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    Apuntes Solemne 2 BioMol

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    La transcripción en procariotas es llevada a cabo por la ARN polimerasa, la cual sintetiza los diferentes tipos de ARN. Está compuesta por una subunidad alfa, beta y una core de 5 subunidades esenciales. Requiere del factor sigma para reconocer regiones promotoras específicas en el ADN y dar inicio a la transcripción. En eucariotas existen 3 ARN polimerasas que reconocen promotores de clases diferentes. La transcripción requiere de factores generales de transcripción que se unen secuencialmente

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    La transcripción en procariotas es llevada a cabo por la ARN polimerasa, la cual sintetiza los diferentes tipos de ARN. Está compuesta por una subunidad alfa, beta y una core de 5 subunidades esenciales. Requiere del factor sigma para reconocer regiones promotoras específicas en el ADN y dar inicio a la transcripción. En eucariotas existen 3 ARN polimerasas que reconocen promotores de clases diferentes. La transcripción requiere de factores generales de transcripción que se unen secuencialmente

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    La transcripción en procariotas es llevada a cabo por la ARN polimerasa, la cual sintetiza los diferentes tipos de ARN. Está compuesta por una subunidad alfa, beta y una core de 5 subunidades esenciales. Requiere del factor sigma para reconocer regiones promotoras específicas en el ADN y dar inicio a la transcripción. En eucariotas existen 3 ARN polimerasas que reconocen promotores de clases diferentes. La transcripción requiere de factores generales de transcripción que se unen secuencialmente

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    La transcripción en procariotas es llevada a cabo por la ARN polimerasa, la cual sintetiza los diferentes tipos de ARN. Está compuesta por una subunidad alfa, beta y una core de 5 subunidades esenciales. Requiere del factor sigma para reconocer regiones promotoras específicas en el ADN y dar inicio a la transcripción. En eucariotas existen 3 ARN polimerasas que reconocen promotores de clases diferentes. La transcripción requiere de factores generales de transcripción que se unen secuencialmente

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    TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIONTES

    ¿Quién realiza la transcripción? RNA pol


    ¿Cómo es posible el proceso? RNA pol crea un canal para que la hebra codificante no
    moleste en el proceso
    RNA pol
    ● Sintetiza para todos los tipos de RNA celulares (mRNA, tRNA,rRNA)
    ● Solo la primasa puede hacer mas RNA
    ● Core= 5 subunidades
    ● Subunidad alfa y beta son esenciales
    Tener en cuenta que:
    SIGMA + CORE RNA pol = Holoenzima

    Importancia CORE?
    Puede unirse con baja afinidad a cualquier región del ADN, o sea, regiones que no sean
    promotoras
    Importancia SIGMA?
    Le dice que es o no es promotor al CORE, o sea, le da ESPECIFICIDAD.
    Fundamental: Los primeros contactos que se generan entre la holoenzima y el ADN es por
    la SIGMA, es la primera en unirse

    Inicio transcripción: Desde el +1 comienza y existen regiones de números negativos que se


    unen con SIGMA, llamados, TATAAT, extendida -10, -35 TTGACA.

    *Detalle: RNA pol no necesita partidor

    Existen 3 SIGMAs
    ● SIGMA 2: Que se une a la región -10
    ● SIGMA 4: Que se une a la región -35
    ● SIGMA 3: Se une a la posible región -10 extendida

    Proceso: Inicio de la transcripción


    1. Reconoce la existencia o no del promotor
    2. SIGMA hace contacto con el ADN
    3. Se abre el ADN
    4. Lo posiciona en los lugares específicos del sitio catalítico de RNA pol
    5. Luego SIGMA se va para comenzar la transcripción

    ¿Cómo se puede determinar si existe unión de proteínas al ADN y la región a la que se está
    uniendo?
    Dos métodos
    EMSA: (electromobility shift assay)
    -Estudia el cambio de la electromovilidad
    -Se marca radiactivamente
    -¿Qué hace? Al unirse una proteínas al ADN o ARN marcado hace que se mueva más lento
    en el gel por el peso.
    -Demuestra que la proteína si es capaz de unirse a regiones de ADN o ARN.
    -Con este método se puede saber cuánto (%) ADN se unió, por la intensidad de las bandas,
    esto a través de un programa.

    DNAse I Footprinting
    -¿Qué hace? Indica donde se une.
    -¿Como? Huellas que deja la proteína sobre el ADN, también es capaz de visualizarse a
    través de un gel.

    *La Transcripción comienza en un promotor y termina en un terminador.


    Ciclo de la transcripción.
    Iniciación:
    ● Reconocimiento del promotor: Unión de la holoenzima gracias a que SIGMA
    reconoce las regiones -10 (ς2) y -35 (ς4).
    ● Isomerización: SIGMA 2 abre el ADN (forma una burbuja) en la región -10, esto
    provoca que se contorsione el ADN.

    *Elemento UP: Región que puede interactuar con el dominio Alfa C-terminal de la
    holoenzima.
    ¿Que haces UP? Tendrá mayor expresión la regulación ya que este es un elemento
    regulador.

    Transcripción abortiva y escape de RNA pol


    -El RNA que se está sintetizando choca con la región SIGMA 3 y así se crea la transcripción
    abortiva ( menor a 9 nucleótidos de ADN), lo hace repetidamente…
    Hasta que choca y logra desplazar a SIGMA 3, esta es la señal llamada “Escape del
    promotor”
    Esto da paso a la elongación.

    *Factor Anti-SIGMA
    ¿Qué es? Una proteína que compite contra la RNA pol por unirse a SIGMA
    ¿Qué hace? Secuestra a SIGMA y ahora no se puede sintetizar RNA
    Dato: Se trata de parecer al ADN

    *Complejo de elongación de transcripción (TEC)


    -Tiene un canal específico para que entren los nucleótidos
    -Tiene una velocidad de 30-100 nucleótidos/s pero es capaz de pausar (freno de mano)
    ↳¿y qué pasa? Queda una región de RNA atrapado en el canal secundario

    Término de la transcripción
    -Existen dos mecanismos para eso: Para ambos el RNA sintetizado participa en el proceso.
    ↳Independiente de factores (Rho-independiente)
    ↳Dependiente de factores (Rho-dependiente)
    Rho-Independiente
    -Al final se encuentra el “invertido repetido” (rico en GC) y rico en A`s (que se convierte de
    poli A a Poli U
    ↳¿que genera esto? Una horquilla muy fuerte, que es la horquilla de terminación, ya que
    este tiene la capacidad de complementariedad de bases
    ↳¿como ocurre? Cuando se transcribe el Poli U es la “Señal de pausa”, por lo que se pausa
    el RNA pol y le da tiempo para hacer la horquilla.

    Rho-Dependiente
    →Rho genera el término de la transcripción solo si no se está traduciendo ya un RNA.
    →Forma un hexámero (anillo) alrededor de ADN
    →Rho es una ATPasa dependiente de RNA
    →También es una RNA-DNA helicasa (separa híbridos de RNA y DNA)
    →Se une al RNA en sitios rut (rho utilization)

    ¿Qué se necesita para que ocurra?


    ↳Se transcribe rut para que se una Rho y luego avanza a una alta velocidad para alcanzar a
    RNA pol.
    ↳Pero como es imposible que alcance la misma velocidad, existe la señal de pausa para la
    RNA pol para darle tiempo a Rho de llegar.
    ↳Y así se separa RNA del DNA por su actividad de helicasa híbrido.

    Regulación de la Expresión Génica

    Represor→ Genera una regulación negativa, evita la transcripción ya que por qué en off el
    promotor
    Regulación negativa→ El activador que interacciona con RNA pol crea una mayor actividad
    y transcribir el RNAm (duda)
    *Operon= Unidad policistronica (1 molécula de RNA que traduce más de una proteína)
    *Proteínas regulatorias=Activadores o represores
    ↳Sitio operador (represor) y sitio activador

    *Modulación de la actividad de proteínas regulatorias


    ↳Unión a pequeñas moléculas (inductores y correpresores)
    ↳Modificaciones post-traduccionales
    ↳Interacción con proteínas o RNA

    Sistema de regulación Transcripcional


    *Moléculas efectoras
    ● Corepresor
    ○ Si se une al represor, aumenta la expresión génica
    ○ Si se una al activador, inactiva la expresión génica
    ● Inductor
    ○ Si se une al activador, activa la expresión génica
    ○ Si se una al represor, inactiva e induce la expresión génica
    *Cuando no hay glucosa en el medio de E.coli puede usar lactosa para producirla

    ➔ ¿Cómo se explica esto?


    ◆ El gen LacZ codifica (transcribe) para β-galactosidasa que cataliza la
    hidrólisis de la lactosa en glucosa más galactosa
    ◆ El gen LacY codifica para la galactósido permeasa que transporta
    β-galactósidos al interior de la célula bacteriana
    ◆ El gen LacA codifica para la tiogalactósido transacetilasa, este gen no esta
    relacionado con el metabolismo de la lactosa.

    ↳En ausencia de lactosa, todo ocurre en el operón Lac


    ➔ Gen regulatorio
    ◆ Represor
    ● LacI
    ○ Este se une al operador y bloquea la transcripción

    *Tener en cuenta = Cuando no hay lactosa el operón siempre está inactivo por que el
    represor siempre está unido en ausencia de lactosa

    ¿Qué pasa si hay lactosa? → Inductor = Alolactosa


    Este se une a LacI e inactiva al represor y así puede ocurrir la transcripción.
    ↳¿Como se activa? Cuando hay lactosa en el medio

    *¿Seria eficiente mantener la expresión del operón Lac si la bacteria podría utilizar glucosa
    inmediatamente?
    Respuesta= NO, se necesita una forma de detectar glucosa
    ↳¿Cómo se detecta glucosa?
    ↳En la bacteria hay una enzima llamada “Adenilato Ciclasa” que con mucha
    glucosa produce poco cAMP y con baja glucosa produce mucho cAMP
    ¿Para qué sirve esto? → CAP → Proteína que se une a cAMP para activar la transcripción.

    Operon triptofano (TRP)


    ↳¿Que es? Correpresor
    ● Este tiene 2 capas de regulación:
    ○ 1ra. 1 gen regulatorio represor y al unirse al triptofano se reprime la
    transcripción, ya que ya HAY triptófano.
    ○ 2da. Se crea un ADN más pequeño y ocurre cuando hay mucho triptófano, ya
    que avanza igual el RNA pol por lo cual ocurre un freno/corte

    *Existe una región llamada “Líder” que está entre el operador y el primer gen del operón que
    es parte de RNAm pero no codifica ningún gen.
    TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIONTES

    En eucariontes hay 3 RNA pol


    ➔ Pol I = 14 subunidades
    ➔ Pol II = 12 subunidades
    ➔ Pol III = 17 subunidades

    Promotes clase I → Promotores reconocidos por Pol I


    → No son bien conservados en secuencias pero si en estructura
    → Poseen una secuencia conservada, iniciador rico en AT (rINR)

    ❇Elemento CORE = Localizado en el sitio de inicio de la transcripción (-45 a +20)


    ❇Upstream Control Element (UCE) = Localizado entre -156 y -107, el espaciamiento es
    muy importante y este es necesario para una óptima transcripción.

    Promotor clase II → Genes con promotores internos


    → Está dentro del gen
    → Si hay deleción de la totalidad de la regio 5` NO tiene efecto en la
    transcripción
    → Deleción más allá del +50 destruye la función del promotor

    Ejemplos
    ● 5S rRNA: Tiene dos promotores, caja A y B, donde hay un elemento intermedio.
    ● tRNA o vaRNA: Tiene dos promotores, caja A y B, pero distanciados por un espacio.

    Promotores de RNA pol II


    ● El core
    ○ Inr (+1) = Región iniciadora, se abre la doble hélice.
    ○ TATA (-25)
    ○ BRE = Elementos de unión a proteínas

    Factores de transcripción general (GTFs)


    ❖ Factores generales de inicio de transcripción (GTIFs)
    ➢ Proteínas requeridas para la transcripción específicas de un promotor.
    ➢ Requerido por la RNA pol para unirse fuerte y específicamente a promotores.
    ➢ GITFs para la RNA pol II son denotados como TFIIx, donde x = A, B, D,....

    ❇Modelo de unión secuencial de ensamblaje del


    [complejo de preiniciación] PIC.
    ➔ TBP = TATA Banding Protein
    ➔ TFIID contiene a TBP
    ◆ 1er factor que reconoce a los promotores clase II.
    ➔ Luego se recluta la IIA, luego IIB y después IIF
    ➔ IIF es el factor que atrae/recluta a la RNA pol II hacia el promotor
    ❇Todo esto NO significa que se está transcribiendo, sólo está posicionado, que a localizado
    el promotor, pero no esta licenciado para transcribir → FALTA ACTIVARSE
    ● TBP
    ○ Reconoce la caja TATA
    ○ Dobla el DNA en 90° y fuerza la apertura del surco menor
    ○ No actúa sola, es parte de TFIID → También contiene TAF
    ● TAF2 → Reconoce el activador
    ● TAF9 y 6 → Reconoce DPE

    Funciones de TFIIA y TFIIB


    ➔ TFIIA = Se una a TBP, hace que se fije o haga la union mas fuerte a la caja TATA.
    ➔ TFIIB = Necesario para que el complejo pol/TFIIF se una a TFIID.

    Funciones de TFIIF
    ➔ Compuesto por 2 unidades, RAP70 y RAP30 (RNAP associated protein).
    ➔ Reduce la unión no específica de la RNAP al DNA.
    ➔ Funcion analoga al factor sigma de E.coli

    Funciones de TFIIH
    ➔ Requerido para el clearence del promotor
    ◆ Deja el promotor atrás hasta que llega la señal para transcribir
    ➔ Complejo proteico de 10 subunidades
    ➔ Posee actividad quinasa → Esta fosforila el dominio carboxilo terminal (CTD) de la
    subunidad mayor de RNAP

    CTD (dominio C-terminal)


    ➔ Cola conservada (YSPTSPS)n
    ➔ Exclusiva de RNA pol II
    ➔ Función esencial invivo
    ◆ Si se corta el CTD en un 50% es letal
    ◆ Deleciones parciales causan fenotipos condicionadas
    ◆ Truncaciones reducen varias funciones, iniciación y procesamiento de RNAm

    ❇De acuerdo al estado de fosforilación del CTD, se puede dividir en 4 etapas:


    1. Reclutamiento de la RNA pol al promotor, en donde el mediador posee una alta
    afinidad por CTD, o sea, mantiene inmovil a PIC en el promotor.
    2. Fosforilación de Ser5 del CTD por TFIIH/CDK7, lo que genera pérdida de afinidad
    del mediador por CTD y produce el escape del promotor.
    3. En la transcripción productiva (elongación), el CTD, contiene bajos niveles de Ser5P
    y Ser7P, y altos niveles de Ser2P. Esto permite atraer factores de elongación,
    4. Transición al término de la transcripción, donde hay altos niveles de Ser2P y Thr4P,
    lo que promueve el reclutamiento de los factores de corte, poliadenilación y de
    término.

    ❇El CTD es como un código de barras, por los distintos grados de fosforilación que permite
    atraer proteínas relacionadas con la maduración del RNA y la transcripción.
    Parte II: Maduración de mRNA en eucariotas.

    1. Procesamiento al extremo 5´= Adición del CAP


    a. CAP = Adición de un nucleótido que es una ageonocina? metilada
    i. Cap 0 → Se requieren 3 actividades enzimáticas
    1. Tpasa = RNA trifosfatasa
    2. Gpasa = Guanililtransferasa
    3. N7Mtasa = Guanina-N7 metiltransferasa
    ii. Cap 1 → m7G cap-specific 2’O Mtase

    2. Eliminación de los intrones : Splicing


    Esto sucede mediante el mecanismo de
    → Proceso cotranscripcional → A medida que van saliendo, el exón con los intrones de
    RNA pol, que se está recién sintetizando, se va produciendo la eliminación de los intrones.

    ¿Quién elimina los intrones?


    ➔ Ribonucleoproteinas (snRNPs) también conocida como Urna, que se conforma
    mayormente por uracilos.

    Pasos para la eliminación de intrones:

    A. U1snRNP reconoce el 5’ splice site y BBP y U2AF reconoce a branch-point site.


    B. Son desplazados por U1snRNP, cuando se está formando el complejo U1 y U2
    reconociendo el sitio de adenina.
    C. Entra en acción el complejo triple U4/U6, U5
    D. Esto permite que la adenina ataque, con la ayuda de U5, el límite intron-exon de sitio
    5’, generando el corte
    E. Al cortarse queda el extremo 3’ libre y se forma el lazo.
    F. El extremo 3’ que se crea por el corte tiene un grupo OH libre, este ataca al otro
    límite intron-exon, provocando la unión de ambos exones y la liberación del intrón
    (lazo)

    3. Procesamiento al extremo 3’ = Adición de cola Poli-A

    Regulación de la expresión génica en eucariotas

    Heterocromatina Eucromatina
    →Altamente condensada →Descondensada
    →Secuencias repetitivas →Secuencias de copias simples (genes)
    →Replicación tardía en el ciclo →Replicación temprana en el ciclo
    →Transcripcionalmente reprimida →Transcripcionalmente activa
    Proteínas regulatorias de genes:
    →Helix-turn-helix
    →Zinc finger
    →Leucine Zipper
    →Helix-loop-helix

    Regulación de la transcripción
    ➔ miRNAs
    ◆ Se originan a partir de precursores con CAP y poliadenilados (pri-miRNA)
    ◆ Son sintetizados por RNA pol II

    ❇Como blanco del control de expresión génica → Los antisense RNA

    Biogénesis de miRNA
    ➔ Se puede codificar de 2 formas
    ◆ Monocistrónica → 1 Gen 1 Proteína
    ◆ Policistrónica → 1 Gen varias Proteínas

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