MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

ACTIVIDAD: INFORME DE LABORATORIO PRACTICA 1 Y 2

Presentado Por:

JAVIER YESID MARTINEZ PAEZ

Cód. 91.488.388
MARISOL PRADA
Cód.

Ingeniería Ambiental
Grupo 358010_14

Presentado A:

Dra. DIANA GARCÍA

Directora del curso

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

Escuela de Ciencias Básicas, Tecnológicas y de Ingeniería
Ingeniería Ambiental
CEAD – Bucaramanga
2013

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 INTRODUCCION

La microbiología es la rama de la biología que estudia los microorganismos como lo

son: Bacterias, hongos, parásitos, virus y micro algas que no son visibles puesto que
necesitamos la ayuda de un microscopio para poder observarlos, Como todo ser vivo
necesita de nutrientes para su crecimiento y metabolismo estos son los agares y
caldos ideales para su cultivo.

A continuación determinaremos en dos practicas las características de

microorganismos como las bacterias, aislados del ambiente, superficies. Además
conoceremos su fisiología y bioquímica por medio de pruebas de laboratorio para su
identificación.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión
de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio
de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe
estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en

composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano por eso, la base de muchos
medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y el agar es un elemento
solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivos.

En general, las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta

su estudio cuando los exámenes se realizan en fresco. Por esta razón, cuando se
quieren conocer los detalles morfológicos es necesario recurrir a tinciones.

Estos microorganismos difieren en características tales como forma de nutrición,

estructura, tamaño, composición entre otros aspectos; es por ello que se emplea el
estudio microscópico el facilita notablemente la observación; principalmente en las
bacterias se facilitan al tratarlas con colorantes o tinciones los cuales facilitan también
la observación de ciertas estructuras celulares y saberlas diferenciar de los grupos a
los cuales pertenece.

OBJETIVOS:

Conocer y aplicar adecuadamente los diferentes tipos de coloración mas usadas en el

área de microbiología.

Conocer el manejo y aplicación de los diferentes métodos de esterilización.

Identificar el uso de los medios de cultivo por el tipo de muestra o microorganismo.

Conocer, describir y aplicar las diferentes técnicas de inoculación de los medios de

cultivo.

Conocer y emplear la terminología propia del uso de los medios de cultivo.

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 1. MARCO TEÓRICO

La tinciones son de suma importancia para el estudio de las bacterias la cuales

pueden ser simples que solo utilizan un colorante para colorear la bacterias estas
pueden ser positivas o negativas, las positivas va tener atracción con la bacteria y por
eso la tiñe un ejemplo es el azul de metileno las negativa va repelar y por eso solo tiñe
el fondo un ejemple es la tinta china.

1.1 MEDIO DE CULTIVO 

Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y

aislar los microorganismos, así como efectuar pruebas de susceptibilidad.

Los medios de cultivo se clasifican de la siguiente manera:

1.1.1 Según su estado físico:

• Sólido: Se utiliza un agente solidificante (el agar) en una proporción por encima del
15% (12-15 g/L). En ellos las bacterias crecen con mayor dificultad, pues los nutrientes
se agotan con rapidez en el punto donde se desarrollan no obstante nos permite el
aislamiento, purificación y visualización de su crecimiento en colonias, así como su
posible identificación a través de medios específicos y diferenciales de caracteres
sólidos, elaboración de antibiogramas, etc.

• Semisólido: Presentan agar en su composición e una proporción menor al 5%

(2,5g/L). Se utiliza especialmente para el estudio de algunas propiedades bioquímicas
(oxidación-fermentación).

• Líquido: No contienen ningún tipo de agente solidificante y son también

denominados caldos. Favorecen mucho el desarrollo y multiplicación de las bacterias
porque al difundirse éstas por todo el medio encuentran con facilidad las sustancias
que necesitan para nutrirse. Se de gran utilizad para la realización de múltiples
pruebas.

1.1.2 Medios sintéticos: Aparecen sustancias químicas definidas. Son los más
utilizados y siempre deberán contener:

▪ Fuente de carbono o azúcar.

▪ Una fuente de nitrógeno.

▪ Compuestos minerales, y entre ellos, oligoelementos.

▪ Factores de crecimiento.

1.1.3 Medios complejos: Su composición no está exactamente definida. Su uso está

restringido (sólo en virología y parasitología).

Sembrar: Es el acto de colocar el material bacteriológico en el medio de cultivo para

promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente multiplicación.

Azul de metileno se usa para observar agrupamientos y morfología de bacterias y

levaduras las cuales difieren desde el punto de vista químico de su medio exterior y
por eso se tiñen contrastando con su alrededor.

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Cristal violeta es el nombre dado a un grupo de compuestos químicos empleados
como indicadores de pH y colorantes e importante en la coloración de Gram.

Fucsina básica Colorante utilizada en microscopía derivado de la anilina en particular

el clorhidrato de rosanilida. Este colorante colorea en su totalidad a la bacteria debido
a su gran poder catiónico uniéndose a la estructura bacteriana.

2. PROCEDIMIENTO 1 Y 2

2.1 PRACTICA 1. METODOS DE SIEMBRA

1. Desinfectar el área de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo.

2. Coger parte de la muestra y colocarla en el tubo de ensayo que contiene el agua

peptonada. Homogenizar.

3. Dejar 20 – 30 minutos en incubación los tubos.

4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un círculo de papel (8 cm) para

ponerlo debajo de la caja de Petri.

5. Finalizado el tiempo de incubación tomar el asa redonda y esterilizarla por calor

hasta que está esté roja, dejar enfriar cerca al mechero.

6. Abrir el tubo con la muestra y tomar una azada.

7. Cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Teniendo cuidado de que el asa no toque

nada y de no pasarla por encima del mechero, pero siempre estar cerca de este.

8. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento.

9. Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y

envolverla en papel vinipel.

10. Colocar el tubo y la caja a incubar a 37°C. La caja debe estar boca abajo siempre.

11. Desinfectar el área de trabajo, apagar el mechero y entregar el material

2.2 TÉCNICAS DE TINCIÓN

2.2.1 Coloración Simple

a. En una lámina portaobjetos limpia, colocar una gota del agua destilada estéril
(trabajo con muestra sólida) o una gota del cultivo bacteriano (trabajo con muestra
liquida) sobre la misma y con ayuda del asa redonda estéril extender la gota de
suspensión a un área no superior a dos centímetros cuadrados.

b. Dejar que la preparación se seque al aire. Fijar con calor, pasando tres veces
seguidas a través de la llama del mechero.

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c. Dejar enfriar la lámina. Lo anterior se conoce como la realización de un frotis y se
hace para coloraciones donde la muestra debe ser fijada y luego si iniciar las
coloraciones respectivas.

d. Colocar la preparación sobre una rejilla encima del vertedero.

e. Cubrir la suspensión con algún colorante dado por el profesor, así:

i. Cristal violeta: 1 minuto

ii. Azul de metileno: 5 minutos
iii. Fucsina: 1 minuto

f. Terminado el tiempo de coloración según el colorante empleado, eliminar el

colorante lavando con agua suavemente.

g. Dejar secar y colocar la preparación en la platina del microscopio y observar con el

objetivo de menor aumento inicialmente hasta llegar al objetivo de 100X.

2.2.2 Coloración Compuesta

a. Realizar un frotis de la muestra seleccionada.

b. Colocar en la rejilla para coloración y cubrir el frotis con cristal violeta esperando
que transcurra 1 minuto. Lavar con agua el colorante.

c. El segundo colorante es el lugol, el cual se deja por 1 minuto sobre el frotis.

d. Realizar la decoloración con la mezcla alcohol-acetona, por 25 segundos. Lavar

inmediatamente con agua.

e. Finalmente adicionar el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30

segundos. Lavar con agua.

f. Escurrir el exceso de agua, dejar secar y montar al microscopio para hacer las
observaciones respectivas.

2.2.3. Coloraciones Especiales.

a. Coloración de Glicocálix con Rojo Congo Emulsionar la muestra con una (1) gota de
rojo congo y dejar secar la lámina a temperatura ambiente. Al estar seca la lámina
sumergirla en HCl 1N con ayuda de una pinza y teniendo cuidado de no tocar o
salpicar el ácido sobre la piel. Luego lavar con agua teniendo cuidado de no hacerlo
sobre la tinción. Poner azul de metileno sobre la tinción inicial por tres (3) minutos y
terminado este tiempo lavar la lámina con agua. Montar al microscopio la lámina
cuando este seca y hacer las observaciones respectivas.

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3. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

 Fijar un frotis

Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un

poco.

Tomar el asa previamente flameada y con ésta tomar un poco de muestra.

Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que ésta
tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual sirvió para depositar la muestra
contenida en el asa.

Con el asa conteniendo la muestra sobre la lámina portaobjetos, se procede a realizar

la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios sobre la
lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como producto una espiral
en la parte media de la lámina.

Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la
muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo sólo se pasa por la llama,
puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a
observar.

El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente

para ser colocado sobre el dorso de la mano.

 Tinción
Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china
utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para
lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1
minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C.

 Enjuague
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua
corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO
debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la
lámina que no contiene muestra.

Figura 1. Pasos para montar una muestra

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 Figura 2. Cultivo Solido

Figura 3. Toma de muestras caja Petri

CONCLUSIONES

Se observo las diferentes técnicas de tinción en muestras de lixiviados de basura que

sirvieron como agar para su respectivo estudio.
Cuando se cambiaron los colorantes las bacterias mostraban otros aspectos y se
podían identificar mejor su forma.
El crecimiento bacteriano se realizo en las cajas petri cumpliendo con el protocolo.

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 BIBLIOGRAFIA

 Pedroza Padilla Carmen Julia. 2012. Modulo del curso – Microbiología

ambiental. Escuela de ciencias agrícolas, pecuaria y del medio ambiente
(ECAPMA). Valledupar. Universidad Nacional Abierta y a Distancia – UNAD.
Colombia.

 http://www.bdigital.unal.edu.co/3211/

 Pedroza Padilla Carmen Julia. 2011. Protocolo del curso – Microbiología

Ambiental. Escuela de ciencias agrícola, pecuaria y del medio ambiente
(ECAPMA). Valledupar. Universidad Nacional Abierta y a Distancia – UNAD.
Colombia.
 Fernández Rubio, R. (1996). Suelos contaminados. Madrid: Instituto
tecnológico Geominero de España.

WEBGRAFIA

Fuente: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinción

Fuente:https://docs.google.com/document/d/1N2uqW1azHNgvL7xs0NEEZ2Isjnbb9PX
J0rcinEzN0Ac/edit?hl=en_US

ANALISIS DE RESULTADO

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Los resultados obtenidos de los métodos de siembra realizados en el laboratorio el día
25 de abril son los siguientes: