Manual de funcionamiento espectofotómetro de

fluorescencia Shimadzu referencia RF-6000

PRECAUCIONES EN LA OPERACIÓN

▪ Cuando se realicen análisis que requieren de alta sensibilidad, permitir que el

instrumento se estabilice. La lampara de arco de Xenón toma entre 30 a 60 minutos
en estabilizarse.
▪ Mantener siempre la puertilla cerrada durante las mediciones.
▪ Cuando se realicen análisis que requieran de alta sensibilidad, mantener la
temperatura ambiental constante. No cambiar la configuración del aire acondicionado
durante el análisis.
▪ Una vez finalizado el análisis, no dejar la muestra en la cámara de muestras. Las
muestras volátiles pueden contaminar la cámara.

1. CÓMO LLEGAR A MODO DE ANALISIS DESDE EL MENU

PRINCIPAL:

El espectofometro de fluorescencia RF-6000 cuenta con varios modos para analisis de

muestras (espectro, espectro 3D, fotometrico, rendimiento cuántico, y eficiencia cuántica).

Para llegar al menu de selección del metodo se ingresa desde el icono “LabSolutions RF”
que se encuentra en el escritorio del computador.

A continuación, se presenta un ejemplo cuando se inicializa LabSolutions RF. En esta

interface se muestra lo correspondiente a los modos de lectura y configuraciones
generales del equipo. Por lo que se muestra una pestaña que contiene los análisis
básicos como Spectrum, 3D Spectrum, Quantitation, Photometric, y Time Course, seguido
de una pestaña de análisis especiales como Quantum Yield y Quantum efficiency.
Una vez se ingrese al modo de lectura deseado, se procede a enceder el equipo del
switch, el cual se encuentra en la parte lateral derecha inferior del equipo.

Switch de
encendido

Una vez el equipo sea encendido, deberá dirigirse al software y dar click donde dice
“Connect” para establecer conexión con el equipo.
 Presionar
“Connect”

A causa de la configuración interna del Software, aparece una alerta al momento de

conectar el equipo con el software, la cual indica que el tiempo transcurrido desde la
instalación del equipo ha superado 10 años. Sin embargo, este aviso debe omitirse dando
click en “Aceptar”.

Una vez encendido el equipo y conectado al software deberá esperar alrededor de 30

minutos antes de empezar los analisis, esto con el fin de que el sistema óptico, y los
detectores se estabilicen, además de obtener la temperatura optima de trabajo de la
lámpara de Arco de Xenón.
 Transcurrido el tiempo de iniciación, deberá suministrar los parámetros de la medición
dependiendo del modo de lectura, como lo son rango de excitación (nm), rango de
emisión (nm), apertura de Slid, filtros de radiación, etc. Para lo cual debe dirigirse a
“Settings”

Presionar
“Settings”

Parámetros
de medición

Nombre del
archivo y
ubicación

2 LECTURA DE LAS MUESTRAS

El instrumento cuenta con dos accesorios para la lectura, uno para muestras líquidas, y
otro para muestras sólidas. El accesorio para la lectura de muestras líquidas posee un
compartimento en el cual se ubica la celda de cuarzo o vidrio que permite contener la
muestra o estándar. Mientras que el accesorio para muestras sólidas contiene un soporte
enresortado que sostiene una celda en forma de ventana, el cual puede armarse con
diversas configuraciones según las necesidades específicas de cada muestra.

2.2 Lectura de muestras líquidas

Para realizar el análisis de muestras líquidas es necesario verificar que el accesorio porta
celdas está correctamente ubicado, este contiene una flecha la cual indica la dirección del
haz de luz excitante hacia la muestra, y la radiación de emisión de la muestra hacia el
detector.

Para instalar el accesorio es necesario ubicarlo de forma que los tornillos guías queden
perfectamente acoplados al accesorio y ajustarse con el tornillo del centro perfectamente.
 Ventana de
emisión

Ventana de
Flecha excitación
indicadora

Tornillos
Porta guía
cubetas

Tornillo de
ajuste

Luego de verificar o instalar el accesorio correcto se procede con el respectivo análisis de

las muestras líquidas. Para llevar a cabo este procedimiento se emplean celdas
especiales para lectura de muestras, tales como celdas de cuarzo que están marcadas
con la letra Q o de vidrio con la letra G.

2.3 Lectura de muestras sólidas

Para realizar el análisis de muestras sólidas es necesario verificar que el accesorio porta
celdas sólidas esté correctamente ubicado.

Para instalar el accesorio es necesario ubicarlo de forma que los tornillos guías queden
perfectamente acoplados al accesorio y ajustarse con el tornillo del centro perfectamente.
La ubicación del accesorio debe quedar en la posición en que la ventana de cuarzo esté
en dirección diagonal, como se muestra en la imagen a continuación.
 Ventana de Ventana de
emisión cuarzo

Ventana de
excitación
Resorte de
ajuste

Tornillo de
ajuste

Tornillos
guía

3. MODO DE LECTURA

Al momento de iniciar el software LabSolutions RF6000 aparecerá una ventana la cual

indica diferentes modos de trabajo como lo son: Spectrum, 3D Spectrum, Quantitation,
Photometric, Time Course y análisis especiales como Quantum yield, Quantum efficiency.
 3.1 Spectrum

El metodo Spectrum es un modo de trabajo que permite seleccionar una longitud de onda
específica y un amplio rango de longitudes de onda de excitación que permiten obtener un
gráfico de intensidad de señal a la longitud de emisión seleccionada en función de las
longitudes de onda de excitación. Para navegar en este modo de trabajo es necesario
seguir los siguientes pasos:

• Modo de trabajo: Dar click en “Spectrum”

• Conexión con el equipo: Una vez se ingresa a la interfaz del modo de lectura, es
necesario conectar el equipo con el software, para lo cual dar click en “Connect” y
esperar a que se establezca la conexión.

• Selección parametros del metodo: Para la selección del los parametros de

lectura debe dar click en “Settings”

Aparecerá una ventana emergente la cual contiene los parametros para la medición como
longitud de onda de emisión, y el rango de excitación, intervalo de adquisición de datos,
velocidad de escaneo y la ubicación del archivo donde se almacenaran los datos.
 Ventana de
medición Ventana de
datos
Parámetros del
análisis

Botón de Inicio
de lectura

Botón de
apertura/cierre
de diafragma
Biblioteca
Longitud AutoZero de datos
de onda

Almacenamiento
del archivo

• Lectura del blanco: Ubicar el blanco en la celda de análisis y dar click en

“AutoZero” para obtener el cero instrumental.

• Lectura de muestras: Ubicar la celda que contiene la muestra se debe dar Click
en “Start”. Antes de iniciar con el análisis aparecerá una ventana emergente en la
que se indica información específica de la muestra como nombre del analista,
 nombre de la muestra, ID de la muestra, y comentarios generales. La información
de la ventana emergente es opcional para llevar a cabo el análisis.

• Datos: Una vez finalizada la lectura de la muestra, deberá dar click en “View”
para procesar los datos obtenidos. En el gráfico se reporta en el eje Y la
intensidad de la señal de emisión a la longitud de onda seleccionada, y en el eje X
el rango de longitudes de onda de excitación.

3.2 3D Spectrum

El metodo 3D Spectrum es un modo de trabajo que permite seleccionar un rango de

longitudes de onda de emisión y un rango de longitudes de onda de excitación que
permiten obtener un gráfico en 3 dimensiones que relaciona la intensidad de la señal,
las longitudes de onda de emisión, y las longitudes de onda de excitación. Para
navegar en este modo de trabajo es necesario seguir los siguientes pasos:

• Modo de trabajo: Dar click en “3D Spectrum”

 • Conexión con el equipo: Una vez se ingresa a la interfaz del modo de lectura, es
necesario conectar el equipo con el software, para lo cual dar click en “Connect” y
esperar a que se establezca la conexión.

• Selección parametros del metodo: Para la selección del los parametros de

lectura debe dar click en “Settings”

Aparecerá una ventana emergente la cual contiene los parametros para la medición como
el rango de longitudes de onda de emisión, y el rango de excitación, intervalo de
adquisición de datos, velocidad de escaneo y la ubicación del archivo donde se
almacenaran los datos.

• Lectura del blanco: Ubicar el blanco en la celda de análisis y dar click en

“AutoZero” para obtener el cero instrumental.

• Lectura de muestras: Ubicar la celda que contiene la muestra se debe dar Click
en “Start”. Antes de iniciar con el análisis aparecerá una ventana emergente en la
que se indica información específica de la muestra como nombre del analista,
nombre de la muestra, ID de la muestra, y comentarios generales. La información
de la ventana emergente es opcional para llevar a cabo el análisis.

• Datos: Una vez finalizada la lectura de la muestra, deberá dar click en “View”
para procesar los datos obtenidos. En el gráfico se reporta la intensidad de la
señal en código de colores, en el eje Y la longitud de onda de emisión, y en el eje
X la longitud de onda de de excitación.
 3.3 Quantitation

El metodo de quantitation o cuantificación permite mediante el uso de estándares de

concentración conocida determinar la concentración de muestras desconocidas. Para ello
es necesario tener claridad en relación a la longitud de onda de emisión y la longitud de
onda de excitación específicas a las que se realizará el análisis.

• Modo de trabajo: Dar click en “Quantitation”

• Selección parametros del metodo: Para la selección del los parametros de
lectura debe dar click en “Settings”

Al iniciar los parámetros de la medición aparecen parametros como el ancho de

banda espectral de emisión y excitación, la sensibilidad, y la acumulación del
tiempo, es decir, el tiempo en que tarda la excitación y la detección de la señal de
emisión. Dar click en siguiente.

Seleccionar método de cuantificación a usar (Multi Point, Single Point, K-Factor) la

longitud de onda de excitación y la longitud de onda de emisión, y dar click en
“Add” para agregar el metodo, en caso de que se requiera usar más metodos,
repetir los pasos descritos. Seleccionar la longitud de onda a medir en WL1 y dar
en siguiente.
 Dar click en “Siguiente” para proceder.

Almacenamiento de los datos y

los parámetros del método

Sección
estándares

Sección
Muestras
• Conexión con el equipo: Una vez se ingresa a la interfaz del modo de lectura, es
necesario conectar el equipo con el software, para lo cual dar click en “Connect” y
esperar a que se establezca la conexión.

• Datos estándares: Para adicionar los datos de los estándares es necesario dar
click en “Add Line”, y colocar el número de líneas (estándares y réplicas).

• Datos muestras: Para adicionar los datos de las muestras en la sección de

muestras es necesario dar click en “Add Line”, y colocar el número de líneas
(muestras y réplicas).

• Metodo de calibración: seleccionar el metodo con los parámetros establecidos y

dar click en “Save As” para guardar.

• Lectura del blanco: Ubicar el blanco en la celda de análisis y dar click en

AutoZero para obtener el cero instrumental.

• Lectura de estándares: Ubicar la celda que contiene los estándares, dar Click en
“Start”. Leer cada estándar en el orden en que se seleccionó en la sección de
estándares.

• Lectura de muestras: Ubicar la celda que contiene la muestra se debe dar Click
en “Start”. Antes de iniciar con el análisis aparecerá una ventana emergente en la
que se indica información específica de la muestra como nombre del analista,
nombre de la muestra, ID de la muestra, y comentarios generales. La información
de la ventana emergente es opcional para llevar a cabo el análisis.

• Datos: Una vez finalizada la lectura de la muestra, deberá dar click en “View” para
procesar los datos obtenidos.
 3.4 Photometric

El metodo fotometrico permite determinar de forma cuantitativa y sin uso de estandares

de calibración la emisión de las muestras. Para ello es necesario tener claridad en
relación a la longitud de onda de emisión y la longitud de onda de excitación específicas a
las que se realizará el análisis.

• Modo de trabajo: Dar click en “Photometric”

• Selección parametros del metodo: Para la selección de los parametros de

lectura debe dar click en “Settings”

Al iniciar los parámetros de la medición aparecen parametros como el ancho de

banda espectral de emisión y excitación, la sensibilidad, y la acumulación del
tiempo.

Dar click en siguiente

 En cuanto se seleccione las longitudes de onda, adicionar dando click en “Add”
para proceder a seleccionarlo.

Dar click en “Finalizar”.

Es necesario adicionar una tabla de información de muestras y/o estándares, para

lo cual debe dar click en “Add Line” y establecer la cantidad de filas que contendrá
la tabla.

Proceder a suministrar información en torno a las muestras como el nombre, el ID,

el tipo (estándar o muestra), y longitud de onda de excitación.

• Conexión con el equipo: Una vez se ingresa a la interfaz del modo de lectura, es
necesario conectar el equipo con el software, para lo cual dar click en “Connect” y
esperar a que se establezca la conexión.
 • Lectura del blanco: Ubicar el blanco en la celda de análisis y dar click en
AutoZero para obtener el cero instrumental.

• Lectura de muestras: Ubicar la celda que contiene la muestra se debe dar Click
en “Start”. Antes de iniciar con el análisis aparecerá una ventana emergente en la
que se indica información específica de la muestra como nombre del analista,
nombre de la muestra, ID de la muestra, y comentarios generales. La información
de la ventana emergente es opcional para llevar a cabo el análisis.

• Datos: Una vez finalizada la lectura de la muestras, los datos apareceran en la

tabla seleccionada reportada generalmente como intensidad de señal.

3.5 Time course

El metodo de tiempo cursado permite determinar la variación de la intensidad de la

emisión en función del tiempo transcurrido.

• Modo de trabajo: Dar click en “Time Course”

• Selección parametros del metodo: Para la selección de los parametros de

lectura debe dar click en “Settings”.

Establecer la longitud de onda de excitación, y la longitud de onda de emisión. Dar

click en “Add”
 Dar click en “Measurement”, seleccionar los parametros del tiempo de lectura.

• Conexión con el equipo: Una vez se ingresa a la interfaz del modo de lectura, es
necesario conectar el equipo con el software, para lo cual dar click en “Connect” y
esperar a que se establezca la conexión.

• Lectura del blanco: Ubicar el blanco en la celda de análisis y dar click en

AutoZero para obtener el cero instrumental.

• Lectura de muestra: Ubicar la celda que contiene la muestra se debe dar Click en
“Start”. Antes de iniciar con el análisis aparecerá una ventana emergente en la que
se indica información específica de la muestra como nombre del analista, nombre
de la muestra, ID de la muestra, y comentarios generales. La información de la
ventana emergente es opcional para llevar a cabo el análisis.

• Datos: Una vez finalizada la lectura de la muestra, los datos apareceran en la

pestaña “View” en un gráfico que muestra la intensidad de la señal en función del
tiempo.

3.6 Quantum Yield

El modo de lectura de rendimiento cuántico compromete un modo de medición y un

modo de verificación de archivos.

• Modo de trabajo: Dar click en “Time Course”

• Modo de operación: Es necesario seleccionar el modo de operación, medición, o
revisión de archivos.

• Selección parametros del metodo: Seleccionar los parametros de la medición.

• Lectura del blanco: Ubicar el blanco en la celda de análisis y dar click en

AutoZero para obtener el cero instrumental.
 • Lectura de muestra estándar: Ubicar la celda que contiene la muestra se debe
dar Click en “Start-Std”. Antes de iniciar con el análisis aparecerá una ventana
emergente en la que se indica información específica de la muestra estándar como
nombre, ID, y además es necesario suministrar la información en torno al
rendimiento cuántico de fluorescencia (número positivo menos a 1), absorbancia
(número positivo menor a 10), e índice de refracción (número positivo menor a 10).

Seleccionar el rango de scan.

Dar click en “Measurement”

3.7 Quantum efficency

Para determinar la eficiencia cuántica es necesario contar con el accesorio de esfera de

integración.
 4. FILTROS DE RADIACIÓN

El instrumento cuenta con un kit de filtros de radiación electromagnetica con diferentes

características que permiten reducir los niveles de ruidos como la luz excitante dispersa,
luces de segundo orden, y/o luces parásitas del monocromador.

Los filtros son ubicados en las ventanas de excitación y/o de emisión y son sujetadas
mediante pinzas también llamadas porta filtros laterales. Algunas de las funcionalidades
de los filtros de longitudes de onda son los siguientes:

▪ Corte de luz excitante dispersa.

Generalmente, la dispersión de la luz excitante procedente de muestras de polvo

sólido es muy intensa. E, incluso si la longitud de onda de excitación es diferente a
la longitud de onda de la longitud de onda de emisión, el nivel de fondo puede
aumentar debido a esta luz excitante dispersa. En este caso, es necesario usar el
filtro IHU310 o L-42 en porta filtros del monocromador de emisión.

▪ Corte de luces de segundo orden de los monocromadores de excitación y

emisión.

Generalmente, el monocromador tipo rejilla emite junto con la luz monocromática

deseada, luces de orden cuyas longitudes de onda ½,1/3… 1/n veces la de la
deseada. En este caso, para eliminar estas longitudes de onda es necesario
insertar los filtros L-42, IHU310 en el porta filtros lateral de excitación.
Considerando las características espectrales, también es posible usar el filtro Y-50
para este propósito, sin embargo, no es adecuado como filtro lateral de excitación
debido a que este emite fluorescencia.
▪ Remoción de luces parásitas del monocromador.

Usualmente, longitudes de onda parasitas débiles en un amplio rango del espectro

se figan a través del monocromador. En este caso, para la remoción de la luz
parasita se usa el filtro U-340, el cual permite el paso solamente la luz de
excitación deseada. Este filtro es usado para micro análisis de fluorescencia
cuando los picos de emisión son superiores a 400 nm.

5. PARTES DEL INSTRUMENTO

No. Nombre Descripción

1 Tapa de la cámara de Abrir y cerra la puerta cuando se prepara la
muestra muestra para la medición. La medición no
comenzará si la tapa está abierta. Si la tapa
se abre durante la medición, será abortada
la lectura.
2 Indicador LED del estado del Indica el estado del instrumento:
instrumento • Estado normal: iluminado constante
o intermitente de color verde.
• Estado anormal: iluminado constante
o intermitente de color rojo.
• Durante la medición: iluminado
constante azul.
3 Tapa de la carcasa de la Abrir y cerrar esta tapa cuando se instale o
lámpara reemplace la lámpara de arco de xenón.
4 Entrada de aire Permite la entrada de aire externo a la
recamara de la lámpara. Contiene un filtro
que impide la entrada de polvo.
No. Nombre Descripción
1 Suministro del conector de Conecta el cable de energía para proveer
energía electricidad al equipo.
2 Puerto USB Permite establecer conexión con el PC.
3 I/O Conector Permite la conexión con el auto muestreador
automático ASC-5.
4 Entrada externa/ La medición puede ser controlada por una
Terminales de salida entrada de contacto externa.
5 Conector de salida Este es usado para conectarse a un equipo
analógica. externo como una grabadora o un integrador.
6 Botón de encendido Enciende o apaga el instrumento.
7 Rendija de enfriamiento Esta rendija permite enfriar el interior del
instrumento.

No. Nombre Descripción

1 Entrada de aire Permite la entrada de aire para mantener refrigerado el
interior del instrumento. Contiene un filtro que previene
el ingreso de polvo.
No. Nombre Descripción
1 Porta celdas Colocar celdas rectangulares de 10 mm en la porta
celdas.
2 Tornillos de fijación de Permite instalar o remover diversos adaptadores de
la porta celdas. porta muestras.
3 Conector de sorbete Permite la conexión al aditamento sorbete 6000. La
conexión debe realizarla personal técnico de
Shimadzu.
4 Cobertura de la Remover la cobertura cuando se instalen
cámara de muestras. aditamentos en la recamara de muestras.