Ing Gen P2

LABORATORIO DE INGENIERÍA GENÉTICA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA
DOCENTE:
Willian Capa Robles
CURSO:
Ingeniería Genética
TEMA:
Extracción y Purificación de DNA
INTEGRANTES:
Camacho Ávalos Danna Kassandra (0201923029)
Marquina Chupica Edinson Wilfredo (0201923047)
Murrugarra Valderrama Billy Armando (0201923020)
Rejas Gavidia José (0201923032)
Vega Vega Jasmine (0201923028)
CICLO:
VI
Nuevo Chimbote – Perú
2021
PRACTICA N° 2
EXTRACCION Y PURIFICACIÓN DE DNA
INTRODUCCION
Las características de un organismo están especificadas en su información genética, la cual está
representada como una secuencia de ácidos nucleicos, donde la suma total de esta secuencia es
lo que conforma su genoma. Dentro de los procedimientos en biología molecular, el más básico
es la extracción y purificación de ácidos nucleicos, en la forma de DNA o RNA . Por lo tanto, se
requieren métodos seguros para la separación de estos componentes de las células. Para lograr
esto, se utilizan diversos métodos de extracción dependiendo del tipo de tejido a emplear,
fresco, seco o congelado.
Sangre que circula por todo el cuerpo. = períférica
Diferentes métodos y tecnologías están disponibles en el mercado para realizar el aislamiento
de DNA genómico, aunque todos conservan el uso de los mismos principios y fundamentos. En
términos generales, la obtención de DNA a partir de leucocitos totales (obtenidos de sangre
periférica), células en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias; se usa
generalmente una técnica de cuatro pasos secuenciales:
a. Disrupción o alteración de la membrana
b. Lisis
c. Remoción de proteínas y contaminantes
d. Recuperación del DNA
El primer paso en cualquier protocolo de separación es el rompimiento del material

inicial, ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El método utilizado para
romper la célula debe ser tan leve como sea posible con el fin de causar el menor
daño posible al DNA. La lisis celular se puede hacer por acción mecánica,
pulverizando el tejido con hielo seco o nitrógeno líquido, también se puede utilizar la
degradación enzimática de la pared celular (si está presente) y lisis con detergentes
de las membranas celulares. Seguido al rompimiento celular la mayoría de métodos
involucran una desproteinización, lo cual se lleva a cabo con un solvente orgánico,
seguido de una precipitación con isopropanol o etanol y posterior solubilización con
agua o tampón.
El uso del protocolo de extracción con fenol/cloroformo ha sido el método más usado
para obtener DNA genómico. Estos protocolos tienen buenos resultados para
muestras de diversos orígenes. Sin embargo, es un método lento, laborioso y
contaminante. La extracción de DNA usando el protocolo con sal común (NaCl) es
una alternativa simple, fácil, rápida y no contaminante que permite obtener DNA de
buena calidad, en cantidades suficientes, desde diferentes muestras de tejido vegetal,
animal o bacteriano (Lopera-Barrero et al., 2008).
El DNA purificado por medio de este proceso, está listo para ser utilizado en
diferentes aplicaciones, las cuales involucran: amplificaciones (PCR), digestión con
endonucleasas de restricción, Southern blot y Dot blot.
LISIS CELULAR: La lisis celular consiste en la rotura de membrana celular de bacterias o

células que provoca la salida de material biológico.
OBJETIVO
 Identificar las etapas indispensables en los protocolos de extracción de DNA

 Comparar algunas técnicas de extracción de DNA
 Realizar un procedimiento modelo para la obtención de DNA
METODOLOGÍA
Muestras biológicas se colocarán en microtubos Eppendorf para ser tratadas con 550 μL
de solución tampón de lisis o TNES/protK (50 mM de Tris-HCl ( ÁCIDO CLORHÍDRICO) ,
pH 8.0 (+) 50 mM de EDTA (ÁCIDO ETILENDIAMINOTETRAACÉTICO) (+) 100 mM de
NaC (CLORURO DE SODIO) l (+) 1% de SDS (+) 7 μL de 200 μg·mL -1 de proteinasa K
(autoclave TNES, almacene en refrigeración y adicione protK antes de uso).
Inmediatamente se incubara en baño termoregulado a 50°C por 12 h. Luego, se
adicionarán 600 μL de NaCl 5M a cada muestra antes de centrifugar por 10 min a 12000
rpm. El sobrenadante se transferirá a microtubos nuevos, donde se precipitará el DNA con
700μL de etanol absoluto frío y posteriormente se incubará a -20°C por 2 h. Las muestras
de DNA serán centrifugadas, lavadas con 700 μL de etanol 70% y resuspendidas en
tampón TE (10 mM de Tris pH 8.0 y 1 mM de EDTA) (35 a 80 μL) y luego será tratada con
30 μg·mL-1 de ARNsa e incubado en baño de agua por 40 min a 37°C. El DNA obtenido
se conservará a -20°C.
La cantidad y calidad del DNA obtenido se determinará con un espectrofotómetro con una
absorbancia de 260/280 nm. Para esto, muestras de DNA se diluirá a 10 ng·μL -1 en
tampón TE.
TNES: Uso de un buffer que complementa la degradación de proteínas.

CUESTIONARIO
1. ¿Características diferenciales DNA, cromosomas, organelos involucrados de

células procariotas y eucariotas?
A NIVEL DE DNA:
EN LAS PROCARIOTAS EL ADN es una molécula única, generalmente circular y

filiforme, multiforme y de doble filamento, que se encuentra ubicada en un sector de la
célula que se conoce con el nombre de nucleoide. Este sistema sirve para guardar la
información genética, a diferencia con el sistema existente en células eucariotas, donde el
ADN se almacena dentro de un orgánulo con doble membrana llamado núcleo ya que la
celula es muy pequeña y cada molecula de ADN debe estar empaquetada esta forma se
denomina cromosoma.
A NIVEL CROMOSÓMICO:
Procariotas: No poseen cromatina y también en el citoplasma se encuentra libre de

estructuras membranosas Eucariotas: El DNA cromosómico está relacionado con proteínas,
se encuentra con una gran diversidad de estructuras, la mitocondria tiene diferente DNA de
su célula, y en el RE elabora proteínas y lípidos de importancia.
A NIVEL DE ORGANELOS:
Las células procariotas no tienen núcleo, ni organelos membranosos y su información

genética está dispersa en el citoplasma. Las células eucariotas tienen núcleo bien definido y
está delimitado por su membrana celular, poseen organismos membranosos, cloroplasto,
aparato de Golgi, retículo endoplasmático.
2. Hay muchos métodos de extracción de DNA que usan buffer de lisis y que
contiene principalmente EDTA y SDS. ¿Cuál es la función de estos dos reactivos
dentro de este contexto?
Desarrollado para la extracción de proteína soluble total de tejidos animales frescos o

congelados. Se basa en un buffer orgánico, que utiliza un detergente no iónico suave
y una combinación patentada de varias sales y agentes. Mejora la extracción y
estabilidad de las proteínas.
- EDTA: Es un quelante de iones Mg 2 baja la concentración efectiva del ión

antes mencionado, inhibe las nucleasas y minimiza la degradación de ADN
durante la extracción/ purificación.
- SDS: Son los detergentes que desnaturalizan las proteínas en hibridación.
3. ¿Qué tipo de enzima se emplea para realizar la remoción de proteínas? ¿Cuál es

el fundamento de este procedimiento?
las enzimas son proteinas producidas por las celulas vivas ,La extracción de
proteínas es un paso de preparación de muestras esencial en la proteómica,
pueden ser extraídos de plantas y animales de tejido, levaduras y
microorganismos. La sonicación es un método fiable, eficiente extracción de
proteína que da altos rendimientos de proteínas dentro de un tiempo de extracción
corto.
4. La recuperación del DNA se puede realizar mediante diferentes métodos, los más
comunes son: Salting-Out, extracción orgánica con fenol-cloroformo, gradientes de
densidad de cloruro de cesio, métodos basados en sílica-gel o resina quelante
(Chelex). ¿Diga cuál es el principio de cada uno de ellos? Ventajas y desventajas.
GRADIENTE DE VENTAJA DESVENTAJA

DENSIIDAD DE
CLORURO DE CELSIO.
5. Describa un método de extracción de DNA y fundamente la razón del uso de cada

reactivo y de las condiciones del proceso (temperatura, pH, sal, etc.).
Método del acetato de potasio la pata fue homogeneizada de forma manual

en 100 µL de tampón de lisis (NaCl 0,1 M; sacarosa 0,2 M; EDTA 50 mM; tris-
HCl 100 mM pH 8,25; SDS 0,05 %). La suspensión se incubó durante 30 min a
65 °C. Los ácidos nucleicos se extrajeron adicionando 14 µL de acetato de
potasio 8 M incubándose en hielo durante 15 min, seguido de una
centrifugación a 8 000 g durante 10 min a 4 ºC donde se colectó la fase
acuosa. El ADN se precipitó a - 20 ºC durante 30 min en presencia de 2
volúmenes de etanol absoluto que contenía acetato de sodio 0,3 M.
Posteriormente, se centrifugó la mezcla a 10 000 g durante 20 min y el
precipitado se lavó con etanol (70 %). Después de secar a temperatura
ambiente, el ADN se disolvió en 50 µL de tampón TE. El ARN restante se
eliminó con RNAsa H (Boehringer Mannheim), la suspensión se incubó a 37
ºC durante 1 h. Después de extraer con igual volumen de cloroformo-alcohol
isoamílico (24:1), la fase acuosa se conservó a - 20 °C.
a) Disgregar tejidos y lisar células.

b) Desnaturalizar proteínas y complejos nucleoproteicos.
c) Inactivar nucleasas endógenas.
d) Aislar ADN de otros ácidos nucleicos, proteínas y otros componentes
celulares.
Primero se debe liberar el DNA contenido dentro de las células en el material
biológico inicial. Se empieza con una lisis celular e inactivación de nucleasas
mediante ruptura mecánica (lisis hipotónica) o tratamiento químico
(detergentes, agentes caotrópicos y quelantes). También puede realizarse
por digestión enzimática (proteinasas K, lisozima)
Tras la lisis celular y la inactivación de nucleasas, el DNA es separado
mediante filtración o precipitación. Se debe purificar el DNA del resto de
sustancias presentes en las células de las muestras biológicas y después de
la lisis se separa el DNA mediante, separación/precipitación (sales, pH,
solventes organicos), por cromatografía (filtración por gel, etc), y
centrifugación (densidad, gradientes de CsCl).
6. Que actividades particulares deben tener las técnicas de extracción de DNA

según: organelos (núcleo, cloroplasto), tejido, célula (animal, fago, bacteria,
planta), estructuras genéticas (cromosoma, plásmidos,). En todos casos incluir las
referencias bibliográficas consultadas.
7. ¿A qué longitud de onda se lee el ADN?

El ADN cuenta con una concentración en referencia a su valor de absorbancia
obtenido a una longitud de onda de 260 nm. Dado que la absorbancia de A260/A280 y
A260/A230 se utiliza para evaluar las purezas de las muestras.
La relación de A260/280 es la más estable y considerada que un ADN de pureza
optima un valor entre 1.8- 2. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una
relación A260/280>1.6, y un valor de A260/280<1.6 indica una posible contaminación
por compuestos aromáticos como fenoles y proteínas. Un radio de A260/280 >2.1
puede deberse a presencia de ARN en la muestra.
No obstante, esta relación resulta mucho más variable que la relación A260/280
dependiendo de los factores como la concentración de ADN o de la composición del
tampón de resuspension de la muestra.
Figura 1: Valores indicativos de pureza en muestras de ADN
Nota: El grafico representa valores de absorbancia obtenidos en la cual el ADN

se puede interpretar sin dañar su estructura (Departamento de control de calidad
del Banco Nacional de ADN,2020)
8. ¿Por qué el rango de longitud de onda es de 260 a 280 A?
Es muy estable y se considera que un ADN de pureza óptima y aceptable debe tener
al menos una relación A260/280 > 1.6. Un valor A260/280 < 1.6 indica una posible
contaminación por compuestos aromáticos como fenoles y proteínas.
Figura 2 Análisis de ADN a 260 nm

Nota: En esta grafica representa que es un buen indicador de contaminación por proteínas:
la muestra de ADN será pura si es menor o igual a 1,8. En el caso es menor 1,8 indica la
existencia de contaminación causada probablemente por componentes orgánicos o agentes
caotrópicos (Heredia Díaz et al, 2016)
BIBLIOGRAFIA
- Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega,

Biorad, Biologend, Bioline, etc.
- David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology.
Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986.
- Heredia-Díaz, M. Y., Machado-García, M. R., Mendoza- Suárez, L. M., Jardines-Cala,
L. D., & Vázquez-Domínguez, M. A. (2016, Setiembre 03). Desproteinización de
muestras de suero y plasma para el estudio analítico de carbamazepina. Scielo,
28(03), 880. https://www.google.com/url?
sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=&cad=rja&uact=8&ved=2ahUKEwiC-
5HHl5f0AhV3D7kGHam8DHYQFnoECBcQAQ&url=http%3A%2F%2Fscielo.sld.cu
%2Fpdf%2Find%2Fv28n3%2Find10316.pdf&usg=AOvVaw2nv1xDRdkAxPRbQh-
X5EGL
- Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6 Sons,
1988.
- Programa de control de calidad de ácidos nucleicos. Banco Nacional de ADN
Carlos III (Universidad de Salamanca). www.bancoadn.org
- Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2 edition, Col
nd
Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

-
-
Espectro de luz visible
Que es la longitud de onda

 Puesto 1: Danna
 Puesto 2: Billy
 Puesto 3: José
 Puesto 4: Jasmine
 Puesto 5: Edinson

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EXTRACCION Y PURIFICACIÓN DE DNA

El primer paso en cualquier protocolo de separación es el rompimiento del material

LISIS CELULAR: La lisis celular consiste en la rotura de membrana celular de bacterias o

 Identificar las etapas indispensables en los protocolos de extracción de DNA

TNES: Uso de un buffer que complementa la degradación de proteínas.

1. ¿Características diferenciales DNA, cromosomas, organelos involucrados de

EN LAS PROCARIOTAS EL ADN es una molécula única, generalmente circular y

Procariotas: No poseen cromatina y también en el citoplasma se encuentra libre de

Las células procariotas no tienen núcleo, ni organelos membranosos y su información

Desarrollado para la extracción de proteína soluble total de tejidos animales frescos o

- EDTA: Es un quelante de iones Mg 2 baja la concentración efectiva del ión

- SDS: Son los detergentes que desnaturalizan las proteínas en hibridación.

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GRADIENTE DE VENTAJA DESVENTAJA

5. Describa un método de extracción de DNA y fundamente la razón del uso de cada

Método del acetato de potasio la pata fue homogeneizada de forma manual

a) Disgregar tejidos y lisar células.

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7. ¿A qué longitud de onda se lee el ADN?

Figura 1: Valores indicativos de pureza en muestras de ADN

Nota: El grafico representa valores de absorbancia obtenidos en la cual el ADN

8. ¿Por qué el rango de longitud de onda es de 260 a 280 A?

Figura 2 Análisis de ADN a 260 nm

- Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega,

Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

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