CULTIVO DE

TEJIDOS
VEGETALES

MÓNICA JADÁN GUERRERO

2021

1
Programa del curso:

PRIMERA
1. Historia UNIDAD

2. Establecimiento de un laboratorio

3. Métodos de esterilización

4. Medios de cultivo: componentes

5. Reguladores de crecimiento SEGUNDA

UNIDAD

6. Conceptos: totipotencia

7. Embriogénesis somática

8. Organogénesis
2
Programa del curso:

9. Micropropagación

10. Sistemas de producción masiva: SIT y RITAS

TERCERA
11. Suspensiones celulares UNIDAD

12. Aislamiento y fusión de protoplastos

13. Mejoramiento genético

14. Transformación genética

15. Técnicas para obtención de plantas haploides

16. Metabolitos secundarios

 11.
SUSPENSIONES
CELULARES
 Las suspensiones celulares (S.C) consisten en células
libres y agregados celulares distribuidos en un medio liquido
CONCEPTO en movimiento. Estas suspensiones pueden ser
permanentes mediante el suministro continuo de
acumulación de celulas, en nutrimentos.
la base si no esta en mov

El más utilizado el de Murashige y Skoog (1962) pero

hay resultados con otros. No difieren mucho de su
composición.

Se establecen a partir de callos y los medios no son los

MEDIO DE mismos que para el establecimiento de suspensiones
CULTIVO celulares, el nivel de auxinas y citoquininas pude ser
diferente en cada especie.

Las suspensiones necesitan algunos requerimientos:

AC, extracto de levadura, a.a., etc. AC=agua de coco,
los requerimientos de tienen para que las
celulas en supension que estan solas o agrupadas celulas en suspension tenga un crecimiento
celulas libres y agreagados, no mas de 10, sincronico.

5
 Iniciación de las suspensiones:

Las S.C. se inician generalmente mediante

la incubación de trozos de callos friables en
medios líquidos que están, en movimiento
continuo (intercambio gaseoso).
1g de callo y 5ml de medio de cultivo
Se coloca trozos de callo en frascos
Erlenmeyer hasta llenar ~ 1/5 de la
capacidad del frasco. Incubar con en un
agitador giratorio a 80-150 rpm, bajo luz
continua y a 25 ◦C de temperatura.

Mediante subcultivos
semanales, las S.C. quedan
establecidas después de
varios días.
 Mejor inoculo
???

Callo friable con un A veces es necesario

alto ritmo de división utilizar otros tipos de
celular callos
romper los agregados
celulares

Se puede utilizar medios mecánicos, como el

uso de frascos con deflectores o el filtrado; la
adición de pectinasas y celulasas al medio de
cultivo también pueden reducir el tamaño de los
agregados celulares.
continuos cerrados-- se suministra a la solucion
medio fresco en forma continua y simultaneamente cerrados- las celulas producidas quedan
se retira solo el medio usado,las celulas, separadas en el medio y de esta manera se da un
aumento en la densidad celular. cuando
mecanicamente, se acumulan en el sistema Sistemas de llega la fase estacionaria se toman
fracciones para un subcultivo
cultivo --continuos/cerrados---
continuos/abiertos-- se suministra medio
fresco, pero el medio usado sale junto
con las celulas.

Cerrados Continuos Continuos

cerrados abiertos
• Las células • En este sistema se • Al igual que el
producidas se suministra a la anterior, se
quedan en el solución medio suministra medio
medio y de esta fresco en forma fresco, pero el
manera se da un continua, y medio usado sale
aumento en la simultáneamente junto con las
densidad celular. se retira sólo el células.
Cuando llega a la medio usado, las
fase estacionaria células, separadas
se toman mecánicamente,
fracciones de ella se acumulan en el
para subcultivarla sistema.
en medio fresco. 30 dias o más hayq ue cambiar el medio de cultivo
de los 21 a 30 dias.

la forma del enlemeyer tiebe una base ancha (mayor area de desarrollo celular) y una boca angosta (reduce riesgo de contaminacion)
de 50 a 100ml de medio de cultivo
 Sistemas de
cultivo

C. CERRADO C. CONTINUO CERRADO C. CONTINUO ABIERTO

9
 METODOS PARA MEDIR EL
CRECIMIENTO:

Número de células: dispersar los grupos de células a

menos de 10. camara de Neubauer

Volumen celular: vol. conocido y centrifuga por

3 min. A 200 rpm (ml de cell x ml de cultivo)
frascos falcon

Peso fresco: sobre papel filtro cells. Lavadas y se

pesan.

Peso seco: igual al anterior, pero se secan a 60 ºC por

12h (al vacío).
en estufa por 12 h o quitasato
 Suspensiones celulares…

SUSPENSIONES CELULARES DE Chenopodium

ambrosioide

11
 12.
PROTOPLASTOS
 FUSIÓN DE PROTOPLASTOS

OBTENCIÓN DE BROTES EN CALLO DE

PROTOPLASTOS FUSIONANTES DE HOJA in vitro
DE JIGACHO (Vasconcellea stipulata) Y CALLO DE
BABACO (Vasconcellea x heilbornii)

AISLAMIENTO Y REGENERACIÓN DE
PROTOPLASTOS EN Zantedeschia spp.
 3. Cultivo de
1. Materia Prima 2. Aislamiento protoplastos
aislados

a. Enzimas
a. Material de
para el
a. Callos origen de los
aislamiento de
protoplastos
protoplastos

b. Densidad de
b.
b. Medio de población de
Suspensiones
incubación los
celulares
protoplastos

c. Purificación c. Sistema de
c. Hojas
de protoplastos cultivo

d. Adecuada
composición
del medio
4. Fusión de 5. Regeneración de
protoplastos plantas

Químicos: PEG (polietilenglicol)

Métodos
Mecánicos: electroporación, biobalística,
shock eléctrico (electrofusión)

Medio de
cultivo

Medio de
regeneración
Productos de fusión de protoplastos

16
13. MEJORAMIENTO
GENÉTICA
 Mejoramiento genético
Fusión de protoplastos

Tranformación

18
 14.
TRANSFORMACIÓN
GENÉTICA
 Técnicas básicas

Enzimas de restricción

Clonación de genes

Agrobacterium tumefaciens
Secuenciación
(vectores biológicos)
Electroforesis de Proteínas,
ARN y ADN
Hibridación con anticuerpos
(western blot)
Hibridación de ácidos nucleicos
(southern, northern)
Biobalística
(bombardeo con Reacción de la polimerasa en
macropartículas) cadena (pcr)
Enzimas Clonación
Secuenciación Electroforesis
Southern blot
Extracción de ADN
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Transformación genética: A. tumefaciens
Transformación genética: A. tumefaciens
Transformación genética: A. tumefaciens
 • Infección

A B
 • Arroz Var. Basmati 370

A B

Figure 1. A,B. Callus of Basmati 370 rice 5 day after infection, showing sectors
with small transient GFP expression.
 A

• Arroz: var. Taipei 309

B C

Figure 2. A, B, C. Callus of Taipei 309 rice, 5 day after infection, showing

sectors with small transient GFP expression.
• COTTON: First Experiment

A B

Figure 3. Various stages of transformation and formation of callus in cotton.

A. Cotyledon, B. Hypocotyls disk showing transient GFP expression in
the cells at the cut surface, 104 h after infection.
 • COTTON: First Experiment

A B

Figure 4. A Hypocotyl segment, 4 weeks after transformation, showing growth

of stably transformed individual calluses at both the cut surfaces.
B. Hypocotyl segment, 4 weeks after transformation.
 • COTTON: First Experiment

A B

Figure 5. A, B. Fluorescence image of cotyledon, two weeks after infection,

showing sectors with (green) and without (red) GFP expression.
• SORGHUM: Third Experiment

A B

Figure 6. A, B. Embryos of sorghum, one week after infection, showing

sectors with small transient GFP expression.
• SORGHUM: Third Experiment

Figure 7. Embryo of sorghum, one week after infection, showing sectors

with small transient GFP expression.
Transformación genética: Biobalística
 Transformación genética: Biobalística

El término biobalística deriva de la conjunción de “biología y balística” o

“balística biológica”. Este es un método muy original ideado y refinado en la
década de 1980 por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell
(EE.UU.), que permite introducir ADN a virtualmente cualquier tipo de célula.

En este procedimiento el ADN es introducido en las células por medio de

partículas microscópicas (micropartículas) aceleradas a velocidades
supersónicas, que atraviesan la pared y la membrana celular.

Las partículas son aproximadamente esféricas (de 0.4 a 2.0 micrómetros de

diámetro), están hechas de materiales densos como oro o tungsteno (ver
microfotografía 1 y 2 , respectivamente), y se recubren con el ADN que se
desea transferir a las plantas. (El Cuaderno:El porque Biotecnologia, Edicion
N.28)
 Transformación genética: Biobalística

Para que las micropartículas

puedan atravesar las membranas
celulares y llegar al núcleo de las
células blanco, son impulsadas a
gran velocidad por explosión de
pólvora seca, liberación de gas
comprimido a alta presión (aire,
helio, CO2 o N2 ), o por una
descarga eléctrica de una gota de 1 2

agua. Una vez dentro del tejido

vegetal el ADN se desprende de Micropartículas de oro (1) y tungsteno (2)

las micropartículas debido a las

modificaciones del entorno
iónico. (El Cuaderno:El porque
Biotecnologia, Edicion N.28)
GENES UTILIZADOS Y CARACTER CONFERIDO EN
PLANTAS TRANSGÉNICAS

Tipo de gen utilizado en Caracter que confiere

transgénesis a la planta

Toxina de Bacillus thuringensis

Resistencia a
Insectos

Proteína de la cubierta viral Resistencia a Virus

Quitinasas, glucanasas de
plantas y de otros organismos Resistencia a Hongos

Lisozima humana y de cerdo. Resistencia a

Otros péptidos bactericidas Bacterias
Genes cuyos productos afectan Resistencia a
la biosíntesis de aminoácidos, o
la fotosíntesis Herbicidas
Genes cuyos productos afectan Retraso maduración
la biosíntesis del etileno, o la
formación de pared cellular de frutos
 ALGUNAS LIBERACIONES COMERCIALES DE PLANTAS
TRANSGÉNICAS (Birch, 1997)
Cultivo (Fecha Nombre Compañía Caraterísticas
liberación)

Tomate (1994) Flavr Savr Calgene Savor de madurez en

rama, largavida

Tomate (1995) Zeneca Consistencia de pasta

de tomate

Algodón Bollgard Toxina deBacillus

Papas NewLeaf Monsanto thuringiensis para
Maiz (1996-97) YieldGuard resistencia insectos

Soya
Resistencia a
Raps Roundup Ready Monsanto
Glifosato (herbicida)
Algodón (95-96)
OTRAS PLANTAS QUE HAN SIDO GENÉTICAMENTE
MODIFICADAS

Abeto Eucalyptus Pino

Acelga Frambuesa Plátano
Alfalfa Frutilla Poroto
Algodón Kiwi Poroto de soya
Alamo Lechuga Remolacha
Arabidopsis Lirio Repollo
Arroz Maíz Rosa
Arveja Maní Sorgo
Camote Manzana Tabaco
Caña de Maravilla Tomate
azucar Orquidea Tulipán
Cebada Papa Trigo
Centeno Papaya Vides
Clavel Petunia Zanahoria
Crisantemo Pera Zapallo
Espárrago
 MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA

Transformación de Plantas

Biobalística
o
Agrobacterium

Mejoramiento
Genético

Resistencia a Resistencia a Esterilidad Calidad del

Patógenos Herbicidas Sexual Producto

Roundup Materna
Insectos Hongos Bacterias Color Postcosecha
Listo Paterna
 Glifosato

Glifosato

Bromoxinil
Todas las diapositivas de Transformación, fueron
obtenidas de la siguiente dirección electrónica:

http://www.slidefinder.net/p/p20021127154412vitro
transformacion/2683414
15. TÉCNICAS
PARA
OBTENCIÓN
DE PLANTAS
HAPLOIDES
CULTIVO DE ANTERAS Y POLEN

48
 CULTIVO DE ANTERAS Y POLEN

Mediante esta técnica las anteras inmaduras que contienen polen en una
etapa específica de desarrollo se colocan en medios donde el polen
inmaduro se divide para formar embriones o callo. El resultado es
plantas haploides estériles.

Condiciones que afectan al

cultivo de anteras

1. Genotipo de las plantas

donantes
2. Albinismo
3. Fisiología de las plantas
donantes
4. Desarrollo de polen
5. Pre-tratamiento de las
anteras
Medio de Aplicaciones en el
cultivo Fitomejoramiento

- Obtención rápida de líneas homocigotas

Líquido - En arroz se puede obtener en 7 a 8 meses
- Por técnicas tradicionales de 4 a 6 años
Sacarosa

Auxinas
FUTURO

Método potencialmente
Se espera que técnicas más eficaz y accesible
moleculares modernas para crear plantas
proporcionen valiosa haploides
información sobre la
Urge, lograr que el genética de los caracteres
cultivo de anteras sea relacionados con la
accesible a otras especies respuesta al cultivo de
cultivadas de anteras y faciliten el
importancia (yuca, maíz) desarrollo de nuevas
estrategias.
CULTIVO DE EMBRIONES
 CULTIVO DE EMBRIONES

Consiste en remover de los óvulos de las plantas los embriones de

cigotos inmaduros, y cultivarlos en un medio estéril que contenga los
nutrimentos necesarios. En este medio los embriones se pueden
desarrollar normalmente y germinar

Aplicaciones

Obtención de embriones
Obtención de monoploides
híbridos
Rescate de material de
Fertilización de óvulos in vitro
propagación en
Frutales deciduos cuyas Embriogénesis somática a
semillas son generalmente de partir de nucelas
baja viabilidad.
Obtención de híbridos en
algunos frutales
 Factores que
afectan el cultivo Importancia

- Ha sido de gran ayuda al

Medio de cultivo mejoramiento genético de especies
arbóreas: acorta el período siembra –
Osmolaridad floración.
- Acorta la latencia y producción de
plántulas para el transplante de 2 a 3
Reguladores de crecimiento semanas.
GERMINACIÓN DE SEMILLAS Y PROPAGACIÓN
VEGETATIVA DE ORQUÍDEAS

55
CULTIVO DE ORQUÍDEAS

Bernard (1909) descubrió que los hongos están en simbiosis con semillas de
orquídeas

• Semillas muy pequeñas tienen

pocas o ninguna reserva
alimenticia. En condiciones
normales pueden perderse

• Cultivada in vitro no se necesita

del hongo para que sobreviva la
orquídeas

• Si al cruzar se obtienen pocas

semillas, con el medio apropiado
se puede cultivar in vitro
 Permite germinar-embriones inmaduros, acortándose
el ciclo de mejora

Germinación y el desarrollo tienen lugar mucho más

Cultivo in vitro
rápido

hay un ambiente controlado y sin competencias con

hongos y bacterias

El embrión absorbe agua a través de la testa,

aumentando el volumen

Germinación de Se inicia la división celular, rompiendo el

semillas embrión la cubierta seminal

Se forma una estructura de tipo protocormo a

partir del agregado de células y sobre aquel
puede distinguirse un meristemo del vástago
 Esterilización de capsulas

Cerrada Abierta 10% NaClO) en

Antes de sembrar
proporción de 2-
Alcohol de 96 % y comprobar que tienen
5% (v/v) se añade
se flamea embrión
tween 20 u 80,
(estereomicroscopio)
durante 15 min

Medio sólido
Replicar las
inclinado con ayuda
plantas 3- 4 veces
de aguja de siembra o
hasta tamaño
por medio de una
suficiente para
gota, se siembra sobre
sembrar en suelo.
el medio.
 Cultivo de orquídeas…

Tan pronto como se inicia la diferenciación de

órganos comienza un período de crecimiento intenso

Se forman las primeras

Si el protocormo
raíces endógenas, el
está a la luz
protocormo y los rizoides
(verde) forman
terminan su misión
hojas (autótrofa).
nutritiva y desaparecen.

59
Cultivo de orquídeas… Propagación vegetativa de las orquídeas….

El cultivo de las semillas

se puede dividir en tres fases:
1.Transformación
del meristemo en un
cuerpo protocórmico

2.Propagación de los
protocormos

3.Conversión de los
protocormos en
vástagos con raíces.

60
 Cultivo de orquídeas…

Factores que afectan

a la germinación y
crecimiento:

- Temperatura
- Luz
- Agar
- Minerales
- Azúcar
- pH
- Vitaminas
- Reguladores
- Mezclas complejas
- Carbón activo
http://www.google.com/imgres?imgurl=http:
 Producción de
CULTIVO DE MERISTEMOS plantas libres de
virus

Meristemos de 1
mm con dos
Desinfección
primordios
foliares

Se baña el vástago Lejía 3 -10% (10

Se siembra por 6-10 sin hojas en alcohol
semanas hasta que min.) con tween
de 70% y luego por 20-80. Lavado
aparezcan
protocormos, se 10 min. Con lejía
con agua estéril
separan y se vuelven a 10%. Se separan las
sembrar yemas axilares,
lavado con agua
estéril
 Características de propagación:

El pH: debe ser entre 4,8

– 5,8
Para la siembra se usa turba
suave y se sube el pH y se
Fuente de carbono:
sacarosa: 1-3 % (glucosa añade nutrientes
o fructosa 1,5%)

Se añade leche de coco.

No es necesario colocar
reguladores, puede haber
mutaciones en presencia
de estos.

La temperatura óptima: 22
y 28 °C, con duración de
12-16 Hrs.
 16.
METABOLITOS
SECUNDARIOS
Substancias de uso farmaceútico, agrícola o Cultivos
industrial, cuya producción comercial por los Alternativa de células
métodos convencionales – síntesis química o y tejidos
extracción de plantas que los sintetizan – resulta vegetales
difícil o económicamente poco viable. in vitro

Constituye una promesa para aumentar el

rendimiento de los principios activos presentes en
las plantas, así como para controlar adecuadamente
la producción
 Metabolitos secundarios
(M.S)

Concepto Función

Productos metabólicos naturales que Protege contra los depredadores

no son esenciales para el
crecimiento vegetativo de los Permite competir por el hábitat con
organismos productores, pero se otras plantas
consideran compuestos de
diferenciación que confieren roles
adaptativos. Atrae polinizadores y simbiontes

Importantes para la sobre vivencia Protege contra el estrés al que son

de las plantas. sometidos durante su vida.
Factores que afectan en la Técnicas para la Producción de
síntesis M.S

Seleccionar variantes
genéticamente sobre productoras
Temperatura

Optimizar el medio de
cultivo para la producción de
Luz biomasa y para la biosíntesis

Reguladores de
crecimiento
Producir biomasa en gran escala
1. Modificación genética y selección de 2. Optimización de los Medios de
líneas sobre – productoras Cultivo

Se puede utilizar diferentes

medios de cultivo
Técnica de transferencia de
genes. Ejemplo: algunas
enzimas constituyen blancos
específicos Hay factores físicos y químicos
del medio que afectan a la
velocidad de crecimiento y
acumulación de M.S.
 Factores
Nutricionale
s pH Físicos Reguladores Otros

La aireación, -Inducen
por flujo generalmente a
La longitud la formación
Inicial es de controlado de
La cantidad de onda, la
5 y 6, los gases o por -La cantidad y
de los intensidad y
cambios agitación calidad de las -Carbón
nutrimentos el
pueden mecánica es auxinas activado
influye fotoperíodo presentes en el
afectar necesario para -Adición de
directamente pueden el incremento
gravemente proceso inicial extractos
sobre la estimular o de la biomasa
la del cultivo microbianos
velocidad de inhibir la y afecta
acumulación tiene un
crecimiento biosíntesis de también en la
de M.S marcado efecto
M.S. acumulación sobre el M.S. y
de M.S. M.P.
3. El cultivo a gran escala Problemas

a. Lento crecimiento de la
biomasa
Se utilizan b. Tendencia a la agregación
fermentadores que celular
permitan obtener c. Acumulación intracelular
toneladas del producto. de los productos
d. Poca resistencia a la
agitación mecánica

Inmersión temporal
Soluciones

Inmovilización de células en
matríces inertes
Permeabilización
Diseño de biorreactores especiales
 Estrategia general

Selección de plantas con Establecimiento de una

alto rendimiento para el línea celular a partir de la
metabolito deseado planta seleccionada

Desarrollo de condiciones
Desarrollo de un medio
para inducir la síntesis de
óptimo de crecimiento
los productos secundarios

Selección clonal de las Desarrollo de un medio

líneas celulares de alto óptimo para la producción
rendimiento de los M.S.
 Bioreactor system for
plant cultures and
secondary metabolites
production

HortTech. Chungbuk Natl. Univ.

Cheongju, South Korea
1. Bioreactors as a new culture system
 5 weeks of liquid culture

8 weeks of solid culture

 Fundamental studies of bioreactors related to
bioreactor design and operation:

• Assessment of cell and tissue growth, and product formation

• Analysis and modeling of culture dynamics, including the integration of

biosynthesis and product separation

• Studies of flow, mixing and mass transfer between the phases, in order
to define criteria for bioreactor design and scale up
 Types of Bioreactor
• Mechanically agitated bioreactors (aeration
agitation bioreactor, rotating drum bioreactor,
spin filter bioreactor)

• Pneumatically agitated and non-agitated

bioreactors (simple aeration bioreactor, bubble
column bioreactor, air-lift bioreactor, balloon
type bubble bioreactor, overlay aeration
bioreactors)
Layout of airlift and bubble column-type bioreactor

a, air compressor
b, main filter system
c, air flow meter
d, 0.2 m air inlet membrane
filter
e, water column
f, gas sparger
g, medium reservoir
h, membrane filter
I, sampling device
j, water circulator
k, control box
l, pH probe
m, dissolved oxygen
n, anti-foam agent
o, acid
p, base
q, draught tube
Bubble column-type
 g
k j
Air a b
c

d
pH control
O2 e BOX

FLOW VALVE
f i
g h
DO control
O2 BOX
Gas control unit
O2 CO2 FM-140

Fig. Schematic diagram of a balloon type bioreactor

a: air compressor, b: air reservoir, c: air after cooler, d: air filter system,
e: air dryer, f: air flow meter, g: membrane filter, h: glass sparger, i:
medium feeding port, j: DO sensor K: pH sensor .
Ginseng adventitious roots in balloon type bioreactors
Fig. Ginseng cell cultures in 20 L bioreactors
2. Physico-chemical parameters in bioreactor
cultures
 1) Bioreactor type

A B C D

A : Cylinder, B : Bulb, C : Balloon, D : Cone

Table. Effects of bioreactor types on initial oxygen transfer
coefficient (KLa) and growth of ginseng adventitious roots
cultured for 40 days.

Bioreactor Initial KLa Fresh wt Dry wt

types (h-1) (g) (g)

Cylinder 5.25 533.6 bz 38.55 c

Bulb 6.98 560.7 a 41.92 a

Balloon 5.49 556.7 a 40.22 b

Cone 5.69 558.8 a 41.52 a

zMean separation within columns by Duncan’s multiple range test, = 0.05.

P/a/n/a/x g/i/n/s/e/n/g
 Chrysanthemum shoots in different types of bioreactors

Balloon type Column type Modified column type

Changes in CO2 concentration during culture period

1600
Ebb and flood
1400 Immersion
CO 2 concentration

1200 Raft
(µmol·mol-1)

1000
800
600
400
200
0
2 4 6 8 10
Weeks after culture
 2) Column and sparger

Column Sparger
length
diameter & pore size
Table. Effects of column length on initial KLa and growth of
adventitious roots cultured in 20 L bulb type bioreactors for 40
days.
Column Initial KLa Fresh wt Dry wt
length (cm) (h-1) (g) (g)
8.0 5.42 1942 b 155.24 b

16.0 7.81 1959 a 173.58 a

zMean separation within columns by Duncan’s multiple range test, = 0.05.
Table. Effects of sparger diameter on initial KLa and growth of
ginseng adventitious root cultured in 20 L bulb type
bioreactors for 40 days.

Sparger
Initial KLa Fresh wt Dry wt
diameters
(cm) (h-1) (g) (g)

1.5 4.77 2260 bz 175.21 c

3.0 7.98 2272 b 175.92 c

5.0 9.79 2287 a 181.43 b

8.0 10.93 2295 a 191.91 a

zMean separation within columns by Duncan’s multiple range test, = 0.05.

 3) Air supply

Air supply No air supply

After 3 wks
 Air supply DFT without air supply

Air supply No air supply

Fig. Growth and multiplication of A. formosanus as affected by

with or without air supply (3 months).
 4) Culture method

Immersion culture: Explants were placed on

the bottom of a bioreactor and cultured in the
medium

Ebb and flood culture: Explants were placed on

the bottom of a bioreactor and culture medium
was sub-irrigated for 30 min at 2 hr intervals

Raft culture: Explants were placed on a

plastic net and culture medium was supplied
to the underneath of the explants
Fig. Shoot multiplication of Spathiphyllum as affected
by culture method

Immersion Raft Ebb& flood

Solid Immersion Raft Ebb& flood

 Grape rootstocks

Ebb & Flood Raft immersion

 75
70
65
Dry wt.(g)

60
55
50
45
40
A B C D E F G H

Fig. Growth of adventitious roots as affected by gas

combination (O2, CO2, C2H4)

A: Control B: O2 C: CO2 D: C2H4 E:O2+CO2 F:O2+C2H4

G: CO2+C2H4 H: O2 + CO2 + C2H4
Effect of type and concentration of gas supply

O2
Cont. (20.8%) 30% 40%

CO2

Cont (0.03%) 2.5% 5%

C2H4

Cont (0 ppm) 10ppm 20ppm

 6) Medium
composition

Medium type
Medium strength
Growth regulators
Sucrose conc.
Medium type

10 1

8 0.8
Fresh weight (g)

Dry weight (g)

6 0.6

4 0.4

2 0.2

0 0
MS LS WPM SH mMS

Fresh wt Dry wt

Fig. Effect of medium type on growth of Panax ginseng

adventitious roots.
Sucrose concentration

500 50 7
B

Saponin content (mg g-1 dry wt)

A
Fresh wt 6
400 Dry wt 40
Fresh weight (g)

Dry weight (g)

300 30 4

200 20 3

2
100 10
1

0 0 0
10 30 50 70 10 30 50 70

Sucrose concentration (g·L-1)

Fig. Effects of sucrose concentration on root growth (A) and saponin

accumulation in Panax ginseng (B) after 4 weeks of culture.
Medium strength

FW
300.00 255.90 30.00
DW
Fresh weight (gm)

250.00 25.00

Dry weight (gm)

209.81
200.00 19.60 19.98 20.00
143.90
150.00 14.6415.00
100.00 10.00
50.00 30.19 5.00
3.79
0.00 0.00
2MS MS 1/2MS 1/4MS
MS medium strength

Fig. Effects of MS medium strength on embryo growth

of Siberian ginseng in bioreactors after 45 days of
culture.
 Growth regulators

1 mg/L 3 mg/L 5 mg/L 7 mg/L 9 mg/L

IBA

NAA
Cont

Fig. Growth of Gymnema sylvestre cells as affected by

types and concentrations of auxin after 3weeks of culture.
3. Bioreactor culture of medicinal plants and
secondary metabolite production

System examples: Panax ginseng, Acanthopanax,

Echinaecia angustifolia, Gymnema, Anaectochilus
Panax ginseng C.A. Meyer

1 2 3 4 5

Wild mountain Callus induction Adventitious root

Selection of root line Bioreactor culture
ginseng from root explant induction from callus

6 7 8 9

Scaled up production Harvest Dry Final product

HORTTECH
Growth patterns and kinetics in batch culture

70
60
50
Dry wt.(kg)

40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Cultivation time (d)

Fig. Growth curve of adventitious roots during bioreactor culture

Elicitation

Ginsenoside content of cultivated ginseng roots and adventitious roots

(without elicitation).

Ginsenosides (mg · g-1 dry wt)

Plant material
PDz PTy PD/PT Total

Head 12.77 ± 1.27 9.88 ± 0.74 1.29 22.65 ± 2.02

Cultivated
Body 12.53 ± 0.49 7.48 ± 0.41 1.68 20.01 ± 0.90
root
Lateral
root 24.89 ± 4.97 10.14 ± 0.41 2.45 35.01 ± 5.37

Adventitious root 4.19 ± 0.30 2.98 ± 0.38 1.41 7.17 ± 0.64

zPD: Protopanaxadiol (Rb1+Rb2+Rc+Rd)

yPT: Protopanaxatriol (Re+Rf+Rg )
1
 Ginsenoside (mg g-1 dry wt)
700 70 10
A B
600 60
8
Fresh wt
Fresh weight (g)

500 50

Dry weight (g)

Dry wt
6
400 40
300 30 4
200 20
2
100 10
PT PD TS
0 0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Culture period (days)

Fig. Changes in root growth (A) and ginsenoside accumulation

(B) during the culture (PD:Protopanaxadiol, PT:Protopanaxatriol,
TS:Total saponin)
 Table. Effect of types and concentrations of jasmonate on
saponin content in adventitious ginseng roots.
Concentration Saponin content (mg g-1 dry
Jasmonates PD/PT
(M) wt)
50 11.15 ez 1.69
Methyl dihydro jasmonate 100 11.55 e 2.17
150 13.90 e 2.94
50 44.55 b 14.31
Methyl epi-jasmonate 100 64.20 a 19.98
150 59.70 a 16.66
50 14.15 e 2.50
Methyl epi-dihydro
100 18.30 de 4.55
jasmonate
150 30.30 c 6.25
50 26.80 cd 7.7
Jasmonic acid 100 15.50 e 2.86
150 16.55 e 4.77
50 47.45 b 5.55
Methyl Jasmonate 100 51.50 b 4.76
150 49.85 b 4.55
zMean separation within columns by Duncan’s multiple range test, = 0.05.
 25 70
60

Saponin content
Fresh weight (g) 20

(mg g-1 dry wt)

Dry weight (g) 50
15 40
10 30
20
5
10
0 0
0 10 30 50 100 150
MeJA (µM)
Fresh wt Dry wt Saponin content

Fig. Adventitious root growth and saponin accumulation

as affected by MeJA concentration.
 700 40
600
Fresh weight (g)

Saponin content
(mg g-1 dry wt)
500 30
400
20
300
200 Fresh wt 10
Saponin
100 content
0 0
0 1 3 7 10 14
Elicitation (days)

Fig. Saponin accumulation during elicitation.

Scaled-up Production of Ginseng
Adventitious Roots
 Balloon type
(500 L) Modified (1000 L )
HORTTECH

Horizontal type (500 L)

 356.4
R180

120
ID 500 x 4t

613
493
285
97

306.8

1606
1910
692
593

385.2
400
150
1200
40

147
267.4x4t

9
145
100
204
Fig. Balloon type bioreactor Fig. Drum type bioreactor ,
(500, 1000 L) (500,1000 L)

LEGENDS

MARK DESCRIPTION

BALL VALVE

STEAM TRAP

FILTER

AIR FLOW METER

REGULATOR

PRESSURE GAUGE

TEMPERATURE INDICATOR

TEMPERATURE ELEMENT

REDUCER

DRAIN

Fig. Pilot scale bioreactor system

Cutting device and blade placed inside of a bioreactor
HORTTECH
Commercial scale bioreactor system

10-ton

3-ton
1-ton

▪ 10-ton scale distilled water reservoir, medium mixer, and medium sterilizer
▪ 100 and 200 L inoculation bioreactors
▪ 1 and 3-ton scale bioreactors with blade for seed culture
▪ 4 10-ton scale bioreactors with internal tube and/or impeller
10-ton bioreactors
Sparger at the bottom
of a bioreactor
Inoculation Medium sterilizer Motor for
bioreactor cutting and
stirring
 A B Sight glass

Light glass Inoculatio

n

Cooling
water
inlet

Steam Cooling
inlet water
outlet

Air inlet Air inlet

Sparger

Steam
Medium transfer
outlet Transfer port

Fig. Diagram of a medium sterilizer (A) and a inoculation bioreactor (B)

 Harvest

Adventitious roots
cultured in a 10-ton
bioreactor
Cultured ginseng adventitious roots after harvest
Everybody is happy!!
Dryer

Drying process also affects

secondary metabolite content
 Bioactive compounds
in cultured mountain ginseng
and their efficacy
 Ginsenoside content according to sources of ginseng

Ginsenosides (mg/g DW)

Ginseng source
Triol Diol D/T Total
Cultivated
5.25x0.15 6.100.40 1.16 11.350.55
ginseng
Red ginseng 4.940.20 9.090.90 1.83 14.041.09

Mountain ginseng 6.610.34 7.570.24 1.10 14.191.20

Adventitious root
2.750.70 1.860.30 0.73 4.610.98
(AR)–1
AR-2 3.410.00 2.570.04 0.75 5.980.04
AR-3 3.340.80 14.741.05 4.41 18.091.03
AR-4 2.810.33 29.662.30 10.56 32.462.28
Callus 0.310.04 2.540.31 8.45 2.850.26
Hairy root 3.560.22 6.260.41 1.75 9.831.05
xEach value represents mean  S.E. of three replicate vessels
Certificate of US FDA and California Department of Health
Services (DOHS) [FDA.I.D code 2030950 dated 6/7/02]
Parameter Result
pH 5.62 pH Units
Calories 351 Cal/100g
Calories from fat 5.00 Cal/100g
Fat 0.54 g/100g
Saturated Fatty Acid 56.7 g/100 of fat
Cholesterol 0.54 mg/100g
Carbohydrates 58.8 g/100g
Total Dietary Fiber 28.1 g/100g
Total Sugars 4.61 g/100g
Moisture 1.19 g/100g
Ash, total 11.7 g/100g
Protein (5N x 6.25) 27.8 g/100g
Vitamin A 20.0 IU/100g
Vitamin C 39.6 mg/100g
Sodium 107 mg/100g
Calcium 464 mg/100g
Iron 11.9 mg/100g
 10

0
Cul. Ginseng Red ginseng Mountain Adventitious
ginseng root

Fig. Total phenolic compounds in cultivated ginseng, Red ginseng,

mountain ginseng and adventitious roots.
 µ mole min-1 mg protein-1 600
Cul. Ginseng
500
400 Adventitious root

300
200
100
0
APX DHAR MDHAR CAT POD GR GST
Antioxidant
Fig. Antioxidant activities in cultivated ginseng and adventitious roots.

(APX: Ascorbate peroxidase; DHAR: Dehydro ascorbate reductase;

MDHAR: Mono dehydro ascorbate reductase; CAT: Catalase; POD: Peroxidase;
GR: Glutathione reductase; GST: Glutathione S transferase;
GPX: Glutathione peroxidase; SOD: Superoxide dismutase)
Cholesterol decreasing effect

HDL-cholesterol LDL-cholesterol

(mg/kg) (mg/kg)
39
215
185
24.5 23.5
19 126

40

Control High fat CBN-3 고려인삼 Control High fat CBN-3 고려인삼
A B C D A B C D
control control

A: Control, B: High fat control, C: Adventitious root, D: Cultivated ginseng

 C 1 2 3 4 5 6 7

Tumor suppressor gene (p53)

Fig. Anti-cancer activity of ginseng adventitious roots.

C: Cultivated ginseng,
1: vitamin C 50 mg/L 2: -carotene,
3: Ginseng adventitious root 4: Taxol
5: Taxol+ vitamin C 6: Taxol+ -carotene
7: taxol+adventitious root
Commercialization
 Commercial Production of Useful Materials
by Plant Cell/Tissue Cultures
Organization Components (Species) Use (year) Note

Mitsui Petrochemical Shikonin (Lithospermum Cosmetics Low mol. wt.

Corporation erythrorhizon) (1983) Low mol. wt.
Berberine (Coptis japonica) Pigment Low mol. wt.
Purpurin (Rubia akane) Pigment Low mol. wt.
Catharanthine (Catharanthus Drug Low mol. wt.
roseus) Drug
Taxol (Taxus sp.)
Nitto Denko Callus (Panax ginseng) Food (1985) Extracts
Corporation
Kao Corporation Polysccharides (Polianthes Cosmetics Low mol. wt.
tuberosa) (1994)
Kibun Corporation Kinobeon A (Carhamus tinctorius) Pigment Low mol. wt.
Samyang Genex Taxol (Taxus sp.) Drug (2000) Low mol. wt.
Corporation
KRIBB Peroxidase (Ipomoea batatas) Diagnostic Enzyme
CBN Biotech Co., LTD Adventitious roots (Panax ginseng) Food, Extracts
Cosmetics
Microplants Co., LTD Seedlings (Acanthopanax Food, Extracts
senticocus) Cosmetics
Lab based venture company: CBN Biotech (2002.4)

Location: Ochang Science Park

(near the Univ. campus)
Staff: 20
Products:
1) Ginseng adventitious root:
35-40 tons (FW)/year
2) Micropropagated plants: 500,000/year
(mainly Phalaenopsis orchids)
 Patents
Ginseng adventitious Root

1. Mass propagation of ginseng, mountain ginseng and

cultivated mountain ginseng using tissue culture
techniques
2. Mass production of plants containing geranium using
tissue culture techniques
3. Increase of saponin content in ginsrng tissue cultures
Plus 4 more registered patents and 5 patents pending

Patents on new devices

1. Balloon type bubble bioreactors
2. Drum type bubble bioreactors
Ginseng adventitious Root

Food Permit

1. Obtained the approval of FDA for tissue cultured

mountain ginseng powder with/without containing
germanium (Code: 2030950): 2002.6.
2. Obtained the approval of KFDA for tissue cultured
mountain ginseng as a subsidiary health food: 2003. 4
Development of cultured mountain ginseng-based product

Subsidiary health food, alternative medicine, cosmetics et al.

CBN BIOTECH
Researchers in HortTech and CBN Biotech

Director: KY Paek
1 research professor; 4 Post Doc.fellows; 2 visiting
scientist; 7 phD students 4 Ms students
137