Prácticas Glucosa God

Práctica: DETERMINACIÓN DE LA GLUCOSA EN PLASMA
“MÉTODO DE LA GLUCOSA OXIDASA” TRINDER
FUNDAMENTO
La glucosa oxidasa (GOD) es un enzima que cataliza la oxidación de glucosa a

ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno que se produce en la reacción se puede
detectar mediante un aceptor cromogénico de oxígeno (fenol-ampirona) en presencia del
enzima peroxidasa (POD):
GOD
Β-D-Glucosa + O2 + H2O Ácido glucónico + H 2O2
POD
H2O2 + Fenol + Ampirona Quinona + H 2O
La quinona formada adquiere una coloración rosada, en función de la intensidad

de coloración medida se determinará la concentración de glucosa ya que la intensidad
de coloración es directamente proporcional a la concentración de glucosa presente en la
muestra analizada.
MATERIAL NECESARIO
 Pipetas automáticas de 1000 μl y de 10 μl.

 Puntas de pipeta automáticas apropiadas para el modelo empleado.
 Cubetas espectrofotométricas.
 Espectrofotómetro.
 Una gradilla.
 Reactivos:
- Agua destilada.
- R1 Tampón:
 TRIS pH 7,4…………………92 mmol/l
 Fenol………………………...0,3 mmol/l
- R2 Enzimas:
 Glucosa oxidasa (GOD)………15000 U/l
 Peroxidasa (POD)………………1000 U/l
 4-Aminofenazona (4-AF)…….2,6 mmol/l
- Glucosa cal, patrón primario acuoso de glucosa 100 mg/dl.
1
 Muestra:
- Suero normal.
 ……. – …… mg/dl siendo el valor exacto de ……… mg/dl.
- Suero patológico.
 ……. – …… mg/dl siendo el valor exacto de ……… mg/dl.
OBJETIVOS
Los objetivos de la práctica son los de determinar la concentración de glucosa en

una muestra de suero normal y en una muestra de suero patológico, para lo cual
emplearemos las técnicas espectrofotométricas.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
En primer lugar habrá que reconstituir los reactivos que se van a utilizar en la
práctica ya que para una mayor conservación éstos se presentan liofilizados en sus
correspondientes envases, tras la reconstitución de los reactivos, se les anotará la fecha
de reconstitución en el envase y se conservarán en el congelador para una mayor
duración de dichos reactivos.
Para la reconstitución del reactivo de trabajo (RT) se ha de disolver el contenido

de un vial de R2 Enzimas en un frasco de R1 Tampón. Tras esto se agita levemente
para no crear espuma, se vuelve a depositar un poco de la mezcla en el vial R2 para
apurar los restos de reactivo R2, repetiremos esta operación unas tres o cuatro veces.
Finalmente tapamos y mezclamos muy suavemente para crear la menor espuma posible
que podría influir de manera negativa a la hora de la toma de volúmenes con las pipetas
automáticas cargando burbujas de aire en lugar de reactivo de trabajo.
Para la reconstitución del suero patológico como la del suero normal, bastará con
añadir 5 ml de agua destilada, como se muestra en la etiqueta de cada uno de estos
reactivos, una vez añadida el agua destilada se agita muy suavemente el vial para, al
igual que antes, no crear espuma.
Por último el suero estándar se reconstituirá de la misma manera añadiéndole la

cantidad de agua destilada indicada en el vial.
2
Una vez reconstituidos todos los reactivos se procede a preparar una batería de
análisis, para ello se prepararán cuatro diluciones diferentes según muestra el cuadro
esquemático:
Blanco Estándar Muestra Normal Muestra Patológica

Reactivo de trabajo (ml) 1 1 1 1
Muestra estándar (μl) ----- 10 ----- ---------
Muestra normal (μl) ----- ----- 10 ---------
Muestra patológica (μl) ----- ----- ----- 10
Dichas diluciones, dado que suponen volúmenes muy pequeños, se prepararán

directamente en las cubetas espectrofotométricas, una vez preparadas se mezclan y se
dejan reposar 30 minutos a temperatura ambiente (15 – 20º C) o se incuban 10 minutos
a 37º C, con la finalidad de que se produzca la reacción química indicada en el
fundamento.
Mientras que se lleva a cabo la reacción procederemos a conocer el manejo de

un nuevo autoanalizador a manejar, el cual estaba encendido previamente para que se
fuera calentando.
Este nuevo instrumento es el autoanalizador de bioquímica: Clima RAL. Este

modelo incluye un peltier que consiste en una placa calefactora que produce calor por
medio de una diferencia de potencial eléctrico y que es capaz de incubar diez muestras.
3
A la hora de realizar el análisis deseado, éste ha de ser programado en el
autoanalizador, para realizar esta programación han de conocerse una serie de
parámetros relacionados con el método analítico que se esta llevando a cabo, en este
caso, las condiciones de ensayo que se habrán de tener en cuenta son las siguientes:
o Tipo de analito  Glucosa

o Longitud de onda  505 nm.
o Unidades  mg/dl
o Temperatura  37º C
o Concentración del estándar de Glucosa  100 mg/dl
o Límite de linealidad  500 mg/dl
o Volumen de muestra empleado  10 l
o Volumen de reactivo empleado  1000 l
Una vez se tienen en cuenta todas estas condiciones de experimentación se

procede a la programación del autoanalizador, Para ello se habrán de realizar los pasos
recogidos en el protocolo (ver documento)
CALCULOS
A la hora de realizar los cálculos deberemos tener en cuenta la siguiente

expresión matemática:
(Amuestra/ Apatrón) x c patrón = c muestra

(mg/dl)
Escribe y desarrolla las ecuaciones matemáticas de las que se ha partido,

aplicando la Ley de Lambert Beer, para llegar a esta formula simplificada a partir de
la cual vas a obtener la concentración de la glucosa con los datos de la práctica.
4
Por otra parte, el resultado de la concentración mediante el autoanalizador de
bioquímica se obtiene de forma directa.
En el autoanalizador de bioquímica el resultado lo obtendremos directamente mientras

que en el resto de los espectrofotómetros mediremos la absorbancia y posteriormente
habrá de calcularse la concentración de glucosa presente en cada muestra.
Clima RAL
Heλios α Heλios δ v4.60
5
COMENTARIO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
¿Los resultados obtenidos son coherentes?. En caso negativo indica las medidas
correctoras que aplicarías.
………………………………………………….
6
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La glucosa oxidasa (GOD) es un enzima que cataliza la oxidación de glucosa a

La quinona formada adquiere una coloración rosada, en función de la intensidad

 Pipetas automáticas de 1000 μl y de 10 μl.

Los objetivos de la práctica son los de determinar la concentración de glucosa en

Para la reconstitución del reactivo de trabajo (RT) se ha de disolver el contenido

Por último el suero estándar se reconstituirá de la misma manera añadiéndole la

Blanco Estándar Muestra Normal Muestra Patológica

Dichas diluciones, dado que suponen volúmenes muy pequeños, se prepararán

Mientras que se lleva a cabo la reacción procederemos a conocer el manejo de

Este nuevo instrumento es el autoanalizador de bioquímica: Clima RAL. Este

o Tipo de analito  Glucosa

Una vez se tienen en cuenta todas estas condiciones de experimentación se

A la hora de realizar los cálculos deberemos tener en cuenta la siguiente

(Amuestra/ Apatrón) x c patrón = c muestra

Escribe y desarrolla las ecuaciones matemáticas de las que se ha partido,

En el autoanalizador de bioquímica el resultado lo obtendremos directamente mientras

Heλios α Heλios δ v4.60

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