Introducción

INTRODUCCIÓN
La amplificación de material genético extraído mediante la técnica de PCR convencional, o

Reacción en Cadena de la Polimerasa, ha revolucionado la investigación y el diagnóstico en
el campo de la inmunología. Desde su desarrollo en la década de 1980 por Kary Mullis y su
colega Faloona, esta poderosa técnica ha permitido a los científicos duplicar secuencias
específicas de ADN o ARN de manera eficiente y precisa. La PCR convencional ha allanado
el camino para una comprensión más profunda de la respuesta inmunológica y su relación
con una amplia gama de enfermedades, desde trastornos autoinmunes hasta infecciones
virales (James & Glare, 2018).
La PCR convencional ha demostrado ser una herramienta invaluable en el arsenal de

los inmunólogos. Esta técnica permite la amplificación de secuencias genéticas específicas, lo
que resulta fundamental para identificar marcadores genéticos de enfermedades autoinmunes
y para detectar material genético de patógenos infecciosos. La capacidad de amplificar y
analizar fragmentos de ADN o ARN con precisión ha revolucionado la comprensión de los
mecanismos inmunológicos subyacentes. Además, la PCR convencional se ha utilizado en
estudios para caracterizar la respuesta inmunológica a vacunas y para investigar la
variabilidad genética relacionada con la susceptibilidad a infecciones (Lodish, 2005).
Uno de los aspectos más notables de la PCR convencional en inmunología es su

contribución al diagnóstico de enfermedades. La detección de patógenos, la identificación de
biomarcadores y la caracterización de respuestas inmunológicas específicas son áreas
cruciales en el diagnóstico de trastornos inmunológicos y enfermedades infecciosas. La PCR
convencional ha mejorado la precisión y la velocidad de estos procesos, lo que tiene un
impacto directo en la atención médica (Griffiths et al, 2002).
OBJETIVO
 Amplificar las muestras de DNA genómico previamente extraído con el kit comercial,
utilizando PCR convencional empleando oligonucleótidos específicos.
MATERIALES Y REACTIVOS
• Alícuota de DNA genómico extraído.
• Tubos de 1,5, 0,5 o 0,2 mL estériles
• Micropipetas y puntas (10, 200, 1000µL)
• Flujo laminar
• Agua estéril ultrapura
• Isopor con hielo
• Marcador de tubos
• Guantes y alcohol 70%
• Reactivos PCR: Buffer 10x, Buffer, Mg+2Cl, dNTPs. Primers: LBF y LBR, DNApol
• DNA genómico L. braziliensis
• Equipos: Termociclador Verity, mini spin
METODOLOGÍA
Primers Concentración (μM) Tm (° C)
LBF 100 μM 68,3

LBR 100 μM 70,7
 Como pasos previos se trabajaron en las concentraciones de los primers LBF y LBR,
teniendo en cuenta las siguientes informaciones:
 Para la solución de trabajo se utilizó 10µM de cada oligonucleótido.
 Se calcularon los volúmenes y luego se preparó el mix, que llevó todos los reactivos a
excepción del DNA genómico. Se dispensaron en tubos de PCR, y se agregó el
volumen calculado de DNA a cada tubo, fuera del espacio destinado para preparar la
mix
CÁLCULOS Y RESULTADOS
Reactivo Concentración inicial Volumen µL (1 Concentración final

tubo)
Buffer 10 x 30 1x
Mg +2 50 mM 9 1,5 mM
dNTPs 10 mM 60 2 mM
LBF 10 µM 6 0,2 µM
LBR 10 µM 6 0,2 µM
DNApol 2.5 U 0,4 1U
Água 68,6
DNA L. braziliensis 10 ng/µL 120 4 ng/ µL
Total 50 µL
DESCRIPCIÓN Y ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
Los resultados de una PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) dependen de la

presencia o ausencia de amplificación de una secuencia de ADN específica. Los resultados
típicos de una PCR utilizando los reactivos mencionados fueron:
 Buffer: El buffer proporcionó las condiciones óptimas de pH y salinidad para que la

enzima de ADN polimerasa funcione correctamente. La presencia del buffer fue
necesaria para mantener un ambiente propicio para la amplificación de ADN (White,
1993).
 Mg^2+: El ion de magnesio (Mg^2+) fue esencial para la actividad de la ADN

polimerasa, ya que actúo como cofactor para la enzima. La presencia adecuada de
Mg^2+ es crucial para la eficiencia de la PCR (Ídem).
 dNTPs (nucleótidos desoxirribonucleósidos trifosfato): Los dNTPs fueron los

bloques de construcción del ADN. Estos fueron necesarios para sintetizar nuevas
cadenas de ADN complementarias a la plantilla original durante la PCR (Frey, 2011).
 LBF y LBR (Cebadores o Primers): Los cebadores son pequeñas secuencias de

ADN diseñadas específicamente para hibridarse con la secuencia de ADN que se
desea amplificar. En este caso, LBF y LBR fueron los cebadores utilizados (Ídem).
 DNA polimerasa: La ADN polimerasa es la enzima que realizó la síntesis del nuevo
ADN complementario a partir de los cebadores. Puede ser la Taq polimerasa u otra
enzima termoestable (Ídem).
 Agua: El agua se utiliza como componente del reactivo y para ajustar el volumen total
de la reacción (White, 1993).
 DNA L.braziliensis: Este es el ADN que se deseó amplificar. La presencia de ADN

de L. braziliensis es el material genético objetivo que se amplificará mediante la PCR.
El resultado principal de la PCR fue la amplificación de la secuencia de ADN de L.
braziliensis, con ayuda de los cebadores son específicos y las condiciones adecuadas de
temperatura y tiempo. Esto resultó en la obtención de una cantidad significativamente mayor
de ADN amplificado en comparación con la cantidad inicial.
Para interpretar completamente los resultados de una PCR, se suelen realizar análisis
posteriores, como la electroforesis en gel, para verificar la presencia de los fragmentos
amplificados y su tamaño, lo que proporciona una confirmación visual de si la amplificación
se ha logrado con éxito (Ídem).
 Responder las siguientes preguntas:
1. ¿En qué consiste una PCR? (Describe el proceso y qué se necesita para
llevarla a cabo).
La PCR es una técnica de biología molecular ampliamente utilizada para copiar,

amplificar y estudiar secuencias específicas de ADN. Consiste en un proceso de tres etapas
principales: desnaturalización, alineación de cebadores y extensión, y se realiza en un
termociclador que controla las temperaturas necesarias para cada etapa:
Desnaturalización: El ADN de la muestra se calienta a una temperatura elevada

(generalmente alrededor de 94-98°C). Esto rompe los puentes de hidrógeno entre las dos
cadenas complementarias del ADN, lo que resulta en la separación de las hebras de ADN y la
formación de dos hebras simples de ADN (Dennis, 2008).
Alineación de cebadores: La temperatura se reduce a un rango específico (alrededor de 50-

65°C), permitiendo que los cebadores (pequeñas secuencias de ADN) se unan a las
secuencias de ADN complementarias en la muestra. Los cebadores son esenciales porque
determinan la región específica que se amplificará. A través de la complementariedad de las
bases, los cebadores se unen de manera específica a las secuencias objetivo (Ídem).
Extensión: La temperatura se eleva nuevamente, a menudo alrededor de 72-75°C, y la ADN

polimerasa, una enzima termoestable, comienza a sintetizar una nueva hebra complementaria
al ADN original utilizando los cebadores como punto de partida. Esto da como resultado la
formación de una nueva hebra de ADN complementaria a la secuencia objetivo. El proceso
de desnaturalización, alineación de cebadores y extensión se repite en ciclos sucesivos para
amplificar exponencialmente la cantidad de la secuencia de ADN deseada (Ídem).
2. ¿Para qué sirve una PCR?
Sirve para amplificar secuencias específicas de ADN en una muestra. Esto tiene una
amplia gama de aplicaciones en la biología molecular y la investigación científica, así como
en la medicina y otros campos (Griffiths et al, 2002).
3. Investigue al menos tres variantes de esta técnica.
PCR en Tiempo Real: Esta técnica permite no solo la detección de la amplificación de ADN
o ARN en tiempo real, sino también su cuantificación durante el proceso. Emplea sondas
fluorescentes que se unen a las secuencias amplificadas, midiendo la cantidad de
fluorescencia en cada ciclo de PCR. Esto proporciona datos cuantitativos precisos sobre la
cantidad de material genético presente en la muestra, siendo ampliamente utilizada en
aplicaciones de expresión génica y detección de virus (Lodish, 2005).
PCR Múltiple: Con esta variante, se puede amplificar simultáneamente múltiples secuencias
de ADN en una única reacción. Se utilizan múltiples juegos de cebadores específicos para
diferentes fragmentos de ADN, lo que posibilita la detección de varias secuencias objetivo en
un solo tubo de reacción. Esto resulta útil en situaciones donde se necesita identificar varios
patógenos en una muestra o amplificar diversos genes de interés en un solo experimento
(Griffiths et al, 2002).
PCR Cuantitativa Digital: Permite cuantificar la cantidad absoluta de ADN o ARN en una
muestra sin necesidad de curvas de calibración. Divide la muestra en pequeños
compartimentos individuales, donde ocurre la PCR de forma independiente. Luego, se analiza
cuántos compartimentos contienen amplificación y cuántos no. Esto proporciona una medida
absoluta de la concentración del material genético en la muestra, lo que es especialmente útil
en aplicaciones de alta sensibilidad, como la detección de mutaciones genéticas raras o la
cuantificación precisa de copias genéticas (Klug et al, 2006).
CONCLUSIÓN
Se logró amplificar las muestras de DNA genómico previamente extraído con el kit
comercial, utilizando PCR convencional empleando oligonucleótidos específicos. La
precisión y eficiencia de la PCR convencional, respaldada por el uso de cebadores específicos
aseguro la obtención de resultados fiables para futuros análisis y experimentos.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- DENNIS, L. (2008). Clinical Applications of PCR. Estados Unidos: Humana Press.
- FREY, J. (2003). PCR Detection of Microbial Pathogens. Italia: Humana Press.
- GRIFFITHS, A., MILLER, J., SUZUKI, D., LEWONTIN, R. y GELBART, W. (2002).
Genética. McGraw-Hill.
- JAMES, A. M., & GLARE, E. M. (2018). Polymerase chain reaction: Basic protocol plus
troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments, (134),
e56417.
- KLUG, W. CUMMING, M. y SPENCER, C. (2006). Conceptos de genética. Pearson.
- LODIS, H. (2005). Biología celular y molecular. Argentina. Médica Panamericana.
- WHITE, B.A. (1993). PCR Protocols: Current Methods and
Applications. Alemania: Humana Press.

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La amplificación de material genético extraído mediante la técnica de PCR convencional, o

La PCR convencional ha demostrado ser una herramienta invaluable en el arsenal de

Uno de los aspectos más notables de la PCR convencional en inmunología es su

• Alícuota de DNA genómico extraído.

• Tubos de 1,5, 0,5 o 0,2 mL estériles

• Micropipetas y puntas (10, 200, 1000µL)

• Agua estéril ultrapura

• Isopor con hielo

• Guantes y alcohol 70%

• DNA genómico L. braziliensis

• Equipos: Termociclador Verity, mini spin

Primers Concentración (μM) Tm (° C)

LBF 100 μM 68,3

Reactivo Concentración inicial Volumen µL (1 Concentración final

Los resultados de una PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) dependen de la

 Buffer: El buffer proporcionó las condiciones óptimas de pH y salinidad para que la

 Mg^2+: El ion de magnesio (Mg^2+) fue esencial para la actividad de la ADN

 dNTPs (nucleótidos desoxirribonucleósidos trifosfato): Los dNTPs fueron los

 LBF y LBR (Cebadores o Primers): Los cebadores son pequeñas secuencias de

 DNA L.braziliensis: Este es el ADN que se deseó amplificar. La presencia de ADN

 Responder las siguientes preguntas:

La PCR es una técnica de biología molecular ampliamente utilizada para copiar,

Desnaturalización: El ADN de la muestra se calienta a una temperatura elevada

Alineación de cebadores: La temperatura se reduce a un rango específico (alrededor de 50-

Extensión: La temperatura se eleva nuevamente, a menudo alrededor de 72-75°C, y la ADN

3. Investigue al menos tres variantes de esta técnica.

- DENNIS, L. (2008). Clinical Applications of PCR. Estados Unidos: Humana Press.

- FREY, J. (2003). PCR Detection of Microbial Pathogens. Italia: Humana Press.

- GRIFFITHS, A., MILLER, J., SUZUKI, D., LEWONTIN, R. y GELBART, W. (2002).

troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments, (134),

- KLUG, W. CUMMING, M. y SPENCER, C. (2006). Conceptos de genética. Pearson.

- LODIS, H. (2005). Biología celular y molecular. Argentina. Médica Panamericana.

- WHITE, B.A. (1993). PCR Protocols: Current Methods and

Applications. Alemania: Humana Press.

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