UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

TRABAJO DE TITULACIÒN

PROPAGACIÓN CLONAL IN VITRO DE ANTURIO (Anthurium

andreanum) ATRAVÉS DE CALLO Ú ORGANOGÉNESIS
INDIRECTA

ANDREA FERNANDA ESPINOZA VELEPUCHA

2014

i
 UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

TRABAJO DE TITULACIÓN SOMETIDO A CONSIDERACIÓN DEL H. CONSEJO

DIRECTIVO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS CÓMO
REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE

INGENIERA AGRÓNOMA

PROPAGACIÓN CLONAL IN VITRO DE ANTURIO (Anthurium

andreanum) ATRAVÉS DE CALLO Ú ORGANOGÉNESIS
INDIRECTA

ANDREA FERNANDA ESPINOZA VELEPUCHA

2014

ii
 CERTIFICACIÓN

Este trabajo de titulación ha sido aceptado en la forma presente por el tribunal de grado
nominado por el Honorable consejo directivo de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la
Universidad Técnica de Machala, como requisito parcial para optar al grado de

INGENIERA AGRONÒMA

…………………………………………….
Ing. Agr. Alexander Moreno Herrera Mg. Sc.
(Director)

…………………………………………….
Ing. Agr. Abrahán Cervantes Álava Mg. Sc.
(Miembro)

…………………………………………….
Ing. Agr. Iván Villacres Mieles Mg. Sc.
(Miembro)

iii
La responsabilidad de esta investigación, resultados y
conclusiones del presente trabajo, pertenecen exclusivamente a
su autor

Andrea Fernanda Espinoza Velepucha

iv
 DEDICATORIA
Este trabajo elaborado con mucho esfuerzo dedico a Dios padre celestial y la Virgen de
Natividad de Chilla por darme salud e inteligencia para realizar mis estudios y esta
investigación.

A mis padres Prof. Miguel Espinoza Peralta y María Velepucha Macas por haberme dado la
vida, la mejor educación y sobre todo el amor brindado a ellos por el esfuerzo que hacen por
darme lo mejor y dejarme la mejor herencia de mi vida mi profesión

A mi Esposo Sheyler Pérez e Hija Sheyla Sofía quienes forman parte de mi vida y son los que
me inspiran a la superación y optimismo para lograr mis metas propuestas.

A mi hermanas Alexandra, Yajaira, Marianela y Johana que son mi orgullo y las cuales me
incentivaron para seguir adelante y están siempre cuando las necesito.

A mis sobrinos Miguel, Anthony, Johan, Alexander y Sebastián que con sus ocurrencias
alegran mi vivir y son lo más bonito del mundo.

A mis queridos Abuelitos Rigoberto Velepucha (+) y Nestorina Macas (+) que desde el cielo
me iluminan y me cuidan en mi caminar a ustedes mi queridos papitos porque fueron un
ejemplo de vida.

A mis compañeros y amigos de mi vida universitaria que formaron parte de cada momento
que estuvieron en las buenas y malas Cristina, Jessenia, Carlos, Fernando y Arnaldo.

Andrea Espinoza Velepucha

v
 AGRADECIMIENTO
A la pionera en educación superior la Universidad Técnica de Machala mi querida Facultad
de Ciencias Agropecuarias y la Escuela de Ingeniería Agronómica por haberme recibido y
dado la oportunidad de estudiar.
A la Ing. Ana Castillo por su colaboración y enseñanza durante mi periodo de elaboración de
este trabajo.
A mis distinguidos miembros de tesis Ing. Alexander Moreno, Ing. Abrahán Cervantes y al
Ing. Iván Villacres que con su experiencia y conocimientos colaboraron en esta investigación.
A mis queridos y apreciados maestros Ing. Vicente Valencia, Ing. Franklin Alba, Ing. Max
Iñiguez, Ing. Oswaldo Espinoza, Ing. Carmen Serrano, Ing. Armando Tandazo, Arq. Jorge
Moreno, Ing. Julio Chabla, quienes impartieron sus conocimientos y enseñanzas en el
transcurrir de mi vida universitaria quienes más que unos maestros fueron unos verdaderos
amigos que estuvieron prestos ayudar y formar profesionales de excelencia.

Andrea Espinoza Velepucha

vi
 UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ACTA DE CESIÓN DE DERECHOS DE TESIS DE GRADO Y TRABAJOS DE

TITULACIÓN
Consigno con el presente escrito la cesión de los Derechos de Tesis de grado/ Trabajo de
Titulación, de conformidad con las siguientes clausulas:
PRIMERA
Por sus propios derechos y en calidad de Director de Tesis la Ing. Agr. Alexander Moreno y
la tesista Srta. Andrea Fernanda Espinoza Velepucha, por sus propios derechos, en calidad de
Autor de tesis.
SEGUNDA
La tesista Srta. Andrea Fernanda Espinoza Velepucha, realizó la Tesis Titulada
“PROPAGACIÓN CLONAL IN VITRO DE ANTURIO (Anthurium andreanum)
ATRAVÉS DE CALLO Ú ORGANOGÉNESIS INDIRECTA”, para optar por el título de
Ingeniera Agrónoma, en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Técnica de
Machala, bajo dirección del Docente Ing. Agr. Alexander Moreno, es política de la
Universidad que la Tesis de Grado se aplique y materialice en beneficio de la colectividad.
Los comparecientes Ing. Agr. Alexander Moreno, como Director de Tesis y el tesista Srta.
Andrea Fernanda Espinoza Velepucha, como autora de la misma, por medio del presente
instrumento, tiene a bien ceder en forma gratuita sus derechos de Tesis a la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad Técnica de Machala y conceden autorización para
que la Universidad pueda utilizar esta Tesis en su favor y/o de la colectividad, sin reserva
alguna.
APROBACIÓN
Las partes declaran que reconocen expresamente todo lo estipulado en la presente Cesión de
Derechos.
Para constancia suscriben la presente Cesión de Derechos en la ciudad de Machala a los 3 días
del mes de julio del año 2014

Ing. Agr. Alexander Moreno Mg. Sc. Srta. Andrea Espinoza Velepucha
DIRECTOR DE TESIS AUTOR

vii
 ÍNDICE DE CONTENIDO

Tema Página

1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 12
2. REVISON DE LITERATURA ...................................................................................... 14
2.1 ANTURIO................................................................................................................. 14
2.2 ORIGEN ................................................................................................................... 14
2.3 TAXONOMÍA .......................................................................................................... 14
2.4 DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA........................................................................... 15
2.5 CONDICIONES AMBIENTALES ........................................................................ 16
2.6 PROPAGACIÓN ..................................................................................................... 16
2.6.1 PROPAGACIÓN POR SEMILLA ..................................................................... 16
2.6.2 PROPAGACIÓN POR HIJUELOS DE TALLO ............................................. 17
2.6.3 PROPAGACIÓN POR HIJUELOS DE RAÍZ ................................................. 17
2.6.4 PROPAGACIÓN POR DIVISIÓN DEL TALLO ............................................ 17
2.7 CULTIVO DE TEJIDOS ........................................................................................ 17
2.8 PROPAGACIÓN IN VITRIO ................................................................................ 18
2.9 DESINFECCIÓN DE HOJAS ................................................................................ 19
2.10 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVO IN VITRO ............................... 20
2.11 ORGANOGÉNESIS INDIRECTA..................................................................... 21
2.12 CALLOS EMBRIOGÉNICOS ........................................................................... 22
3. MATERIALES Y METODO ........................................................................................ 23
3.1 MATERIALES ............................................................................................................ 23
3.1.1 UBICACIÓN DEL ENSAYO .......................................................................... 23
3.1.2 UBICACIÓN GEOGRÁFICA ........................................................................ 23
3.1.3 UBICACIÓN CLIMATICA ............................................................................ 23
3.1.4 UBICACIÓN ECOLÓGICA ........................................................................... 23
3.1.5 MATERIALES ................................................................................................. 23
3.1.6 TRATAMIENTOS ........................................................................................... 24
3.2 MÉTODOS ................................................................................................................... 26
3.2.1 CONCENTRACIÓN DE CLORO Y TIEMPO DE EXPOSICIÓN ADECUADO
PARA LA DESINFECCIÓN E INTRODUCCIÓN DE SECCIONES DE HOJA DE
ANTURIO IN VITRO. ............................................................................................................. 26
3.2.3 DISEÑO EXPERIMENTAL .......................................................................................... 28
3.2.2.1 Modelo matemático ....................................................................................... 28

viii
 3.2.2.2 Hipótesis Estadística ..................................................................................... 28
3.2.2.3 Análisis de varianza ...................................................................................... 28
3.2.2.4 Análisis estadístico ........................................................................................ 29
3.2.2.5 Pruebas de separación de promedios .......................................................... 29
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 31
4.1 INICIO DEL EZBOSO DE FORMACIÓN CÉLULAS MERISTEMATICASA
LOS 45 DIAS........................................................................................................................... 31
5. CONCLUSIÓN ............................................................................................................... 40
6. RESUMEN ...................................................................................................................... 41
7. SUMARY......................................................................................................................... 43
8. BIBLIOGRAFÍA CITADA ........................................................................................... 45
APENDICE ............................................................................................................................. 48

ix
 INDICE DE CUADROS

Tema Página

CUADRO 1. TRATAMIENTOS PARA LA PROPAGACIÓN CLONAL IN VITRO DE ANTURIO

(ANTHURIUM ANDREANUM) A TRAVÉS DE CALLO Ú ORGANOGÉNESIS INDIRECTA, 2014 ...... 24
CUADRO 2 CLASIFICACIÓN DE LA LÁMINA FOLIAR POR COLOR A LOS 45- 62 DÍAS. .................. 25
CUADRO 3 MEDIO DE CULTIVO PARA LA PROPAGACIÓN CLONAL IN VITRO DE ANTURIO
(ANTHURIUM ANDREANUM) A TRAVÉS DE CALLO Ú ORGANOGÉNESIS INDIRECTA, 2014 ...... 27
CUADRO 4 ANÁLISIS DE VARIANZA MODELO 1: EFECTOS FIJOS PARA PROPAGACIÓN CLONAL IN
VITRO DE ANTURIO (ANTHURIUM ANDREANUM) A TRAVÉS DE CALLO Ú ORGANOGÉNESIS
INDIRECTA, 2014 ............................................................................................................... 29
CUADRO 5 NÚMERO DE EXPLANTES CON PRESENCIA DE ESBOZOS EN PROCESO DE FORMACIÓN 50
CUADRO 6 ANÁLISIS DE VARIANZA PARA EL NÚMERO DE EXPLANTES CON ESBOZOS A LOS 45
DÍAS ................................................................................................................................... 50
CUADRO 7 NÚMERO DE EXPLANTES CONTAMINADOS POR UNIDAD EXPERIMENTAL A LOS 30 DÍAS
.......................................................................................................................................... 50
CUADRO 8 ANÁLISIS DE VARIANZA PARA EL NÚMERO DE EXPLANTES CONTAMINADOS. ......... 51
CUADRO 9. NÚMERO DE EXPLANTES CON PROCESOS DE EMBRIOGÉNESIS................................ 51
CUADRO 10 ANÁLISIS DE VARIANZA PARA EL NÚMERO DE EXPLANTES CON PROCESOS DE
EMBRIOGÉNESIS ................................................................................................................. 51
CUADRO 11 EMBRIOGÉNESIS PARCIAL Y COMPLETA A LOS 62 DÍAS ......................................... 52
CUADRO 12 TAMAÑO DEL CALLO EN LOS EXPLANTES DE ANTHURIUM ANDREANUM A LOS 52 Y 62
DÍAS ................................................................................................................................... 52
CUADRO 13 FRECUENCIA DE CALLOS CON COLORES VERDE CLARO, CAFÉ VERDOSO Y VERDE
OSCURO ............................................................................................................................. 53

x
 INDICE DE FIGURAS

Tema Página

FIGURA 1 . INICIO DE ESBOZO DE CALLO .................................................................................... 31

FIGURA 2 NÚMERO DE EXPLANTES CON ESBOZOS DE LA ACTIVIDAD MERISTEMÁTICA. ............. 32
FIGURA 3 . A) EXPLANTE CONTAMINADO Y B) CAJA CONTAMINADA A LOS 30 DÍAS ................. 32
FIGURA 4 NÚMERO DE EXPLANTES CONTAMINADOS A LOS 30 DÍAS. .......................................... 33
FIGURA 5 EMBRIOGÉNESIS PARCIAL PRIMARIAS 45 DÍAS ........................................................... 34
FIGURA 6 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA PARCIAL EN EXPLANTES FOLIARES DE ANTHURIUM
ANDREANUM A LOS 45 DÍAS ................................................................................................ 35
FIGURA 7 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA SECUNDARIA ................................................................. 36
FIGURA 8 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA PARCIAL Y COMPLETA EN EXPLANTES FOLIARES DE
ANTHURIUM ANDREANUM A LOS 62 DÍAS............................................................................. 36
FIGURA 9 TAMAÑO DEL CALLO A LOS 52 Y 62 DÍAS ................................................................... 37
FIGURA 10 SE GRAFICA LOS PROMEDIOS DE LOS TRATAMIENTOS PARA LAS DOS ETAPAS DE
EVALUACIÓN. .................................................................................................................... 38
FIGURA 11 CALLOS CON COLORES A)VERDE CLARO, B)CAFÉ VERDOSO Y C) VERDE OSCURO .... 38
FIGURA 12 FRECUENCIA DE CALLOS POR COLORES. ................................................................... 39
FIGURA 13 CÁMARA DE FLUJO Y LOS TRATAMIENTOS UTILIZADOS. ........................................... 49
FIGURA 14 DÍA DE LA SIEMBRA DE LOS EXPLANTES DE ANTHURIUM ANDREANUM................... 49
FIGURA 15 EXPLANTES SEMBRADOS A)T0 Y B) T2 .................................................................... 49

xi
 1. INTRODUCCIÓN

De las especies e híbridos pertenecientes a las monocotiledóneas, los Anturios son plantas
altamente apreciadas como ornamentales, debido a la belleza de sus flores y a su exótico
follaje. Mediante el empleo de los métodos de mejora de la especie Anthurium andreanum
Linden, se han obtenido un sin número de cultivares que han sido empleados como flor de
corte o para maceta, los que se comercializan a través del mundo. La demanda de este
material propagado y de los nuevos cultivares es muy amplia, alcanzando altas cotizaciones
en el mercado internacional Ponce (2002).

El Anturio dentro de las flores tropicales puede llegar a significar alrededor de 2% del
mercado mundial, alcanzando un costo entre 0,18 centavos y 1,00 USD por unidad. Se estima
que, en México se tiene el valor más alto de las flores en todo el mundo, alcanzando precios
de hasta $ 35.00 por flor.

Las actividades florícolas ubican al Ecuador como un protagonista en el mercado mundial

cuya producción se centra en el cultivo de rosas, claveles y flores de verano. Sin embargo, el
cultivo de anturio (Anthurium andreanum L.) empieza a ocupar mayor espacio en la actividad
exportadora debido a su exótica belleza en colores y formas (Ponce, 2002).

En el mercado nacional las flores tropicales y follajes, son considerados como un producto
nuevo y atractivo para los diferentes usos decorativos, ha presentado una buena
acogida gracias a la variedad que existe. Además, existen zonas tropicales como Machala,
Milagro, Santo Domingo, Tena y Naranjal, que pueden ser utilizadas para expandir este
cultivo (Benedictis et al., 2001).

Métodos eficientes para la regeneración de plantas de células cultivadas de muchas especies

importantes de cultivo fueron desarrollados durante la etapa de los años 1980 del siglo XX.
Esto fue posible por la inducción de cultivos embriogénicos los cuales formaron embriones
somáticos que germinaron para dar lugar a plantas normales. Esta tecnología, combinada con
la habilidad de células vegetales genéticamente transformadas forman hoy las bases de la
biotecnología vegetal a nivel comercial (Vasil. 2003).

12
La propagación tradicional de esta planta presenta inconvenientes debido a la escasa cantidad
de semillas, el almacenamiento de las mismas y la heterogeneidad que presentan (Murguía,
2007). Es por este motivo que se considera al cultivo de tejidos vegetales como una
herramienta útil para su multiplicación en masa. En el caso del anturio se han logrado obtener
plantas in vitro de forma directa o indirecta a partir de múltiples explantes siendo los más
utilizados secciones de hojas.

La formación de callos es la primera fase para iniciar el proceso de embriogénesis somática.

Los factores más importantes para lograrlo son el genotipo, la composición del medio de
cultivo así como la concentración del regulador de crecimiento. Además, Lee et al. (2003)
señalan que el número, color, forma y apariencia del callo con estructuras embriogénicas varía
entre los genotipos y esto depende del medio de cultivo utilizado, indicando que la formación
de callos está influenciada por las características propias del explante (la edad, el tamaño, la
procedencia, el genotipo).

El presente estudio plantea la organogénesis indirecta in vitro de secciones de hoja de

anturio, como una opción viable para la producción de plantas completas, uniformes y
libres de enfermedades. A continuación se experimenta reguladores de crecimiento y
concentración de macronutrientes , en las fases de introducción e iniciación, para
generar material sano, en un lapso corto de tiempo.

Los objetivos planteados fueron:

1 .Obtener la inducción de la embriogénesis somática en Anthurium andreanum.

2. Determinar cuál de los tratamiento es mejor para obtener mayor porcentaje de callos de

Anthurium andreanu

13
 2. REVISON DE LITERATURA

2.1 ANTURIO

El Anturio es una planta ornamental que se distingue por los llamativos colores de su
espata, apreciada por su larga vida en florero (15 a 20 días), muy razonable con respecto a
otras especies. Inicialmente, su cultivo y selección se realizaron en Francia y Bélgica,
descubierta durante una expedición al oeste de los Andes en Colombia y Ecuador en el
año 1876, dando origen mediante hibridaciones a las variedades de flores para corte y
maceta Anthura (2011).

2.2 ORIGEN
Murguía (2007) menciona que el nombre de la variedad Anthurium proviene de las palabras
griegas anthos y oura, que significan respectivamente “florecimiento” e “inicio”, a la que
pertenecen cerca de 1000 especies (Rivero et al., 2008), siendo la más conocida en el
mercado por su demanda A. andreanum Linden, que cuenta con la mayoría de las
variedades comerciales.
El anturio (Anthurium andreanumL.), es una planta herbácea perenne originaria de los
bosques lluviosos de Colombia, Ecuador y América Central .En su medioambiente, los
anturios nacen y crecen sobre la hojarasca del bosque y bajo la sombra de los árboles,
donde hay buena humedad y noches frescas, además la planta tiende a pegarse al tallo de
los árboles a través de raíces adventicias, y muchas veces asociada a otras epífitas como las
orquídeas y bromelias.

2.3 TAXONOMÍA
Según Salgado (2007) la clasificación taxonómica del anturio es la siguiente:

Dominio: Eukaryota
Reino: Plantae
Subreino: Viridaeplantae
Phylum: Tracheophyta

14
 Subphylum: Spermatophytina
Infraphylum: Angiospermae
Clase: Liliopsida
Subclase: Aridae
Suborden Aranae
Orden: Arales
Familia: Araceae
Subfamilia: Photoideae
Género: Anthurium
Especie: andreanum

Nombres comunes: Anturio

Corazón chino
Planta del flamenco (Países Bajos)
Cresta de gallo (América del Sur)
Cabeza de buey (China)
Flor de cola (Estados Unidos)
Variedades: Linden ex André, Schott, Tropical, Avoclaudia, Avonette, Avanti Casino,
Lunette, Avoanneke, Limbo, Scorpion, Acrópolis, Fantasía, Cuba, Merengue, Uranus,
Paradise, Champion, Alii, New Pahoa Red, Marian Seefurth, Tatsata Pink, Kalapana,
Oshiro Red, Lavender Lady, Mickey Mouse, Oshiro White, Tropic Mist, Rainbow, Blush
Oishi, Kozohara, Blush Bride, Nitta, Ozaki, Red Obake, Bettina, Sarah, PlewThien
Phuket, Valantino, Sonat.

2.4 DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA

Murguía (2007) indica que Anthurium andraeanum Linden es un planta perenne y por
esta razón permanece viva durante el invierno, con una vida productiva de varios años; es
herbácea y epífita. La raíz es fibrosa, cilíndrica, de consistencia carnosa, gruesa, no
profundiza mucho en la tierra, blanca, con producción de raíces adventicias. El tallo es
erecto, simple, herbáceo cuando joven y semileñoso cuando adulto, llega a crecer hasta
1,5 m. Las hojas son grandes de ápice agudo y borde liso, miden 30 cm de longitud
por 20 cm de ancho, con una disposición alternada en el tallo. El pecíolo de la hoja está
envuelto por una vaina inserta en el tallo, es largo y de color verde brillante. La flor

15
comercial es una hoja modificada llamada espata en forma de corazón de alrededor de 5-8 cm
de longitud, la cual envuelve a una estructura cilíndrica denominada espádice de
aproximadamente 9,5 cm de longitud.

2.5CONDICIONES AMBIENTALES
Según de FLORES ORGASMIC (2010) el Anturio es una planta tropical y, por lo tanto, no
tolera bien las temperaturas inferiores a 15 ºC y las superiores a 30 °C, asimismo puede
soportar temperaturas extremas de 40 °C, sin embargo los pedúnculos largos y las espatas
anchas, representativas de la más alta calidad, se han obtenido a temperaturas de 19 a 22 °C
en el aire Se cultiva para producción comercial a altitudes entre 200 y 2000 msnm.
La intensidad luminosa más apropiada se ubica entre 18000-25000 lux (250-300 Watt),
además prefiere un 75% de media sombra, con malla negra o plateada, una fija que
proporcione el 60% y una segunda que proporcione el 50% de protección, con una
humedad relativa entre el 60 y el 80% .

2.6 PROPAGACIÓN
Trujillo y Otros (2000) manifiesta que todos los métodos de propagación existentes
pueden ser utilizados para multiplicar el anturio, como son la división de plantas, esquejes
o “chupones” del rizoma propagación por acodo e incluso la propagación sexual por
semilla, los cuales resultan lentos y poco costeables . A continuación se describen las
formas de propagación comúnmente usadas.

2.6.1 PROPAGACIÓN POR SEMILLA

Ruiz (2000) menciona que Anthurium andreanum es una especie de flores protóginas.
Aunque las plantas son autocompatibles, la polinización cruzada en algunas plantas es
preferida para producción comercial de semilla, donde se realiza una selección de plantas
“élite” por aspectos como tamaño, forma de la espata y color. Sin embargo este es un proceso
lento, que lleva hasta tres años desde que se establece la semilla hasta la floración,
posteriormente pasan seis o siete meses para que se formen los frutos maduros y se obtenga la
semilla, además su viabilidad es muy corta, presenta una gran variación en la progenie y la
fase juvenil es de larga duración.

16
 2.6.2 PROPAGACIÓN POR HIJUELOS DE TALLO
Murguía (2007) menciona que esta forma de propagación es la más rápida, utilizando los
hijuelos que brotan del tallo (1 a 8 por año) para una vez que den su primera flor separarlos de
la planta, aproximadamente en ocho a diez meses, dependiendo de la variedad y manejo del
cultivo.

2.6.3 PROPAGACIÓN POR HIJUELOS DE RAÍZ

Murguía (2007) demostró que para obtener plántulas de la raíz, es necesario dar
condiciones óptimas de nutrición, aireación y riego a la planta, para seguidamente
cortarlos y sembrarlos cuidadosamente, debido a que son muy tiernos y se deshidratan
fácilmente.

2.6.4 PROPAGACIÓN POR DIVISIÓN DEL TALLO

Murguía (2007) señala que este método consiste en seccionar las plantas adultas cuyo tallo
sea de más de 40 cm de altura y posea por lo menos cinco nudos. Los mismos que se
siembran preferiblemente en forma horizontal sobre un substrato poroso esterilizado.
Posteriormente emergerán las raíces de las estacas y cuando broten las primeras hojas se
trasplantarán al lugar definitivo.

2.7 CULTIVO DE TEJIDOS

Ruiz (2000) indica que la propagación en el laboratorio, también llamada por cultivo de
tejidos, permite obtener un gran número de plantas en muy poco tiempo, libres de virus y
enfermedades bacterianas o fungosas.

De acuerdo a Lee et al (2003) que el cultivo in vitro de anturio fue desarrollado

inicialmente por Pierik (1974) y posteriormente abordado por otros investigadores.

Jiménez (1996) empleó hojas jóvenes abiertas, para la propagación clonal in vitro de
anturio a través de callo ú organogénesis indirecta, cortando secciones de 3 cm x 8 cm y de
1,5 cm x 2 cm, sembrados en tubos de ensayo en un medio semisólido de iniciación,
constituído de 50% macronutrientes y 100% micronutrientes, suplementado con 1,5 mg L-
1
BAP, 0.2 mg L-12,4-D y 30 g L-1 Glucosa, permitiendo su propagación masiva comercial.

17
Lee et al(2003) obtuvieron el mayor número de brotes a partir de yemas axilares de
Anthuriun andreanum L., en medio líquido MS (37,5%) suplementado con 0.8 ppm de N6-
bencilaminopurina (BAP), en agitación. Además, probaron medio MS sólido adicionado
0.2 ppm de N6-bencilaminopurina (BAP), que rindieron la mayor proliferación de brotes
múltiples por organogénesis directa.

Rivero et al(2008) reportan la inducción de embriogénesis somática indirecta en

Anthurium andreanum. (Monocotiledónea), usando explantes de segmentos foliares de
plantas micropropagadas sobre un medio de cultivo MS modificado suplementado con 6,79
μM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y 2,32 μM kin (kinetina). Además, indican
la diferenciación de los embriones somáticos en el medio de cultivo MS modificado
adicionado 4,44 μM de N6-bencilaminopurina (BAP), en condiciones de oscuridad.

2.8 PROPAGACIÓN IN VITRIO

Castillo (2004) manifiesta que este es un método de propagación rápido, que permite obtener
un gran número de plantas libres de enfermedades, virus, bacterias u hongos, en muy
poco tiempo.
2.8.1 Etapa 0

Se refiere al mantenimiento de la planta madre, es decir en condiciones sanitarias óptimas,

con una nutrición y riego adecuados, para permitir un crecimiento vigoroso y libre de
enfermedades.
2.8.2 Etapa I

Esta es la etapa de iniciación, donde se realiza el aislamiento estéril de los explantes,

eliminando los contaminantes externos como hongos y bacterias que habitan en forma
natural en el ambiente. De ésta manera se puede llevar a cabo un crecimiento y desarrollo sin
contaminación para poder establecer el cultivo in vitro.
Explante

Para el establecimiento y desarrollo de cada cultivo se debe seleccionar el explante

adecuado. La elección del explante se basa principalmente, en el objetivo que se

18
persigue y la especie utilizada. Por lo que se debe de tomar en cuenta los siguientes
factores:
Edad de la planta: la capacidad regenerativa disminuye conforme la planta envejece,
por lo que se utiliza material procedente de plantas juveniles. Para la regeneración in
vitro de Anthurium andreanum, es necesario el uso de tejido joven y aun blando.

Edad del órgano o tejido: los tejidos jóvenes son más apropiados para el cultivo que
los tejidos viejos y leñosos. En Anthurium andreanum se pueden utilizar explantes de
órganos jóvenes que están en la parte aérea de la planta, como la vena central
de la hoja y el espádice de la inflorescencia.

Tamaño del explante: mientras mayor sea el fragmento vegetal, más fácil es
inducir el crecimiento y la regeneración, debido a que cada fracción aislada tiene su
propia porción de reservas y hormonas.

Tipo de explante: la propagación de anturio a través de segmentos de hoja es

la más utilizada, ya que da la mayor cantidad de explantes y su desinfección es más
eficiente que la espata o el espádice, evitando pérdida general de material por
ataque de microorganismos.

2.9 DESINFECCIÓN DE HOJAS

Según Ruiz, 2000 existen cuatro fuentes de infección: la planta, el medio, el aire y
operador. De estas la más importante es la planta, y por ende el material vegetal debe bien
esterilizado superficialmente antes de su aislamiento in vitro.
En el caso del anturio (Anthurium andreanum), la fase crítica para su propagación in vitro es
la etapa de iniciación. existen distintas formas de llevar a cabo la desinfección en los
diferentes tipos de explantes utilizados, sin embargo la mayoría incluyen soluciones
con hipoclorito de sodio (NaOCl) como ingrediente activo, por ejemplo: se recomienda
sumergir el material en alcohol al 70% por unos segundos, seguido por una inmersión en una
solución de hipoclorito de sodio que contenga 15 g L-1 de cloro activo y 0.5 ml de Tween
por cada 100 ml de solución desinfectante por 10 a 15 min, para finalmente enjuagar tres
veces con ADE

19
Para las hojas se recomienda lavar su superficie con agua y jabón líquido, y posteriormente
en cámara de flujo laminar sumergirlas en una solución de hipoclorito de sodio al 3% por
15 min, con tres gotas de Tween 20 por cada 100 ml de solución, seguida de tres enjuagues
de 2 min cada uno con ADE.

Según Castillo, (2004) aplicó un protocolo de desinfección que consistió en sumergirlos

sucesivamente por 10 minutos en soluciones de Betadine (10 %), Benomyl (3 g·L-1),
Kasumín (4 mL·L-1), Bidroxyl (500 mg·L-1) e hidróxido de sodio (i.a. 5,25 %). Entre cada
paso se realizaron tres enjuagues con agua destilada y esterilizada. El medio de cultivo estuvo
conformado por las sales de Murashige y Skoog al 100 % y sacarosa a 30 mg·L-1 en las dos
fases de cultivo.

2.10 FACTORES LIMITANTES DEL CULTIVO IN VITRO

Fenolización.- La fenolización es el pardeamiento que se presenta con mayor frecuencia

en explantes de especies leñosas, se relaciona con la liberación al medio y oxidación de
polifenoles, es producido por acción de enzimas oxidasas que contienen cobre, como las
polifenoloxidasas y las tirosinasas que se liberan al herirse los tejidos, dando como
resultado compuestos quinónicos altamente activos y tóxicos para el explantes Toro (2004).

Contaminación.- La contaminación de los explantes se puede presentar en forma

exógena por una inadecuada esterilización del material vegetal o en forma endógena
cuando existen contaminantes sistémicos difíciles de eliminar, las fuentes de donde
proceden los contaminadores son: el explante (tejido), el medio, el aire y el investigador;
siendo la más importante el material vegetal.

 Contaminación exógena.-La contaminación que el explante lleva en su

superficie se puede eliminar mediante un eficiente protocolo de desinfección,
generalmente se hace uso de soluciones de hipoclorito de sodio (NaOCl) en
concentraciones de 1 a 3%, es una de las preparaciones más útiles como
germicida, se lo ha utilizado durante muchos años como esterilizante superficial
en los tejidos, siempre y cuando no se produzcan lesiones debido a su acción
blanqueadora. Como esterilizante superficial también se utiliza la solución de
bicloruro de mercurio (HgCl2), sin embargo es altamente tóxico y se debe

20
 utilizar con cautela en una solución acuosa entre 0.1 a 1.5% (p/v) por 3 a
10 minutos. También se puede hacer uso de desinfectantes como el yodo,
fungicidas, y otros bactericidas de naturaleza química.
 Contaminación endógena.-Esta se produce cuando los contaminantes se
encuentran dentro del tejido y por ende son difíciles de eliminar. En este caso
puede ser útil la inclusión de fungistáticos o bacteriostáticos en el medio de
cultivo; el sulfato de gentamicina, la penicilina y el sulfato de estreptomicina (10 a
50 mg L-1), son algunos de los productos de amplio espectro que se pueden
utilizar .El cultivo de tejidos incrementa el promedio de multiplicación
normal de las plantas y puede considerarse como una fuente de material
limpio, ya que está libre de bacterias y otras enfermedades como la
antracnosis, decadencia, mancha de la hoja y nudo de raíz Salgado, 2007

2.11 ORGANOGÉNESIS INDIRECTA

Gupta (2005) menciona que la formación de un primordio unipolar a partir de una yema con
el subsecuente desarrollo de este en un brote vegetativo, existiendo siempre una conexión
entre los nuevos brotes y el tejido paterno. Estos brotes vegetativos son posteriormente
puestos a enraizar en otra etapa, vía formación de primordios de raíces y el subsecuente
enraizamiento final.

Los brotes pueden formarse directamente del explante (organogénesis directa) o

indirectamente a partir de callos.

En contraste con la embriogénesis somática, en la vía organogénica para la formación de una

planta completa, ya sea por la vía directa o indirecta, se requiere de una secuencia de medios
de cultivo, ya que aquellos medios que favorecen el desarrollo de los brotes inhiben la
formación de raíces y viceversa.

La embriogénesis somática como sistema de propagación de plantas presenta una serie de

ventajas frente a otros sistemas: Una enorme capacidad de multiplicación aplicable
industrialmente, permite obtener en un solo proceso estructuras completas con ápice y raíz,
que pueden ser almacenadas y encapsuladas perfectamente.

21
 2.12 CALLOS EMBRIOGÉNICOS

Doran (2009) denomina tejido calloso a una masa amorfa de células vegetales poco
diferenciadas y de rápida proliferación. En condiciones naturales este tejido aparece como un
mecanismo de cicatrización cuando se presentan heridas o en tumores (agallas) inducidos por
organismos fitopatógenos. La aparición natural de tejido calloso se da como consecuencia de
un cambio en los niveles endógenos de reguladores del crecimiento, principalmente auxinas y
citocininas.

Se puede definir el callo en cultivo de tejidos como un tejido obtenido por medio del
aislamiento de órganos o tejidos diferenciados, los cuales posteriormente son llevados a una
desdiferenciación celular, presentando estas células una proliferación continua, acelerada y de
apariencia desorganizada, que da origen a una masa amorfa de tejido. Esta masa celular puede
presentar diferentes tipos morfológicos, los cuales varían según la apariencia externa, textura
y composición celular, pero por lo general son heterogéneos en su composición celular. La
coloración de este tejido también varía, aun derivando de la misma especie (se pueden
presentar callos que carecen de pigmentación, mientras otros pueden ser de diferentes tonos
de verde, amarillo, café o rojo). El tipo y grado de pigmentación está influenciado por factores
nutricionales y ambientales, y se manifiesta por la presencia de clorofila, carotenos,
antocianinas

22
 3. MATERIALES Y METODO

3.1 MATERIALES

3.1.1 UBICACIÓN DEL ENSAYO

Se llevó a cabo en la granja experimental Santa Inés de la Facultad de Ciencias Agropecuarias

de la Universidad Técnica de Machala, ubicada a 5,5 km de la vía Machala – Pasaje;
perteneciente a la parroquia El Cambio, cantón Machala, provincia de El Oro, Región 7.

3.1.2 UBICACIÓN GEOGRÁFICA

La Granja experimental Santa Inés se encuentra en las siguientes coordenadas geográficas:

Longitud: 1796388663965 UTM
Latitud: 6166612595 UTM
Altitud: 5msnm

3.1.3 UBICACIÓN CLIMATICA

La temperatura oscila entre 31º C la máxima y 20º C la mínima, con una humedad relativa de
83%. Velocidad del viento 14 km/h y una heliofania de 125 h/mes.
Precipitación: 420 mm

3.1.4 UBICACIÓN ECOLÓGICA

Según la zona de vida Holdridge, la región corresponde a un bosque muy seco tropical, Bmot.

3.1.5 MATERIALES

 Hojas de Anturios
 Betadine
 Kasumin
 Hipoclorito de sodio
 Hidróxido de sodio
 Vitrofural

23
  Cajas petri
 Balanza
 Vasos de precipitación 50 ML
 Cámara de flujo
 Autoclave
 Tiras de desinfección
 Etiquetas
 Fundas para autoclavar
 Pipeta
 Probeta

3.1.6 TRATAMIENTOS

Se indican en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Tratamientos para la propagación clonal in vitro de anturio (anthurium

andreanum) a través de callo ú organogénesis indirecta, 2014

Código Tratamiento
T1 Testigo solución hipoclorito de sodio
T2 Solución Betadine+ rydomil + phyton + Kasumin + hidróxido de sodio
T3 Solución rydomil + phyton + Kasumin+ hidróxido de sodio
T4 Solución phyton + Kasumin+ hidróxido de sodio
T5 Solución rydomil + hidróxido de sodio
T6 Solución hidróxido de sodio
T7 Solución Betadine
T8 Solución rydomil
T9 Solución phyton
T10 Solución Kasumin

24
3.1.7 VARIABLES EVALUADAS

1. Coloración del callo

2. Tamaño del callo
3. Porcentaje de contaminación a los 30 días
4. Inicio de germinación
5. Numero de embriogénesis somática completa a los 45- 62 días
6. Numero de embriogénesis somática parcial a los 45- 62 días
7. Numero de embriogénesis somática secundaria a los 62 días

3.1.8 MEDICION DE VARIABLES

3.1.8.1 Porcentaje de embriogénesis somática a los 45 - 62 días.

Para determinar el porcentaje de callos a los 30 días después de la siembra se procederá a contar el
total de callos germinados en cada uno de los tratamientos, utilizando una simple regla de tres.

Total de hojas sembradas – totales hojas propagadas

Brotación % = 𝑋 100
Total de hojas sombradas

3.1.8.2 Coloración del callo

Para la toma de este dato se escogerán al azar 5 callos germinados y se definirá que color de callo
predomina.
color símbolo
verde claro a
café verdoso b
verde oscuro c

Cuadro 2 Clasificación de la lámina foliar por color a los 45- 62 días.

25
3.1.8.3 Tamaño del callo

Para la toma de este dato se escogerán al azar 5 callos germinados y con un flexómetro se
procederá a medir desde la base hasta la punta del callo.

3.1.6.4 Porcentaje de contaminación a los 30 días

Para determinar el porcentaje de explantes contaminados a los 30 días después de la siembra
se procederá a contar el total de explantes prendidos en cada uno de los tratamientos
utilizando una simple regla de tres.

Total de hojas sembradas – totales hojas propagadas

Contaminación % = 𝑋 100
Total de hojas sombradas

3.1.6.5 Inicio de germinación

Para determinar el porcentaje de explante germinación después de la siembra se procederá a
contar el total de hojas prendidas en cada uno de los tratamientos utilizando una simple regla
de tres.

Total de hojas sembradas – totales hojas germinadas

Germinación % = 𝑋 100
Total de hojas sembradas

3.2 MÉTODOS
Para cumplir con el primer objetivo: Obtener la inducción de la embriogénesis somática en
Anthurium andreanum, 2014.

3.2.1 CONCENTRACIÓN DE CLORO Y TIEMPO DE EXPOSICIÓN

ADECUADO PARA LA DESINFECCIÓN E INTRODUCCIÓN DE SECCIONES DE
HOJA DE ANTURIO IN VITRO.

Para la elección de explantes se contara con plantas adultas de Anthurium andreanum.Lind. de

la variedad “Sonate”, que crecen en condiciones controladas dentro de un invernadero, y de
las cuales se espera obtener hojas jóvenes aún blandas que tengan entre 50 y 70% del largo
definitivo, ya que tienen mayor capacidad de regeneración.

26
Seleccionados los explantes, se procederá a lavar las hojas con agua y jabón líquido
limpiando el limbo suavemente con una esponja para eliminar polvo e impurezas, posterior a
esto se las coloca en abundante agua corriente para quitar residuos de jabón.

Inmediato al ingreso del material a la cámara de flujo, se deberá sumergir las hojas en una
solución de cloro agitando suavemente; en esta fase se evaluara nueve tratamientos de
desinfección, que consistirán en la interacción de diferentes concentraciones de
betadine, kasumin, Phyton e hidróxido de sodio y tiempos de exposición, luego se
enjuagaran tres veces con agua destilada estéril para eliminar todo residuo del agente
desinfectante, para una vez desinfectadas las hojas, cortarlas en segmentos de
aproximadamente 1 cm2 y finalmente introducirlas en medio basal, colocándolas de forma
que las tres cuartas partes queden sumergidas en el medio de cultivo.

3.2.2 CONCENTRACIÓN DE MACRONUTRIENTES MS ADECUADO

Cuadro 3 Medio de Cultivo para la propagación clonal in vitro de anturio (anthurium

andreanum) a través de callo ú organogénesis indirecta, 2014

MEDIO DE CULTIVO
MACROELEMENTOS Cantidad 1 Litro
1 Nitrato de Amonio
2 Fosfodiacido de Potasio 100 ml
3 Cloruro de Calcio
4 Sulfato de Magnesio 50 ml
5 Nitrato de Potasio 100 ml
MICRONUTRIENTES Cantidad
1 Sulfato de Manganeso
2 Sulfato de Zinc
3 Ácido Bórico
4 Yoduro de Potasio 5 ml
5 Molibdenato de Sodio
6 Sulfato de Cobre
7 Cloruro de Cobalto
FUENTE DE HIERRO Cantidad
1 Sulfato de Hierro
5 ml
2 Etilendiaminotetracico
VITAMINAS Medidas 1000 ppm
1 Myo-inositol 100 ml
2 Tiamina 0.4 ml
ANTIOXIDANTE Cantidad
1 Ácido Ascórbico 40 mg
HORMONAS Medidas 100 ppm

27
 1 BAP 1.75
2 2,4 D 0,08
SUCROSA 30 g
AGAR 4.5 g
pH 5,6 - 5,8

3.2.3 DISEÑO EXPERIMENTAL

3.2.2.1 Modelo matemático

El modelo matemático del diseño randomizado, vendrá representado por la siguiente ecuación
lineal:

YIJ = µ + τi +ξij

Dónde:
Yij = Las variables dependientes a evaluarse
µ = Promedio general del ensayo
τi = Efecto de los tratamientos
€ijk = Error experimental

3.2.2.2 Hipótesis Estadística

Nula Ho:

Los métodos de propagación no difieren con relación al sistema tradicional testigo

Alternativa Ha:

Las nuevas metodologías de propagación, en al menos uno de los sistemas se espera que
difiera estadísticamente del testigo.

3.2.2.3 Análisis de varianza

Se indica en el cuadro 4.

28
Cuadro 4 Análisis de varianza modelo 1: efectos fijos para propagación clonal in vitro de
anturio (Anthurium andreanum) a través de callo ú organogénesis indirecta, 2014

G.L. Varianza esperada

Tratamientos 8σ2 + Στ/n

Productos 6

Variedades 1

testigo 1
Error experimental 40 σ2

Total 53

3.2.2.4 Análisis estadístico

Las variables evaluadas en porcentaje, se normalizarán a arco- seno {P}0.5 previo el análisis
de varianza. Para la prueba de separación de promedios se empleará la técnica de contrastes o
comparaciones entre tratamientos con respecto testigo.

Una Prueba complementaria consistirá en someter los datos a una prueba de independencia
de los tratamientos con las diferentes variables analizadas, empleando la prueba de Chi
cuadrado, con un nivel de significación α = 0.01.

3.2.2.5 Pruebas de separación de promedios

Para cumplir con el segundo objetivo: Determinar cuál de los tratamiento es mejor para
obtener mayor porcentaje de callos de Anthurium andreanum.., 2014.

Los promedios de tratamientos se compararon todos los posibles pares de tratamientos

mediantes la prueba de Tukey para el factor A y la prueba de Dunnett para el factor B, ambas
con un nivel de significancia del 95 % con la siguiente fórmula.

T (α) = q (α; c; gl error) * Sd

Donde:

q = valor de la tabla

29
 α = 95 % (0,05)

c = Número de factores

gl error = grados de libertad del error

Sd = √CM error/N/v

CM error = Cuadrado medio del error

N = Número total de observaciones

v = Número de medias que se están comparando

d (Dunnett) = t (α ; p ; gl error) * Sd

Donde:

t = valor de la tabla de Dunnett

p = número de tratamientos sin considerar al testigo

gl error = grados de libertad del error

Sd = √2 x CM error/r

CM error = Cuadrado medio del error

r = Número de bloques

Además se utilizó el método del Número Índice para otorgar valores porcentuales en la
comparación de clases, pero solo aquellos con significancia estadística.
Especificaciones del diseño:

Unidad experimental 1

Numero de tratamientos 9

Numero de réplicas 5

Número de plantas /tratamientos 45

Número de plantas / ensayo 225

30
 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 INICIO DEL EZBOSO DE FORMACIÓN CÉLULAS

MERISTEMATICASA LOS 45 DIAS

Figura 1 . Inicio de esbozo de callo

Los explantes de Anthurium andreanum, sometidos al proceso de desinfección en cloro y la

inmersión siguiente en emulsiones de mezclas de fungicidas (Betadime, Rydomil, Kasumin,
y Phyton) más Hidróxido de sodio presentaron los primeros indicios de la actividad celular a
los 45 días, cuyos resultados se presentan en el cuadro 1 con el correspondiente ANOVA
(figura 2) para el número de explantes activos por unidad experimental, integrados por cinco
ex plantes de 1 cm, de acuerdo con estos resultados el cuadrado medio para tratamientos fue
altamente significativo; en la prueba de Duncan los rangos de separación de promedios de
tratamientos variaron entre 1.0 a 1.17, en este contexto el mejor tratamiento en esta fase del
proyecto fue el T5 Kasumin+ hidróxido de sodio con un promedio de 3.6 (72%), el mismo
que fue similar estadísticamente con los tratamientos T3. Rydomil+ Phyton Kasumin+
H.sodio, T4. Phyton Kasumin+ hidróxido de sodio, T10 Kasumin. En el testigo con
Hipoclorito de sodio como desinfectante el promedio de esbozos formados a 45 días fue de
2.4 (48%).

31
 El promedio más bajo le correspondió al tratamiento Phyton con 0.6 esbozos/caja, equivalente
al 12%.

INICIO DEL EZBOSO DE FORMACIÓN CÉLULAS

MERISTEMATICASA LOS 45 DIAS
3,6 3,4
4 3,2
3,5 2,4 2,4
3
2,5 1,8 1,6 1,8
2 1,4
1,5 0,6
1
0,5
0

Figura 2 Número de explantes con esbozos de la actividad meristemática.

Gupta (2005) menciona que la formación de un esbozo unipolar a partir de una yema con el
subsecuente desarrollo de este en un brote vegetativo, existiendo siempre una conexión entre
los nuevos brotes y el tejido paterno lo cual se vino a dar entre los tratamientos T5 que es
kasumin + H. de sodio que se obtuvo el más alto porcentaje de esbozos y el T9 Phyton no
pudimos obtener una buena reacción con lo que se corrobora a Castillo (2004) se fundamenta
en el hecho real que los explantes contienen reservas de productos hormonales que se activan
para dar lugar a la formación de esbozos de nuevas plantas.

4.2 CONTAMINACION DE LOS EXPLANTES A LOS 30 DIAS

a b

Figura 3 . a) Explante contaminado y b) caja contaminada a los 30 días

32
En la figura 4 se presenta los valores correspondientes al número de explantes por unidad
experimental que presentaron indicios de contaminación causado por bacterias y el
correspondiente análisis de varianza y prueba de Duncan para los promedios de tratamientos.
Según estos resultados, el cuadrado medio de tratamientos fue significativo al nivel 5%. El
tratamiento T10 Kasumin presento el menor porcentaje de contaminación promediando 0.2
explantes/caja equivalente al 4% en el otro extremo con 1,6 explantes contaminados aparece
el tratamiento T2 betadine- rydomil- phyton- kasumin con 1.6 explantes, correspondiendo al
32%. Entre este intervalo los tratamientos si difieren significativamente.
Para esta variable el promedio general del ensayo fue de 18.4% con un coeficiente de
variación del 6.51%.

EXPLANTES CONTAMINADOS A LOS 30 DIAS

1,6
1,4 1,4
1,6 1,2 1,2
1,4 1
1,2
1
0,8 0,4 0,4 0,4
0,6 0,2
0,4
0,2
0

Figura 4 Número de explantes contaminados a los 30 días.

Salgado (2007) menciona que la contaminación de los explantes se puede presentar en

forma exógena por una inadecuada esterilización del material vegetal o en forma
endógena cuando existen contaminantes sistémicos difíciles de eliminar, las fuentes de
donde proceden los contaminadores son: el explante (tejido), el medio, el aire y el
investigador; siendo la más importante el material vegetal es asi que deduce que la
contaminación que tuvimos en mayor porcentaje se dio por las causas antes mencionadas a lo
que Ruiz 2000 menciona que en el proceso de establecimiento de los explantes de hojas recién
abiertas de plantas sanas y libre de enfermedades, juega un rol importante el sistema de
desinfección y el medio de cultivo potenciado con los componentes como 6-BAP

33
 (Bencilaminopurina ), kinetina el mismo que en el ensayo se demostró complementarse con
los tratamientos desinfectantes de los explantes.

4.3 EMBRIOGENSIS PARCIAL A LOS 45 DIAS

Figura 5 Embriogénesis parcial Primarias 45 días

La embriogénesis somática está ampliamente considerada como la mejor vía de regeneración

que utiliza las técnicas de cultivo de tejidos vegetales en el contexto del ensayo se encontró
significación estadística para tratamientos dado que los tratamientos investigados causaron
efectos significativos en el proceso de la formación de embriones somáticos. En la figura 6 se
visualiza el número de esbozos embrionales; de acuerdo con estos resultados en 12 de las 50
unidades experimentales se reportó varios caso de generación de embriones somáticos, en los
restante, los promedios de tratamientos variaron entre 0.8 en el tratamiento T9 Phyton a 3.0
embriones con el tratamiento desinfectante T5 Kasumin+ hidróxido de sodio.
El promedio general del ensayo fue de 1.5 casos de embriones somáticos por unidad
experimental, con un coeficiente de variación de1 10.65%.

34
 EMBRIOGENSIS PARCIAL A LOS 45 DIAS
3
3
2,5 2
1,8
2 1,6 1,6
1,4
1,5 1,2 1,2
1
0,8
1
0,5
0

Figura 6 Embriogénesis somática parcial en explantes foliares de Anthurium andreanum

a los 45 días

Doran (2009) La aparición natural de tejido calloso se da como consecuencia de un cambio en

los niveles endógenos de reguladores del crecimiento, principalmente auxinas y citocininas
las cuales fueron utilizadas en el medio de cultivo en cantidades adecuadas para un obtener
embriogénesis somática mientras que nos basamos en salgado (2007) que mediante la
aplicación de la técnica de estimulación a la embriogénesis a partir de material vegetal se
evidencio que la probabilidad de inducir la embriogénesis somática empleando segmentos
de hojas jóvenes manipuladas mediante las técnicas de propagación in vitro libre de
contaminación.

4.4 EMBRIOGENESIS SOMATICA SECUNDARIA Y COMPLETA A LOS 62 DIAS

La embriogénesis secundaria y completa de los explantes de hojas jóvenes de Anthurrhium

se visualiza en la figura 8 , en el que se incluyen los promedios y varianza de tratamientos y
del Error experimental. De acuerdo con el análisis no se encontró significancia estadística
para tratamientos, por lo tanto no se puede rechazar la Hipótesis de nulidad y se acepta que la
embriogénesis primaria y secundaria fue homogénea en todo el ensayo y para las dos fases de
evaluación.
La embriogénesis secundaria en el tratamiento vario dentro del rango de 1.0 a 1.6,
correspondiendo los extremos a los tratamientos T6. Hidróxido de sodio y a T5. Kasumin +

35
hidróxido e sodio. El promedio general del ensayo fue de 1.22 con un coeficiente de
variación del 5.11%.
Para la embriogénesis completa el rango de variación fue de 1.0 a 1.8 correspondiendo los
valores extremos a los tratamientos T2, T8 y T5. Kasumin + hidróxido de sodio, rango dentro
de cual los promedios no difieren significativamente. En esta caso el promedio general de
ensayo fue de 1.33 por unidad experimental con un coeficiente de variación del 4.34%.

Figura 7 Embriogénesis Somática Secundaria

EMBRIOGÉNESIS PARCIAL Y COMPLETA A LOS 62

DÍAS
1,8
2 1,6 1,6
1,4 1,4 1,4
1,5 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2
1 1 1 1
1
0,5
0

secundaria completa

Figura 8 Embriogénesis somática parcial y completa en explantes foliares de Anthurium

andreanum a los 62 días.

36
 Gupta (2005) La embriogénesis somática como sistema de propagación de plantas presenta
una serie de ventajas frente a otros sistemas: Una enorme capacidad de multiplicación
aplicable industrialmente, permite obtener en un solo proceso estructuras completas con ápice
y raíz, que pueden ser almacenadas y encapsuladas perfectamente lo cual hace referencia a los
resultados obtenidos a los 62 días con la embriogénesis secundaria parcial y completa que no
tuvieron mucha significancia al obtener resultados casi similares.

4.5 TAMAÑO DEL CALLO A 52 Y 62 DIAS

a b

Figura 9 Tamaño del callo a los 52 y 62 días

En la figura 10 se presenta los valores promedios del tamaño de los callos en evaluaciones
realizadas a los 52 y 62 días de iniciado el estudio. De acuerdo con estos resultados, los
cuadrados medios para tratamientos fueron significativos, en este contexto se estima que los
tratamientos investigados están relacionados con el crecimiento en longitud de los callos.
A los 52 días el tamaño de los callos vario dentro de 0.02 a 0.26 mm correspondiendo los
valores extremos a los tratamientos T9 Phyton y a T5Kasumin + hidróxido de sodio. El
promedio general fue de 0.126 mm con un coeficiente de variación del 3.94%

A los 60 días, crecieron para alcanzar un techo de 0.38 cm en dos tratamientos T2. betadine-
ridom-phit-kasum + hidróxido de sodio y en T5. Kasumin + H. SODIO.

37
 TAMAÑO DEL CALLO A LOS 52 Y 62 DIAS
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05 52 dias
0
60 dias

Figura 10 Se grafica los promedios de los tratamientos para las dos etapas de
evaluación.

Doran (2009) Se puede definir el callo en cultivo de tejidos como un tejido obtenido por
medio del aislamiento de órganos o tejidos diferenciados, los cuales posteriormente son
llevados a una diferenciación celular, presentando estas células una proliferación continua,
acelerada y de apariencia desorganizada, que da origen a una masa amorfa de tejido es así
originando diferenciación de tamaños de callos durante el experimento que se pudo observar.

4.6 COLORACION DE LOS CALLOS ACTIVOS

La coloración de los callos variaron entre verde claro a verde oscuro (figura 12), las
frecuencias del color adoptado por los callos en los diez tratamientos se presentan en la figura
11.

a b c

Figura 11 Callos con colores a)verde claro, b)café verdoso y c) verde oscuro

38
 FRECUENCIA DE CALLOS CON COLORES VERDE
CLARO, CAFÉ VERDOSO Y VERDE OSCURO
5
5
4
3 2 2 2 22 2 2
2 1 11 1 1 1 1
1 00 0 00 0 00 0 0 0 0 0 00
0

verde-claro café-verdoso verde oscuro

Figura 12 Frecuencia de callos por colores.

Del análisis de los resultados del color del callo en el experimento de acuerdo a Doran (2009)
la coloración de este tejido también varía, aun derivando de la misma especie (se pueden
presentar callos que carecen de pigmentación, mientras otros pueden ser de diferentes tonos
de verde, amarillo, café o rojo). El tipo y grado de pigmentación está influenciado por factores
nutricionales y ambientales, y se manifiesta por la presencia de clorofila, carotenos,
antocianinas, el cual nos da unos resultados similares el cual nos sirvió para elaborar una tabla
cualitativa sobre los colorares que mas sobresaltaron.

39
 5. CONCLUSIÓN

 Los explantes de hojas jóvenes libre procedentes de pantas madres de buen desarrollo
vegetativo y libre de virus y enfermedades constituyó un método idóneo para el
desarrollo de la embriogénesis punto de partida para la regeneración de Anthurium
andreanum Lind
 Los tratamientos desinfectantes los productos Kasumin solo fue el más efectivo en el
control de la contaminación del medio de cultivo in vitro de los explantes de
Anthurium.
 De los fungicidas seleccionados para el control de la contaminación del medio de
cultivo de explantes de Anthurium el Phyton solo fue significativamente similar que
las mezclas de Kasumin-Hidróxido de sodio y Rydomil- hidróxido de sodio.
 Los explantes que quedaron libre de contaminación nos dieron como resultados unos
callos de mediana altura.

40
 6. RESUMEN

En el laboratorio de biotecnología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad

Técnica de Machala, se realizó la investigación relativa a la multiplicación in vitro de
Anthurrium andraeanum Lind a partir de explantes de hojas desinfectados con mezclas de
fungicidas orgánicos que conduzcan a reducir los problemas de contaminación causada por
hongos y bacterias.

Los objetivos planteados fueron

1 .Obtener la inducción de la embriogénesis somática en Anthurium andreanum.

2. Determinar cuál de los tratamiento es mejor para obtener mayor porcentaje de callos
embriogénicos de Anthurium andreanum.

En el estudio se empleó hojas de anturio, fungicidas, Betadine, Rydomil, Phyton, Kasumin y

desinfectantes, Hipoclorito de sodio, Hidróxido de sodio, Frascos de vidrio estufa, balanza,
vasos de precipitación 50 ml, refrigeradora, cámara de flujo laminar autoclave, tarrinas
plásticas de 25 onza, tiras de desinfección, etiquetas. Los tratamientos fueron, T1 Testigo
solución hipoclorito de sodio , T2 Betadine + Rydomil + phyton + kasumin + hidróxido de
sodio, T3 Solución rydomil + phyton +kasumin + hidróxido de sodio, T4 Solución phyton
+kasumin + hidróxido de sodio, T5. Solución kasumin+ hidróxido de sodio, T6. Hidróxido de
sodio, T7.Betadine. T8. Rydomil, T9. Phyton y T10. Kasumin.

Las variables estudiadas, porcentaje de contaminación a los 30 días, embriogénesis somática

parcial y completa a los 45 días, y 62 días y embriogénesis somatica secundarias a los 62 dias,
tamaño de los callos, color de los callos. Para la elección de explantes se empleó hojas
jóvenes con aproximadamente el 50 a 70% del tamaño normal de la variedad “Sonata a
lavadas con agua y jabón líquido limpiando el limbo suavemente con una esponja para
eliminar polvo e impurezas, posterior a esto se las coloca en abundante agua corriente para
quitar residuos de jabón. Luego se trasladó el material a la cámara de flujo laminar se
sumergió la solución de cloro agitando suavemente; en esta fase se evaluara nueve
tratamientos de desinfección, , para una vez desinfectadas las hojas, cortarlas en

41
segmentos de aproximadamente 1 cm2 y finalmente introducirlas en medio de cultivo in
vitro. De los análisis de varianza se evidencio que los tratamientos desinfectantes, los mejores
resultados en la protección del medio de cultivo in vitro y de los explantes fueron Kasumin
solo y Rydomil- hidróxido de sodio variable en la cual se obtuvo alta significancia
estadística. Los explantes de hojas jóvenes libre procedentes de pantas madres de buen
desarrollo vegetativo y libre de virus y enfermedades constituyó un método idóneo para el
desarrollo de la embriogénesis punto de partida para la regeneración de Anthurium
andreanum Lind; De los fungicidas seleccionados para el control de la contaminación del
medio de cultivo de explantes de Anthurium el Phyton solo fue significativamente similar
que las mezclas de Phyton-Kasumin- Hidróxido de sodio y Rydomil- hidróxido de sodio. En
ellos eventos correspondientes a la formación de embriones somáticos no se obtuvo
diferencias significativas entre tratamientos, al no haberse obtenido significación estadística
para tratamientos.

Palabras Claves: embriogénesis, callo, contaminación, fungicidas

42
 7. SUMMARY

In the biotechnology laboratory of the Faculty of Facultad de Ciencias Agropecuarias de la

Universidad Técnica de Machala, research on the in vitro multiplication of Anthurrium
andraeanum Lind from explants disinfected with mixtures of organic fungicides leaves
leading to reduce problems was performed pollution caused by fungi and bacteria.
The objectives were:
1. Obtain the induction of somatic embryogenesis in Anthurium andreanum.

2. Determine which treatment is best for highest percentage of embryogenic callus of

Anthurium andreanum.
The study leaves of anthurium, fungicides, Betadine, Rydomil, Phyton, Kasumin and
disinfectants, sodium hypochlorite, sodium hidróxido, used glass bottles Stove, Balance,
Beakers 50 ML, Fridge laminar flow chamber Autoclave, 25 ounce plastic tubs, disinfection
Strips, Tags.
The treatments were, T1. Solution sodium hydroxide Ridomil + Witness sodium hypochlorite
solution, T2. Betadine Solution rydomil + + + Python + Kasumin sodium hydroxide, T3.
Solution Kasumin + + Python + sodium hydroxide solution phyton + T4 + Kasumin sodium
hydroxide, T5. Kasumin + sodium hydroxide, T6. Sodium hydroxide T7.Betadine. T8.
Rydomil, T9. Phyton and T10. Kasumin.
The studied variables, Percentage of contamination at 30 days, 45 days somatic
embryogenesis, and 62 days, callus size, color of the callus. For the choice of explants young
leaves with about 50 was used at 70% of normal size range "Sonata washed with liquid soap
and water cleaning limbo gently with a sponge to remove dust and impurities, after this is the
place in running water to remove soap residue. The material is then moved to the laminar flow
chamber clarines solution was immersed gently shaking; in this phase disinfection nine
treatments evaluated, for once disinfected leaves, cut into segments of about 1 cm 2 and
finally introduce in vitro culture medium. From the analysis of variance was evident that
disinfectants treatments, the best results in the protection of the in vitro culture of explants
and I were alone and Rydomil Kasumin variable sodium hydroxide in which high statistical
significance was obtained. Explants from young leaves free mother plants of good vegetative
and free development of virus and disease was a suitable method for the development of
embryogenesis starting point for the regeneration of Anthurium andreanum Lind; elected for

43
the control of contamination of the culture medium of the explant Phyton fungicides
anthurium was significantly similar to one mixtures Kasumin Phyton-sodium-hydroxide-
sodium hydroxide Rydomil. They correspond to the formation of somatic embryos events no
significant difference between treatments was obtained in the absence of statistical
significance obtained for treatments.
Keywords: organogenesis , callus, contamination, fungicide

44
 8. BIBLIOGRAFÍA CITADA

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47
APÈNDICE

48
 Figura 13 Cámara de flujo y los tratamientos utilizados.

Figura 14 Día de la siembra de los explantes de Anthurium andreanum

a b

Figura 15 Explantes sembrados a)T0 y b) T2

49
 Cuadro 5 Número de explantes con presencia de esbozos en proceso de formación

TRATAMIENTOS R1 R2 R3 R4 R5 TOTAL MEDIA

T1. Hipoclorito de sodio 2 1 3 3 3 12 2,4 ab
T2. Betadine-Rydomil-Phyton-
Kasumin-H de Na 1 2 0 2 2 7 1,4 C
T3. Rydomil-Phyton-Kasumin-H
de Na 3 3 3 2 1 12 2,4 ab
T4 Phyton-Kasumin-H de Na 4 3 3 4 2 16 3,2 ab
T5 Kasumin-H de Na 4 4 4 3 3 18 3,6 A
T6. Hidróxido de sodio 3 2 2 1 1 9 1,8 C
T7. Betadine 2 1 2 1 2 8 1,6 cd
T8 Rydomil 2 2 2 2 1 9 1,8 C
T9. Phyton 1 1 1 0 0 3 0,6 D
T10. Kasumin 5 3 4 3 2 17 3,4 ab
111 3

Cuadro 6 Análisis de varianza para el número de explantes con esbozos a los 45 días

FUENTES DE VARIACION G.L SC CM FC F0.05 F0.01

TRATAMIENTOS 9 41.78 4.64222 7.48** 2,08 2.8
ERROR EXPERIMENTAL 40 24.8 0.62
TOTAL 49 66.58 1.35878
Rangos de Duncan 1.0 – 1.17 CV(%) 5.28469

Cuadro 7 Número de explantes contaminados por unidad experimental a los 30 días

TRATAMIENTOS R1 R2 R3 R4 R5 TOTAL MEDIA

T1. Hipoclorito de sodio 2 2 1 1 1 7 1,4 b
T2. Betadine-Rydomil-Phyton-
Kasumin-H de Na 2 1 2 1 2 8 1,6 b
T3. Rydomil-Phyton-Kasumin-H de
Na 1 1 3 1 1 7 1,4 b
T4 Phyton-Kasumin-H de Na 0 1 1 0 0 2 0,4 a
T5 Kasumin-H de Na 0 0 2 0 0 2 0,4 a
T6. Hidróxido de sodio 1 1 2 1 1 6 1,2 b
T7. Betadine 1 1 2 1 1 6 1,2 b
T8 Rydomil 1 2 0 1 1 5 1 ab
T9. Phyton 1 0 1 0 0 2 0,4 a
T10. Kasumin 0 0 1 0 0 1 0,2 a
46 0,5

50
Cuadro 8 Análisis de varianza para el número de explantes contaminados.

FUENTES DE VARIACION G.L SC CM FC F0.05 F0.01

TRATAMIENTOS 9 12.08 1.34222 3.44* 2,08 2.8
ERROR EXPERIMENTAL 40 15.6 0.39
TOTAL 49 27.68 0.5649
Rangos de Duncan : 0.79 –
0.93 CV(%) 6.51086

Cuadro 9. Número de explantes con procesos de embriogénesis

TRATAMIENTOS R1 R2 R3 R4 R5 TOTAL MEDIA

T1. Hipoclorito de sodio 2 1 3 1 1 8 1,6 ns
T2. Betadine-Rydomil-Phyton-
Kasumin-H de Na 3 2 0 0 0 5 1 ns
T3. Rydomil-Phyton-Kasumin-H de
Na 2 3 3 1 1 10 2 ns
T4 Phyton-Kasumin-H de Na 2 3 3 0 0 8 1,6 ns
T5 Kasumin-H de Na 5 4 4 1 1 15 3 ns
T6. Hidróxido de sodio 2 2 2 0 0 6 1,2 ns
T7. Betadine 3 1 2 0 0 6 1,2 ns
T8 Rydomil 1 2 2 1 1 7 1,4 ns
T9. Phyton 2 1 1 0 0 4 0,8 ns
T10. Kasumin 0 4 4 0 1 9 1,8 ns
78 1,5

Cuadro 10 Análisis de varianza para el número de explantes con procesos de

embriogénesis

FUENTES DE VARIACION G.L SC CM FC F0.05 F0.01

TRATAMIENTOS 9 17.52 1.9467 1.09 ns 2,08 2.8
ERROR EXPERIMENTAL 40 70.8 1.77
TOTAL 49 88.32 1.8024
Rangos de Duncan: 1.69- 1.96 CV(%) 10.65%

51
Cuadro 11 Embriogénesis parcial y completa a los 62 días

TRATAMIENTOS secundaria Completa

T1. Hipoclorito de sodio 1,2 1,2
T2. Betadine-Rydomil-Phyton-Kasumin-H
de Na 1,2 1
T3. Rydomil-Phyton-Kasumin-H de Na 1,2 1,2
T4 Phyton-Kasumin-H de Na 1,2 1,4
T5 Kasumin-H de Na 1,6 1,8
T6. Hidróxido de sodio 1 1,2
T7. Betadine 1,2 1,2
T8 Rydomil 1 1
T9. Phyton 1,2 1,4
T10. Kasumin 1,4 1,6
promedio general 1,22 1,3
varianza de tratamientos 0,32 0,15
Varianza del error 0,34 0,23
coeficiente de variación 5,11 4,34
Rangos de Duncan P<0.05 0.72 -0.82 0.61 - 0.72

Cuadro 12 Tamaño del callo en los explantes de anthurium andreanum a los 52 y 62 días

TRATAMIENTOS 52 días 62 días

T1. Hipoclorito de sodio 0,1 0,18
T2. Betadine-Rydomil-Phyton-Kasumin-H de
Na 0,24 0,38
T3. Rydomil-Phyton-Kasumin-H de Na 0,06 0,14
T4 Phyton-Kasumin-H de Na 0,2 0,12
T5 Kasumin-H de Na 0,26 0,38
T6. Hidróxido de sodio 0,1 0,14
T7. Betadine 0,06 0,26
T8 Rydomil 0,1 0,18
T9. Phyton 0,02 0,06
T10. Kasumin 0,12 0,12
promedio general 0,126 0,196
varianza de tratamientos 0,03246667 0,06036
varianza del error 0,0196 0,0479
coeficiente de variación 3,94% 4,94%
0.28-
Rangos de Duncan P< 0.05 0.18-0.20 0.32

52
Cuadro 13 Frecuencia de callos con colores verde claro, café verdoso y verde oscuro

café-
TRATAMIENTOS verde-claro verde oscuro
verdoso
T1. Hipoclorito de sodio 2 0 0
T2. Betadine-Rydomil-Phyton-Kasumin-
2 0 1
H de Na
T3. Rydomil-Phyton-Kasumin-H de Na 2 0 0
T4 Phyton-Kasumin-H de Na 1 1 0
T5 Kasumin-H de Na 5 0 0
T6. Hidróxido de sodio 1 0 1
T7. Betadine 2 2 0
T8 Rydomil 2 0 1
T9. Phyton 0 1 0
T10. Kasumin 2 0 0
total colores 19 4 3

53