Elisa Instructivo

2023
ENSAYO DE INMUNOADSORCIÓN
LIGADO A ENZIMAS (ELISA)
INSTRUCTIVO PRÁCTICO INMUNODIAGNÓSTICO 202320
CLAUDIA LLANOS TRONCOSO

INMUNODIAGNÓSTICO
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
La técnica ELISA ("Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay" Ensayo inmunoabsorbente ligado a

enzimas) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante
anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo,
un colorante, puede ser medido espectofotométricamente.
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación
de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ej. en el clonaje
de anticuerpos monoclonales), o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A
continuación, se describen los más comunes.
1. En un ELISA directo, el antígeno se une al fondo del pocillo

de la microplaca y, a continuación, se añade un anticuerpo
específico del antígeno, conjugado a su vez a una enzima u
otra molécula que permita su detección.
2. En un ELISA indirecto, el antígeno se une al fondo del

pocillo de la microplaca y posteriormente se añade un
anticuerpo específico del antígeno. A continuación, se une
al primer anticuerpo un anticuerpo secundario conjugado
con una enzima u otra molécula de detección.
3. En un ELISA competitivo se une al fondo del pocillo de la

microplaca un antígeno de referencia. Se añade a los pocillos
la muestra más el anticuerpo y si existe un antígeno presente
en la muestra, compite con el antígeno de referencia por la
unión al anticuerpo. El material no unido se elimina con los
lavados. Cuanto más antígeno hay en la muestra, menos
anticuerpo termina unido al fondo de los pocillos a través del
antígeno de referencia y, por tanto, menos señal.
INMUNODIAGNÓSTICO
4. En el ELISA tipo sándwich se usan dos anticuerpos

específicos de dos epítopos diferentes presentes en el
antígeno diana. El anticuerpo de captura se une al fondo del
pocillo de la microplaca uniéndose a uno de los epítopos del
antígeno. El anticuerpo de detección se une a un epítopo
diferente del antígeno y está conjugado a una enzima que
permite su detección. (Si el anticuerpo de detección no está
conjugado, entonces se necesita un anticuerpo de
detección secundario conjugado con una enzima).
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en fase sólida para la detección cualitativa de

IgG contra Trypanosoma cruzi (T. cruzi) en suero o plasma humano.
La enfermedad de Chagas es una infección zoonótica transmitida por insectos por el protozoo
T. cruzi, que causa una infección sistémica en humanos con manifestaciones agudas y de larga
duración. Aproximadamente 50.000 personas mueren cada año a causa de la enfermedad de
Chagas crónica (Organización Mundial de la Salud)". El examen de la capa leucocitaria, la
detección por PCR y los xenodiagnósticos son los métodos2.3 más utilizados en el diagnóstico
de la infección aguda por T. cruzi, ya que la parasitemia es elevada en las infecciones agudas. Sin
embargo, la parasitemia es muy baja en las infecciones crónicas, lo que hace que la detección
de anticuerpos sea el método de elección durante las últimas etapas de la infección". El ELISA
RecombiLISA Chagas IgG utiliza múltiples antígenos recombinantes para detectar gG frente a T.
cruzi en suero o plasma humano. En comparación con las pruebas tradicionales basadas en
antígenos nativos, el RecombiLISA Chagas IgG ELISA es altamente específico y censitivo.
PRINCIPIO DE PRUEBA
El RecombiLISA Chagas IgG ELISA es test ligado a enzimas en fase sólida basado en el principio
de la técnica EIA indirecta para la detección de Ig T. cruzi en suero o plasma humano.
RecombiLISA Chagas IgG ELISA se compone de dos componentes clave:

1. Micropocillos sólidos prerevestidos con antígeno recombinante de T. cruzi.
2. Conjugados líquidos compuestos de peroxidasa de rábano picante conjugada con anti-
IgG humana de ratón (conjugado HRP-anti-IgG humana)
Durante el ensayo, la muestra de prueba se incuba primero en los micropocillos antig patados
de T. cruzi recombinante. El anti-T. cruzi IgG, si está presente en la muestra, se une al antígeno
de la superficie del micropocillo y cualquier muestra no unida se elimina mediante un lavado.
Durante una segunda incubación con el conjugado HRP-anti-IgG humana, el anticuerpo IgG
unido a la superficie del micropocillo se une a la IgG antihumana en el conjugado HRP formar un
inmunocomplejo conjugado. Luego, el conjugado no unido se elimina con washi. Luego se añade
sustrato MB a los micropocillos y se confirma la presencia del conjugado. omplex se muestra por
el desarrollo de un color azul resultante de una reacción entre e enzima y sustrato. Esta reacción
luego se apaga al agregar el S solución, y el valor de absorbancia para cada micropocillo se
determina usando electrofotómetro a 450/620-690 nm.
INMUNODIAGNÓSTICO
Almacenamiento y estabilidad
Los reactivos, excepto el tampón de lavado concentrado, están listos para usar tal como se
suministran. Guarde todos los componentes a 2-8°C. No congelar. Evite la luz intensa. Asegúrese
de que los reactivos estén a temperatura ambiente antes de abrirlos. Vuelva a sellar los
micropocillos después de retirar la cantidad deseada de pocillos. Coloque los pocillos no
utilizados en la bolsa de plástico con cierre proporcionada y regréselo a 2-8°C. Todos los
reactivos son estables hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta si no se abren.
Toma y preparación de muestra
- El suero o el plasma deben prepararse a partir de sangre entera obtenida mediante una
técnica de punción venosa aceptable.
- Este kit está diseñado para usarse únicamente con muestras de suero o plasma sin
aditivos.
- Si no se analiza inmediatamente, la muestra se puede almacenar a 2-8°C por hasta 7
días. Las muestras deben congelarse a -20°C para un almacenamiento más prolongado.
Evite múltiples ciclos de congelación y descongelación. Si se va a enviar una muestra,
empaquetarla de acuerdo con las regulaciones federales que cubren el transporte de
agentes etiológicos.
- Las muestras que contienen precipitantes pueden dar resultados de prueba
inconsistentes. Clarifique dichas muestras mediante centrifugación antes del ensayo.
- No utilice muestras de suero que demuestren lipemia grave, hemólisis grave o turbidez.
No utilice muestras que contengan azida sódica.
Procedimiento
1. Calcule el número deseado de micropocillos. Retire el microondas restante y colóquelo con

desecante en la bolsa de plástico con cierre, ciérrela y guárdela a 2-8 °C para su uso posterior.
2. Agregue muestras según la designación en la Hoja de trabajo de ELISA:

2.1 Pozo en blanco: No agregue ningún reactivo.
2.2 Pocillos de control: agregue 100 μL de control positivo y negativo de IgG de Chagas en los
pocillos de control designados, respectivamente.
2.3 Pocillos de prueba: agregue 100 µL de diluyente de muestra a todos los pocillos de prueba y
luego transfiera 10 μL de cada muestra de prueba a cada pocillo de prueba, respectivamente.
3. Agite la microplaca suavemente durante 20 segundos y luego cubra la placa con sellador de
microplacas.
4. Incubar los pocillos a 37°C durante 30 minutos.
5. Paso de lavado (se puede realizar manualmente o con lavado automático

Lavado manual: retire con cuidado la mezcla de incubación desechando la solución en un
recipiente para residuos. Llene cada pocillo con 350 µl de Wash Buff diluidos y agite suavemente
durante 20 a 30 segundos. Deseche el solución de lavado completa Repita 4 veces más. Después
de completar el último paso de lavado, golpee el plato con papel absorbente para eliminar el
líquido residual.
Lavado automático: El lavador de placas automático debe estar calibrado para garantizar un
lavado eficiente. Aspire completamente la mezcla de incubación de todos los pocillos. Llene bien
INMUNODIAGNÓSTICO
con 350 l de tampón de lavado diluido. Aspire todos los pocillos por completo. Repita 4 meses
veces.
6. Agregue 100 µL de conjugado HRP-anti-IgG humana en cada pocillo excepto en el pocillo

blanco. Cubre el plato con un sellador.
7. Incubar a 37°C durante 20 minutos.
8.Lave la placa 5 veces como se describe en el paso
9. Agregue 50 µL de Sustrato A de TMB y 50 µL de Sustrato B de TMB en cada w, incluidos los

pocillos en blanco.
10. Incubar a 37°C en oscuridad durante 10 minutos.
11. Detenga la reacción agregando 50 μL de solución de parada a cada pocillo. Mezclar

suavemente durante 30 segundos. Es importante asegurarse de que todo el color azul cambie
completamente a un color amarillo.
12. Establezca la longitud de onda del lector de microplacas a 450 nm. Mida la absorbancia (OD)
de cada pocillo frente al pocillo en blanco dentro de los 15 minutos posteriores a la adición de
la solución de parada. Se puede utilizar un filtro de 620-690 nm como longitud de onda de
referencia para optimizar el resultado del ensayo.
Interpretación de Resultados.
CONTROLES
Configurar el valor de corte
El valor de corte (Cut-off)= 0,15+N
N: DO media del control negativo. Utilice N=0,05 para calcular el valor de corte si es inferior a
0,05.
Cálculo de la relación DO de la muestra.

Calcule una relación de DO para cada muestra dividiendo su valor de DO por el valor de corte de
la siguiente manera:
DO Muestra
Relación de la DO de la muestra = Valor Cut−off
Validación del ensayo

El valor medio de DO de los controles positivos de Chagas IgG debe ser >0,50.
El valor medio de DO de los controles negativos de Chagas IgG debe ser ≤ 0,10
MUESTRA
MUESTRA Relación DO de la muestra.

Negativo <1,00
Positivo ≥1,00
*El resultado negativo indica que no hay anticuerpo IgG anti T.Cruzi.
*Es aconsejable analizar las muestras por duplicado.

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Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

La técnica ELISA ("Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay" Ensayo inmunoabsorbente ligado a

1. En un ELISA directo, el antígeno se une al fondo del pocillo

2. En un ELISA indirecto, el antígeno se une al fondo del

3. En un ELISA competitivo se une al fondo del pocillo de la

4. En el ELISA tipo sándwich se usan dos anticuerpos

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en fase sólida para la detección cualitativa de

RecombiLISA Chagas IgG ELISA se compone de dos componentes clave:

Toma y preparación de muestra

1. Calcule el número deseado de micropocillos. Retire el microondas restante y colóquelo con

2. Agregue muestras según la designación en la Hoja de trabajo de ELISA:

4. Incubar los pocillos a 37°C durante 30 minutos.

5. Paso de lavado (se puede realizar manualmente o con lavado automático

6. Agregue 100 µL de conjugado HRP-anti-IgG humana en cada pocillo excepto en el pocillo

7. Incubar a 37°C durante 20 minutos.

8.Lave la placa 5 veces como se describe en el paso

9. Agregue 50 µL de Sustrato A de TMB y 50 µL de Sustrato B de TMB en cada w, incluidos los

10. Incubar a 37°C en oscuridad durante 10 minutos.

11. Detenga la reacción agregando 50 μL de solución de parada a cada pocillo. Mezclar

Cálculo de la relación DO de la muestra.

Validación del ensayo

MUESTRA Relación DO de la muestra.

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