ACTIVIDAD No 3: CROMATOGRAFÍA

Temario: Fundamentos de la separación cromatográfica. Tipos de cromatografías. Fase

móvil y fase estacionaria. Principios por los cuales ocurre la separación cromatográfica:
adsorción, partición. Cromatografía en papel. Cromatografía en capa fina. Relación de
frente. Cromatografía en columna.
Importante: Para la realización de esta actividad es imprescindible el conocimiento de
temas que fueron desarrollados en otras asignaturas. Revise el tema “Separación de
mezclas” de Laboratorio I.

Cuando haya completado esta actividad, Ud. deberá ser capaz de:
-Distinguir los fenómenos fisicoquímicos involucrados en cada tipo
de cromatografía y comprender la función de cada una de las
fases,
-Determinar si una sustancia se encuentra pura o no,
-Determinar si es posible separar los componentes de una mezcla
mediante una cromatografía,
-Elegir la metodología a seguir y las condiciones (por ej. elegir un
solvente adecuado) para realizar la cromatografía adecuada.
-Identificar una sustancia.

Los métodos cromatográficos son los más versátiles para la separación y

purificación de compuestos orgánicos. También es posible utilizarlos como criterio de
pureza o método de identificación. Estos métodos son aplicables a muestras sólidas,
líquidas y gases.
Separación de mezclas por cromatografía
Bajo la denominación de Cromatografía se incluyen un grupo de técnicas que
dependen de cuán rápidamente se mueve una sustancia en una corriente de gas o líquido
que pasa por una fase estacionaria la cual puede atraer con distinta afinidad a dicha
sustancia. Un ejemplo es el experimento sencillo de cromatografía en papel, realizado en
Laboratorio I. El experimento típico consiste en colocar una línea de tinta cerca de un
extremo de una tira de papel, extremo que luego se sumergirá en una mezcla de etanol y
agua. A medida que el solvente (fase móvil) asciende por capilaridad por el papel, la tinta
se mueve hacia arriba separándose en una serie de bandas de distintos colores que
corresponden a las diferentes sustancias coloreadas que la componen. La razón por la cual
la tinta se separa en bandas que contienen las diferentes sustancias coloreadas es que
cada una de estas sustancias interacciona con distinta fuerza con el agua que humedece
el papel −agua absorbida. A medida que la solución se mueve hacia arriba, las sustancias
que son atraídas con menor fuerza por el agua absorbida se mueven más rápidamente.
Este tipo de fenómeno se conocía ya en el siglo XIX y el botánico ruso Mikhail
Tswett fue el primero en entender los fundamentos de la cromatografía y en aplicarla en
forma sistemática como método de separación.

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Tipos de cromatografía
De manera general, se puede decir que en una cromatografía la separación de dos
o más compuestos de una mezcla se produce por distribución entre dos fases: una fase
móvil que fluye a través de (o sobre) una fase estacionaria o fija. Sin embargo, en los
distintos tipos de cromatografías, la distribución de los componentes de una mezcla entre
las dos fases involucra procesos fisicoquímicos de diferente naturaleza:
Tipos: Cromatografía de adsorción
Cromatografía de partición.
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de filtración en geles
En esta asignatura, sólo se estudiarán los dos primeros tipos de cromatografía:

Cromatografía de adsorción
Se denomina adsorción al proceso por el cual las moléculas son atraídas por una
superficie. En una adsorción física las moléculas se adhieren a la superficie del sólido por
acción de fuerzas intermoleculares débiles, mientras que en una adsorción química las
moléculas interaccionan fuertemente con la superficie a través de fuerzas de enlace
químico. El proceso inverso se denomina desorción (una molécula es removida de la
superficie sobre la cual se encuentra física o químicamente adsorbida).
En una cromatografía de adsorción la fase estacionaria es un sólido en el cual los
componentes de la muestra se adsorben. La fase móvil puede ser líquida (cromatografía
líquido-sólido) o gaseosa (cromatografía gas-sólido). Los componentes de la mezcla se
distribuyen entre las dos fases mediante equilibrios de adsorción-desorción. Cada
componente de la mezcla se adsorbe sobre la superficie del sólido (o adsorbente) que
forma la fase estacionaria y es desorbido por acción de la fase móvil. Así, el componente
más fuertemente atraído por el adsorbente se desplazará a menor velocidad. El equilibrio
de distribución es dinámico, con moléculas constantemente adsorbiéndose y
desorbiéndose. El número promedio de moléculas que permanecen adsorbidas sobre el
sólido en el equilibrio, depende de la naturaleza de la molécula y del poder disolvente del
solvente con el cuál compite el adsorbente.

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 La fase estacionaria, en la cual se adsorben los compuestos a separar, debe ser un
material inerte e insoluble en la fase móvil. Algunas fases sólidas ampliamente utilizadas
son sílica gel y alúmina, en forma de polvo finamente dividido. Las interacciones entre los
compuestos a separar y la fase estacionaria dependerán de las estructuras químicas de
estos compuestos. Las fuerzas de interacción varían con el tipo de compuesto. Para una
fase estacionaria polar se observa que mientras más polar es la molécula, más
fuertemente es atraída por la fase estacionaria y el grado en que un solvente arrastrará
un compuesto adsorbido en el soporte, dependerá directamente de su polaridad. La fase
estacionaria es generalmente más polar que la fase móvil.
Figura 1 Tipos de interacciones entre la fase estacionaria y diferentes compuestos

Por ejemplo, en el caso de la alúmina, varios tipos de fuerzas intermoleculares intervienen

en la unión con diferentes compuestos orgánicos. Los compuestos no polares se unen a la
alúmina únicamente por fuerzas de van der Waals (fuerzas débiles). Los compuestos
orgánicos polares se unen a la misma, por medio de interacciones más fuertes (tipo dipolo-
dipolo, puente hidrógeno, etc.). La Figura 1 muestra tipos de interacciones de compuestos
orgánicos con la alúmina (mostrando sólo una porción de la estructura de la alúmina).

Cromatografía de partición
Cuando una sustancia se encuentra en contacto con dos fases líquidas (solvente A
y solvente B), inmiscibles entre sí, la sustancia se distribuye entre las dos fases según la
relación:

concentración de soluto en el solvente A

=K
concentración de soluto en el solvente B
donde K es una constante de equilibrio que usualmente se denomina coeficiente de
partición.
El proceso de partición involucra una disolución selectiva basada en la diferencia
de solubilidad de la sustancia en los dos solventes (dos fases) (la separación de mezclas
por extracción se basa también en este proceso, como se vio en Laboratorio I).

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 En la cromatografía de partición la fase estacionaria es un líquido inmovilizado (por
absorción) en un sólido inerte y la fase móvil puede ser otro líquido (cromatografía líquido-
líquido) o un gas (cromatografía gas-líquido). La fase móvil compite con la fase
estacionaria por la muestra. Recordemos que la muestra tiene diferente solubilidad en los
dos líquidos inmiscibles. Las distintas sustancias componentes de una mezcla se separarán
en función de sus diferentes coeficientes de partición. En las cromatografías líquido-
líquido, frecuentemente la fase estacionaria es agua y la fase móvil un solvente orgánico.
La fase acuosa se encuentra adsorbida en un sólido hidrofílico (sílica gel, tierra de
diatomea, almidón, geles hidrofílicos, celulosa en polvo, papel de filtro y otros).

Técnicas cromatográficas
Existen diferentes técnicas mediante las cuales se puede realizar una separación
cromatográfica:
I - Cromatografía en Columna.
II - Cromatografía en Placa Delgada ó Placa Fina.
III - Cromatografía en Placa Preparativa.
IV - Cromatografía en Papel.
Las cromatografías en Placa Delgada y en Papel son utilizadas como criterio de
pureza y para la identificación de compuestos; las cromatografías en Placa Preparativa o
de Columna, son utilizadas para aislar ó separar compuestos.

I - Cromatografía en Columna.
En esta técnica, la mezcla de compuestos a separar se introduce en una columna
cilíndrica de vidrio rellena con el adsorbente (fase estacionaria o fija). Los compuestos
de la mezcla se adsorben en la parte superior de la columna (proceso de siembra) y un
flujo continuo de solvente (fase móvil), que pasa a través de la columna, eluye a los solutos
de la columna (ver Figura 2).

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Figura 2. Representación del proceso que ocurre en la columna cromatográfica.

Debido a que en cada punto de la columna se alcanza el equilibrio entre el soluto

adsorbido en el adsorbente y el disuelto en el solvente, compuestos diferentes se moverán
a velocidades diferentes, dependiendo de sus afinidades relativas por el adsorbente, por
un lado, y por el solvente, por el otro. Los solutos se separan en forma de bandas móviles
de compuestos puros. Si la columna es suficientemente larga y se ha efectuado una
correcta elección de otros parámetros, las bandas estarán separadas unas de otras por
una banda de solvente puro y de este modo, se podrá “recoger” sucesivamente cada banda
en distintos tubos.
Algunos parámetros experimentales importantes para una cromatografía en columna son:
- Adsorbente.
- Elección del solvente (polaridad).
- Tamaño de la columna (largo y diámetro).
- Velocidad de elución.
Los dos adsorbentes más utilizados son la silica gel y la alúmina. Estos pueden
servir para adsorber prácticamente a todas las moléculas orgánicas que presenten algún
grupo funcional. Algunas propiedades de los adsorbentes a tener en cuenta son:
químicamente inerte (el adsorbente no debe reaccionar con los compuestos) y tamaño de
gránulo (un menor tamaño de partícula implica mayor superficie de contacto, por ende
mayor adsorción, lo que conduce a una mejor separación).
Cuando se utilizan estas fases estacionarias, se cumple en general que los
compuestos menos polares pasan por la columna más rápido que los más polares, porque
tienen menor afinidad por el adsorbente. La velocidad de elución debe ser tal que permita
alcanzar el equilibrio soluto adsorbido-soluto disuelto en cada punto de la columna.
La columna puede ser eluída con un solo solvente, pero por lo general se utilizan en
forma consecutiva, varios solventes de polaridad creciente (busque y analice una Tabla
con polaridad creciente de solventes).

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II - Cromatografía en Placa Fina.
El tipo de adsorbente es similar al utilizado en cromatografía en columna, pero en
este caso el adsorbente se adhiere a una placa que actúa como soporte (placa de vidrio)
mediante el agregado de yeso (ligante). El solvente asciende por capilaridad a través de
la placa cuando ésta se coloca en forma vertical dentro de un recipiente denominado cuba
cromatográfica (Figura 3). El sembrado de la muestra se realiza sobre la placa con un
capilar y una gota es, generalmente suficiente (¿cuál debería ser la altura de la siembra
para que el solvente no disuelva la muestra?)
Cuando el solvente asciende, la muestra se distribuye por el mismo principio que
en cromatografía en columna. ¿Qué tipo de sustancias ascenderá primero?
En la Figura 4 se muestra el esquema del proceso cromatográfico en placa fina de una
mezcla de compuestos sembrados frente a un compuesto “testigo” ó “patrón”.
Una vez desarrollada la corrida cromatográfica, se retira la placa de la cuba,
marcando con un lápiz la línea del solvente antes de que éste se evapore (frente del
solvente o distancia recorrida por el solvente). Si los compuestos son coloreados se
podrán observar a simple vista, de lo contrario es necesario revelar la placa (busque
métodos de revelado en un libro de texto).

Figura 3. Esquema de la cuba cromatográfica.

Figura 4. Esquema del proceso cromatográfico en placa fina para una mezcla de
componentes y un testigo.

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 Dependiendo de las condiciones en que se efectuó la corrida cromatográfica, se
puede calcular la distancia que recorre un determinado compuesto relativa al frente de
solvente. Esta relación se denomina relación de frente (Rf) y se expresa como lo indica
la figura 5.

Figura 5. Cálculo de Rf
El Rf es característico de cada compuesto bajo condiciones específicas
(adsorbente, solvente de desarrollo, temperatura, etc.), por ello puede ser utilizado para
la identificación de compuestos.
Una buena cromatografía en placa depende de los siguientes parámetros:
- adsorbente.
- espesor de la capa adsorbente
- solvente o mezcla de solventes utilizados.
- cantidad de material sembrado.
La gran ventaja de este método es la pequeña cantidad de muestra que se utiliza, además
pueden detectarse cantidades del orden de 10-7 g, dependiendo del método de
visualización.
El uso de la cromatografía en Placa Fina es muy importante y puede ser utilizada para:
- Determinar el número de componentes de una mezcla
El número de manchas reveladas indica el grado de pureza de la muestra. Si al cambiar
los solventes empleados, aparece una mancha única en todos los casos, es muy probable
que la muestra sea una sustancia pura.

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- Determinar el solvente adecuado para realizar la separación de una mezcla de
sustancias utilizando cromatografía en Columna.
Cuando una mezcla se desea separar por cromatografía en Columna, se elige el mejor
solvente utilizando cromatografía en placa fina. Se realizan distintas corridas
cromatográficas en diferentes solventes y se elige aquel solvente en el cual se observa
una mayor separación entre los componentes (representada por una mayor diferencia
entre los distintos Rf).
- Monitorear la separación de una columna cromatográfica.
Cuando se separa por cromatografía en Columna una mezcla de compuestos incoloros, se
analizan las fracciones colectadas por medio de una cromatografía en Capa Fina y
posterior revelado, para determinar la eficiencia de la separación.
- Establecer si dos compuestos son idénticos.
Si dos compuestos presentan el mismo Rf en una misma corrida, probablemente sean
idénticos, pero si los Rf son diferentes definitivamente no son idénticos.

III - Cromatografía en Placa Preparativa

Una Placa Preparativa es aquélla que posee una capa más gruesa de adsorbente que
la placa fina, lo que permite sembrar mayor cantidad de muestra y luego extraer
aisladamente las distintas manchas. Por lo tanto, en ese sentido comparte características
con la cromatografía en Columna. Sin embargo, si se compara con la cromatografía en
Columna, las ventajas que presenta la cromatografía en Columna sobre la de Placa
Preparativa son las siguientes:
a) El cambio secuencial de la polaridad del solvente de elución.
b) El desplazamiento ilimitado del frente de solvente (se deja gotear tanto como se
desee).
c) Mayor cantidad de fase estacionaria (largo de la columna).

IV - Cromatografía en Papel
En esta cromatografía, el papel de filtro (celulosa) es el soporte sólido y la fase
estacionaria es agua absorbida en él. La fase móvil asciende por capilaridad en forma
análoga a la cromatografía en placa. Si la fase estacionaria es líquida, ¿cuál cree Ud. que
será el principio de separación? (Revise la guía de actividades de Laboratorio I).

Otros tipos de cromatografías

Cromatografía de intercambio iónico.
Hay una amplia variedad de materiales, tanto naturales como sintéticos, orgánicos
o inorgánicos, que poseen grupos reactivos asociados a iones capaces de intercambiarse
con los iones del medio que los rodea. Estos materiales se denominan intercambiadores

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iónicos y son, en general, insolubles. Ellos absorben una considerable cantidad de solvente
y tienen estructura porosa. De manera sencilla, para un material que tiene un ion
intercambiable B y que se coloca en una solución que contiene iones A, se establece un
equilibrio de intercambio de iones que se puede representar como:
A(en solución) + B(en el intercambiador) ⇔ A(en el intercambiador) + B(en solución)
Así, recibe el nombre de cromatografía de intercambio iónico aquélla en la cual el
intercambio de iones es el único fenómeno que ocurre en el material durante todo el
proceso de separación. La fase estacionaria es un intercambiador iónico y la fase móvil es
un líquido, generalmente una solución acuosa (es, por lo tanto, una cromatografía líquido-
sólido). En general, los iones de mayor carga tienen más afinidad por el intercambiador
que los de menor carga. Para regenerar el intercambiador se utiliza una solución acuosa
de los iones que tenía originalmente.

Cromatografía de filtración en geles

La cromatografía en geles es un tipo particular de cromatografía líquido-sólido.
Esta técnica se utiliza para separar sustancias que difieren mucho en el tamaño, como por
ejemplo polímeros, proteínas de distinto peso molecular, etc.
La fase estacionaria es un sólido poroso y la fase móvil, el solvente que arrastra
una solución de la mezcla a separar. A medida que la fase móvil atraviesa la estacionaria,
la solución difunde en la fase estacionaria y por ende, las distintas moléculas pasan a
través de los poros. Si se selecciona adecuadamente el tamaño del poro, las moléculas más
grandes no entrarán en él y serán arrastradas por el solvente. La distribución molecular
uniforme entre las dos fases es la que permite la separación gradual de los componentes
de acuerdo a su peso molecular. El de mayor peso molecular, que no entra en los poros,
pasa más rápidamente. Las moléculas de tamaño medio, que pueden entrar parcialmente
en la fase estacionaria por difusión, son retenidas un poco más y las moléculas más
pequeñas, que penetran fácilmente en los poros, los recorren y son más retenidas,
demorando más tiempo en salir. Las fases estacionarias más usadas son geles hidrofílicos
(ej. Sephadex).

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