Velásquez FC
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FACULTAD DE MEDICINA
EAP DE TECNOLOGÍA MÉDICA
IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES
MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO
TEMPRANO DE LA DIABETES MELLITUS TIPO II,
EN UNA POBLACIÓN DE LIMA
TESIS
AUTOR
Lima – Perú
2014
La mayoría de las ideas fundamentales de la ciencia son esencialmente sencillas y
por regla general pueden ser expresadas en un lenguaje comprensible para todos.
Albert Einstein
(1879 – 1955)
En memoria de quien en vida fue Doña Victoria Magdalena Ronceros Napa de
Figueroa, mi querida abuelita, una mujer luchadora quien combatió contra esta
enfermedad hasta sus últimos días.
(1932 – 2013)
Esta tesis ha sido financiada por el Vicerrectorado de Investigación de la
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, en mérito al ocupar el primer lugar
del Concurso del Fondo de Promoción de Tesis de Pregrado 2012.
A mis padres, Don Carlos Velásquez Vásquez y Doña Martha Figueroa Ronceros,
por su apoyo incondicional y aliento inagotable; a mi hermana Gabriela y su
pequeña hija Isabella, luz que ilumina y llena de alegría a todo mi hogar.
Al Dr. Oscar Acosta y la Mg. Cecilia Miranda por sus doctas aportaciones y sabios
consejos, definitivamente su experiencia ha significado una valiosa herramienta
para esta investigación.
Al Lic. TM Ricardo Rodríguez Torres e Int. TM Ángela Urbina Antezana por sus
valiosos aportes, generosa colaboración y constante apoyo.
DG Diabetes gestacional
DJ Diabetes juvenil
IL-6 Interleuquina 6
C Citosina
G Guanina
Pro Prolina
Ala Alanina
pb Pares de bases
OR Odds ratio
CAPN10 Calpaína 10
Índice
I. RESUMEN .................................................................................................................. 1
II. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 3
III. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES .................................................................... 5
3.1 Epidemiología de la Diabetes Mellitus Tipo II ........................................................... 5
3.2 Clasificación de la Diabetes Mellitus......................................................................... 5
3.3 Diagnóstico de la Diabetes Mellitus .......................................................................... 7
3.4 Genética de la Diabetes Mellitus tipo I ...................................................................... 8
3.5 Marcadores moleculares de la Diabetes Mellitus tipo II ............................................ 9
3.6 Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) ............................................................ 10
3.7 Polimorfismo Pro12Ala del gen PPAR-g2 (ID: Rs1801282) y su asociación con la
Diabetes Mellitus tipo II ................................................................................................ 13
3.8 Polimorfismo 174 G/C del gen IL-6 (ID: Rs1800795) y su asociación con la Diabetes
Mellitus tipo II ............................................................................................................... 14
3.9 Otros polimorfismos asociados con la Diabetes Mellitus tipo II ............................... 15
3.10 Variables epigenéticas asociadas con la Diabetes Mellitus tipo II ......................... 17
3.10.1 Teoría del genotipo ahorrador ........................................................................ 18
3.10.2 Teoría del fenotipo ahorrador ......................................................................... 19
3.11 Equilibro de Hardy-Weinberg................................................................................ 20
IV. OBJETIVOS E HIPÓTESIS ...................................................................................... 22
V. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 23
5.1 Diseño de investigación.......................................................................................... 23
5.2 Variables ................................................................................................................ 23
5.3 Población ............................................................................................................... 23
5.4 Muestra .................................................................................................................. 23
5.5 Tipo de muestreo ................................................................................................... 24
5.6 Criterios de inclusión y exclusión ............................................................................ 24
5.6.1 Criterios de inclusión ........................................................................................ 24
5.6.2 Criterios de exclusión ....................................................................................... 24
5.7 Plan de recolección de datos.................................................................................. 25
5.8 Técnicas e instrumentos ......................................................................................... 25
5.8.1 Procesamiento molecular ................................................................................. 25
5.8.2 Análisis estadístico .......................................................................................... 27
5.9 Ética ....................................................................................................................... 28
VI. RESULTADOS.......................................................................................................... 29
VII. DISCUSIÓN .............................................................................................................. 34
VIII. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 42
IX. RECOMENDACIONES ............................................................................................. 43
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 44
XI. ANEXOS ................................................................................................................... 51
Anexo N° 1: Otros tipos de Diabetes Mellitus ............................................................... 51
Anexo N° 2: Otros polimorfismos relacionados con la DM-II......................................... 53
Anexo N° 3: Operacionalización de variables ............................................................... 54
Anexo N° 4: Método de purificación de ADN ................................................................ 55
Anexo N° 5: Protocolos de amplificación y restricción .................................................. 57
I. RESUMEN
1
I. ABSTRACT
DNA markers are useful in identifying genes and their variants that have an
influence in a genetic predisposition to a certain disease. People with certain
multiple genes polymorphisms may be susceptible to diabetes; however, studies in
other countries have shown that Pro12Ala PPAR-γ2 and the 174G/C IL-6 genes
polymorphisms play an important role in the development of this disease and could
be considered as a genes candidates in the molecular early diagnosis of diabetes
mellitus type II (DM-II) in a Peruvian population; in order to prevent complications
of diabetes as retinopathy, kidney damage, CNS damage, etc. According to official
information from the Ministry of Health, in our country there are more than 86,000
diabetic patients and 2 of 10 elderly subjects suffer from this problem; this reasons
show us the importance for this study. Objective: 1. Determine the genotype and
allele frequencies of the Pro12Ala PPAR-γ2 and the 174G/C IL-6 genes; 2.
Establish the association between the polymorphism of the Pro12Ala PPAR-γ2 and
the 174G/C IL-6 genes with Diabetes. Participants: Samples of Molecular Biology
Laboratory CIBN. Materials and Methods: 100 samples from people that live in
Lima, 50 control samples and 50 samples from patients with DM-II; extraction of
genomic DNA was performed and analysis of polymorphism Pro12Ala PPAR-γ2
and the 174G/C IL-6 genes with PCR-RFLP were developed. Results: The
distributions of the genotypes of PPAR-γ2 gene in groups of cases and controls
were in agreement with the hypothesis of Hardy-Weinberg equilibrium; however,
the genotype frequencies of the IL-6 gene did not have this condition.
2
II. INTRODUCCIÓN
Diversas investigaciones han hecho lo propio con la Diabetes Mellitus tipo I (DM-I);
estudios moleculares señalan al gen HLA-DQb como uno de los principales genes
involucrados en la manifestación clínica de esta enfermedad 1. Los análisis
genéticos de la Diabetes Mellitus tipo II (DM-II) han sido menos claros que los de
la DM-I; al parecer existen varios genes involucrados pero con una influencia
parcial en la enfermedad; como consecuencia, los pacientes quienes padecen de
DM-II tienen una alta variabilidad genética y los genes relacionados tienen
diferente distribución alélica en las distintas poblaciones.2
Actualmente, se han descrito más de 250 genes relacionados con la DM-II entre
los que destacan los genes que codifican para las proteínas involucradas en la
señalización de la insulina, en el transporte de la glucosa, en la síntesis del
glucógeno, en la síntesis y absorción de ácidos grasos y en la diferenciación de
los adipocitos. Algunos científicos concluyeron que los genes CAPN10 y PPAR-γ2
son los candidatos más prometedores para diagnosticar y prevenir de manera
oportuna el desarrollo de la DM-II3; otros investigadores han determinado una
asociación significativa entre la DM-II, resistencia a la insulina, hipertensión y otros
trastornos metabólicos con el polimorfismo de un sólo nucleótido (SNP) 174G/C
del gen de la Interleuquina 6 (IL-6).4
4
III. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES
Esta enfermedad se clasifica en: 1)Diabetes Mellitus tipo I (DM-I) que resulta de la
destrucción autoinmune de las células beta del páncreas (productoras de insulina)
produciendo la insuficiencia de insulina, 2) Diabetes Mellitus tipo II (DM-II)
causada por la disminución en la secreción de insulina y por la resistencia a la
insulina de los tejidos blanco (hígado y músculos), 3)Diabetes gestacional (DG)
que se define como un estado de intolerancia a la glucosa durante el embarazo y
4) Otros tipos específicos de Diabetes Mellitus, el cual deriva generalmente a
partir de ciertas cirugías (iatrogenia) u otras enfermedades pre-existentes.16
5
La DM-I representa sólo el 5-10% de las personas con DM y es el resultado de
una destrucción autoinmune de las células beta del páncreas. Los marcadores de
esta destrucción autoinmune incluyen autoanticuerpos contra las células de los
islotes, autoanticuerpos contra la insulina, autoanticuerpos contra la enzima ácido
glutámico descarboxilasa (GAD65) y autoanticuerpos contra las tirosina fosfatasas
IA- 2 e IA -2b. Por lo general, al menos dos de estos autoanticuerpos están
presentes en 85-90 % de pacientes con DM-I. También, esta enfermedad tiene
una fuerte asociación con el cluster HLA, directamente vinculado a los genes DQA
y DQB, e influenciado por el gen DRB. 1
6
Definiciones recientes postulan a la DM-II como un desorden metabólico de
etiología multifactorial, caracterizado por una hiperglicemia crónica debida a la
resistencia periférica a la insulina o a una disfunción secretora de esta hormona, lo
cual produce alteraciones en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas
y, en un lapso variable, lesiones macro y microvasculares, especialmente en ojos,
riñón, nervios, corazón y vasos sanguíneos. La DM-II pertenece a un grupo de
alteraciones metabólicas de carácter heterogéneo con grado variable de
predisposición hereditaria y participación de diversos factores ambientales; esta
enfermedad tiene un origen complejo y multifactorial, asociándose principalmente
con obesidad, concentración elevada de triglicéridos, baja concentración de
colesterol-HDL y resistencia a la acción de la insulina. La participación de factores
genéticos relacionados con la susceptibilidad a padecer la DM-II, se asocian
fuertemente cuando existen antecedentes de herencia familiar de diabetes. 21
8
La DM-I resulta de la destrucción autoinmune de las células productoras de
insulina en el páncreas y representa el 5-10% del total de casos de Diabetes
Mellitus en el mundo. La región del mapa genético que presenta una mayor
susceptibilidad a producir DM-I se encuentra en la región HLA del cromosoma 6.
Estudios moleculares indicaron en un inicio como marcadores de susceptibilidad a
DM-I al gen HLA-DR (con alelos DR3 y DR4) del cluster HLA; sin embargo,
estudios posteriores señalan al gen contiguo HLA-DQb (proteína DQB) que
presenta una mayor correlación entre mutaciones y la enfermedad 1.
Se han asociado varias regiones cromosómicas y genes con la DM-I, que influyen
en la susceptibilidad y resistencia e indican que en la mayoría de los casos se
trata de una enfermedad poligénica. Esta hipótesis se ve apoyada por la
concordancia de la DM-I más alta en gemelos monocigóticos que entre hermanos
con un genotipo idéntico de HLA18. Se supone que la susceptibilidad a la DM-I
está relacionada con un locus mayor y varios loci menores, que contribuyen al
riesgo de la diabetes mediante interacción genética.
9
Existen distintas estrategias para la identificación de los genes que participan en la
susceptibilidad al desarrollo de la enfermedad. Entre las más importantes están el
análisis de genes candidatos y sus variantes, los estudios de mapeo genético, los
estudios de expresión diferencial de genes o proteínas y los modelos animales
donde se inactiva selectivamente la función de algunos genes en distintos tejidos.
20
Las investigaciones en la actualidad han dado cierto giro; aunque han seguido los
esfuerzos por asociar los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) a la DM-II,
actualmente muchas investigaciones están orientadas a buscar la asociación de
varios SNP de distintos genes con algún otro factor que está relacionado con la
DM-II. En este sentido, los SNPs representan una herramienta muy útil para
construir mapas genéticos de alta resolución; debido a ello, la investigación de
polimorfismos asociados a la DM-II ha ido cobrando más importancia, ya que en
un futuro cercano se espera tener una serie de marcadores genéticos para estimar
de modo temprano el riesgo a desarrollar esta enfermedad.
Un estudio meta-analítico arrojó datos sobre los estudios genéticos más recientes
relacionados con la DM-II, de una base de 20,690 publicaciones de diferentes
fuentes que reportan factores genéticos asociados a esta enfermedad, 61 artículos
estaban relacionados directamente con estudios de SNP. De estos, sólo 30
reportaron una evidencia clara de asociación del SNP estudiado con la DM-II.21
Los SNPs son variaciones de una secuencia de ADN que se producen cuando un
solo nucleótido de la secuencia es diferente de la norma (“alelo normal”) en al
10
menos uno por ciento de la población. Cuando estos polimorfismos ocurren dentro
de un gen, crean diferentes alelos del mismo.6
Las variaciones en las secuencias de ADN de los seres humanos pueden afectar
el cómo éstos desarrollan enfermedades y responden a los patógenos, productos
químicos, medicamentos, vacunas y otros agentes. En este sentido, los SNPs son
críticos para la medicina personalizada; sin embargo, su mayor importancia en la
11
investigación biomédica se da con la comparación de los SNPs entre poblaciones
(como los grupos de casos y control) en los estudios de asociación.6
Un único SNP puede causar una enfermedad mendeliana; no obstante, para las
enfermedades complejas, los SNPs no suelen funcionar individualmente, sino que
trabajan en asociación con otros SNPs para manifestarse clínicamente. 8 Hay
evidencia de que algunos polimorfismos de los genes PPAR-γ2 e IL-6 están
íntimamente ligados con algunas de las alteraciones metabólicas consecuencia de
la DM-II. 2, 4, 21, 24, 26, 27, 29, 32
La sustitución de una citosina (C) por una guanina (G) en el codón 12 del gen
PPAR-γ2 produce un cambio de prolina a alanina en la proteína PPAR-γ2,
responsable de modular la actividad transcripcional23. Esta sustitución es muy
cercana del sitio NH2-terminal de la proteína en el dominio de activación
independiente de ligando, cuya actividad se potencia a través de la fosforilación
por la insulina. La estructura y en consecuencia la función de la proteína pueden
ser afectados por este cambio de aminoácidos, ya que la alanina favorece la
formación de α-hélices mientras prolina impide que éstas se formen. La isoforma
alanina conduce a la estimulación menos eficiente de genes diana del factor de
transcripción PPARG-γ2 y predispone a las personas a una mayor acumulación de
masa de tejido adiposo, que a su vez actúa disminuyendo la sensibilidad a la
insulina jugando un papel importante en la patogénesis de la DM-II. 25
174G/C es un SNP en la región promotora del gen IL-6 que afecta a los niveles
plasmáticos de esta importante citoquina. Fue descrita por primera vez en 1988
cuando se demostró que el alelo C produce menos IL-6 que el alelo G, lo que
apoyó la hipótesis de que el genotipo CC sería un “genotipo protector” para
algunas afecciones inflamatorias crónicas. 29
Actualmente se han acumulado evidencias de que la DM-II está asociada con una
inflamación subclínica sistémica que pudiera ser atribuible a una desregulación del
sistema inmune innato; esta respuesta inmune se caracteriza por niveles elevados
de marcadores de la respuesta de fase aguda y de su principal mediador, la IL-6.
12
Existen pruebas convincentes de que los niveles aumentados de IL-6 están
asociados con la etiología de la DM-II. La alta tasa de depuración plasmática de
IL-6 sugiere que la concentración de esta citoquina se regula constantemente a
través de los procesos de transcripción y traducción; es allí donde el
descubrimiento del SNP 174G/C en la región promotora del gen de la IL-6 planteó
la posibilidad de que ciertos alelos del gen de la IL-6 pueden ser considerados
como factores de riesgo para el desarrollo de la DM-II. 4
Un estudio realizado en Túnez con 242 pacientes diabéticos y 246 controles sanos
no reveló diferencias significativas en las frecuencias de los alelos Pro-12Ala del
gen PPAR-γ2 entre los pacientes diabéticos y sujetos control; sin embargo, el alelo
Ala12 se encontró significativamente asociado con niveles altos de presión arterial
sistólica en el grupo de pacientes diabéticos.27
14
adiposo, y células beta pancreáticas. Esta citoquina media la respuesta
inflamatoria y el estrés. Se ha calculado que la tercera parte de la concentración
circulante de IL-6 proviene del tejido adiposo y de acuerdo con observaciones
recientes, la concentración circulante de IL-6 se relaciona con la acción de la
insulina21. Uno de los diversos polimorfismos en la región promotora del gen IL-6
que han sido descritos es el polimorfismo -174 G/C, que afecta la transcripción del
gen de IL-6 induciendo una mayor producción de esta citoquina relacionado con
estados de insulinorresistencia.29
Diversos estudios han descrito una posible asociación del polimorfismo -174 G/C
del gen de IL-6 con susceptibilidad a la DM1, específicamente con la presencia del
genotipo G/G. Un estudio desarrollado en pacientes chilenas con DM-I no
determinó una asociación significativa entre este genotipo y la enfermedad; sin
embargo, encontró una mayor tendencia de asociación para la presencia del alelo
G con mayor IMC en pacientes con DM-I.32
18
Al igual que con la disponibilidad de alimentos, en los últimos cien años han
ocurrido cambios dramáticos en nuestros niveles de actividad física y las
sociedades modernas son notablemente sedentarias. Como consecuencia,
aquellos alelos que favorecían la función y entregaban ventajas selectivas en la
era paleolítica hoy en día resultan en una desventaja que promueve un aumento
41
en la prevalencia de enfermedades metabólicas.
19
que estas modificaciones se heredarán de manera estable en las células lo que
determinará un fenotipo que puede predisponer a enfermedades crónicas o a
fenotipos intermedios. 41
1) No ocurren mutaciones.
21
IV. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
Objetivo general
Objetivos específicos
Determinar los polimorfismos Pro12Ala del gen PPAR-γ2 y 174 G/C del gen
IL-6 en una población de Lima.
Hipótesis
22
V. MATERIALES Y MÉTODOS
5.2 Variables
5.3 Población
5.4 Muestra
23
5.5 Tipo de muestreo
24
5.7 Plan de recolección de datos
Máster mix: H2O PCR: 9.04uL, Buffer10x: 1.2uL, dNTPs 2.5mM: 0.96uL,
MgCl2 50mM; 0.36uL, PrimerF 10uM: 0.12uL, PrimerR 10uM:
0.12uL, Taq Platinum: 0.2uL, ADN punch: 4 unid.
25
Ciclos PCR: 94°C x 5min, 36 ciclos (94°C x 1min, 55°C x 1min, 72°C x
1min), 72°C x 10 min
Máster mix: H2O PCR: 8.80uL, Buffer10x: 1.2uL, dNTPs 2.5mM: 0.96uL,
MgCl2 50mM; 0.6uL, PrimerF 10uM: 0.12uL, PrimerR 10uM:
0.12uL, Taq Platinum: 0.2uL, ADN punch: 3 unid.
Ciclos PCR: 94°C x 10min, 35 ciclos (94°C x 1min, 55°C x 1.5min, 72°C x
1min), 72°C x 10 min
26
bandas de ADN en los geles respectivos. Sobre la base de la bibliografía
revisada4,27 , en el presente estudio se emplearon los siguientes criterios para la
lectura e interpretación de las corridas electroforéticas:
2. Para el polimorfismo 174G/C del gen IL-6 los resultados se interpretaron bajo el
criterio 198pb = Alelo C y 140pb = Alelo G.
27
5.9 Ética
28
VI. RESULTADOS
29
Tabla N°1. Resultados de los genotipos según característica
30
Tabla N°2: Frecuencias genotípicas de los polimorfismos Pro12Ala del gen
PPAR-γ2 y 174G/C del gen IL-6
CASO CONTROL
Frecuencia genotípica OR IC 95% p
n % n %
Pro/Pro (C/C) 24 48 28 56 0.73 0.33 - 1.59 0.55
Pro/Ala (C/G) 25 50 22 44 1.27 0.58 - 2.80 0.69
PPAR-γ2
Ala/Ala (G/G) 1 2 0 0 NC - -
Total 50 100 50 100
C/C 12 24 13 26 0.9 0.36 - 2.22 1
C/G 11 22 8 16 1.48 0.54 - 4.06 0.61
IL-6
G/G 27 54 29 58 0.85 0.39 - 1.87 0.84
Total 50 100 50 100
NC: Resultado no calculado debido a la frecuencia nula del genotipo Ala/Ala en el grupo control.
CASO CONTROL
Frecuencia alélica OR IC 95% p
n % n %
Pro (C) 73 73 78 78 0.76 0.40 - 1.46 0.51
PPAR-γ2 Ala (G) 27 27 22 22 1.31 0.69 - 2.51 0.51
Total 100 100 100 100
C 35 35 34 34 1.05 0.58 - 1.87 1
IL-6 G 65 65 66 66 0.96 0.53 - 1.71 1
Total 100 100 100 100
31
Las distribuciones genotípicas observadas en los grupos caso y control del SNP
174G/C IL-6 no son concordantes con lo esperado bajo la hipótesis de equilibrio
de Hardy-Weinberg (p-HW control = 0.0001, p-HWcaso = 0.0004, p-HW < 0.05).
Equilibrio de Hardy-Weinberg
2
SNP Grupo X Pearson p-HW
Caso 8.41 0.09
Pro12Ala PPAR-γ2
Control NC 0.08
Caso 16.71 0.0001
174G/C IL-6
Control 31.87 0.0004
NC: Resultado no calculado debido a la frecuencia nula del genotipo Ala/Ala en el grupo control.
La evaluación del Odds Ratio de los SNPs combinados Pro12Ala del gen PPAR-
γ2 y 174G/C del gen IL-6 en los grupos de casos y controles se muestran en la
tabla N° 6. El análisis pareado del alelo “Ala” del gen PPAR-γ2 con el alelo “C” del
gen IL-6 evidencia una diferencia significativa entre los grupos de casos y
controles (p=0.03). A pesar de que se demuestra que en el análisis de las
frecuencias alélicas pareadas existe una diferencia significativa entre los grupos
casos y controles; debe desestimarse este resultado debido a que el grupo control
del gen IL-6 no cumplió con la condición de equilibrio de Hardy-Weinberg.
32
Tabla N°5: Análisis del Odds Ratio de la interacción pareada de los
genotipos Pro12Ala del gen PPAR-γ2 y 174G/C del gen IL-6 en los grupos
caso y controle.
NC: Resultado no calculado debido a la frecuencia nula del polimorfismo en el grupo control.
Tabla N°6: Análisis del Odds Ratio de la interacción pareada de los alelos
Pro12Ala del gen PPAR-γ2 y 174G/C del gen IL-6 en los grupos caso y
controle.
33
VII. DISCUSIÓN
34
Instituto de Medicina Tropical “Daniel Alcides Carrión” – UNMSM) la epidemiología
molecular es definida como la ciencia que estudia las causas de la aparición,
propagación, mantenimiento y descenso de los problemas de salud en
poblaciones mediante el uso de las técnicas de la biología molecular -como el
estudio del ADN para identificar biomarcadores en muestras humanas-, con la
finalidad de prevenirlos o controlarlos; es decir, “la biología molecular al servicio
del enfoque epidemiológico”. 58, 59
36
restricción son más pequeños y el gel de poliacrilamida permite que la resolución
de bandas se visualice con mayor nitidez.
Nuestros resultados no son concordantes con los hallazgos de Byung Cheol Lee
et al en población coreana (casos n=283: Pro/Pro=90%, Pro/Ala=10%; controles
n=141: Pro/Pro=91%, Pro/Ala=9%)50 ni con los de Zouari Bouassida K. et al en
población tunecina (casos n=242: Pro/Pro=89%, Pro/Ala=11%; controles n=246:
Pro/Pro=90%, Pro/Ala=9%, Ala/Ala=1%)27 quienes tampoco demostraron algún
riesgo significativo asociado con los SNPs del gen PPAR-γ2; sin embargo, el alelo
Ala12 se encontró significativamente asociado con niveles altos de presión arterial
sistólica en el grupo de pacientes diabéticos27. Estos resultados, aunque son muy
diferentes a los encontrados en estudios de nuestra región 33,49, son concordantes
entre sí.
Las frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo 174 G/C del gen IL-6
obtenidas en nuestro estudio no son concordantes con otros resultados de la
región. Huerta D. et al (n=90; frecuencias genotípicas: C/C=10%, C/G=16%,
G/G=74%, frecuencias alélicas: C=18%, G=82%)33 y Pérez F. et al (n=103;
frecuencias genotípicas: C/C=1%, C/G=26%, G/G=73%, frecuencias alélicas:
C=15%, G=85%)32 obtuvieron resultados muy comparables entre sí en controles
sanos de Perú y Chile respectivamente. En ambos estudios la muestra estudiada
cumplió con el equilibrio de Hardy-Weinberg, hecho que refuerza nuestra teoría de
que el tamaño y estratificación de la muestra influyó en nuestro análisis de
validación poblacional.
38
Illig et al. (2004) determinaron la asociación del SNP -174G/C del gen de IL-6 en
704 participantes de un estudio, hallando una asociación significativa con la DM-II
en pacientes almenanes (OR=1.51, 95% IC, 1.11-2.07, p=0.0096)4; hallazgo
similar al encontrado por un grupo de investigadores mexicanos, quienes
determinaron una asociación significativa en 90 miembros de 30 familias en un
estudio de de ligamiento entre el polimorfismo -174G/C de la IL-6 con la DM-II
(OR=1.23, 95% IC, 1.01 – 0.5) 34. Según Hyo-Jeong et al (2010), el estudio de Illig
et al. (2004) demostró un grado de asociación bajo entre el polimorfismo 174G/C
del gen de IL-6 con la DM-II. 21
Nuestros resultados tampoco guardan relación con los datos obtenidos por Illig et
al 4 en 704 participantes alemanes. Este equipo de investigación calculó un OR del
alelo 174-G de 1,59 (IC=95%, 1,03-2,44) determinando una diferencia significativa
entre los grupos de casos y controles (p=0.036).
Un único SNP puede causar una enfermedad mendeliana; no obstante, para las
enfermedades complejas, los SNPs no suelen funcionar individualmente, sino que
trabajan en asociación con otros SNPs para manifestarse clínicamente 8. Un
número limitado de estudios ha evaluado el riesgo común al combinar información
de varios polimorfismos que predisponen genéticamente a la DM-II; en la mayoría
los casos, los polimorfismos individuales sólo determinan un riesgo moderado, lo
cual posee un valor clínico poco útil en la evaluación del riesgo genético a
desarrollar la enfermedad. Un grupo de investigadores del Reino Unido evaluó el
efecto combinado de múltiples alelos de susceptibilidad de tres SNPs
comúnmente estudiados de forma individual (Lys23 de KCNJ11, Pro12 de PPAR-
γ2 y un alelo T en rs7903146 del TCF7L2). Los OR de los alelos individuales
oscilaron entre 1.14 (95% IC, de 1.05 a 1.23) hasta 1.48 (95% IC, de 1.36 a 1.60).
En este estudio no se encontró pruebas de la interacción SNP-enfermedad; sin
39
embargo, los riesgos de múltiples alelos fueron consistentes con un modelo
multiplicativo. Cada alelo de riesgo adicional aumentó las probabilidades de
diabetes tipo 2 en 1.28 veces (95% CI, de 1.21 a 1.35).28
Cada vez resulta más evidente que la base genética de la DM-II implica múltiples
genes y que la interacción con otros loci de susceptibilidad y/o factores
ambientales pueden resultar en efectos más sustanciales.
41
VIII. CONCLUSIONES
42
IX. RECOMENDACIONES
43
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Todd JA, Bell JI and McDevitt HO. HLA-DQ (beta) gene contributes to
susceptibility and resistance to insulin-dependent diabetes mellitus. Nature
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50
XI. ANEXOS
51
de diabetes mediada anticuerpos contra el receptor de la insulina y otros.
inmunológicamente
52
Anexo N° 2: Otros polimorfismos relacionados con la DM-II (Willer
et al.). 39
53
Anexo N° 3: Operacionalización de variables
54
Anexo N° 4: Método de purificación de ADN FTA Cards Whatman
®
55
Mezclar la suspensión con ayuda de un vortex por 2 minutos, dejar en
reposo por 2 minutos.
Repetir el paso anterior 2 veces.
Descartar el sobrenadante.
Dejar secar a 37°C por 24 horas.
56
Anexo N° 5: Protocolos de amplificación y restricción
Master mix: H2O PCR: 9.04uL, Buffer10x: 1.2uL, dNTPs 2.5mM: 0.96uL,
MgCl2 50mM; 0.36uL, PrimerF 10uM: 0.12uL, PrimerR 10uM:
0.12uL, Taq Platinum: 0.2uL, ADN punch: 4 unid.
Ciclos PCR: 94°C x 5min, 36 ciclos (94°C x 1min, 55°C x 1min, 72°C x
1min), 72°C x 10 min
Master mix: H2O PCR: 8.80uL, Buffer10x: 1.2uL, dNTPs 2.5mM: 0.96uL,
MgCl2 50mM; 0.6uL, PrimerF 10uM: 0.12uL, PrimerR 10uM:
0.12uL, Taq Platinum: 0.2uL, ADN punch: 3 unid.
Ciclos PCR: 94°C x 10min, 35 ciclos (94°C x 1min, 55°C x 1.5min, 72°C x
1min), 72°C x 10 min
57