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Bioscience, biotechnologie et biochimie, 2016 Vol.

80, n° 1, 7–12

Examen
Facteurs environnementaux qui façonnent la formation du biofilm

Masanori Toyofuku1 , Tomohiro Inaba1 , Tatsunori Kiyokawa1 , Nozomu Obana1 , Yutaka Yawata2
et Nobuhiko Nomura1, *
1 2
École supérieure des sciences de la vie et de l'environnement, Université de Tsukuba, Tsukuba, Japon ; et génie Département des affaires civiles
environnemental, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, États­Unis

Reçu le 1er avril 2015 ; accepté le 14 mai 2015

http://dx.doi.org/10.1080/09168451.2015.1058701

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l2
S Les cellules réagissent à l'environnement et modifient l'expression
des gènes. Des études récentes ont révélé les aspects sociaux de la
vie bactérienne, comme la formation de biofilms.
La formation du biofilm est largement affectée par l'environnement, et
les mécanismes par lesquels l'expression génique des cellules
individuelles affecte le développement du biofilm ont suscité l'intérêt.
Facteurs environnementaux
déterminer la décision de la cellule de former ou de laisser un film
biologique. De plus, la structure du biofilm dépend largement de
l'environnement, ce qui implique que les biofilms sont façonnés pour
s'adapter aux conditions locales. Les seconds messagers tels que
l'AMPc et le c­di­GMP sont des facteurs clés qui relient les facteurs
environnementaux à la régulation des gènes. La communication de
cellule à cellule est également un facteur important dans la formation
du biofilm. Dans cette courte revue, nous présenterons les bases de la
formation de biofilm et discuterons plus en détail des facteurs
environnementaux qui façonnent la formation de biofilm. Enfin, les
outils de pointe qui nous permettent d'étudier les biofilms dans diverses
conditions sont discutés.

Mots clés : biofilm ; détection de quorum ; environnement

l'assistance d'EPS dans la phase de maturation. Après maturation, la
cellule quitte le biofilm au stade de la dispersion.
Chaque étape est affectée par plusieurs facteurs environnementaux
et est un processus hautement régulé (Fig. 1).10,11)

1. Fixation en surface

L'attachement à la surface est l'un des processus les plus

importants car il représente un tournant entre la vie tonique de la
planche et le mode biofilm. L'attachement de surface a été étudié en
détail chez Pseudomonas aeruginosa qui a été utilisé comme
organisme modèle pour la formation de biofilms. Tout d'abord, les
cellules bactériennes s'attachent à la surface de manière réversible au
pôle des cellules, ce qui est appelé attachement réversible.11,12) Les
appendices cellulaires tels que les flagelles, les pili et les fimbriae sont
impliqués dans l'attachement réversible. À ce stade, les bactéries
peuvent s'engager dans le mode de vie du biofilm ou quitter la surface
et revenir au mode de vie planctonique. Après un attachement
réversible, les cellules subissent un attachement irréversible.13) À ce
stade, des protéines de surface telles que SadB ou LapA et EPS
facilitent l'adhésion entre la cellule et la surface.14,15) Au cours de la
transition vers l'attachement irréversible, un second messager
intracellulaire, bis ­(3′­5′)­cyclo dimère guanosine monophosphate (c­di­
GMP), est impliqué. Le c­di­GMP est produit par de nombreuses
Les biofilms sont des agrégats structurés de cellules bactériennes
bactéries et régule la production et la motilité des EPS dans des
qui sont incorporées dans des substances polymères extracellulaires
directions opposées. De plus, Ono et al. ont rapporté qu'un autre
(EPS) autoproduites.1,2) Les biofilms peuvent avoir fait partie de la vie
second messager, l'AMPc, est impliqué dans la transition de
la plus ancienne sur Terre ;3) et on pense maintenant que la plupart
l'attachement réversible à l'attachement irréversible.16) Les
des bactéries forment des biofilms dans nature.4,5) Les cellules
concentrations de c­di­GMP et d'AMPc sont contrôlées par diverses
formant un biofilm diffèrent généralement de leurs homologues conditions environnementales, telles que le carbone et l'oxygène, et
planctoniques et présentent des différences dans l'expression des gènes.6,7) L'un des
donc la régulation de l'attachement à la surface par ces seconds
les caractéristiques des biofilms sont que l'environnement intérieur
messagers reflète les conditions environnementales.17) Il a été
est hétérogène, et donc des profils d'expression génique spécifiques à
récemment démontré que les différences de capacité d'attachement
la localisation cellulaire dans le biofilm sont observés.8) La
jouent un rôle dans la spéciation, soulignant l'importance de
multicellularité des biofilms suggère que ces cellules développent un
l'attachement à la surface.18)
réseau social avec division du travail. Le domaine émergent de la
microbiologie qui étudie les aspects sociaux de la vie bactérienne, y
compris la formation de 9) biofilms , est maintenant reconnu comme la
«
sociomicrobiologie ».
La formation de biofilm est généralement établie en plusieurs 2. Maturation du biofilm
étapes. Premièrement, les cellules planctoniques s'attachent à la
surface dans un processus connu sous le nom d'attachement de Après attachement irréversible, les cellules bactériennes
commencent
surface. Après fixation en surface, les biofilms forment une architecture structurée avec à développer des microcolonies en s'assemblant préalablement

*Auteur correspondant. Courriel : nobuhiko.nomura.ge@u.tsukuba.ac.jp

© 2015 Société japonaise pour les biosciences, la biotechnologie et l'agrochimie

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8 M. Toyofuku et al.

Planctonique

Changement de température

Appauvrissement en nutriments

Oxygène Appauvrissement en oxygène

Indices environnementaux Accumulation de

Température
métabolites

Surface

Réversible Irréversible Maturation

Microcolonie Dispersion
pièce jointe pièce jointe

Fig. 1. Facteurs environnementaux qui façonnent les formations de biofilms.

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8 ft
l2 Remarques : L'image montre la formation de biofilm et certains facteurs environnementaux qui affectent chaque étape de la formation de biofilm. Les signaux environnementaux
contrôlent la concentration de seconds messagers tels que l'AMPc et le c­di­GMP. Ces seconds messagers contrôlent les facteurs liés au biofilm tels que les appendices cellulaires,
les protéines de surface, les EPS et la motilité cellulaire. QS est également impliqué dans la formation du biofilm en contrôlant les facteurs ci­dessus liés au biofilm.

cellules attachées et en cours de division cellulaire.19) Ces

microcolonies se développent via la prolifération cellulaire et
produisent des EPS. Dans la plupart des biofilms matures, le
PSE représente plus de 90 % de la masse sèche.1) Les
composants du PSE comprennent des polysaccharides, des
acides nucléiques, des protéines, des lipides et d'autres
biopolymères. Dans le biofilm, l'EPS est responsable de
l'adhérence aux surfaces, de l'échafaudage des cellules ensemble
et du maintien de l'architecture tridimensionnelle du biofilm. De
plus, l'EPS entourant le biofilm protège les cellules bactériennes
contre divers stress tels que les antimicrobiens, le système
immunitaire de l'hôte, l'oxydation et les cations métalliques.1) À
l'intérieur du biofilm, l'EPS retient les molécules de signalisation
du quo rum sensing (QS), les enzymes extracellulaires et les
produits métaboliques. . Par conséquent, l'EPS prend en charge
la communication cellule­cellule et les substances dégradantes.1,20)
Les progrès des méthodes analytiques ont révélé qu'un biofilm
n'est pas une simple agrégation de cellules bactériennes et
d'EPS, mais a une architecture complexe.10) P. aerugi nosa et
Bacillus subtilis forment des biofilms entrecoupés de canaux
d'eau ouverts.10,21,22) Ces canaux peut faciliter l'échange de
nutriments et de déchets en infusant du liquide dans le biofilm.10)
Fait intéressant, sev
De nombreuses études ont démontré que la structure du biofilm
change de manière dynamique en fonction des conditions
environnementales. Par exemple, P. aeruginosa, la bactérie
modèle biofilmogène, forme une structure en forme de champignon
avec des canaux entre les macrocolonies constituées de cellules
en forme de bâtonnets dans des conditions oxiques. En revanche,
P. aeruginosa forme une structure en forme de maillage
tridimensionnel avec des canaux ou des espaces entre les
macrocolonies constituées de cellules filamenteuses allongées
dans des conditions anoxiques.23) Ce changement morphologique
dans le biofilm altère vraisemblablement la diffusibilité des
substances et permet une adaptation métabolique sous conditions
oxiques ou anoxiques en optimisant les échanges de nutriments
et de déchets. Cependant, l'effet de l'anaérobiose varie selon les
souches, suggérant une régulation compliquée de la formation du Fig. 2. Les images montrent différentes structures de biofilm de C. perfringens sous

biofilm.24) En outre, il a été récemment démontré qu'une enzyme différentes températures.

Notes : Panneaux de gauche 37 °C. Panneaux droits 25 °C. (A) Formation de
respiratoire affecte la formation du biofilm, indiquant des rôles
biofilm de pellicule à 25 oC. (B) Coloration au cristal violet de films bio attachés à la
autres que la conservation de l'énergie dans la formation d'une
surface. (C et D) Images de microscopie à réflexion confocale (barre d'échelle, 20
communauté multicellulaire sous certaines conditions. μm). (E) Images de microscopie électronique à balayage des biofilms (barre d'échelle,
conditions.25) Chez Clostridium perfringens, un agent pathogène 2 μm). L'image est réimprimée à partir de la réf. 26. Copyright © 2014, American
anaérobie à Gram positif, sporulant, les changements de Society for Microbiology [Journal of bacteriology, 196, 2014, 1540–1550, doi:10.1128/
température affectent considérablement le biofilm JB.01444­13].
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Comment l'environnement façonne la formation du biofilm 9

la morphologie, y compris l'épaisseur et la densité cellulaire, Réponse QS.31) QS régule de manière synchrone des gènes
reflétant la régulation de la production d'EPS en fonction de la spécifiques qui facilitent diverses activités de groupe telles que la
température (Fig. 2).26) La température est donc un signal important bioluminescence et la production d'enzymes et de toxines
de l'environnement à l'extérieur ou à l'intérieur du mammifère hôte, extracellulaires. Les bactéries pathogènes n'expriment pas de
garantissant que la formation de biofilm induite de manière facteurs de virulence à faible densité cellulaire et échappent ainsi
appropriée pour l'infection.26) La structure du biofilm n'est donc à la réponse immunitaire de l'hôte. Cependant, lorsqu'elles sont
pas simple et uniforme mais change dynamiquement en fonction cultivées à haute densité cellulaire dans des conditions de
des conditions environnementales. La formation de biofilm semble croissance optimales, les bactéries pathogènes produisent
être une préparation à des conditions environnementales instables. collectivement des toxines. Le système QS applique la
L'idée que la formation de biofilms est un « effet d'assurance » des synchronisation dans les comportements de groupe et optimise
cellules contre les environnements changeants est étayée par vraisemblablement les activités de groupe jusqu'à ce que le coût
l'isolement plus fréquent de variants à partir de biofilms que de équilibre le bénéfice. Les bactéries utilisent diverses molécules
cultures planctoniques.27) signal et différents types de systèmes QS. Les bactéries à Gram
négatif produisent de l'acyl­homosérine lactone et des dérivés de

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S
htt 3. Dispersion de biofilms

Du biofilm mature, certaines cellules bactériennes sont

transférées à la croissance planctonique. Ces cellules dispersées
explorent d'autres niches et se fixent à nouveau sur une nouvelle
surface. Ainsi, la dispersion n'est pas seulement la dernière étape
du cycle de vie du biofilm, mais aussi le début d'un autre cycle de
vie. Il existe une « dispersion active », qui dépend de la motilité
cellulaire ou de la dégradation de l'EPS, et une « dispersion
passive », qui dépend de facteurs physiques tels que la force de
cisaillement dans des conditions d'écoulement de liquide.10,28) La
dispersion active est déclenchée par des changements dans
l'environnement . conditions telles que le changement de
température, la famine, le manque d'oxygène et l'accumulation de
métabolites . impliqués dans la production d'EPS, comme la
synthèse des polysaccharides, et dans l'attachement, comme la
synthèse des fimbriae, sont régulés à la baisse.28)

Le second messager intracellulaire c­di­GMP est étroitement

impliqué dans cette régulation génique. Les niveaux intracellulaires
de c­di­GMP sont contrôlés dynamiquement par les conditions
environnementales. Contrairement à l'étape d'attachement, une
diminution des niveaux intracellulaires de c­di­GMP favorise la
la S­adénosyl méthionine (SAM) tels que l'AI­2. Les bactéries Gram­
positives utilisent des peptides appelés peptides auto­inducteurs
(AIP) comme molécules de signalisation, et les actinomycètes
produisent le facteur A.32) La définition des molécules de
signalisation pour la communication de cellule à cellule telles que
QS varie selon les chercheurs, et le signaux est largement utilisé
parce que les molécules de signal QS pourraient également agir
comme des signaux biologiques qui affectent les phénotypes
individuels en dehors des systèmes QS. Cependant, la définition
généralement acceptée est que les signaux profitent à l'émetteur et
non au récepteur et que la production du signal co­évolue avec sa
réponse.33) Le système QS est impliqué non seulement dans la
production de facteurs de virulence mais aussi dans le métabolisme
primaire comme la respiration34,35) et la formation de biofilms et
l'utilisation efficace des molécules de signalisation devraient
permettre des méthodes de contrôle de la communauté microbienne .
Les MV bactériens ont récemment été impliqués dans la délivrance
de molécules de signalisation.36) Plusieurs voies de biogenèse des
MV ont été proposées, et la quantité et la qualité des MV dépendent probablement de

5. Relation entre la formation de biofilm et la

communication de cellule à cellule

Les cellules sont densément emballées dans des biofilms,

permettant l'accumulation élevée de molécules de signalisation
conversion du mode de vie planctonique en biofilm en régulant les ainsi que de métabolites et de produits de sécrétion. À la suite
gènes impliqués dans la dispersion. En revanche, une augmentation du rapport de Davies et al. (1998) de la relation entre la
des niveaux intracellulaires de c­di­GMP favorise la conversion au formation de biofilm et la communication intercellulaire
mode de vie biofilm. Ainsi, c­di­GMP joue un rôle central en tant 38) arégulation
QS chez P. aeruginosa, tems été étudiédudans
biofilm par lebactéries.
diverses système
que commutateur entre les modes de vie planctonique et Le mutant agr QS de Staphylococcus aureus augmente la formation
biofilm.28,29) de biofilm dans des conditions spécifiques, et l'ajout de signaux
peptidiques Agr à la culture induit la dispersion du biofilm.39) Le
système Vibrio cholera QS, qui utilise des signaux dérivés de SAM,
4. Communication cellule à cellule chez les bactéries inhibe la formation de biofilm en induisant la expression du
régulateur transcriptionnel maître HapR.40) Les biofilms bactériens
La communication cellule à cellule joue un rôle dans l'organisation sont capables de former des conformations élaborées, et il a
et la différenciation de la cellule en biofilms en fonction des également été suggéré que la signalisation QS soit impliquée dans
conditions. Les bactéries communiquent à l'aide de divers la détermination structurelle. Les systèmes QS de P. aeruginosa
composés chimiques signal. Un type de communication utilisé pour régulent la motilité d'essaimage et la libération d'ADN extracellulaires,
reconnaître la densité de population d'une même espèce est le QS, influençant ainsi les structures du biofilm.41) De plus, environ 30 %
qui joue un rôle important dans la communication bactérienne de des protéines EPS du biofilm sont dérivées des MV,42) suggérant
cellule à cellule.30) Les bactéries produisent des composés signal, que les MV sont abondants dans les biofilms et peuvent également
qui s'accumulent avec l'augmentation de la densité cellulaire. Une jouer un rôle dans la délivrance de composés signal. Ces relations
fois que la concentration du signal atteint un niveau seuil, il est importantes entre la communication de cellule à cellule et la
reconnu par le ou les récepteurs situés dans le cytoplasme ou la formation de biofilms sont profondément influencées par les
membrane cellulaire et active l'expression des gènes impliqués conditions expérimentales, telles que le milieu, et de nombreux
dans la production du signal. Cette boucle d'autorégulation
prédictive des gènes QS favorise la synchronisation de la
communauté cellulaire en termes de
Machine Translated by Google

dix M. Toyofuku et al.

les bactéries sont capables de former des biofilms structuraux sans tion de biofilms sans transformation génétique ni sondage par
communication de cellule à cellule. Ainsi, la contribution de la fluorescenceDe plus, le COCRM permet de manière unique une
communication de cellule à cellule aux structures du biofilm peut être visualisation non destructive du biofilm, y compris son substrat
conditionnelle et nécessite une étude plus approfondie. Le manque attaché. Récemment, la visualisation séquentielle d'un biofilm
de clarté est dû aux méthodes analytiques limitées disponibles pour complexe buccal avec son substrat attaché et les caries dentaires
les biofilms, qui comprennent la microscopie et les tests de tolérance liées au biofilm a été
aux antibiotiques. L'état physiologique des cellules du biofilm est mal rapporté.49) En outre, une combinaison de COCRM et de coloration
connu. Par conséquent, pour clarifier la relation entre la formation du fluorescente a été utilisée pour visualiser le transport de la substance
biofilm et la communication de cellule à cellule, de nouvelles dans le biofilm.50)
techniques innovantes sont nécessaires pour observer l'architecture Le problème le plus difficile dans la recherche sur les biofilms est
du biofilm de manière continue et dynamique et analyser simultanément de mesurer l'état physiologique des cellules. A cette fin, les métabolites
les états physiologiques. libérés par les cellules sont mesurés.
Les métabolites hydrosolubles ainsi que les structures
tridimensionnelles des biofilms ont été analysés.51)

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S
htt 6. Développement de technologies
d'analyse de biofilm

Comme indiqué ci­dessus, des études antérieures ont révélé que

la plupart des bactéries forment des biofilms structurés fonctionnels
dont la formation est régulée par divers facteurs endogènes et
exogènes. Ces découvertes ont été rendues possibles par le
développement des technologies d'analyse.
Par conséquent, le développement et l'amélioration des technologies
d'analyse de biofilm sont essentiels aux études de biofilm.

7. Technologies de base pour l'analyse

des biofilms

À l'aube de la recherche sur les biofilms, la microscopie électronique

à balayage (SEM) était fréquemment utilisée pour observer la
structure détaillée des biofilms . fixation, déshydratation et séchage.
Ainsi, les biofilms vivants ne peuvent pas être observés par SEM. Des
méthodes d'imagerie fluorescente utilisant la microscopie confocale
à balayage laser (CLSM) ont ensuite été établies pour l'imagerie en
temps réel des biofilms.45) Les méthodes d'observation des biofilms
utilisant le CLSM et les systèmes d'expression de protéines
fluorescentes sont devenues courantes dans les études sur les
biofilms.
Les métabolites gazeux qui sont produits à la suite de la respiration
dans les biofilms ont également été analysés à l'aide d'un système de
culture en flux nommé « Réacteur à flux étanche à l'air pour l'analyse
non destructive des métabolites gazeux et la visualisation de la
structure » (AFGAS).23) La méthode AFGAS permet l'analyse
simultanée et séquentielle analyse de la structure du biofilm, des
métabolites aqueux et des métabolites gazeux. La relation entre la
respiration anaérobie et la structure du biofilm chez P. aeruginosa a
été examinée à l'aide de la méthode AFGAS.23) Comme indiqué ci­
dessus, l'analyse séquentielle des biofilms est devenue possible grâce
au développement des technologies de visualisation. Cependant,
l'analyse séquentielle et simultanée nécessite un grand système de
débit et ne convient pas aux échantillons multiples et aux expériences
multi­conditions.

La technologie des dispositifs microfluidiques peut fournir des

solutions expérimentales révolutionnaires dans la recherche sur les biofilms.
La technologie des dispositifs microfluidiques permet la fabrication
d'une variété de dispositifs expérimentaux miniatures, tels que des
chambres de microculture, des microcanaux, des microvalves ou des
microcapteurs, sur une petite puce de silicone (généralement moins
d'un pouce carré). Les dispositifs microfluidiques offrent une flexibilité
sans précédent dans la configuration et un contrôle précis de
l'environnement interne, permettant de nouvelles approches pour des
questions qui étaient auparavant difficiles à résoudre. Des
microenvironnements tels que des micropaquets de nutriments ou de
force de cisaillement peuvent être développés dans les dispositifs, ce
De plus, la combinaison de systèmes de culture continue et de
qui les rend particulièrement adaptés à l'analyse de l'écologie
CLSM a été largement utilisée pour observer le processus de
bactérienne en réponse à l'environnement.18,52) De plus, les
formation de biofilm.46,47) Ces technologies et méthodes de
dispositifs microfluidiques peuvent être facilement conçus pour intégrer
visualisation ont permis d'observer séquentiellement des biofilms
des microcapteurs qui permettent le détection rapide des cellules.53)
bruts pour révéler des structures tridimensionnelles et le processus
Récemment, un dispositif microfluidique a été récemment développé
de formation. Cependant, le domaine d'application de la microscopie
qui maintient les cellules dans une petite chambre de culture dans
à fluorescence est très restreint en raison de l'exigence d'une
laquelle un microcapteur sur puce surveille en permanence la
transformation génétique et de conditions de culture modérées pour
consommation d'ammoniac et un matériau en silicone transparent
des conditions normales.
permet une visualisation continue des cellules par COCRM.54 , 55)
fonction protéique fluorescente.45)
Une analyse précise de la relation entre les changements temporels
Les systèmes de cellule d'écoulement combinés avec le CLSM
dans la morphologie cellulaire et le métabolisme de l'ammoniac est
sont généralement utilisés pour observer la structure tridimensionnelle
possible en raison des caractéristiques uniques de la microfluidique.
détaillée pendant le développement du biofilm. Cependant, les
Les technologies microfluidiques deviennent progressivement un outil
techniques conventionnelles d'observation des biofilms, y compris le
de choix pour un large éventail d' études microbiennes.18,56,57)
système de cellule d'écoulement, dépendent largement de la
fluorescence. Dans ce cas, les cellules doivent être colorées avec
des colorants fluorescents ou étiquetées avec des protéines
fluorescentes. La méthode basée sur la microscopie par réflexion, la 8. Perspectives d'avenir
microscopie par réflexion à optimisation continue (COCRM) a été
développée pour remédier à cette limitation technique. La principale Il est de plus en plus évident que les sociétés bactériennes sont
différence est que le COCRM utilise la lumière réfléchie comme plus complexes qu'on ne le pensait. L'expression des gènes dans les
signal, plutôt que la fluorescence dans le CLSM.48) Ainsi, le COCRM communautés bactériennes est hétérogène, 58­60) et les sous­
ne dépend pas de la fluorescence et permet une visualisation tridimensionnelle.
populations qui présentent différents phénotypes, tels que
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Comment l'environnement façonne la formation du biofilm 11

cellules persistantes, 61) émergent. Alors que la plupart des [13] Petrova OE, Sauer K. Situations collantes : composants clés qui contrôlent la
études de biofilm en laboratoire sont menées dans des surface bactérienne Bacteriol. 2012;194:2413–2425.
pièce jointe. J

conditions statiques, les conditions naturelles fluctuent. La

[14] Caiazza NC, O'Toole GA. SadB est nécessaire pour la transition d'une fixation
façon dont cette expression génique hétérogène contribue à
réversible à une fixation irréversible lors de la formation du biofilm par
la flexibilité et à la plasticité des biofilms dans des Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bactériol. 2004;186:4476–4485.
environnements fluctuants est mal comprise, et son élucidation
permettrait non seulement d'approfondir nos connaissances [15] Hinsa SM, Espinosa­Urgel M, Ramos JL, O'Toole GA. La transition d'un
mais aussi de développer de nouvelles voies de traitement attachement réversible à un attachement irréversible lors de la formation du
des bactéries. Le développement de techniques telles que biofilm par Pseudomonas fluorescens WCS365 nécessite un transporteur ABC
et une grande protéine sécrétée. Mol. Microbiol. 2003;49:905–918.
l'analyse unicellulaire permettra d'étudier des communautés
plus complexes, ce qui pourrait nous permettre d'explorer la
[16] Ono K, Oka R, Toyofuku M, et al. La signalisation de l'AMPc affecte la fixation
multicellularité de cet organisme unicellulaire. irréversible lors de la formation du biofilm par Pseudomonas aeruginosa PAO1.
Microbes Environ. 2014;29:104–106.
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S
htt Déclaration de divulgation

Aucun conflit d'intérêt potentiel n'a été signalé par les auteurs.

Financement

Cette étude a été financée en partie par le financement d'une

subvention pour la recherche scientifique à MT, NO et NN du ministère
de l'Éducation, de la Culture, des Sports et de la Technologie du
Japon. TK a été financé par JSPS. Cette recherche a également été
financée par l'Agence japonaise des sciences et technologies, le
CREST et l'ALCA.

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