromatografo LC 2010ª HT Liquid Chromatograph SHIMADZU

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 Puntas azules para micropipeta

 Acetonitrilo grado HPLC.

 Irritación por inhalación de vapores.

6.2 Elementos de protección personal

 Usar los elementos de protección personal

7. PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES, MUESTRA Y BLANCO

7.1. Preparación del estándar o materia prima

7.2. Preparación de la muestra

7.3. Preparación del blanco

8.1. Procedimiento cromatográfico

 Conectar la columna cromatográfica

8.2. Estabilización del sistema

8.3. Programación de las condiciones del equipo fuera del programa de

8.4. Programación gradiente del sistema

 Horno (Temperatura de trabajo 23ºC – temperatura máxima 65 ºC)

Tiempo Acción Valor

8.6. Inyección de la muestra y estándares

 Filtrar una porción de muestra, si es necesario usando papel No 2.

 Calculo del factor de respuesta

Concentración del estándar

 Calculo del factor de dilución

 Concentración del analito en la muestra

Concentración del analito = FR x FD x Área del analito en la muestra

El factor de dilución de la muestra debe aplicarse cuantas veces haya diluido la

10.1. La estabilización de la fase móvil, se monitorea con el programa cromatográfico

12. HISTORIAL DE CAMBIOS

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2010/01/27 00 *Creación del documento

*Modificación de condiciones cromatográficas cambio de

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