Qué Es La Tinción de Gram y Cómo Hacerla

¿QUÉ ES LA TINCIÓN DE GRAM Y CÓMO HACERLA?
La tinción de Gram es un método diferencial de tinción utilizado para asignar bacterias a

uno de los dos grupos (gram-positivo y gram-negativo) basado en las propiedades de sus
paredes celulares. También se conoce como tinción de Gram o método de Gram. El
procedimiento lleva el nombre de la persona que desarrolló la técnica, el bacteriólogo danés
Hans Christian Gram.
Cómo funciona la tinción de Gram

El procedimiento se basa en la reacción entre el peptidoglicano en las paredes celulares de
algunas bacterias. La tinción de Gram implica la tinción de bacterias, la fijación del color
con un mordiente, la decoloración de las células y la aplicación de una contra-tinción.
 La tinción primaria (violeta cristal) se une al peptidoglicano, coloreando las células de

color púrpura. Tanto las células gram-positivas como las gram-negativas tienen
peptidoglican en sus paredes celulares, así que inicialmente todas las bacterias tiñen de
violeta.
 El yodo de Gram (yodo y yoduro de potasio) se aplica como mordiente o fijador. Las
células grampositivas forman un complejo cristalino de yodo violeta.
 El alcohol o la acetona se utilizan para decolorar las células. Las bacterias
gramnegativas tienen mucho menos peptidoglicano en sus paredes celulares, así que este
paso esencialmente las vuelve incoloras, mientras que sólo parte del color se elimina de
las células grampositivas, que tienen más peptidoglicano (60-90% de la pared celular).
La pared celular gruesa de las células grampositivas es deshidratada por el paso de
decoloración, haciendo que se encojan y atrapando el complejo yodo-mancha en su
interior.
 Después del paso de decoloración, se aplica una tinción (generalmente safranina, pero a
veces fucsina) para colorear la bacteria de rosa. Tanto las bacterias grampositivas como
las gramnegativas captan la tinción rosada, pero no es visible sobre la púrpura más
oscura de las bacterias grampositivas. Si el procedimiento de tinción se realiza
correctamente, las bacterias grampositivas serán de color púrpura, mientras que las
gramnegativas serán de color rosa.
Propósito de la técnica de tinción de Gram

Los resultados de la tinción de Gram se observan usando microscopía de luz. Debido a que
las bacterias son de color, no sólo se identifica su grupo de tinción de Gram, sino que se
puede observar su forma, tamaño y patrón de aglutinación. Esto hace que la tinción de
Gram sea una valiosa herramienta de diagnóstico para una clínica o laboratorio médico. Si
bien es posible que la tinción no identifique definitivamente a las bacterias, a menudo es
suficiente saber si son grampositivas o gramnegativas para recetar un antibiótico eficaz.
Limitaciones de la técnica
Algunas bacterias pueden ser gram-variables o gram-indeterminadas. Sin embargo, incluso
esta información puede ser útil para reducir la identidad bacteriana. La técnica es más
confiable cuando los cultivos tienen menos de 24 horas. Aunque se puede usar en cultivos
de caldo, es mejor centrifugarlos primero. La principal limitación de la técnica es que
produce resultados erróneos si se cometen errores en la técnica. La práctica y la habilidad
son necesarias para producir un resultado fiable. Además, un agente infeccioso puede no
ser bacteriano. Los patógenos eucariotas tiñen gram-negativo. Sin embargo, la mayoría de
las células eucariotas, excepto los hongos (incluyendo la levadura), no se adhieren al
portaobjetos durante el proceso.
PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN DE GRAM
Materiales
Cristal violeta (tinción primaria)
Yodo de Gram (mordiente, para fijar el cristal violeta en la pared celular)
Etanol o Acetona (decolorante)
Safranina (tinción secundaria o contra-tinción)
Agua en una botella de chorro o en una botella con gotero
Guías de microscopio
Microscopio compuesto
Tenga en cuenta que es mejor usar agua destilada que agua del grifo, ya que las diferencias
de pH en las fuentes de agua pueden afectar los resultados.
Pasos
1. Coloque una pequeña gota de muestra bacteriana en un portaobjetos. El calor fija las
bacterias al portaobjetos pasándolo a través de la llama de un quemador Bunsen tres
veces. Aplicar demasiado calor o durante demasiado tiempo puede derretir las paredes
celulares de las bacterias, distorsionando su forma y provocando un resultado inexacto. Si
se aplica muy poco calor, las bacterias se lavarán del portaobjetos durante la tinción.
2. Use un gotero para aplicar la tinción primaria (violeta cristal) al portaobjetos y
déjelo reposar durante 1 minuto. Enjuague suavemente el portaobjetos con agua durante
no más de 5 segundos para eliminar el exceso de manchas. Enjuagar demasiado tiempo
puede eliminar demasiado color, mientras que no enjuagar lo suficiente puede permitir
que demasiada tinción permanezca en las células gramnegativas.
3. Use un gotero para aplicar el yodo de Gram al portaobjetos y fijar el cristal violeta a
la pared celular. Déjelo reposar durante 1 minuto.
4. Enjuague el portaobjetos con alcohol o acetona durante unos 3 segundos, seguido
inmediatamente de un enjuague suave con agua. Las células gram negativas perderán
color, mientras que las células gram positivas permanecerán violetas o azules. Sin
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embargo, si el decolorante se deja encendido por mucho tiempo, ¡todas las celdas
perderán color!
5. Aplique la tinción secundaria, safranin, y deje reposar durante 1 minuto. Enjuague
suavemente con agua no más de 5 segundos. Las células gram negativas deben estar
teñidas de rojo o rosa, mientras que las células gram positivas seguirán apareciendo de
color púrpura o azul.
6. Ver el portaobjetos usando un microscopio compuesto. Puede ser necesaria una
ampliación de 500x a 1000x para distinguir la forma y la disposición de las células.
Ejemplos de patógenos grampositivos y gramnegativos

No todas las bacterias identificadas por la tinción de Gram están asociadas con
enfermedades, pero algunos ejemplos importantes incluyen:
Cocos grampositivos (redondos) -Staphylcoccus aureus

Cocos gramnegativos - Neisseria meningitidis
Bacilos grampositivos (varillas) - Bacillus anthracis
Bacilos gramnegativos - Escherichia coli
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ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con
material y medios de cultivo estériles. En microbiología la esterilización se define como “el
proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de
resistencia) de un objeto, medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de
microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos
métodos de esterilización, entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias
termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de óxido de etileno (para jeringas y
cajas de plástico).
Un medio de cultivo está constituido por una mezcla de agua y sustancias orgánicas
e inorgánicas, los que en conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el
desarrollo de los microorganismos. La composición de los medios de cultivo varía en
función de: a) grupo microbiano que se pretende estudiar, b) complejidad química, c)
estado físico, y d) aplicación.
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TÉCNICAS DE SIEMBRA PARA EL CULTIVO DE BACTERIAS
La caracterización de microorganismos se basa en la observación de las características microscópicas

y de desarrollo que presentan en diferentes medios de cultivo. Para esto último se aplican técnicas de siembra
específicas para cada microorganismo y de acuerdo a la presentación del medio. La formación de colonias
visibles con características particulares permite diferenciar a los microorganismos, así como detectar
contaminantes en los cultivos puros. Las colonias provenientes de un mismo microorganismo deben ser
iguales en forma, tamaño y color; al microscopio deben presentar las mismas características morfológicas y
tintoriales.
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MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
1. - Determinación del número de células totales
Recuento directo al microscopio

Se determina directamente el número de células contándolas al microscopio con la ayuda
de cámaras especiales que albergan un volumen conocido de líquido (Hemocitómetros,
Cámara de Petroff- Hausser).
El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rápida de estimar el
número de células microbianas. Sin embargo, presenta algunas limitaciones:
• No se pueden distinguir las células vivas de las células muertas.
• Las células muy pequeñas son difíciles de contar.
• La precisión es difícil de lograr
• El método no es adecuado para suspensiones celulares de baja densidad, es decir las
soluciones deben contener aproximadamente 107 células/mL o más.
A continuación, se desarrolla, como ejemplo, el recuento directo al microscopio utilizando

la cámara de Petroff-Hausser. En este método la suspensión de la muestra se coloca en la
cavidad cuadriculada de dimensiones conocidas de la cámara, y se tapa con el cubreobjetos.
Como se conoce el área de las cuadrículas y la altura de la cámara de recuento, el volumen
ocupado por la suspensión en cada cuadrícula queda determinado. Por tanto, para obtener el
número de bacterias por mililitro de suspensión, todo lo que se requiere es contar el número
de microorganismos en varias cuadriculas, calcular el promedio de recuento por cuadrícula
y multiplicar este promedio por el factor correspondiente.
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La tinción de Gram es un método diferencial de tinción utilizado para asignar bacterias a

Cómo funciona la tinción de Gram

 La tinción primaria (violeta cristal) se une al peptidoglicano, coloreando las células de

Propósito de la técnica de tinción de Gram

PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN DE GRAM

Ejemplos de patógenos grampositivos y gramnegativos

Cocos grampositivos (redondos) -Staphylcoccus aureus

La caracterización de microorganismos se basa en la observación de las características microscópicas

1. - Determinación del número de células totales

Recuento directo al microscopio

A continuación, se desarrolla, como ejemplo, el recuento directo al microscopio utilizando

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