DESARROLLO DE UN PROCESO PARA LA EXTRACCIÓN DE PAPAÍNA

EN COLOMBIA

ADRIANA MARIA PUIG

RODRIGUEZ

UNIVERSIDAD DE LOS
ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA
QUÍMICA BOGOTÁ
2008
 IQ-2007-II-39

DESARROLLO DE UN PROCESO PARA LA EXTRACCIÓN DE PAPAÍNA

EN COLOMBIA

ADRIANA MARIA PUIG

RODRIGUEZ
Proyecto de Grado para optar por el título de Ingeniero
Químico

Asesor
IVAN DARÍO GIL

Co-Asesor
OSCAR FERNANDO
SÁNCHEZ
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DEDICATORIA

“Todo esfuerzo tiene su recompensa, pero quedarse sólo en palabras lleva a

la pobreza” Proverbios 14:23 NVI

Este trabajo se lo dedico a Dios por ser mi amigo, mi fortaleza, mi motivación,

mi esperanza y mi mejor apoyo.
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AGRADECIMIENTOS

A Dios por haberme permitido contar con su ayuda y la de todas

aquellas personas que me aman.

A mi mamá, mis hermanos, mi familia y mi novio por su apoyo

incondicional.

A todo el equipo de la papaína empezando por Edgar Hernández, Luz

Dary Rugeles, José María Robles, Sonia Rojas y Josué Ramírez por el trabajo
en el laboratorio.

A Jaime Oyuela por la adquisición de los

reactivos. A mis asesores por ser mis amigos y

confiar en mi.

A Alejandro Rojas y Paula Alonso por guiarme en el desarrollo

experimental. A la familia Vera Soriano, por permitirme usar su cultivos de

papayas.

A todo aquel que ahora si conoce que es la papaína y de alguna forma me

ayudó a realizar este proyecto.
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CONTENIDO

LISTA DE TABL AS
LISTA DE
FIGURAS
INTRODUCCION
OBJETIVOS

1. GENERALIDADES
1.1 PAPAÍN A
1.1.1 Propiedades Físicas
1.1.2 Propiedades Químicas
1.1.3 Almacenamiento
1.1.4 Toxicidad
1.2 CULTIVO DE Carica Papaya
1.2.1 Descripción
1.2.2 Cultivo
1.3 APLIC ACIONES INDUSTRIALES DE LA PAPAÍN A
1.3.1 Farmacéutica
1.3.2 Cervecera
1.3.3 Carne
1.3.4 Textil- Cueros
1.3.5 Alimentos
1.3.6 Cosméticos

2. PROCESO DE PRODUCCIÓN
2.1 EXTR ACCIÓN DEL LÁTEX
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2.2 SECADO DEL LÁTEX

2.2.1 Luz Solar
2.2.2 Secador
2.2.3 Horno
2.2.4 Secado al Vacío
2.2.5 Secado por Liofilización
2.3 PURIFICACIÓN DE L A PAPAÍNA
2.3.1 Fraccionamiento
2.3.2 Purificación

3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
3.1 PAPAÍN A CRUDA
3.1.1 Extracción
3.1.2 Secado
3.1.3 Caracterización de la papaína cruda
3.2 PAPAÍN A PURIFICAD A
3.2.1 Metodología Original
3.2.2 Metodología Empleada
3.2.3 Caracterización de la papaína purificada

4. RESULTADOS Y AN ÁLISIS
4.1 EXTR ACCIÓN Y SEC ADO
4.2 CARACTERIZACIÓN DE L A PAPAÍN A CRUDA
4.3 PURIFICACIÓN Y CAR ACTERIZACIÓN DE LA PAPAÍN A PURIFIC AD
A.

CONCLUSIONES
RECOMENDACIONE
S REFERENCIAS
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LISTA DE TABLAS

Tabla 1. pH óptimos para diferentes

sustratos. Tabla 2. Etapas en la purificación
de proteínas.
Tabla 3. Procesos de secado con temperaturas y presiones seleccionadas
para cada uno.
Tabla 4. Curva de calibración de
Tirosina.
Tabla 5. Preparación de geles de corrido para la
electroforesis. Tabla 6. Resultados de Acti vad enzimática
según el origen.
Tabla 7. Resultados de actividad y
absorbancia.
Tabla 8. ANOVA para actividad con origen y proceso de secado como
factores. Tabla 9. Mediciones de Actividad Específica.
Tabla 10. ANOVA para actividad
específica. Tabla 11. Determinación de
peso molecular. Tabla 12. Acti vidad de
papaína purificada.
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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estructura Tridimensional de la

Papaína. Figura 2. Taxonomía de la Carica
Papaya.
Figura 3. Secadores solares.
Figura 4. Esquema para un secador de
Bandejas. Figura 5. Esquema para un filtro.
Figura 6. Extracción de látex de C. papaya provenientes de frutos inmaduros.
Figura 7. Proceso para obtener el triturado de cáscara proveniente de
frutos inmaduros.
Figura 8. Secador de
bandejas. Figura 9. Horno.
Figura 10. Secador al
vacío. Figura 11.
Liofilizador.
Figura 12. Curva de calibración de
tirosina. Figura 13. Preparación de
muestras.
Figura 14. Baño térmico y centrifugación para muestras y blancos
Figura 15. Espectrofotómetro (THERMO).
Figura 16. Disposición de las muestra en el gel a para una electroforesis SDS-

PAGE. Figura 17. Disposición de las muestra en el gel b para una electroforesis
SDS-PAGE comparando dos tipos de buffer.
Figura 18a. Disposición de las muestra en el gel c para una electroforesis SDS-
PAGE

de muestras de látex denaturadas.

Figura 18b. Disposición de las muestra en el gel c para una electroforesis SDS-
PAGE

de muestras sin denaturar.

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Figura 19. Proceso de preparación de muestras para una electroforesis.
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Figura 20. Gel de electroforesis

Figura 21. Transiluminador (BIORAD).
Figura 22. Montaje para una cromatografía de intercambio iónico en una matriz
de
Q-Sefarosa.
Figura 23. Graficas de residuales para la actividad
Específica. Figura 24. Graficas de efectos principales para
la actividad. Figura 25. Efectos principales para la actividad
específica.
Figura 26. Gráficas de residuales para la actividad específica.
Figura 27a. Muestras de látex y cáscara servidas según Figura 16.
Figura 27b. Muestras usando diferentes buffers servidas según la Figura
17. Figura 27c. Muestras de látex servidas según la figura 18a.
Figura 27d. Muestras de látex sin denaturar servidas según la Figura 18
b. Figura. 29 Determinación de pesos moleculares
Figura. 28 Bandas para el marcador de peso molecular (161-0309 BIO-
RAD). Figura 30. Gel de electroforesis de muestras purificadas.
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INTRODUCCION

La Papaya es la fruta del árbol de papayo (Carica papaya L.) originaria

de Centroamérica. Su crecimiento es rápido, la fruta madura de 4 a 6 meses
dependiendo del clima en donde se cultiva (Salunkhe & Kadam, 1995). Las
propiedades organolépticas dependen del tiempo de maduración del fruto.
Una señal clara de maduración está dictaminada por un cambio en el color de
la cáscara. El cultivo de esta fruta tiene dos finalidades principales: la venta
de la fruta para el consumo y la extracción de enzimas.

La papaína es una enzima proteolítica natural que se extrae del látex de las
hojas, el tallo y los frutos inmaduros de la Papaya (Baeza, Correa &
Salas, 1989). Usualmente se agrupa con la quimopapaína, glicil endopeptidasa
y endopeptidasa III, debido a su similaridad de peso molecular, constituyendo
el 40% del látex en concentraciones cercanas a 1 mM (Azarkan, Moussaoui,
Wuytswinkel, Dehon & Looze, 2004). Su especificidad es baja por lo cual es
capaz de hidrolizar diferentes tipos de moléculas tales como: aminoácidos
básicos, Leucina, Glicina, Argininia y Lisina, entre otros. Según Rodríguez y
Umaña (1995), se compone de 212 aminoácidos, tres puentes disulfuro y
un grupo funcional libre. Debido a que es una hidrolasa, que rompe enlaces
peptídicos, su número de clasificación bajo la nomenclatura de la Comisión
Enzimática de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular es
3.4.22.2.

La papaína es una enzima que tiene diversos usos industriales y con el pasar
de los años su campo de aplicación va en aumento. Estos diversos usos
hacen que la comercialización de papaína a nivel mundial maneje
aproximadamente 150 millones de dólares anuales con una producción anual
aproximada de 900 a 1000 toneladas métricas, de las cuales solo 100
corresponden a papaína altamente refinada. Aunque no existe un reporte
oficial del crecimiento del mercado (Fernadez, 2005), se cree que irá en
aumento debido a la inexistencia de una enzima sintética capaz de remedar
sus propiedades. Los principales productores de la enzima son países
africanos, aunque también existen algunos en Asia, otros países como Chile,
tienen una producción capaz de suplir exclusivamente sus necesidades
nacionales. En Colombia, la papaína se emplea en procesos propios de la
industria cosmética, química y de alimentos con un consumo superior a los
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1
46000 Kg anuales , sin embargo, en el país no existe una planta de producción
y en general se desconoce el proceso de obtención, lo cual obliga a los
proveedores a importar la enzima para su comercialización a nivel nacional.
Según el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (2006), para el año
2005 existían 5055 hectáreas de cultivos de papaya en Colombia lo cual
muestra que existe una oportunidad para explotar este sector dando lugar
a un estudio que permita comprender las condiciones necesarias para
producir papaína en el país, identificar las posibles rutas de
transformación y llegar a desarrollar un proceso que sirva de apoyo a la
pequeña y mediana industria, con el fin de generar alternativas de
aprovechamiento de esta fruta con la elaboración de productos de valor
agregado.

Este estudio pretende seleccionar un proceso de producción de papaína a nivel

industrial para aplicarlo en Colombia, estableciendo las condiciones de
operación necesarias para obtener papaína de dos calidades: cruda y
purificada, cuyas características deber ser verificables y reproducibles.

1
Cantidad esti mada por el aut or basado en l a producci ón anual de c erveza en C olombia y un consumo apr
oximado de papaína por cada hec tolitro.
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OBJ
ETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Estudiar y seleccionar un proceso de producción de papaína a nivel industrial

para aplicarlo en Colombia.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Estudiar y diseñar un proceso para obtener papaína cruda

• Estudiar y diseñar un proceso para obtener papaína purificada
• Caracterizar la papaína cruda y purificada a través de técnicas
de enzimología
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1. GENERALIDADES

1.1 PAPAINA

1.1.1 Propiedades Físicas. La papaína puede ser un polvo granulado o

unas hojuelas según haya sido la cantidad de látex secado. Su color
esta entre el blanco, el crema y el amarillo dependiendo del tipo secado
al que es sometido el látex o su grado de oxidación. Su olor es
característico del látex. Es parcialmente soluble en agua, salvo a que se
trate de un extracto altamente purificado, e insoluble en cloroformo,
éteres y alcoholes. Su
3
densidad es de 1.2 gr/cm (Rodríguez & Umaña, 1995).

• Estructura. Se compone de 212 aminoácidos, 3 grupos disulfuro y

un grupo funcional libre.

Figura 1. Estructura Tridimensional de la Papaí na. Recuperado el 30 de diciembre de 2007,

de http:// merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops .cgi?id=c1struct ura
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1.1.2 Propiedades Químicas.

• Enzimas proteolíticas. La papaína es una enzima proteolítica cuyo

numero de identificación dado por la Comisión enzimática es EC
3.4.22.2 en donde dada número representa una característica en
particular de la enzima: 3. corresponde a grupo de enzimas hidrolasas.
4 representa que estas hidrólisis tienen lugar sobre enlaces peptídicos y
22. muestra que es una endopeptidasa de Cisterna.

Una reacción de hidrólisis se presenta cuando se de la disociación

electrolítica de una molécula de agua y en el caso de papaína se
presenta un rompimiento de enlaces peptídicos sin que se destruyan o
se produzca racemización.

• pH y Temperatura. Gracias a que la papaína tiene un rango muy amplio

de pH en donde es activa (3 - 11) se puede emplear en diferentes
sustratos ajustando esta variable, teniendo en cuenta que es
inestable para pH mayores a 12 e inferiores a 2.5. (Pirateque, 2002).
La Tabla 1 muestra algunas condiciones óptimas de pH para la
actividad proteolítica de la papaína en diferentes sustratos, la
temperatura para cada una de estos varia entre los 30 y 60°C (Pirateque,
2002).
•

Tabla 1. pH óptimos para diferentes s ustratos

Sustrato pH
Caseína 4.5-8
Albúmina de Huevo 3.5-8
Fibrina Pept ona Hemoglobi na 2.5-1
5.0
5.0-8

1.1.3 Almacenamiento. Una enzima requiere de cuidados especiales a la hora

de su almacenamiento. Para la papaína es importante tener en cuenta
que para evitar la pérdida de actividad es necesario estabilizarla y una
de las formas más usadas es llevándola estado sólido. Por su parte el
látex se debe congelar a -20°C agregándole cloruro de Sodio para evitar
que se oxide. Una vez seca, la papaína se debe mantener en recipientes
cerrados, legos de la exposición a al luz o al calor a una temperatura no
superior a los
25°C (Rodríguez & Umaña, 1995).
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1.1.4 Toxicidad. Una exposición leve a la papaína no ha reportado alguna

señal alérgica, pero periodos de exposición continua puede
desencadenar asma y conjuntivitis. Dado que es una enzima proteolítica
es recomendable evitar el contacto con la piel y la inhalación y nunca
hacer inyecciones subcutáneas ya que pueden causar edemas e
inflamaciones (Pirateque,
2002).

1.2 CULTIVO DE Carica Papaya

1.2.1 Descripción. La papaya es el fruto del árbol del papayo, originario

de Centroamérica. Se cultiva con el fin de producir papaína o para el
consumo humano dado su alto contenido en vitamina C. El papayo
es un árbol pequeño, semileñoso, sin ramas en la parte inferior,
lactífero. Usualmente es dicotiledoneo, con formas machos, hembras,
hermafroditas (donde ambos sistemas se encuentran presentes) y
andrógenos (que se desarrollan dependiendo de la temporada y la
condición climática). Son preferidas las formas hermafroditas (Salunkhe
& Kadam, 1995),(Cronquist,
1982).

Según Rodríguez y Umaña (1995), las especies existentes en

Colombia son:

• Carica Papaya
• Carica Candamarcensis
• Carica Goudotiana
• Caria Cauliflora
• Carica Pentagona

La taxonomía de la Carica Papaya se muestra en la Figura 2.

1.2.2 Cultivo (Salunkhe & Kadam, 1995). El suelo necesario par cultivar
papaya debe ser aireado, regado, permeable y suelto. De acuerdo a la
fertilidad del suelo se obtienen frutos de mayor o menor tamaño. Puede
crecer en suelos de tan solo 45cm de profundidad con una cantidad
de lluvia anual de
2000mm, pero si se presenta una inundación, el árbol disminuye su
tamaño y comienza a debilitarse.
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Vegetal Reino

Embriophyta Subrei no

Tracheophyt División

a Subdivisió

Sper n Tipo

mat ophyta Clase

Angioesperma Subclas

e Dicotiledonea e Orden

Archichlamyda Suborden

e Parietal es Familia

Carinicinae Género

Caricácea Especie

Carica

Carica papay a
L.

Figura 2. Taxonomía de l a Carica Papaya adaptada de (Pirat eque, 2002).

El clima ideal para este tipo de cultivos es el tropical dado que este influye en el
sexo de la planta y en las características organolépticas de la fruta. La
altura máxima recomendada es de 1300 metros sobre el nivel del mar.
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Un cultivo de papaya se inicia con semillas sembradas en hoyos no muy

profundos, preferiblemente en la tarde, en donde teniendo en cuenta que de
una misma semilla pueden crecer árboles genotípicamente diferentes según la
interacción de la semilla con el medio. Luego éstos arbustos pueden ser o
no transplantados según el rendimiento que se desee, si se cultivan árboles
muy cercanos el rendimiento por árbol disminuye.

1.3 APLICACIONES INDUSTRIALES DE LA

PAPAÍNA

1.3.1 Farmacéutica. Su principal uso es en la fabricación de Heparina, vacunas

y enzimas digestivas (Camargo, 1996). Se ha empleado como
tratamiento de dolores lumbares con un riesgo mínimo de alergia
mediante la inyección de la enzima al líquido céfalo raquídeo de la
espina dorsal (Murray, 1964). También se emplea para el tratamiento de
parásitos intestinales gracias a su acción vermífuga, así como para el
tratamiento de úlceras y la limpieza de heridas que han iniciado
necrosis (Starley, Mohammed, Schneider & Bickler, 1999).

1.3.2 Cervecera. Durante la etapa de maduración de la cerveza, en donde se

realiza un enfriamiento a 0ºC durante 3 ó 4 semanas, es necesario
evitar que las proteínas y taninos que se van agregando a la mezcla se
coagulen y formen coloides, haciendo que la cerveza se enturbie.
Con el fin de evitarlo se emplea la papaína, puesto que es una
enzima, es capaz de digerir o hidrolizar los fragmentos de proteínas
precipitables presentes en la bebida durante el periodo de
almacenamiento. El 80% de las cervezas producidas en Estados
Unidos emplean papaína como agente anticoagulante (Camargo, 1996).

En Colombia, Bavaria emplea la papaína dentro de su proceso de

producción de cerveza, considerándola como una materia prima
crítica. Consume cerca de 1Kg por cada 500 Hectolitros de cerveza
producidos. Los parámetros principales evaluados son:

ƒ Poder proteolítico: 500 Unidades de Tirosina.

ƒ Humedad: 3%
ƒ pH: 4.8-6.2
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2
ƒ Color: Blanco o Crema

Una aplicación similar se emplea en el vino y en la producción de

jugos.

1.3.3 Carne. El grado de maduración de la carne es dado naturalmente por la

acción de enzimas conocidas como catepsinas, quienes le dan a la
carne los niveles necesarios para su comercialización ya que determinan
la cantidad de tejido conjuntivo, el poder de hidratación, el contenido de
grasa y la integridad de las proteínas, pero tarda semanas de
refrigeración. Este proceso se puede acelerar mediante el uso de
enzimas proteolíticas que logren un relajamiento en los enlaces
peptídicos de las fibras musculares y el tejido conectivo (Camargo,
1996). La actividad proteolítica de la papaína degrada las proteínas de
alto peso molecular, provocando el ablandamiento de la carne.

1.3.4 Textil-Cueros. La papaína se emplea en primera instancia para retirar

tejido graso del cuero y luego se emplea un tratamiento controlado con
el fin de disimular las protuberancias, desengrasar y estirar el cuero
(Gregory,
1939). En la industria textil se usa como detergente, específicamente
se emplea para desengomar la seda, reducir el encogido del algodón al
lavar, para mejorar la calidad de las tinturas, así como para dar el
efecto de desgastado a las telas. También aporta mayor suavidad al
producto terminado.

1.3.5 Alimentos. Dada su semejanza con la pepsina humana, la papaína se

emplea en la producción de alimentos especiales para bebés, pues
facilita la asimilación y degradación de los compuestos de alto peso
molecular a cadenas más cortas permitiendo la absorción de los
nutrientes en el intestino del bebé (Camargo, 1996).

En la fabricación de quesos, esta enzima se involucra en el añejamiento

de quesos madurados acelerando el proceso (Pirateque, 2002).

En la industria panadera, se utiliza para evitar la formación de grietas en

las galletas dado que causa la descomposición del gluten. (Pirateque,
2002).

2
Especificaciones Técnicas de materia prima Bavaria
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1.3.6 Cosméticos. En los cosméticos, la papaína se utiliza para limpiar

eficazmente prótesis dentales y lentes de contactos. Cuando se
encuentra presente en cremas faciales, su acción es la de remover
células muertas que causan pigmentaciones indeseadas (Pirateque,
2002).
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2. PROCESO DE PRODUCCIÓN

2.1 EXTR ACCIÓN DEL

LÁTEX

Se deben seleccionar frutos verdes de 3 a 4 meses de edad. A cada uno se le

realiza no más de cuatro incisiones verticales, en la parte inferior, de 3 mm de
profundidad aproximadamente empleando una navaja (Salunkhe & Kadam,
1995). La operación se repite en intervalos de dos semanas hasta que el flujo
de látex disminuya y la fruta deba ser removida del árbol. Con la maduración, la
producción del látex y la concentración de enzimas del mismo disminuye
significativamente. La recolección se recomienda durante horas de la
mañana en temporada de lluvias ya que el flujo de látex disminuye en
temporadas con humedades bajas (Rodríguez & Umaña, 1995).

El látex se recolecta y según Rodríguez y Umaña (1995), se lleva a un tanque

con agitación que permita tener un líquido homogéneo para proceder a una
filtración que ayude a eliminar el material ceroso y las impurezas. Todos los
procesos de extracción y/o purificación de la papaína parten de la extracción
del látex, pero según las características que se quiere que tenga el producto, el
proceso difiere. Para la obtención de papaína cruda solo es necesario secar el
látex.

2.2 SECADO DEL

LÁTEX

El líquido obtenido luego del filtrado es secado para darle una mayor estabilidad
a la enzima que se encuentra presente en el látex. Un proceso de secado
que puede ser continuo o semi batch y consiste en retirar la humedad presente
en una muestra dando lugar una transferencia de masa entre la muestra y el
gas circundante. La elección del proceso de secado apropiado para una
muestra depende de la misma y de la fuente que retirara la humedad
presente (Treybal,
1981).
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Algunos de los procesos de secado mas utilizados para el látex son:

2.2.1 Luz solar. El principio que utiliza este método es la radiación de calor
del los rayos solares (Rodríguez & Umaña, 1995). Comúnmente la
muestra se vierte en bandejas pandas que permitan tener una buena
área de contacto con los rayos permitiendo que se seque
uniformemente. Estas bandejas pueden tener algún tipo de protector
contra el polvo y los insectos cuyo diseño varia según la aplicación, la
Figura 3 muestra algunos esquemas de secadores solares.

Figura 3. Secadores s olares. (Oti-Baateng / Axtell)

Cuando el látex es secado al sol, se obtiene un polvo de color marrón,

pues el proceso no evita que se oxide y esto genera una pérdida
considerable de la actividad enzimática (Rodríguez & Umaña, 1995), por
lo cual no es un proceso que se utilice mucho en la industria.
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2.2.2 Secador. Es una operación de secado directa cuyo equipo consta de una
cámara provista de bandejas removibles en donde se deposita la
muestra. Estas bandejas reciben un flujo de aire proveniente de un
ventilador o compresor a una temperatura mayor a la ambiente para
retirar la humedad presente por convección. Cuando la muestra esta
seca, se retira y se carga con nueva muestra, por lo cual es un proceso
batch. Es importante anotar que como el flujo de aire es turbulento, el
contenido de la humedad de una muestra en diferentes lugares del
secador puede variar. (Treybal, 1981). La Figura 4 muestra un esquema
básico de secador de bandejas

Figura 4. Esquema para un s ecador de Bandejas

(Treybal, 1981).

2.2.3 Horno. Este método consiste en una cámara cerrada con bandejas, la
diferencia con el secador por bandejas radica en que en esta cámara no
existe un flujo de aire, sino se imparte calor al aire presente dentro de
la cámara, el cual puede tener o no una salida al exterior graduable
(Treybal,
1981). La temperatura del aire debe ser controlada y verificada para que
ésta no genere una pérdida de la actividad enzimática (Nitsawang, Hatti-
Kaul & Kanasawuda (2006).

Rodríguez y Umaña (1995) afirman que el uso de un horno no es

un método de secado ideóneo para el látex debido a que se obtiene un
polvo de color marrón lo cual indica que se ha producido una oxidación.

2.2.4 Secado al vacío. Consiste en una cámara hermética con bandejas donde
una bomba se encarga de generar vacío dentro de la misma. No existe
un flujo de aire, sino se produce un cambio en le punto de ebullición del
agua y gracias a que las bandejas pueden tener una temperatura
ajustable, el agua se evapora.
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Cuando se utiliza para la papaína, el proceso involucra un pretratamiento

del látex, ya sea una licuefacción o un secado en horno con le fin de
disminuir la humedad presente.

2.2.5 Secado por liofilización. Se utiliza cuando una muestra no puede

ser calentada para evitar la pérdida de alguna característica no
termoestable. La muestra necesita ser congelada a una temperatura de
al menos -20°C (Treybal, 1981). En una cámara hermética tiene lugar la
sublimación de los cristales de hielo formados y la humedad restante
contenida en la muestra se desplaza por difusión a los espacios vacíos
dejados por los cristales (Nitsawang et al., 2006)

2.3 PURIFICACIÓN DE
PAPAÍNA

Las técnicas de purificación de proteínas son diversas y su elección

depende básicamente del grado de purificación que se desee alcanzar, el
presupuesto disponible y obviamente de las características de la proteína a
purificar tales como peso molecular, carga, solubilidad, hidrofobicidad y
actividad biológica. Según la fuente de la proteína, esta estará acompañada de
diferentes contaminantes, propios del extracto madre (Roe, 2001). En el caso
de la papaína si es extraída del látex o de la cáscara, estarán presentes
contaminantes como la clorofila.

Los pasos básicos en una purificación se muestran en la tabla

2.
Tabla 2. Etapas en la purificación de
proteínas.

Etap a Objeti vos Oper ac io nes bás ic as

1. Fraccionamiento Obtener una sol ución clarificada de la proteí na Centrifugación
Microfiltración
Precipitación salina
2. Purificación Remover cont aminantes y concentrar Cromat ografía
la prot eína
3. Li mpiez a Estabilización de la proteína par a su Cromat ografía de exclusión
almac enami ent o, elimi nando otras proteí nas
o proteína degradada.

El escalamiento de un proceso de purificación debe tener en cuenta la

factibilidad de realizar la operación seleccionada en una escala mayor. La
cromatografía de intercambio iónico es una cromatografía que se puede
emplear en la industria sin involucra una inversión exagerada de capital (Roe,
2001).
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La purificación de papaína puede tener como objetivo alcanzar una papaína

libre de impurezas o alcanzar una papaína apta para formulación de vacunas y
medicamentos. A continuación se muestran algunas de las técnicas
empleadas para alcanzar una papaína libre de impurezas, ya que una papaína
utrapurificada requiere de más operaciones y no tiene una demanda
significativa en el país Colombia.

2.3.1 Fraccionamiento (Roe,

2001).

• Filtración. Consiste en pasar el extracto por una barrera porosa en

donde las partículas de mayor tamaño son retenidas, dejando en el
filtrado aquellas que tienen un tamaño menor al del poro. La fuerza
motriz de la operación es la presión.

Figura 5. Esquema para un

filtro.

Para la concentración de la proteína en la etapa de purificación de

papaína se emplean técnicas de precipitación inducidas por la adición de
polímeros o una cambio en el pH, la fuerza iónica de la proteína
dado que la solubilidad de la misma se determina por la distribución de
cargas en la superficie. El precipitado se colecta por filtración o
centrifugación.

• Precipitación por cambio en le pH o precipitación isoeléctrica. Cosiste

en ajustar el pH al punto isoeléctrico de la proteína ya que en ese punto
las cargas positivas y negativas de la molécula se cancelan, haciendo
que no exista repulsión sino atracción ente moléculas formado el
precipitado.

• Precipitación por incremento en la fuerza iónica o Salting out. Es uno de

los métodos más empleados y cosiste en la adición de sales que no
denaturan la proteína y previenen la contaminación por bacterias. La
precipitación ocurre debido a la agregación dad por los grupos
hidrofóbicos presentes en la superficie, que quedan expuestos luego
de que la sal que ha sido añadida debido a que cada uno de los iones
es solvatado por el agua que se encuentra rodeando la proteína. Se
debe realizar a una temperatura constante y preferiblemente bajo para
evitar la pérdida de actividad de la
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enzima. (4°C). La sal empleada por excelencia es el sulfato de

amonio, dado a que es económica y soluble. Su concentración se da en
porcentaje de saturación asumiendo que la muestra se satura igual
que el agua, escogiendo diferentes porcentajes de saturación para los
que la papaína precipitó.

Esta técnica se puede emplear en un proceso que consta de varias

etapas, lo que se conoce como extracción salina de múltiples etapas.
Esta es una de las técnicas tradicionalmente empleada para la
purificación de papaína, en donde luego de retirar las sustancias no
solubles mediante un cambio de pH, se prepara una solución de
papaína cruda saturada al 45% de sulfato de amonio (primera etapa)
y se agita para continuar con la preparación de una solución saturada al
10% de cloruro de sodio (segunda etapa) para lograr precipitar
completamente la papaína. El precipitado se recupera por centrifugación
(Salunkhe & Kadam, 1995).

• Precipitación por solventes orgánicos. Similar a la precipitación

isolelétrica, la adición de solventes orgánicos, disminuyen la constante
diaelétrica de la solución, es decir que la solubilidad de la proteína
disminuye y se presente la agregación de moléculas. Se favorece si el
pH se encuentra cercano al punto isoeléctrico y si la proteína es de bajo
peso molecular. Con el fin de evitar que se presente denaturación de
la proteína se debe realizar a temperaturas inferiores a 0°C, teniendo
en cuenta que la temperatura resultante tras la adición de solvente
orgánico se incrementa.

También se reporta purificación de proteína por extracción acuosa en dos

fases mediante el uso de dos polímeros o un polímero y una sal.
(Nitsawang et al.,
2006).

2.3.2 Purificación.

• Cromatografía de Intercambio Iónico. Se basa en que la mayoría de

las proteínas tienen cargas en su superficie por lo cual puede tener
lugar una interacción entre ellas. En la cromatografía hay una fase
móvil y otra estática. Existen de dos tipos, catiónica y aniónica,
dependiendo de la carga de la matriz (fase estática). Según sean las
cargas de la proteína que se desea separar, la matriz debe tener la
carga contraria. Una cromatografía de intercambio catiónico se emplea
generalmente para pH inferiores al punto isoeléctrico y lo contrato para
una de intercambio aniónico. Es deseable que la carga de la matriz no
varíe con un cambio en el pH. La separación tiene lugar, cuando iones
presentes en la matriz, son desplazados por la moléculas mediante un
efecto combinado de interacciones de van der Walls y Coulomb (Roe,
2001).
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3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.1 PAPAÍNA CRUDA

3.1.1 Extracción. La extracción de látex por excelencia consiste en hacer

incisiones en frutos inmaduros. Este tipo de extracción tuvo lugar
en cultivos de C. papaya ubicada en los alrededores del municipio de la
Vega (Cundinamarca). Con ayuda de una escalera metálica, se logró
llegar al nivel de los frutos inmaduros. Cada uno de ellos fue lavado
usando una toalla de algodón húmeda con el fin de retirar el polvo e
insectos presentes en la superficie del fruto. Luego con una cuchilla de
acero inoxidable se procedió a hacer incisiones longitudinales a lo largo
del fruto (Nitsawang et al., 2006), recogiendo el látex en un recipiente
plástico color ámbar a una temperatura de -20°C, el cual contenía NaCl
con el fin de disminuir la oxidación del látex. (Orti z, Madriga, Fernandez
& Cooke, 1980).

Figura 6. Extracción de lát ex de C. papaya provenientes de frut os inmaduros .

Otro tipo de extracción consistió en preparar un jugo de la cáscara de

frutos
inmaduros provenientes del municipio de Ginebra Valle del Cauca.
Cada
 IQ-2007-II-39

fruto fue lavado con agua y pelado con un cuchillo a una profundidad de
no más de 1.5 milímetros. Esta cáscara fue triturada en un
procesador de alimentos obteniendo una pasta húmeda almacenada en
frascos plásticos color ámbar que contenían NaCl a una temperatura
aproximada de -20°C.

Figura 7. Proc eso par a obtener el triturado de c áscara proveniente de frut os inmaduros .

3.1.2 Secado

Se escogieron cuatro tipos de secado:

• Secador de Bandejas
• Secador al Vacío
• Horno
• Liofilizador

El secado a la luz solar se descartó dado que en la literatura se refiere al tipo

de secado cuyo producto tiene menor actividad enzimática.
Se empleó la siguiente nomenclatura para las muestras, sometidas a cada tipo
de secado bajo temperaturas y presiones diferentes.
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Tabla 3. Pr ocesos de sec ado con temperaturas y presiones s eleccionadas para cada uno.
Número Orígen Tipo de Secado Temperat ura (°C) Presión (mbar)
1 Lát ex Horno 40 746.6
2 Cáscara Horno 50 746.6
3 Lát ex Horno 40 746.6
4 Cáscara Horno 50 746.6
5 Lát ex Secador de Bandej as 40 746.6
6 Cáscara Secador de Bandej as 50 746.6
7 Lát ex Secador de Bandej as 40 746.6
8 Cáscara Secador de Bandej as 50 746.6
9 Lát ex Secado al Vacío 40 137.06
10 Cáscara Secado al Vacío 50 137.06
11 Lát ex Secado al Vacío 40 137.06
12 Cáscara Secado al Vacío 50 137.06
13 Látex Liofilización -30 0.1
14 Cáscara Liofilización -40 0.1
15 Látex Liofilización -30 0.1
16 Cáscara Liofilización -40 0.1

Cada muestra consistía en 10g de látex o cáscara, dispuestos en

2
bandejas cuadradas de 15 cm de aluminio y en cajas de Petri, tratando de
formar una capa
delgada y homogénea. El producto obtenido se almaceno en frascos de
plástico color ámbar, sellados con papel de parafina para impedir el
contacto con la humedad del aire y los rayos solares tal como lo recomienda
Rodríguez y Umaña (1995).

• Secador de bandejas. Se hizo uso del secador de bandejas del

Laboratorio de Procesos Químicos de la Universidad de los Andes.
Las muestras fueron secadas a temperaturas de 40°C y 50°C bajo un
flujo de aire con velocidad máxima de 10 Km/h. Debido a que el tiempo
de secado depende del espesor de la muestra dispuesta en la
bandeja, esta se trato de homogenizar para todos los casos
permitiendo un tiempo promedio de 150 minutos para el proceso.

• Horno. En un horno (MEMMERT) fueron introducidas muestras en

cajas de Petri a una temperatura de 40°C por un periodo de 8 horas. El
mismo procedimiento fue empleado para una temperatura de 50°C.

• Secador al vacío. Las muestra fueron dispuesta en las bandejas

es
introducidas en la cámara del secador (COLE-PARMER) en
donde
mediante el empleo de una bomba se alcanzó una presión de
137.06mbar.
 IQ-2007-II-39

Se ajustó la temperatura a 40°C y se dejó la cámara por un periodo de

18 horas, después de las cuales se retiraron las muestras y el
exceso de humedad. El procedimiento se repitió de manera exacta para
una temperatura de 50°C.

• Liofilizador. A manera de pretratamiento, se llevaron las muestras a

una temperatura de -80°C en un congelador, por un periodo de 24 horas.
Cada muestra se llevó a un liofilizador (LABCON) ajustando la
temperatura a -30 y la presión a 0.1 mbar durante un periodo de 24
horas. El procedimiento se repitió de manera exacta para una temperatura
de -40°C.

Figura 8. Secador de bandejas . Figura 9. Horno.

Figura 10. Sec ador al vacío. Figura 11. Liofilizador

 IQ-2007-II-39

Como material de protección se emplearon guantes aislantes de temperatura

con el fin de evitar quemaduras. En la preparación de las muestras se
emplearon guantes de nitrilo.

Una vez colectadas todas las muestras, se procedió a caracterizar el

producto obtenido.

3.1.3 Caracterización de la papaína

cruda

• Medición de la actividad Enzimática. Se empleó el

protocolo SSCASE01.001 (1999) de Sigma para la determinación de
actividad enzimática de proteasas, con algunas modificaciones. La
actividad enzimática de la papaína se detectó siguiendo un método
colorimétrico que usa Caseína como sustrato siguiendo la siguiente
ecuación:

Inicialmente se construyó una curva de calibración de Tirosina en el

espectofotometro (THERMO) a 660nm, a partir de una solución 1.1mM
de tirosina, una solución 500 mM de Carbonato de Sodio (Na2CO3),
agua deionizada y el reactivo Folin – Ciocalteus, siguiendo las
cantidades que se
muestran en la Tabla
4.

Tabla 4. Cur va de calibraci ón de Tirosina.

Tirosina H20 Concentración de Na2CO3 Reacti vo F olin
Tirosina
µL µL mM µL µL
625 0 1.10 1570 250
600 25 1.06 1570 250
575 50 1.01 1570 250
525 100 0.92 1570 250
480 145 0.84 1570 250
410 215 0.72 1570 250
340 285 0.60 1570 250
280 345 0.49 1570 250
220 405 0.39 1570 250
180 445 0.32 1570 250
140 485 0.25 1570 250
100 525 0.18 1570 250
40 585 0.07 1570 250
20 605 0.04 1570 250
0 625 0.00 1570 250
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Esta curva se realizó por triplicado y se muestra en la Figura 12

Curva de Calibración de
Tirosina
1
y= 835.71x
2
0.9 R = 0. 9981

0.8
0.7

Replica 1
Absorbanci a (nm )

0.6
Replica 2
Replica 3
0.5 Replica 4
Prom edio
0.4 Lineal (Prom edio)

0.3

0.2

0.1

0
0 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0. 001 0.
0012
Concentración (µmoles de Tirosina
)

Figura 12. Cur va de calibraci ón de

tirosina.

Una regresión lineal de los datos muestra un R de 0.9981 y una

relación entre Absorbancia y µmoles de Tirosina de 835.71. Con esta
curva de calibración es posible hallar la actividad proteolítica presente
en cada una de las 18 muestras de papaína cruda en µmoles de tirosina.

Se tomaron 0.05g de muestra por 5 ml de un buffer pH 7.5 10 mM de

acetato de sodio y 5 mM de acetato de Calcio, para ser disueltos con
la ayuda de un sonicador en un baño de hielo por 10 minutos.

Figura 13. Preparación de mues tras.

 IQ-2007-II-39

Se preparó una solución de Caseína 65% en peso en un buffer fosfato

de potasio p H 7.5 y 50 mM como sustrato. En un eppendorf de 1.5 mL,
455µL de sustrato fueron preincubados a 37°C en un baño termostatado
por 10 minutos, luego se adicionaron 20 µL de cada una de la
muestras y se dejaron reaccionar por 10 minutos. La reacción se
detuvo adicionando
455µL de ácido tricloroacético 110 mM, dejando las muestras 30 minutos
más en el baño térmico. A cada una de las muestras se le preparó un
blanco, a el cual no se le adicionó enzima tras la preincubación, sino
ácido tricloroacético y seguidamente la muestra de papaína.

Las diferentes muestras y respectivos blancos fueron llevadas a una

microcentrífuga refrigerada (THERMO) a 9000 rpm y 4°C durante
20 minutos con el fin de descartar los sólidos generados en la
reacción y recuperar el sobrenadante.

Figura.14. Baño t érmico y centrifugación para muestras y

blancos

625 µL de sobrenadante, fueron mezclados con 1570 µL de una

solución
500mM de carbonato de sodio y 250 µL de reactivo Folin – Ciocalteus
para desarrollar la coloración azul respectiva a la identificación de la
tirosina liberada en la reacción. Cada muestra fue leída en un
espectrofotómetro (THERMO) a 660nm y comparada con la curva de
calibración.

Figura 15. Espec trofotómetr o (THERMO).

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“Una unidad, hidroliza caseína para producir un color equivalente a

1.0µL (181µg) de tirosina por minuto a pH 7.5 y 37°C. (color
desarrollado por Folin-Ciocalteus)” (Sigma, 1999). La transformación de
µmoles de Tirosina a unidades se da empleando la ecuación

Unidades (µmolesTir )(VT )

=
ml enzima (VE)(t)(VC)

Siendo µmolesTir, las moles producidas en la reacción, VT el volumen

total del ensayo en ml, VE el volumen de la enzima en ml, t el
tiempo de reacción en minutos y VC el volumen empleado en
la reacción colorimétrica.

• Cuantificación de Proteína. Con el fin de reportar la actividad específica,

se hizo necesario encontrar la cantidad de proteína presente en la
muestra. Se utilizó el método de Biuret, en el cual se permitió reaccionar
5µL de muestra con 5µL de agua deionizada y 20µL de reactivo de
Biuret durante 30 minutos. Luego haciendo uso de un espetrofotómetro
(NANODROP), se leyó la absorbancia a 580nm y este valor fue
comparado con curva patrón construida con concentraciones conocidas
de albúmina. Sabiendo que éste método es colorimétrico, no es posible
que la muestra a medir tenga algún color, a menos que se conozca su
espectro y se corrobore que ningún pico se solapa con los que se
espera obtener en la prueba. Es así como la prueba de Biuret solo se
aplicó a las muestras provenientes del látex

La trasformación de unidades para reportar la actividad especifica

esta dada por la ecuación

Unidades
Unidades ml enzima
=
mg proteína mg proteína
ml enzima

• Determinación del peso molecular. Se emplearon electroforesis en gel

de poliacrilamida (SDS-PAGE) cuya preparación se muestra en la Tabla
5, usando un equipo de electroforesis vertical (BIO-RAD).
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Tabla 5. Pr epar ación de geles de c orrido para la elec troforesis.

Compuest o Running Gel 12% Stac king Gel 5%
H2O (mL) 1.7 3.5
Running Buff er (mL) 1.25 -
Stac king Buff er (mL) - 0.64
SDS 10% (µL) 50 50
Acrilamida 30% (mL) 2 0.85
Temed (µL) 10 28
Persulfato de Amonio 10% (µL) 25 21
Total 5 5

Se emplearon electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

usando un equipo de electroforesis vertical (BIO-RAD). Se realizaron a
un voltaje constante de 220V, durante 2 horas, variando las muestras
sembradas. En primera instancia, se tomaron 40µL de buffer de corrido
por 0.0001g de muestra de enzima (látex y cáscara), se sometieron a un
baño de 94°C durante 4 minutos para denaturar la proteína. La Figura
16 muestra la disposición de las muestras según la numeración de
la Tabla 3 y el marcador de peso molecular (161-0309 BIO-RAD)
identificado con la letra P

Figura 16. Disposición de las muestra en el gel a para

una elec trofor esis SDS-PAGE.

Luego se comparó un buffer fosfato de pH 7.5 frente a un buffer acetato

de igual pH, diluyendo 0.05g de cada muestra látex secado en 5ml de
cada buffer. Esta comparación buscaba garantizar que el tipo de buffer
empleado (acetato), resultaba más adecuado para las muestras de
papaína que el buffer tradicionalmente empleado en la extracción de
proteínas. Las muestras fueron sometidas a una denaturación a 94°C
durante 4 minutos, para luego ser servidas como lo muestra la Figura 17.

Figura 17. Disposición de las muestra en el gel b para una

electrof oresis SDS-PAGE c omparando dos ti pos de buffer.

La tercera electroforesis se realizó con muestras solamente de látex

secado, denaturadas a 94°C por 4 minutos (Figura 18a.) y una
última, fueron esas mismas muestras pero sin denaturar como lo muestra
el Figura
18 b.
.
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a.
b.

Figura 18 a. Disposición de las muestr a en el gel c para una electrof oresis SDS-PAGE de mues tras de
lát ex denatur adas . b Disposición de las muestra en el gel c para una el ectrof oresis SDS-PAGE de
muestras sin denatur ar.

Figura 19. Proces o de prepar ación de muestras para una

electroforesis.

El proceso de tinción de cada gel constó de dos pasos. El primero

consistió en sumergir el gel en una solución, compuesta por metanol,
ácido acético glacial y azul de Coomassie durante una hora media con
el fin de fijar la proteínas al gel y teñir las bandas. El segundo en
sumergir el gel en una solución compuesta por acido acético y metanol
encargada de desteñir el gel.

Usando un transiluminador (BIORAD), fueron tomadas fotos de los geles

obtenidos usando luz blanca.
 IQ-2007-II-39

Figura 20 & 21 Gel de electr oforesis y transiluminador (BIORAD).

3.2 PAPAÍN A PURIFIC

AD A

Debido a la falta de recursos para realizar esta etapa la metodología

original propuesta sufrió un cambio significativo frente a la metodología
empleada, a continuación se enuncian ambas metodologías

3.2.1 Metodología Original. Se pretende analizar la diferencia de pureza de

los productos obtenidos mediante una purificación por precipitación
cambiando la fuerza iónica de la solución (extracción salina), frente a la
misma purificación seguida de cromatografía de intercambio iónico.

Se elige la muestra con mayor actividad enzimática. Una solución de

esta muestra en buffer fosfato 7.5 es llevada al 85% de saturación con
Sulfato de amonio en un refrigerador a 4°C con agitación constante
durante 4 horas. El producto se lleva a una centrifuga recuperando
únicamente el sobrenadante, el cual se lleva a una saturación del 65%
en un refrigerador a 4°C con agitación constante durante 4 horas. El
producto se lleva a una centrifuga, recuperando ambas fases y
llevando el sobrenadante a un porcentaje de saturación del 35% en
un refrigerador a 4°C con agitación constante durante 4 horas,
nuevamente el producto se lleva a una centrifuga, recuperando ambas
fases. Las 5 muestras recuperadas, se someten a diálisis para retirar
la sal y así medir su actividad enzimática. La
 IQ-2007-II-39

muestra que tenga mayor actividad, será aquella en donde precipitó

la papaína y por eso se repite el procedimiento para ese porcentaje
de saturación. La papaína obtenida, es sometida a una
cromatografía de intercambio iónico en una matriz de Sefarosa en la
cual se harán varias elusiones con soluciones de diferentes
concentraciones de NaCl.

3.2.2 Metodología Empleada. Se procedió a la cromatografía de intercambio

iónico en un matriz de Q-Sefarosa, luego de una filtración de la muestra
original, compuesta por 0.2 de muestra de látex liofilizado a -40°C en
1ml de buffer acetato de sodio 50mM de pH 5. Se prepararon muestras
de 10 ml en balones aforados, a una concentración de 0.5, 0.4, 0.3, 0.2
y 0.1 M de NaCl en el mismo buffer. Se instaló montaje con un balón
embudo de
100ml y una columna de 2.5cm de diámetro y 14cm de altura. En
esta
columna, se rellenó la matriz hasta alcanzar una altura de
10cm.

Para el arranque se hizo una elusión con el buffer. Seguidamente, se

sirvió la muestra y se llevaron a cabo elusiones con las soluciones
salinas de diferente concentración, recuperando cada una en un vaso de
precipitados plástico independiente. Se realizó una prueba de actividad
enzimática para cada muestra y aquella en donde se encontraba la
actividad fue sometida a liofilización a -40°C para concentrarla.
Posteriormente, se resuspendió en
1ml y se sometió a diálisis durante 12 horas haciendo
constantemente cambios de buffer externo. Al final de este periodo se
aplicó la prueba de Biuret para determinar la cantidad de proteína.

Figura 22. Montaj e para una cromat ografía de i ntercambio iónico en una matriz de Q-Sefaros a.
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3.2.3 Caracterización de la papaína purificada

• Determinación del peso molecular. Se realizó una electroforesis en gel

de poliacrilamida, preparando las muestras con 0.01 g en buffer fosfato
pH 7.5. Siguiendo el procedimiento descrito en el numeral 3.1.3

• Acti vidad enzimática. Se determinó siguiendo el procedimiento

descrito para la determinación de la actividad de la papaína cruda
descrito en el numeral 3.1.3.
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4. RESULTADOS Y ANÁLISIS

4.1 Extracción y
Secado

Para evaluar el origen y el proceso de secado más favorable para obtener

la papaína cruda muestras de ambos orígenes fueron sometidas a todos los
tratamientos de secado a las temperaturas seleccionadas, tomando la
actividad enzimática como criterio de evaluación. La Tabla 7 muestra el
camino en la conversión de unidades de actividad general hasta llegar a
Unidades de Tirosina por mg de muestra sólida para muestras de látex y de
cáscara. La Tabla 6 muestra los resultados de actividad general, es decir en
unidades/mg de muestra.

Tabla 6. Res ultados de Acti vad enzimática s egún el

orígen.
Látex Cáscara
Activi dad (unidades/ mg de muestra sólida)
Proceso de Temperat ura Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3
Secado (°C)
Horno 40 0.06782 0.10992 0.17523 0.01024 0.00137 0.02139
Horno 50 0.14314 0.14633 0.17500 0.07351 0.00296 0.01001
Secador 40 0.14314 0.14451 0.19730 0.00228 0.00501 0.00273
Secador 50 0.03755 0.04187 0.03732 0.01866 0.01821 0.01843
Secado al Vacío 40 0.15862 0.10263 0.17386 0.01547 0.00273 0.00660
Secado al Vacío 50 0.16158 0.15202 0.16522 0.01707 0.01752 0.01684
Liofilización -30 0.10400 0.14314 0.15429 0.01866 0.01297 0.01365
Liofilización -40 0.14018 0.14428 0.17227 0.00614 0.00660 0.01070

Se puede observar que la actividad enzimática obtenida para el látex es

mayor que para la cáscara, sin embargo mediante el análisis estadístico
se podrá determinar si hay o no diferencia estadísticamente significativa.

Se plantean entonces dos diseños de tipo factorial dado que las

temperaturas seleccionadas para todos los procesos no son iguales. El primero
se efectúa sobre los datos recogidos para el horno, secador y secado al vacío,
y el segundo sobre el liofilizador. Los factores para ambos diseños fueron:
origen, proceso de secado y temperatura. La elección de un diseño factorial
obedece a que este diseño
 IQ-2007-II-39

permite analizar el efecto de las posibles combinaciones de los tres factores y

los niveles presentes para cada uno. El efecto del factor se traduce en el
efecto que se genera en la variable de salida ante un cambio de nivel del
mismo al no ser constante para todos tiene lugar el efecto de la interacción
entre factores (Montgomery, 2005).

Mediante el uso del software MINITAB 15 se realizó un análisis de varianza

para cada diseño, encontrando que el factor de la temperatura no es
significativo con un α= 0.05 para ninguno de los dos diseños, razón por la
cual, se planteó un nuevo diseño factorial con solo dos factores: origen y
proceso de secado. Un análisis de residuales permite establecer la validez del
diseño, dado que los datos tienden a la normalidad y muestran una
distribución independiente, como se puede observar en la Figura 23. Los
resultados de la ANOVA se muestran en la Tabla 8.

Figura 23. Gr aficas de resi duales para l a acti vidad Específica. Tabla 8. ANOVA para acti

vidad c on origen y proces o de sec ado como fac tores.

Factor GL Seq SS Adj SS Adj MS F P

Proceso 3 0.005245 0.005245 0.001748 1.65 0.200
de Secado
Origen 1 0.170586 0.170568 0.170586 158.09 0.000
Origen*Secado 3 0.004399 0.004399 0.001466 1.36 0.269
Error 40 0.043163 0.043163 0.001079
Total 47 0.223392

Comparando los valores de P obtenidos con un α = 0.05, se observa que el

único factor significativo sobre la actividad resulta ser el origen, mostrando que
el látex resulta ser más favorable en la etapa de extracción conforme a la
literatura (Baeza et al.1989) (Rodríguez & Umaña, 1995).
 IQ-2007-II-39

Tabla 7. Res ultados de acti vidad y abs orbancia.

Absorbancia (nm) Actividad (µmoltirosina/L) Actividad(unidades/mg muestra)

Muestra Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
1 0.298 0.483 0.770 0.0003566 0.0005780 0.0009214 0.06782 0.10992 0.17523
2 0.629 0.643 0.769 0.0007527 0.0007694 0.0009202 0.14314 0.14633 0.17500
3 0.045 0.006 0.094 0.0000538 0.0000072 0.0001125 0.01024 0.00137 0.02139
4 0.323 0.013 0.044 0.0003865 0.0000156 0.0000526 0.07351 0.00296 0.01001
5 0.629 0.635 0.867 0.0007527 0.0007598 0.0010374 0.14314 0.14451 0.19730
6 0.165 0.184 0.164 0.0001974 0.0002202 0.0001962 0.03755 0.04187 0.03732
7 0.010 0.022 0.012 0.0000120 0.0000263 0.0000144 0.00228 0.00501 0.00273
8 0.082 0.080 0.081 0.0000981 0.0000957 0.0000969 0.01866 0.01821 0.01843
9 0.697 0.451 0.764 0.0008340 0.0005397 0.0009142 0.15862 0.10263 0.17386
10 0.710 0.668 0.726 0.0008496 0.0007993 0.0008687 0.16158 0.15202 0.16522
11 0.068 0.012 0.029 0.0000814 0.0000144 0.0000347 0.01547 0.00273 0.00660
12 0.075 0.077 0.074 0.0000897 0.0000921 0.0000885 0.01707 0.01752 0.01684
13 0.457 0.629 0.678 0.0005468 0.0007527 0.0008113 0.10400 0.14314 0.15429
14 0.616 0.634 0.757 0.0007371 0.0007586 0.0009058 0.14018 0.14428 0.17227
15 0.082 0.057 0.060 0.0000981 0.0000682 0.0000718 0.01866 0.01297 0.01365
16 0.027 0.029 0.047 0.0000323 0.0000347 0.0000562 0.00614 0.00660 0.01070
Las gráficas de efectos principales para ambos diseños se muestran en la
figura
24. Con este nuevo resultado y la cuantificación de proteína realizadaza por
el
método de Biuret a las muestras de látex, es posible ahora plantear un
análisis estadístico para la actividad especifica reportada en la Tabla 9.

Figura 24. Gr aficas de efec tos principal es para la acti

vidad.

Tabla 9. Mediciones de Acti vi dad Específic a

Activi dad (uni dades/ml mues tra) Activi dad (unidades/mg prot eína)
Numero Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Replica 1 Replica 2 Replica 3
1 0.00068 0.00110 0.00175 0.00040 0.00081 0.00113
2 0.00143 0.00146 0.00175 0.00097 0.00093 0.00102
5 0.00143 0.00145 0.00197 0.00085 0.00093 0.00127
6 0.00038 0.00042 0.00037 0.00021 0.00025 0.00023
9 0.00159 0.00103 0.00174 0.00088 0.00056 0.00115
10 0.00162 0.00152 0.00165 0.00080 0.00055 0.00089
13 0.00104 0.00143 0.00154 0.00038 0.00079 0.00060
14 0.00140 0.00144 0.00172 0.00073 0.00069 0.00087

El diseño esta vez será unifactorial, siendo el proceso de secado el factor con
cuatro niveles. Empleando el software MINITAB 15, se realizó un análisis de
varianza soportado con un análisis de residuales que verifica la tendencia a la
normalidad y la distribución independiente propios de un diseño adecuado.
La Figura 25 muestra la graficas de probabilidad normal y residuales vs.
valores ajustados. En la primera los valores mas representativos, según
Montgomery, (2005), tienden a la diagonal indicando que una distribución
normal es correcta para la serie de datos introducidos. En la segunda los
datos introducidos no muestran una estructura definida, aunque algunos
de los valores tienden a
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agregarse en cuatro grupos, esto puede sugerir existen unos datos que afectan
la aleatoriedad.

Figura 25. Efect os principales para la acti vidad espec ífica.

La Tabla 10 muestra los resultados para la ANOVA con un α = 0.05 Al comparar

el valor P obtenido para proceso de secado con el α escogido, se puede ver
que este factor no es significativo. En contraposición a Baeza (1989) que
reporta a la liofilización como el tratamiento que conserva de mejor manera
la actividad proteolítica, el presente trabajo muestra que no existe una
diferencia estadísticamente significativa entre los cuatro procesos de secados
comparados. Una grafica de efectos principales (Figura 26) muestra que las
media para los cuatro proceso se encuentran muy cercanas organizadas de
mayor a menor como horno, secado al vacío, liofilizador y secador.

Tabla 10. ANOVA para acti vidad espec ífica.

Factor GL Seq SS-7
Adj SS-7 F
Proceso de 3 2* 10 1 * 10 0.92 0.450
Secado
-6 -7
Error 20 1.7* 10 1* 10
-6
Total 23 2 * 10

Figura 26. Gráfic as de residuales para la acti vidad espec ífica.

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4.2 CAR ACTERIZACIÓN DE L A PAPAÍNA

CRUDA

La actividad enzimática hallada para la papaína cruda se reporta en las tablas

6y
9. En general, la actividad enzimática encontrada para esta papaína, resulta de
un orden mucho mas bajo al esperado, dado a que se encuentra en el
mercado con una actividad de 50UT hasta 1500UT (Fernández, 2005). Una
explicación para ésta pérdida tan alta de actividad puede estar dada por
múltiples factores que van desde las características de los frutos de donde
se hicieron los extractos, su almacenamiento, los cambios de temperatura
para efectuar los diferentes tratamientos de secado y en general, todas aquellas
etapas del proceso que no se pudieron realizar con materiales y equipos
especializados para le mantenimiento de la actividad enzimática. Es así como
los resultados que se obtienen, muestran valores que en general implican
una pérdida similar de la actividad enzimática entre las muestras. Al
momento de escalar este proceso, esta pérdidas no se pueden obviar y entre
mas se minimicen se obtendrá un producto terminado de mejor calidad.

En cuanto al peso molecular, la Figura 27 presenta los geles a, b, c y d

obtenidos tras la electroforesis de las muestras servidas de acuerdo a las
figuras 16, 17, 18a y 18b respectivamente. En el gel a, se puede observar
que en general las muestras se encuentran muy diluidas, pues las bandas
que aparecen en los pozos
7 y 9 se encuentran muy tenues. De igual forma, se pude ver que las
muestras
provenientes de la cáscara no muestran ninguna banda, indicando que la
concentración de la enzima frente al látex es mucho menor. Es por eso que el
gel b, solo contiene muestras de látex en dos buffers diferentes, mostrando
que para el caso de la papaína, resulta más conveniente el empleo de buffer
acetato frente al buffer fosfato, pues las bandas del pozo 1 y 6, las cuales son
las más nítidas, corresponden a este buffer. La banda del pozo 3 corresponde
a buffer fosfato, al igual que los pozos 5, 8 y 10 donde no se aprecia una
banda. En los pozos 4 y 9
se encontraban también muestras de buffer acetato, pero no muestran
banda, posiblemente por que a la hora de tomar las muestra, no se tomo
enzima. En el gel c, se aprecian las bandas obtenidas para las muestras
provenientes del látex secadas bajo distintos tratamientos. La diferencia
entra la densidad de banda puede atribuírsele a un error en la toma de
muestra original, pero se puede ver como la electroforesis muestra solo una
banda cercana a la sexta banda del marcado de peso molecular. Por último, se
obtuvo el gel d, con el fin de evaluar si
los diferentes tratamientos de secado habían generado una denaturación de
la
proteína generando un aumento en la actividad enzimática, dado que se mide
en unidades de tirosina. En esta electroforesis, las muestras no fueron
llevadas a
 IQ-2007-II-39
94°C por 4 minutos sino, se adicionaron directamente en los pozos, Todas
las muestras muestran dos bandas anchas luego es posible notar que no existe
una diferencia en la configuración tridimensional de la proteína dependiendo del
tipo de secado, sino que las dos bandas obtenidas pueden obedecer a que
se llamó
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papaína a un grupo de enzimas de peso molecular similar, las cuales estas

siendo diferenciadas en una electroforesis con un medio sin denaturar.

a b

c d

Figura. 27 Gel a mues tras de látex y c áscara ser vidas según figura 16. Gel b, mues tras us ando
diferent es buffers ser vidas según la figura 17. Gel c muestr as de lát ex ser vidas según la figura 18 a.
G el d muestras de látex sin denaturar ser vidas s egún la figura 18 b.

Para la determinación del peso molecular de las bandas presentes en los geles
a, b y c, se realizó mediante una grafica de calibración entre una medida
de la movilidad relativa las bandas del marcador de peso molecular y el
logaritmo del peso molecular de cada una de ellas. La Figura 28 muestra el
orden de los compuestos del marcador de peso molecular empleado.

Figura. 28 Bandas par a el marc ador de pes o molec ular (161-0309 BIO-RAD).
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Se puede ver que para algunos de los geles no se muestran todas las bandas
del marcador de peso molecular, en especial la banda 4 y la banda 7, que no
aparece claramente en ningún gel. Esto se puede considerar como un error en
la electroforesis que puede obedecer a un almacenamiento inapropiado
del marcador de peso molecular.

Mediante una regresión lineal es posible determinar el peso de la banda

que aparece en la muestra

Log Peso Molecular vs Movilidad Re lativa

5.5000
Log Peso Molecular (Daltons)

5.0000

4.5000
g
4.0000 g

3.5000

3.0000
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200
Movilidad Relativa

Figura 29. Determi nación de pes os molec ulares

La Figura 29 una curva sigmoidea. Si se realizara una interpolación y no una

regresión lineal de la gráfica que se obtiene, se podría encontrar un
peso molecular, un poco mayor, pero el valor dado por la regresión es
igualmente válido (García, 2000). La Tabla 11 muestra ecuación lineal junto
con el peso molecular calculado para las bandas que se presentan.
Tabla 11. Determinación de peso mol
ecular. 2
Gel Ecuación R Peso de Ba da (Da)
a y = -1. 3649x + 5.3609 0.93 22336. 789
b y = -1. 4024x + 5.4007 0.936 22638. 225
c y = -1. 4575x + 5.4589 0.934 21285.
3617

El peso molecular promedio obtenido es de 22086.79 Daltons, lo cual

es consistente con los pesos moleculares reportados en la literatura (Daliya,
Mathew
& Ruey-Shin, 2005).
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4.3 PURIFICACIÓN Y C ARACTERIZACIÓN DE LA PAPAÍN A

PURIFICAD A.

Luego se realizar las elusiones a diferentes concentraciones de NaCl, se

observó que para 0.3 y 0.4 M se encontraba mayor actividad. Se prepararon
muestras para purificar de cada uno de los procesos de secado y se eluyeron
bajo esas mismas concentraciones. La Tabla 12 muestra los resultados
obtenidos para la actividad específica de la papaína purificada.

Tabla 12. Acti vidad de papaína purificada.

Muestra Proceso de Sec ado Activi dad

(unidades/ mgprot eína)
1 Horno 0.050048965
2 Secador 0.007453736
3 Secado Vacio 0.001392938
4 Liofilizador 0.002168884

A diferencia de la papaína cruda, los resultados para la papaína purificada

no requieren de un análisis estadístico, dado que todas fueron realizadas
siguiendo el mismo proceso. En general el protocolo de purificaron
empleado, no resultó conveniente, dado que la papaína obtenida se encuentra
en concentraciones muy bajas, lo que sugiere que deben incluirse otras
etapas de concentración de proteína, además de la liofilización intermedia,
con el fin de mejorar el rendimiento de esta purificación. Se puede atribuir este
error a la imposibilidad de realizar la extracción salina como etapa previa a
la cromatografía, dado que uno de los
logros de esa extracción es precisamente concentrar la
proteína.

Para las muestras de papaína purificada, se halla una actividad

proteolítica mucho mayor que para la papaína cruda, aunque continúa fuera del
rango que se espera Una explicación a la anterior, es la falta de recursos para
que las condiciones de almacenamiento y el protocolo empleado minimicen la
pédida de actividad por factores externos. Con los ensayos realizados, no es
posible garantizar un diagrama de proceso para la obtención de papaína
purificada, pues resulta conveniente evaluar otras opciones y hacer un análisis
similar al realizado para la papaína cruda.

Para la determinación del peso molecular, se realizó una electroforesis en el

cual se sembraron muestras de papaína cruda y papaína purificada junto
con un marcador de peso molecular, obteniendo el gel de la figura 30 Se
obtiene solo una banda, lo cual sugiere que la dilución de 0.01 g en 1 ml es
muy elevada, pues a esa concentración no se puede detectar la enzima
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Figura 30. G el de el ectrof oresis de muestras purificadas.

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CONCLUSIONES

El látex de los frutos inmaduros es la mejor fuente para la obtención de

papaína frente a un extracto de la cáscara.

La temperatura de operación no afecta la actividad enzimática obtenida para una

muestra sometida a un proceso de secado.

Bajo las condiciones evaluadas no existe diferencia estadísticamente

significativa entre los valores actividad enzimática específica, reportados
en unidades de tirosina / mg de proteína, para las muestras de látex
sometidas a los cuatro procesos de secado seleccionados.

La especie de la Vega (Cundinamarca) tiene una papaína cuyo peso molecular

es
22086.79 Da.

La actividad enzimática para la papaína cruda es de 7.5*10-4

UT.

Las concentraciones ideales para eluir la enzima en un matriz de sefarosa son

0.3 y 0.4 M de NaCl.

La actividad enzimática para la papaína cruda es de 1.5*10-2

UT.
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RECOMENDACIONE
S

Se sugiere hacer un análisis económico para establecer el tipo de secado más

favorable.

Sería de gran interés hacer un proceso de purificación con más tiempo para
cada etapa con el fin de poder tener replicas y hacer conclusiones validas

Un marcador de peso molecular no siempre muestra todas sus bandas, por lo

que se recomienda servir varios pozos para poder detectarlas todas.

Durante cualquier proceso que se realice con enzimas, la temperatura y

los tiempos de pre-icubación e incubación son críticos. Se recomienda plantear
un protocolo en donde se especifique el manejo de la temperatura en cada
etapa con el fin de garantizar óptimas condiciones para la conservación de la
enzima.

Un correcto uso de los equipos del laboratorio disminuye el error

experimental
presente en una prueba y aumenta la vida útil del mismo, por eso se
recomienda hacer pruebas iniciales para conocer los equipos a utilizar y del
mismo modo conocer los programas de software disponibles en el
laboratorio con el fin de aprovechar al máximo los recursos disponibles.

La elaboración de un PFD completo de la planta involucra ingeniería de

detalle para el diseño de los equipos por lo que se recomienda continuar con
el trabajo para tener un diseño listo para buscar financiación. Si se tiene un
inversionista que disponga del capital suficiente, Colombia podría iniciar la
producción de papaína, aprovechando sus cultivos y dándole un impulso a al
desarrollo de la industria nacional.
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