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Electroforesis en gel de agarosa

Electroforesis en gel de agarosa

Gallardo Casillas Lezly Jazmín

Garnica Ocampo Susana Lizeth

Medina Duran Mónica Lizeth

Ramos Sánchez José de Jesús

Villalvazo Ibarra Adriana Guadalupe

Lic. Químico Farmacéutico Biólogo

Universidad Tecnológica de Guadalajara UTEG

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Electroforesis en gel de agarosa

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Electroforesis en gel de agarosa

Fundamento

La electroforesis es una técnica para la separación de ácidos nucleicos y proteínas de

acuerdo con su tamaño y carga eléctrica, a través de un gel de agarosa o poliacrilamida. Esta

técnica sirve para evidenciar la presencia o ausencia de un fragmento de ADN amplificado

previamente mediante PCR en una muestra, con los fines de identificar genes de interés o

purificar productos de PCR y analizarlos mediante otros procedimientos, entre otros.

La agarosa es un polímero que, al gelificarse, forman una matriz constituida de poros

cuyo diámetro estará dado por la concentración de agarosa utilizada.

Los geles de agarosa tienen menor poder de resolución, pero tienen un mayor rango de

separación de fragmentos de ADN, ya que se pueden separar moléculas de 50 hasta 20mil pares

de bases (pb).
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Electroforesis en gel de agarosa

Recursos

Material Reactivos Equipo

 Agarosa  TAE 1X (500ml)  Microcentrifuga

 ADN purificado  Buffer de carga (colorante  Cámara de electroforesis

(Humano, Vegetal y con azul de bromofenol) horizontal

procariota)  Bromuro de etidio.  Fuente de poder

 Productos de PCR  SDS 1%  Transiluminador

 Matraz Erlenmeyer de  Cloro 1%

250ml

 Micropipeta

 Puntillas estériles
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Tabla de Contenidos

Cámara de electroforesis ..................................................................................................... 7

¿Qué es una cámara de electroforesis? .......................................................................... 7

Partes de la cámara de electroforesis y su montaje ....................................................... 8

Preparación de buffer y sustancias ...................................................................................... 9

SDS (sodio dodecil sulfato): ........................................................................................... 9

TAE (Tris-Acetate-EDTA): ........................................................................................... 10

Cloro: ............................................................................................................................ 11

Procedimiento ................................................................................................................... 11

Resultados ......................................................................................................................... 14

Conclusiones ..................................................................................................................... 14

Lista de Referencias .......................................................................................................... 15

Observaciones ................................................................................................................... 14
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Electroforesis en gel de agarosa

Lista de Figuras

Ilustración 1: Cámara horizontal………………………………………………………..7

Ilustración 2: Cámara vertical……………………………………..…………………….8

Ilustración 3: Partes de la cámara de electroforesis……………………………………..9

Ilustración 4: Ensamblaje de la gradilla para el gel………………………………...…..11

Ilustración 5: Colocación de la gradilla en la cámara de buffer……………………..…12

Ilustración 6: Llenado de pocillos………………………………………………………13

Ilustración 7: Montaje de la cámara de electroforesis………………………………….13

Ilustración 8: Gel en transiluminador que presenta en el pocillo dos y

tres material de DNA humano y Vegetal positivo con ligera degradación………..……..14
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Electroforesis en gel de agarosa

Cámara de electroforesis

¿Qué es una cámara de electroforesis?

La cámara de electroforesis es el dispositivo en donde se introduce la muestra para dicho

proceso; y en donde se crea el campo electromagnético que se forma en el proceso de

electroforesis, dicho campo tiene lugar dentro de una solución amortiguadora en la que se

encuentra sumergido el gel; la concentración alta de electrolitos hace posible la transición de la

corriente eléctrica. El principio de la electroforesis consiste, en la migración de las moléculas a

través del gel generada por el campo electromagnético de acuerdo al peso molecular y tamaño.

Dicho gel cuenta con poros que actúan como un colador, provocando que las moléculas

pequeñas se muevan más rápido que las moléculas grandes. En la cámara hay dos polos que se

conectan a la fuente de energía.

Tipos de cámaras de electroforesis:

Ilustración 1: Cámara horizontal en donde se procesan por lo general el ADN y el ARN, esta

tiene su polo positivo en uno de los extremos (Kalstein, 2021)

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Ilustración 2: Cámara vertical en donde se trabajan las proteínas y el ADN, que posee el polo

positivo en su extremo inferior. (Kalstein, 2021)

En ambos tipos de cámaras se pueden distinguir el polo negativo del polo positivo,

gracias a la diferencia de colores, ya que el polo positivo se identifica de color rojo y el negativo

de color negro. (Kalstein, 2021)

Partes de la cámara de electroforesis y su montaje

Las partes de una cámara de electroforesis deben identificarse de manera sencilla

conociendo también la importancia de cada una de ellas y así realizar su montaje correctamente

para obtener resultados óptimos.

El montaje se realiza por partes ya que son diferentes buffer y soluciones que no deben

mezclarse entre sí.

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Ilustración 3: Partes de la cámara de electroforesis. I. Puertas de goma. II. Peine para pocillos.

III. Electrodo positivo y negativo. IV. Cable positivo y negativo. V. Gradilla para gel. VI.

Cámara de buffer. VII. Tapa de seguridad. VIII. Fuente de poder

Preparación de buffer y sustancias

SDS (sodio dodecil sulfato): Es un detergente aniónico que solubiliza los lípidos y proteínas, y

desestabiliza la estructura de la membrana celular.

SDS a 1% (10 ml)

Agua destilada estéril 9ml

SDS 1g

Tabla 1. Formula inicial para 10ml de SDS

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La práctica solicita menos cantidad de reactivo por lo cual se ajustaron los valores a 5ml

en total.

TAE (Tris-Acetate-EDTA): es un tampón ampliamente utilizado para aplicaciones de

electroforesis en gel de agarosa que requieren una alta resolución y separación de ADN

bicatenario de alto peso molecular.

TAE 50X (1000 ml)

Agua destilada estéril 750ml

Base tris 242.28 g

EDTA 18.61 g

ácido acético glacial 57.1 ml

Tabla 2: Fórmula inicial para 1000 ml de TAE 50X

Realizar una dilución con 10ml de TAE 50X con 490 de agua destinada estéril para

obtener TAE 1X

Gel agarosa: es un polímero lineal de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa

Gel agarosa (65 ml)

Agarosa 0.65 g

TAE 1X 65 ml

Bromuro de etidio 6.5 µl

Tabla 3: Fórmula para 65ml de gel agarosa

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Cloro: Sirve para inactivar los residuos contenidos en la cámara de buffer para su posterior

lavado.

Cloro al 1% (50ml)

Agua destilada 50 ml

Cloro 50 µg

Tabla 4: Fórmula para 50ml de cloro al 1%

Procedimiento

1. Inundar la cámara de electroforesis con agua destilada e inactivar con cloro al 1%

2. Enjuagar con agua destilada y agregar SDS al 1%
3. Realizar delicadamente lavados en cada una de las piezas (peines, gomas, gradilla y
cámara de buffer)
4. Enjuagar con agua destilada varias veces hasta verificar que quede completamente
limpia.
5. Dejar secar
6. Humedecer las gomas
7. Armar la gradilla para el gel con las gomas

Ilustración 4: Ensamblaje de la gradilla para el gel (gradilla para gel, puertas de goma y

peine para pocillos)

8. Agregarle 6.5µl de bromuro de etidio al gel agarosa

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9. Ensamblar el peine para pocillos en la gradilla para gel

10. Vaciar el gel agarosa en la gradilla sin generar burbujas
11. Dejar polimerizar el gel para luego retirar las gomas
12. Retirar el peine para pocillos lentamente para no romper el gel
13. Colocar la gradilla para gel en la cámara de buffer

Ilustración 5: Colocación de la gradilla en la cámara de buffer

14. Inundar la cámara de buffer con TAE 1X al límite señalado
15. Realizar una dilución con 10µl de muestra de DNA con 3µl de buffer de carga
16. Llenar cada pocillo con 13µl con el orden siguiente:
Pocillo #1 Marcador de peso molecular
Pocillo #2 DNA Humano
Pocillo #3 DNA Vegetal
Pocillo #4 DNA Bacteriano
Pocillo #5 Control +
Pocillo #6 Control –
Pocillo #7 Extracción 96
Pocillo #8 Extracción 13
Pocillo #9 Extracción 36
Pocillo #10 Extracción 7
Pocillo #11 Extracción 552
Pocillo #12 Extracción 8
Pocillo #13 Extracción 16
Pocillo #14 Extracción 26
Pocillo #15 Extracción 47
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Pocillo #16 Marcador de peso molecular

Ilustración 6: Llenado de pocillos

17. Cerrar la cámara de buffer con la tapa de seguridad
18. Conectar cables positivo y negativo en los electrodos correspondientes
19. Configurar el voltaje y tiempo de la fuente de poder
20. 80V/30min.

Ilustración 7: Montaje de la cámara de electroforesis.

21. Retirar la gradilla con cuidado de no tirar el gel
22. Colocar el gel en el Transiluminador
23. Observar los resultados
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Resultados

Ilustración 8: Gel en transiluminador que presenta en el pocillo dos y tres material de

DNA humano y Vegetal positivo con ligera degradación

Observaciones

Conforme se realizaba la práctica se lograron observar ciertas alteraciones en las técnicas

de llenado de pocillos a la vez también las diluciones eran bastante dudosas ya que las

micropipetas no tenían calibración así que se tuvo que realizar la práctica dos veces para obtener

mejores resultados. La técnica de llenado fue bastante favorable y no hubo derrames ni mezclado

de pocillo a pocillo.

Conclusión

Durante la realización de la práctica logré identificar las buenas y malas técnicas de

llenado a la vez de que la calibración de las micropipetas es fundamental ya que pueden variar

los resultados. Es necesario tener organización ya que es un proceso muy extenso y solo así se

podrán obtener resultados positivos en las muestras.

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Electroforesis en gel de agarosa

Lista de Referencias

Alberto Checa Rojas. (2017). Método: Gel de electroforesis Agarosa. 2023, Mayo 15,

Conogasi.org Sitio web: https://conogasi.org/articulos/metodo-gel-de-electroforesis-agarosa/

Biocell Science (2016). Buffer TAE (Tris-Acetate-EDTA) Sitio web:

https://biocellsci.com/portfolio_page/buffer-tae-tris-acetate-edta/

Rebecca Talley; Adriana Gallego. (2023) GolBio Como hacer tampones TAE y TBE.

Sitio web: https://goldbio.com/articles/article/Preparar-Soluciones-Tampon-

Frecuente#:~:text=TAE%3A%20Para%20preparar%20una%20soluci%C3%B3n,Almacenar%20

a%20temperatura%20ambiente.

David Alejandro López de la Mora; Ana Soledad Sandoval Rodríguez (2013) Biología

molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud, Mc Graw Hill. Sitio web:

https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1473&sectionid=102741484

Kalstein. Cámara de electrophoresis, Kalstein (2021). Sitio web:

https://www.kalstein.cl/camara-de-

electroforesis/#:~:text=Existen%20dos%20tipos%20de%20c%C3%A1maras,positivo%20en%20

su%20extremo%20inferior.
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