Validation analytique : application de la procédure

SFSTP 2003-2006 au domaine de la phytothérapie

Isabelle Pinguet

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Isabelle Pinguet. Validation analytique : application de la procédure SFSTP 2003-2006 au domaine
de la phytothérapie. Sciences pharmaceutiques. 2015. �dumas-01188779�

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 UNIVERSITE DE BORDEAUX
U.F.R. DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES

Année 2015 Thèse n°55

THÈSE pour l’obtention du

DIPLÔME D’ÉTAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE

Présentée et soutenue publiquement

le 29 mai 2015 à Bordeaux, par
ISABELLE PINGUET
Née le 22/02/1988 à Saintes (Charente-Maritime)

Validation analytique : application de la procédure SFSTP 2003-

2006 au domaine de la phytothérapie

Directeur de thèse
Mme Catherine Chèze

Membres du jury
Mme Catherine Chèze, Président & Directrice
Mme Evelyne Laborde, Assesseur
M. Jean-Pierre Dubost, Assesseur

1
2
 REMERCIEMENTS

A Madame Catherine Chèze,

Pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de présider et diriger cette thèse.
Soyez assurée, Madame, de tout mon respect et de ma profonde gratitude.

A Madame Evelyne Laborde,

Pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de faire partie de mon jury et de m’avoir
accompagnée tout au long du travail de préparation de cette thèse.
Je te remercie sincèrement de ton soutien et de tes encouragements.

A Monsieur Jean-Pierre Dubost,

Pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de faire partie de mon jury.
Je vous remercie d’avoir accepté de juger mon travail.

3
A ma mère,

Merci pour ton soutien inconditionnel pendant toutes mes études de pharmacie
et cette thèse. Si je peux écrire ces mots aujourd’hui, c’est grâce à toi.

A mon père et à ma sœur,

Merci pour vos encouragements et votre soutien malgré la distance qui nous
sépare.

A mes amis de fac et d’ailleurs,

Merci pour toutes ces années passées ensemble. Je n’oublierai jamais les bons
moments que l’on a partagés, ni ceux qui restent à venir.

A Cécile Miette,

Merci pour ton aide et ta disponibilité pendant et après mon stage. Ce travail a
pu être réalisé grâce à toi et je t’en remercie.

A Aurélien,

Merci d’être toujours là pour moi.

4
 TABLE DES MATIÈRES

Introduction....................................................................................................... 11
Partie I. : La validation des méthodes analytiques ........................................ 12
I.1. Généralités .......................................................................................... 12
I.1.1. Définitions ..................................................................................... 12
I.1.2. Contexte réglementaire ................................................................ 14
I.1.3. Objectifs d’une validation analytique............................................. 15
I.1.4. Concept de « fitness-for-purpose »............................................... 17
I.2. Cycle de vie d’une méthode ................................................................ 18
I.2.1. Sélection de la méthode ............................................................... 18
I.2.2. Mise au point de la méthode ......................................................... 19
I.2.3. Validation de la méthode .............................................................. 19
I.2.4. Estimation de l’incertitude et vérification de l’aptitude................... 20
I.2.5. Utilisation en routine ..................................................................... 21
I.2.6. Revalidation .................................................................................. 21
I.3. Etalonnage d’une méthode ................................................................. 22
I.3.1. Notion de résidu............................................................................ 22
I.3.2. Calcul du modèle d’étalonnage..................................................... 23
I.3.3. Méthode des moindres carrés classique ...................................... 24
I.3.4. Méthode du maximum de vraisemblance ..................................... 24
I.3.5. Erreur résiduelle et coefficient de détermination ........................... 25
I.4. Fidélité d’une méthode ........................................................................ 26
I.4.1. Conditions d’estimation de la fidélité............................................. 26
I.4.2. Calcul de la répétabilité et de la fidélité intermédiaire ................... 27
I.4.3. Interpréter une valeur de fidélité ................................................... 28
I.5. Justesse d’une méthode ..................................................................... 30
I.5.1. Expression de la justesse ............................................................. 30
I.5.2. Spécificité, erreur systématique .................................................... 30
I.6. Profil d’exactitude ................................................................................ 33
I.6.1. Objectifs de la validation ............................................................... 33
I.6.2. Plan d’expérience de validation, plan d’expérience d’étalonnage . 34

5
 I.6.3. Etalonnage inverse ....................................................................... 35
I.6.4. Critères de validation et intervalle de tolérance ............................ 36
I.6.5. Construction du profil d’exactitude et interprétation des résultats . 38
I.7. Incertitude de mesure.......................................................................... 42
I.7.1. Généralités ................................................................................... 42
I.7.2. Utilisation du profil d’exactitude .................................................... 42
Partie II. 2ème partie : Contrôle de la qualité des médicaments à base de
plantes ...................................................................................................... 44
II.1. Généralités .......................................................................................... 44
II.1.1. Définitions ..................................................................................... 44
II.1.2. Contexte réglementaire ................................................................ 45
II.1.3. Constituants des médicaments à base de plantes........................ 48
II.1.4. Catégories de HMP ...................................................................... 49
II.2. Variabilité des plantes : notion de chimiotype...................................... 51
II.2.1. Principe......................................................................................... 51
II.2.2. Impact sur le contrôle qualité des HMP ........................................ 51
II.3. Contrôle qualité des médicaments à base de plantes ......................... 53
II.3.1. Principe......................................................................................... 53
II.3.2. Problèmes rencontrés................................................................... 53
II.3.3. Identification par fingerprint........................................................... 54
II.4. Dosage des HMP ................................................................................ 56
II.4.1. Principe......................................................................................... 56
II.4.2. Choix du composé à doser ........................................................... 56
II.4.3. Utilisation de marqueurs : principe et limites................................. 57
II.4.4. Développement de la méthode de dosage ................................... 58
II.4.5. Validation de la méthode de dosage............................................. 60
II.4.6. Critères d’acceptation ................................................................... 60
Partie III. 3ème partie : Validation analytique des produits à base de plantes 62
III.1. Généralités....................................................................................... 62
III.2. Applicabilité du protocole de validation SFSTP 2003-2006 à la
validation des médicaments à base de plantes ............................................ 64
III.2.1. Etablissement du protocole de validation .................................. 64
III.2.2. Statistiques ................................................................................ 68

6
 III.2.3. Conclusion................................................................................. 68
III.3. Etude pratique : validation analytique d’un produit de phytothérapie 69
III.3.1. Matériel et méthodes ................................................................. 69
III.3.2. Résultats ................................................................................... 73
III.3.3. Conclusions ............................................................................... 82
Conclusion........................................................................................................ 84
Bibliographie..................................................................................................... 85

7
 TABLE DES TABLEAUX

Tableau 1 Exemples de fonctions de réponse .................................................. 23

Tableau 2 Profil du gradient d’élution pour l’analyse quantitative par HPLC du
marqueur ......................................................................................................... 72
Tableau 3 Résultats de l’étude de spécificité .................................................... 73
Tableau 4 Résultats des comparaisons des droites [Z = f ( X )] ...................... 75

Tableau 5 Résultats de l’étude statistique sur la droite [Z = f ( X )] .................. 76

Tableau 6 Recouvrements entre X et Z............................................................. 77
Tableau 7 Etude statistique de fidélité par série................................................ 78
Tableau 8 Etude statistique de justesse et de fidélité par niveau de
concentration ....................................................................................................... 79
Tableau 9 Calcul de l’intervalle de tolérance ..................................................... 80

8
 TABLE DES FIGURES

Figure 1 Droite de justesse............................................................................. 32

Figure 2 Profil d’exactitude ............................................................................. 39
Figure 3 Impact de la proportion β sur le profil d’exactitude ........................... 40
Figure 4 Exemples de choix possibles pour les niveaux de concentration des
standards en fonction du type de procédure (Reproduction du Tableau IV du
guide SFSTP 2003 [3]) .......................................................................................... 65
Figure 5 Nombres recommandés de séries et de répétitions par série
(Reproduction du Tableau VII du guide SFSTP 2003 [3]) ..................................... 67
Figure 6 Droite [Z = f ( X )] ............................................................................ 75
Figure 7 Profil d’exactitude ............................................................................. 81

9
 LISTE DES ABREVIATIONS

AMM Autorisation de Mise sur le Marché

EMA European Medicines Agency
IC Intervalle de Confiance
ICH International Conference on Harmonisation
IT Intervalle de Tolérance
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
PTFE PolyTétraFluoroEthylène
PVDF PolyVinyliDene Fluoride
SE Standard d’Etalonnage
SFSTP Société Française des Sciences et Techniques
Pharmaceutiques
SPE Solid Phase Extraction
SV Standard de Validation

10
 INTRODUCTION

Le contexte industriel impose aux entreprises pharmaceutiques de démontrer que

l’ensemble des procédés et des méthodes utilisés pour l’élaboration d’un produit
de santé conduit effectivement au résultat attendu.

Les laboratoires pharmaceutiques sont tenus de prouver que les méthodes

d’analyses employées sont parfaitement valides et fiables.
Si la qualité d’une méthode analytique n’est pas confirmée, la décision de
conformité ou non des produits finis basée sur les données obtenues par le
Contrôle Qualité en utilisant cette procédure analytique devient contestable. C’est
pourquoi l’assurance de la fiabilité de la méthode garantie par la validation est
non seulement une exigence réglementaire, mais également un critère essentiel
de l’assurance de la Qualité.
Actuellement, de nouvelles tendances et de nouveaux concepts scientifiques
apparaissent afin de faire évoluer la validation des méthodes analytiques, avec
notamment l’apparition de l’utilisation du profil d’exactitude comme outil de
décision.

Ces nouveaux outils et concepts ont pour la plupart comme objectif commun de
remettre les résultats obtenus au centre de la notion de validation analytique. Les
anciennes procédures de validation, plus orientées vers la qualité de l’analyse
statistique, ne tiennent pas suffisamment compte du produit concerné, de ses
spécificités, et de la qualité des résultats qui seront finalement obtenus avec la
méthode analytique validée.

C’est dans ce contexte de refonte des méthodologies de validation que se

positionne cette thèse, en proposant d’appliquer ces nouveaux concepts et outils
aux validations analytiques de produits aux caractéristiques bien spécifiques et
jusqu’alors oubliés des guides de validation : les produits de phytothérapie, ou
médicaments à base de plante(s).

11
 PARTIE I. : LA VALIDATION DES MÉTHODES ANALYTIQUES

I.1. GÉNÉRALITÉS
I.1.1. DÉFINITIONS

La clause 5.4.5.1. de la norme ISO 17025:2005 définit ainsi la validation :

« La validation est la confirmation par examen et apport de preuves objectives du
fait que les exigences particulières en vue d’une utilisation prévue déterminée
sont remplies » [1].
La validation analytique d’une méthode correspond à l’étude de plusieurs critères
de validation définis ci-après.

La spécificité ou sélectivité d’une procédure analytique est sa capacité à

permettre l’évaluation univoque de la substance à analyser en présence d’autres
composés potentiellement présents [2].

La linéarité d’une procédure d’analyse est sa capacité à prédire des

concentrations retrouvées proportionnelles aux concentrations théoriques d’une
série d’échantillons [2].

La justesse d’une méthode exprime l’étroitesse de l’accord entre la valeur qui est
acceptée soit comme vraie, soit comme valeur de référence, et la valeur
trouvée [3].

La fidélité exprime l’étroitesse de l’accord entre une série de mesures provenant

de multiples prises d’un même échantillon homogène dans des conditions
prescrites. Elle est exprimée en termes de coefficient de variation à partir d’une
série de mesures.
La fidélité peut être évaluée à trois niveaux :
- la répétabilité exprime la fidélité sous des conditions opératoires
identiques et sur un court intervalle de temps ;
- la fidélité intermédiaire exprime les variations intra-laboratoires : jours
différents, analystes différents, équipements différents… ;

12
 - la reproductibilité exprime la fidélité inter-laboratoire.

L’exactitude d’une méthode combine justesse et fidélité d’un mesurage.

La limite de détection d’une procédure d’analyse est la plus petite quantité de

l’analyte dans un échantillon pouvant être détectée, mais non quantifiée comme
une valeur exacte dans les conditions expérimentales décrites de la procédure.

La limite de quantification est la plus petite quantité de l’analyte dans un

échantillon pouvant être dosée dans les conditions expérimentales décrites avec
une exactitude définie.

Un mesurage est un processus consistant à obtenir expérimentalement une ou

plusieurs valeurs que l’on peut raisonnablement attribuer à une grandeur [4].

Le terme de répétitions est ici entendu comme des mesurages effectués sur un
même prélèvement, c’est-à-dire que les pesées seront prélevées sur un seul
échantillon de matière.

La limite d’acceptabilité d’une méthode sert à chiffrer ses objectifs. Il s’agit

d’une valeur seuil globale exprimée le plus souvent sous forme de pourcentage,
fixée de préférence par l’utilisateur du résultat.

L’incertitude est un paramètre associé au résultat d’une mesure qui caractérise

la dispersion des valeurs que l’on peut raisonnablement attribuer à un
mesurage [5].

L’intervalle de confiance (IC) déterminé au risque α % est un intervalle de

valeurs qui a (1-α) % de chance de contenir la vraie valeur du paramètre estimé :
par exemple, l’intervalle de confiance déterminé au risque de 5% à 95% de
chance de contenir la vraie valeur du paramètre estimé

L’intervalle de tolérance est l’intervalle dans lequel on s’attend à avoir une

proportion (β%) des futurs résultats.

Le profil d’exactitude est la combinaison, sous la forme d’un graphique, de

plusieurs intervalles de tolérance calculés à différents niveaux de concentration et
d’une limite d’acceptabilité.

13
Son but est d’estimer, à partir des résultats obtenus lors de la validation, quelle
garantie aura l’utilisateur que la méthode utilisée en routine fournira des résultats
acceptables.

L’étalonnage est l’opération qui, dans des conditions spécifiées, établit en une
première étape une relation entre les valeurs et les incertitudes de mesures
associées qui sont fournies par des étalons, et les réponses correspondantes
avec leurs incertitudes associées. Dans une seconde étape, cette information est
utilisée pour établir une relation permettant d’obtenir un résultat de mesure à
partir d’une réponse [4].

Si l’on considère une série d’observations suivant une distribution statistique, le

quantile q(p) est défini comme étant la valeur telle qu’une proportion p des
observations est plus petite que q(p) [6].

La fonction de réponse d’une procédure d’analyse traduit, à l’intérieur de

l’intervalle de dosage, la relation existant entre la réponse (signal) et la
concentration (quantité) en substance à examiner dans l’échantillon [3].

I.1.2. CONTEXTE RÉGLEMENTAIRE

Des directives sur la validation des méthodes analytiques sont fournies dans des
publications comme les guidelines ICH, notamment le guideline ICH Q2 (R1) paru
en 2005 : « Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology » [2].
Son but est de fournir des recommandations sur la manière d’appréhender les
différentes caractéristiques de la validation pour chaque méthode analytique. En
outre, le document fournit une indication sur les données qui devraient être
présentées dans un dossier d’enregistrement.
Ce guideline ICH est une exigence réglementaire, toute validation de méthode
analytique présentée dans un dossier d’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché)
doit répondre à ses exigences.
Il existe également des publications ne constituant pas des exigences
réglementaires, comme les guides de validation analytique de la SFSTP :
- SFSTP « Guide de validation analytique – Rapport d’une commission
SFSTP »

14
 o I. Méthodologie, paru dans STP Pharma Prat. en 1992 [7] ;
o II. Exemples d’application, paru dans STP Pharma Prat. en 1992 [8] ;
- SFSTP « Méthodes chromatographiques de dosage dans les milieux
biologiques : stratégie de validation. Rapport d’une commission SFSTP »
paru dans STP Pharma Prat. en 1997 [9] ;
- SFSTP « Validation des procédures analytiques quantitatives :
Harmonisation des démarches »
o I. Généralités, paru dans STP Pharma Prat. en 2003 [3] ;
o II. Statistiques, paru dans STP Pharma Prat. en 2006 [10] ;
o III. Exemples d’application, paru dans STP Pharma Prat. en
2006 [11] ;
o IV. Exemples d’application, paru dans Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis en 2008 [12].

Ces guides ont été élaborés dans le but d’aider les industriels à valider leurs
procédures analytiques en appliquant les recommandations réglementaires, dans
le but d’obtenir une AMM.

I.1.3. OBJECTIFS D’UNE VALIDATION ANALYTIQUE

La validation analytique a pour principal objectif de démontrer l’aptitude et la

fiabilité d’une méthode vis-à-vis des exigences réglementaires et normatives en
vigueur.
Elle permet de garantir que chaque mesure qui doit être réalisée en routine est
comprise dans une limite d’acceptation appropriée au type de procédure
analytique et au produit concerné. Il faut donc définir correctement à la fois les
conditions et le but dans lesquels la méthode sera utilisée.
Ces principes s’appliquent à toutes les méthodes utilisées par un fabricant de
médicaments, qu’elles soient ou non décrites dans une pharmacopée.
Les objectifs de la validation ne sont pas seulement d’obtenir une estimation de la
justesse, du biais ou de la fidélité de la méthode, mais également d’évaluer le
risque statistique lié à son utilisation, qui peut être exprimé par l’incertitude de
mesure associée au résultat [13].

15
Par rapport aux méthodes de validation classiques antérieures basées sur
l’estimation des critères de validation tels que la justesse, la fidélité ou la linéarité,
l’introduction du concept de profil d’exactitude représente une avancée pour
l’évaluation de ce risque. L’idée principale derrière ce concept est qu’une
procédure analytique peut être validée s’il est très probable, ou bien s’il existe un
risque limité, que la différence entre chaque mesure X d’un échantillon et sa vraie
valeur inconnue µ soit à l’intérieur de limites d’acceptabilité prédéfinies, selon les
objectifs de la méthode. Il est alors possible de démontrer sans ambigüité le
« fitness-for-purpose » de cette méthode [14].

16
 I.1.4. CONCEPT DE « FITNESS-FOR-PURPOSE »

Il est reconnu que le but d’une validation de méthode analytique est de démontrer
que la méthode est adaptée à son usage [15].
Cette affirmation se traduit par le concept de « fitness-for-purpose », dont l’IUPAC
donne la définition suivante : « degré auquel les données produites par un
processus de mesure permettent à l’utilisateur de prendre des décisions
techniques et administratives correctes dans un but spécifié » [16].
On peut donc traduire cette notion par l’aptitude d’une méthode à l’usage auquel
elle est destinée.
Une méthode analytique s’intégrera dans ce concept si les résultats qu’elle fournit
correspondent aux exigences requises de son application.
Ceci suppose que ces exigences aient été établies au préalable. Il peut s’agir
d’exigences réglementaires, avec par exemple des limites d’acceptabilité
appliquées aux résultats, ou bien de performances déterminées par l’analyste au
cours du développement de la méthode, comme par exemple le choix de la
fonction de réponse la mieux adaptée pour la courbe d’étalonnage.
Nous verrons dans cette thèse comment l’application du protocole proposé par la
SFSTP en 2003-2006, basé sur l’utilisation du profil d’exactitude et de l’intervalle
de tolérance β, permet d’appliquer ce concept de « fitness-for-purpose » à la
validation analytique.

17
 I.2. CYCLE DE VIE D’UNE MÉTHODE

Le cycle de vie d’une méthode est un concept souligné dans la norme ISO
17025 [1]. L’idée de base est qu’une méthode d’analyse n’est pas statique, mais
une entité vivante qui passe par plusieurs étapes interdépendantes. Ainsi, pour
bien comprendre le rôle et la place de la validation, il convient de décrire les
différentes étapes de ce cycle, depuis la création de la méthode analytique
jusqu’à son remplacement par une autre. L’exemple d’une méthode de dosage
est utilisé ci-après pour illustrer ces différentes étapes [14].

I.2.1. SÉLECTION DE LA MÉTHODE

Cette première étape va permettre de définir les objectifs de la méthode et les

conditions opératoires initiales.
L’analyste va choisir parmi les diverses méthodes physico-chimiques possibles, la
méthode la plus pertinente pour permettre le dosage de l’analyte à déterminer.
La norme ISO 17025 [1] précise que :

« Le laboratoire doit utiliser des méthodes d’essai et/ou d’étalonnage, y compris

des méthodes d’échantillonnage, qui répondent aux besoins du client et qui
conviennent aux essais et/ou étalonnages qu’il effectue, de préférence les
méthodes publiées comme normes internationales, régionales ou nationales ».

Ce texte précise qu’il est préférable d’utiliser des méthodes officielles, lorsque
cela est possible. Cependant, l’utilisation de méthodes développées par le
laboratoire est acceptée.
Dans ce deuxième cas, le développement de la méthode doit être confié à du
personnel qualifié, avec des ressources adéquates, et la démarche de
développement ainsi que les résultats obtenus doivent être correctement
renseignés.

18
 I.2.2. MISE AU POINT DE LA MÉTHODE

Il s’agit d’une étape de développement de la méthode sélectionnée, afin

d’optimiser les différents paramètres du protocole opératoire pour les adapter à la
matrice des échantillons qui seront dosés ainsi qu’aux conditions opératoires
d’utilisation de la méthode.
Il est important, lors de cette étape de développement, de suivre un cheminement
précis et non pas de simplement réaliser des expériences aléatoires, afin de
maîtriser la programmation des essais et les délais.
En tenant compte de cette remarque, l’analyste peut utiliser des plans
d’expériences, qui vont permettre d’optimiser le nombre d’expériences à réaliser
pour trouver les valeurs optimales des variables susceptibles d’influencer le
paramètre à optimiser.
Au terme de cette seconde étape, l’analyste devrait avoir recueilli des
informations de base sur les performances de la procédure analytique,
concernant la pertinence du modèle de régression utilisé pour établir la fonction
de réponse, la variabilité des résultats, la limite de quantification et l’intervalle de
dosage.
Ces prérequis vont ainsi constituer une base pour l’étape suivante, qui est la
phase de validation proprement dite.

I.2.3. VALIDATION DE LA MÉTHODE

L’étape de validation intervient après le développement d’une nouvelle procédure

d’analyse. En effet, les performances de la méthode vont évoluer tout au long du
cycle de vie, et plus particulièrement au cours des deux premières étapes. Ainsi,
la fiabilité du résultat analytique fourni par la méthode doit être améliorée lors de
ces premières phases, pour tendre vers une confiance accrue qui sera attestée
durant cette troisième étape de validation.
On distingue deux types de validation, la validation inter-laboratoire et la
validation intra-laboratoire.

19
La validation inter-laboratoire concerne principalement les méthodes analytiques
destinées à être utilisées par plusieurs laboratoires, ou bien dont les résultats vont
servir lors d’échanges commerciaux. Ainsi, ce type de validation se rencontre
rarement dans l’industrie pharmaceutique où les méthodes sont utilisées en
interne, et très fréquemment dans l’industrie agro-alimentaire. En effet, il faut
impérativement réaliser une validation inter-laboratoire pour des méthodes
destinées à mesurer la conformité d’une denrée lors d’un échange commercial.
Ce type de validation permet en outre de calculer les limites de reproductibilité de
la méthode.
La validation intra-laboratoire est une validation interne concernant l’ensemble
des méthodes analytiques développées par un laboratoire. Le sujet d’étude de
cette thèse se limite exclusivement à ce type de validation.

I.2.4. ESTIMATION DE L’INCERTITUDE ET VÉRIFICATION DE L’APTITUDE

L’estimation de l’incertitude de mesure, tout comme la validation analytique, est

une exigence de la norme ISO 17025 qui indique que :

« les laboratoires d’essais doivent aussi posséder et appliquer des procédures

pour estimer l’incertitude de mesure » [1].

Cette incertitude permet d’estimer la capacité de mesure de la méthode, et

l’adéquation des résultats qu’elle fournit avec les exigences qui lui sont liées. En
ce sens, l’estimation de l’incertitude de mesure et la vérification de l’aptitude de la
méthode rejoignent le concept de « fitness-for-purpose » développé à la
section I.1.4.
L’estimation de l’incertitude de mesure et la validation analytique de la méthode
sont des concepts interdépendants, et le protocole développé par la commission
SFSTP et publié en 2003-2006 lors de la démarche d’harmonisation des
validations analytiques permet de les combiner.
Ainsi, l’utilisation du profil d’exactitude comme outil de décision illustre comment
l’incertitude peut être obtenue à partir des résultats de validation. Le calcul de

20
 [17]
l’intervalle de tolérance selon la méthode développée par Mee (1984) permet
de démontrer clairement le « fitness-for-purpose » de la méthode [5].

I.2.5. UTILISATION EN ROUTINE

L’objectif d’une méthode analytique n’est pas sa validation, mais bien son
utilisation en routine pour l’analyse d’échantillons de valeur vraie inconnue. Le
passage en routine de la méthode s’inscrit dans le cadre d’un système de
contrôle de la qualité qui a pour objectifs de valider les résultats obtenus sur des
échantillons inconnus, et de contrôler les performances de la méthode analytique
au fil du temps.

I.2.6. REVALIDATION

Au cours de l’utilisation en routine de la méthode analytique, certaines

améliorations peuvent être apportées à la méthode. Ces modifications vont alors
conduire à une procédure plus ou moins complète de revalidation. Un test simple
devra être effectué pour déterminer l’impact de ces modifications. En règle
générale, une modification de réglage est considérée comme mineure, tandis
qu’une modification affectant le principe de la méthode est considérée comme
majeure. Dans ce dernier cas, une procédure de validation complète devra de
nouveau être appliquée.

21
 I.3. ETALONNAGE D’UNE MÉTHODE

La majorité des méthodes d’analyse quantitatives ne mesure pas directement une

quantité absolue de l’analyte recherché, mais procède indirectement par
comparaison avec une quantité connue de l’analyte. La validation de ces
méthodes comporte donc nécessairement une étape d’étalonnage, qui consiste à
construire un modèle permettant de prédire la concentration inconnue
d’échantillons, par analogie avec des concentrations connues des solutions
d’étalonnage.

I.3.1. NOTION DE RÉSIDU

En pratique, l’étalonnage est réalisé à partir de solutions de témoin de pureté

connue, préparées à des concentrations connues, et appelées Standards
d’Etalonnage (SE).
L’analyse de ces SE va donner une réponse observée mesurée par l’appareillage.
Cette réponse est constituée de plusieurs composantes :
- une fonction de réponse déterministe, basée sur les « lois » chimiques,
physiques et/ou biologiques ;
- un bruit de fond aléatoire équivalant à une erreur expérimentale.
Pour évaluer cette dualité, on introduit la notion de résidu [4].
Le résidu est la différence entre la valeur observée Y, donnée par l’appareillage,
et la valeur théorique X de l’échantillon. Cette valeur théorique, également
appelée valeur prédite, correspond à la composante déterministe de la réponse.
Elle est calculée et non mesurée, et ne comprend donc pas de bruit de fond ou
d’erreur expérimentale.
La variance des résidus, ou variance résiduelle, nous permet ainsi de mesurer la
dispersion des résultats et d’évaluer la composante aléatoire de mesure.

22
 I.3.2. CALCUL DU MODÈLE D’ÉTALONNAGE

Les mesures effectuées sur les SE permettent de déterminer la relation entre la

réponse Y donnée par l’instrument et la concentration X des solutions. Cette
relation est une fonction de type :
Y = f (X ) + ε (Eq. 1)

Avec ε, l’erreur résiduelle associée à la fonction de réponse. Cette fonction n’est

pas nécessairement linéaire mais elle doit être strictement monotone sur
l’intervalle de dosage envisagé.
La fonction de réponse doit être ajustée, c’est-à-dire que ses paramètres doivent
être évalués de telle sorte que l’erreur résiduelle ε soit minimisée.
La procédure SFSTP 2003-2006 propose d’appliquer le concept de « fitness-for-
purpose » pour choisir la fonction de réponse la mieux adaptée pour la courbe
d’étalonnage, et ainsi avoir un modèle d’étalonnage permettant de minimiser ε et
donc de calculer les concentrations prédites les plus correctes possibles [15].
Le Tableau 1 illustre quelques exemples des différentes fonctions de réponse
pouvant être envisagées lors d’une validation de méthode analytique.

Tableau 1 Exemples de fonctions de réponse

Type Equation Paramètres Linéaire

Droite passant par Y = β X Pente β Oui
l’origine
Droite Y = α + βX Ordonnée à l’origine α Oui
Pente β
Fonction quadratique Y = α + βX + γX 2 α , β ,γ Oui

Fonction logistique à δ −α α , β ,γ ,δ Non

Y =α + β
4 paramètres X 
1 +  
γ 

Les modèles d’étalonnage vont être calculés pour chaque série de validation, et le
calcul des concentrations prédites X des solutions d’échantillon, appelées

23
Standards de Validation (SV) devra être effectué en utilisant le modèle
d’étalonnage de la série correspondante [18].
Les paramètres des fonctions de réponse vont être estimés soit par la méthode
des moindres carrés classique, soit par la méthode du maximum de
vraisemblance, comme recommandé dans la procédure SFSTP 2003-2006.

I.3.3. MÉTHODE DES MOINDRES CARRÉS CLASSIQUE

La méthode des moindres carrés est la méthode de calcul la plus utilisée pour
l’estimation des paramètres d’un modèle à deux variables ayant un lien de
causalité entre elles.
Cette méthode de calcul consiste à estimer les paramètres de la droite
d’étalonnage en minimisant la somme des différences entre les valeurs observées
et les valeurs prédites correspondantes, soit la somme des résidus E .
Y = X +E Réponse observée (Eq. 2)
E =Y − X Résidu (Eq. 3)
Les résidus pouvant être positifs ou négatifs, ils sont élevés au carré pour le
calcul de leur somme afin d’éviter leur contrebalancement.
L’équation de la droite pour laquelle la somme de ces carrés est minimale permet
d’obtenir des valeurs prédites au plus proche des vraies valeurs.

I.3.4. MÉTHODE DU MAXIMUM DE VRAISEMBLANCE

Le protocole SFSTP 2003-2006 recommande d’estimer les paramètres du modèle

d’étalonnage en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance. L’estimation
par maximum de vraisemblance repose sur la notion de vraisemblance d’un
ensemble donné d’observations relatives à un modèle. Dans le cadre d’un
étalonnage, cette méthode consiste à trouver les paramètres permettant de
maximiser la fonction de vraisemblance associée au modèle d’étalonnage, qui
représente la vraisemblance d’avoir obtenu les données que nous avons
générées.

24
Les pré-requis de cette méthode sont d’une part la normalité de la réponse à
chaque niveau de concentration, et d’autre part l’homogénéité des variances ou
homoscédasticité.
Cependant, comme spécifié dans le protocole SFSTP 2003-2006, un modèle
d’étalonnage fournissant de bons résultats sera préféré à un modèle ayant de
bonnes qualités d’ajustement, même si les pré-requis ne sont pas respectés.

I.3.5. ERREUR RÉSIDUELLE ET COEFFICIENT DE DÉTERMINATION

En complément des paramètres de la fonction d’étalonnage, on peut obtenir

d’autres statistiques, en particulier l’écart-type résiduel s E . Cet écart-type permet
d’évaluer la qualité de l’ajustement car il indique l’étroitesse de l’ajustement entre
la droite calculée et les points expérimentaux.
Les variances résiduelles sont estimées pour chaque niveau de concentration,
après alignement des valeurs :
n

∑ (Y i − Y )2
Variance résiduelle (Eq. 4)
s E2 = i =1
I −2
Avec I, le nombre de séries.
Cette variance résiduelle s E2 est un estimateur de la variance des erreurs

expérimentales σ 2 [4]
.
La norme ICH Q2 (R1) demande également de calculer le coefficient de
détermination R 2 de la droite pour évaluer la qualité de l’ajustement par série. Ce
coefficient exprime la partie de la variance totale des réponses expliquée par le
modèle. Il n’est cependant pas approprié, et un coefficient de type R 2 > 0,99 n’est
pas un gage de qualité des résultats qui seront obtenus.
Un moyen simple de diagnostiquer un problème de régression est d’utiliser la
représentation graphique des résidus des résultats. Pour un modèle adéquat, les
résidus sont normalement distribués, donc leur représentation ne doit pas montrer
de motif particulier [13].

25
 I.4. FIDÉLITÉ D’UNE MÉTHODE
I.4.1. CONDITIONS D’ESTIMATION DE LA FIDÉLITÉ

Comme défini à la section I.1.1., la fidélité est une mesure de « l’écart entre des
répétitions faites sur un même échantillon ». C’est une estimation de l’amplitude
avec laquelle une méthode disperse les répétitions, et ainsi elle fournit des
indications sur les erreurs aléatoires. Il est nécessaire de tenir compte de cette
variabilité dans l’interprétation pratique des résultats d’un essai.
Il est important de garder à l’esprit que la fidélité d’une méthode dépend de
nombreux facteurs, qui vont s’ajouter pour former un ensemble de sources de
variation que l’on peut organiser selon les 5M :
1. La main d’œuvre. Des opérateurs bien entraînés et qualifiés sont plus à
même de faire des mesures proches les unes des autres.
2. Le milieu. Un laboratoire dont l’agencement est bien adapté aux mesures
effectuées permet de réduire la variabilité entre répétitions.
3. La méthode. Même si une méthode est normalisée, il existe de légères
variations dans la façon de l’appliquer (réactifs, qualité de la préparation
des solutions d’étalonnage…).
4. Le moyen. L’utilisation d’appareillage qualifié est fondamentale.
5. La matière. La conservation des échantillons au sein du laboratoire
influence la variabilité des mesures.

L’estimation de la fidélité d’une méthode peut être effectuée à trois niveaux : la

répétabilité, la fidélité intermédiaire et la reproductibilité. Trois conditions
d’estimations de la fidélité peuvent alors être rencontrées :
- Condition de répétabilité : les sources de variations listées ci-dessus sont
minimisées autant que possible.
- Condition de reproductibilité : contrairement au cas précédent, les sources
de variations sont maximisées afin d’obtenir des mesures dans les
conditions où le plus grand nombre de sources de variations sont
intervenues.

26
 - Condition intermédiaire de fidélité : dans ce cas également plusieurs
sources de variations viennent interférer, mais les mesures sont effectuées
au sein d’un même laboratoire.

Dans le cadre de la validation analytique d’une méthode destinée à être utilisée

au sein d’un seul laboratoire, les conditions étudiées seront uniquement la
répétabilité et la fidélité intermédiaire, correspondant au cas d’une validation intra-
laboratoire qui est abordé en section I.2.3. La condition de reproductibilité est
nécessaire uniquement dans le cadre d’une validation inter-laboratoire.

I.4.2. CALCUL DE LA RÉPÉTABILITÉ ET DE LA FIDÉLITÉ INTERMÉDIAIRE

Seul le cas de plans de validation équilibrés, c'est-à-dire de plans où toutes les

séries de validation ont le même nombre de répétitions, sera traité dans cette
thèse.
La mesure de fidélité est calculée à partir des écart-types des résultats d’essais.
Le traitement statistique des données consiste à utiliser une méthode appelée
analyse de la variance à un facteur (one-way ANOVA). Elle permet de
décomposer la variance totale de toutes les mesures – toutes séries confondues,
ou variance de fidélité intermédiaire – en une variance intra-série et une variance
inter-série.
Les pré-requis à l’étude ANOVA sont la normalité de la distribution des données,
l’homogénéité des variances inter-séries et l’indépendance des séries les unes
par rapport aux autres.
Une fois l’analyse ANOVA réalisée, deux conclusions sont envisageables. Soit
l’hypothèse nulle est confirmée, et il n’y a alors pas de différence significative
entre les séries, soit l’hypothèse alternative est confirmée, et une différence
significative est établie.
Cette analyse calcule également la variance intra-série selon la formule suivante :
SCEr
sr2 = Variance intra-série (Eq. 5)
I ( J − 1)
Avec : SCEr, la somme des carrés intra-série,
I, le nombre de séries,

27
 J, le nombre de répétitions par série.

A partir de cette variance intra-série, nous pouvons calculer la variance inter-

séries :

 SCE L 
 − sr2 
I −1
s L2 =   Variance inter-séries (Eq. 6)
J
Avec : SCEL, la somme des carrés inter-séries.
Les variances intra et inter-séries que nous venons de calculer sont en fait des
estimations, respectivement, de la variance de répétabilité et de la variance de
fidélité intermédiaire.
Nous pouvons ainsi calculer nos paramètres de fidélité, qui sont l’écart-type de
répétabilité et de reproductibilité, comme suit :

s r = s 2r Ecart-type de répétabilité (Eq. 7)

s R2 = s L2 + sr2 Variance de reproductibilité (Eq. 8)

s R = s L2 + sr2 Ecart-type de reproductibilité (Eq. 9)

Ces écart-types sont des indicateurs des limites maximales que l’on sera en droit
d’atteindre lorsque des répétitions seront effectuées avec cette méthode.

I.4.3. INTERPRÉTER UNE VALEUR DE FIDÉLITÉ

Les paramètres de fidélité que nous venons de calculer ne nous permettent pas,
en soi, de juger de la fidélité de la méthode analytique. Il nous faut donc trouver
une approche permettant d’affirmer si les valeurs de fidélité obtenues sont
correctes ou non.
La variabilité d’une méthode est souvent exprimée sous forme de coefficient de
variation. Ce paramètre ne peut pas à lui seul représenter la fidélité d’une
méthode, car il dépend de la moyenne des valeurs, et de leur écart-type. Il s’agit
donc d’une mesure relative qui ne permet pas de caractériser de façon absolue
une méthode, du fait de son manque de robustesse.
Le modèle proposé par Horwitz pour estimer les performances d’une méthode
[19]
analytique en termes de fidélité, dans le domaine de la chimie alimentaire , est

28
une approche plus aboutie. Ce modèle part du principe que la fidélité, exprimée
par exemple sous forme d’un écart-type de reproductibilité, dépend de la
concentration de l’analyte à doser.
Ce postulat se retrouve également dans la procédure SFSTP 2003-2006, avec le
calcul d’un intervalle de tolérance dépendant de la fidélité de la méthode pour
chaque niveau de concentration. Ce calcul sera détaillé dans la sous-
section I.6.4.2.

29
 I.5. JUSTESSE D’UNE MÉTHODE
I.5.1. EXPRESSION DE LA JUSTESSE

Selon la définition donnée en section I.1.1., la justesse d’une méthode concerne

les deux paramètres suivants :
- la valeur de référence X de l’échantillon étudié ;
- la valeur moyenne Z de mesurages répétés sur ce même échantillon.
Dans le cadre d’une validation analytique, la justesse est donc obtenue en
calculant la différence entre la moyenne des concentrations introduites et la
moyenne des concentrations calculées.
Cette différence peut être exprimée de plusieurs façons.
Elle peut d’abord être exprimée sous forme de biais absolu ou relatif, selon les
formules suivantes :

B=Z−X Biais absolu (Eq. 10)

Z−X 
B% =   ×100
 Biais relatif (Eq. 11)
 X 
Ainsi, si la méthode analytique conduit à une surestimation de la quantité
d’analyte à doser, le biais absolu ou relatif sera positif. A l’inverse, dans le cas
d’une sous-estimation ce biais sera négatif.
Un autre mode d’expression de la justesse est le calcul du taux de recouvrement
comme suit :

Z
R% = × 100 Taux de recouvrement (Eq. 12)
X
Ce taux de recouvrement fournit une indication sur la proportion de ce qui a été
dosé par rapport à ce qui est attendu.

I.5.2. SPÉCIFICITÉ, ERREUR SYSTÉMATIQUE

La notion de spécificité définie en section I.1.1 est intrinsèquement liée à la

justesse de la méthode, dans le sens où les éventuelles interférences provenant

30
d’une non-spécificité de la méthode analytique vont entraîner un défaut de
justesse, et donc un biais de mesure.
Ces interférences peuvent être dues à un effet matrice de l’échantillon, et
conduisent à des erreurs systématiques additives et proportionnelles se
traduisant par un biais sur la réponse analytique.
Dans le cas où la matrice de l’échantillon est entièrement connue et maîtrisée, la
mise en évidence de ses effets est aisée. En revanche, lorsque les différents
constituants de la matrice ne sont pas entièrement connus, il est plus difficile
d’identifier les sources d’interférences possibles. Nous verrons dans la Partie II
que nous nous trouvons dans ce deuxième cas lors de l’analyse d’une substance
végétale, qui est une matrice complexe.
Un moyen simple de représenter graphiquement l’impact des interférences est de
construire une droite de justesse.
Cette droite de justesse représente les concentrations calculées Z en fonction
des concentrations introduites de référence X , et est définie par l’équation
suivante :
Z = f (X ) Droite de justesse (Eq. 13)
La Figure 1 illustre cette droite de justesse selon trois situations possibles :
- la droite 1 représente un cas où il n’y a pas d’interférence ;
- la droite 2 représente un décalage systématique des concentrations
calculées, il s’agit d’un effet additif ;
- la droite 3 représente un biais proportionnel à la concentration, il s’agit d’un
effet multiplicatif.

31
Figure 1 Droite de justesse

Droite 2 - Effet
additif

100 Droite 1
Concentration calculée Z

Droite 3 - Effet
multiplicatif

0
0 100
Concentration introduite X

En pratique, les effets sont souvent combinés, et l’équation de la droite de

justesse est alors de la forme :
Z = b0 + b1 X Droite de justesse avec interférences (Eq. 14)

Les coefficients b0 et b1 peuvent alors servir de base pour le calcul d’un facteur de
correction des données.

32
 I.6. PROFIL D’EXACTITUDE

La méthode de validation utilisant le profil d’exactitude comme outil de décision a

été développée par une commission de la SFSTP (SFSTP 2003 et 2006), pour
pallier aux faiblesses des guides de validation précédents.
Cette commission est repartie des objectifs fondamentaux de la validation
analytique pour proposer un outil de décision permettant de prévoir avec quelle
garantie une proportion donnée des résultats futurs seront compris dans les
limites d’acceptabilité.
Ceci permet de mieux intégrer les besoins de l’utilisateur final de la méthode
analytique aux objectifs de la validation.
Les différentes étapes de cette méthode sont donc :
- définir les objectifs de validation ;
- définir un plan d’expérience de validation et d’étalonnage ;
- calculer les concentrations retrouvées par étalonnage inverse ;
- calculer les critères de validation et l’intervalle de tolérance par niveau de
concentration ;
- construire le profil d’exactitude ;
- interpréter les résultats.
Chacune de ces étapes est étudiée ci-après.

I.6.1. OBJECTIFS DE LA VALIDATION

L’objectif d’une méthode de dosage est de pouvoir déterminer avec le plus

d’exactitude possible chacune des quantités (ou concentrations) inconnues qu’un
laboratoire aura à doser.
L’objectif d’une validation est de pouvoir donner au laboratoire et aux autorités
réglementaires la garantie que chaque résultat Z qui sera obtenu dans le futur par
la méthode d’analyse sera suffisamment proche de la vraie valeur X de
l’échantillon à doser.
Dans cette définition le terme « suffisamment proche » impose en premier lieu de
choisir la limite d’acceptabilité qui correspond à l’écart maximum λ accepté entre

33
le résultat Z obtenu par la méthode d’analyse et la valeur de référence X acceptée
comme valeur vraie.

X −Z <λ (Eq. 15)

La limite d’acceptabilité λ doit être fixée en fonction des exigences

réglementaires, et en fonction des performances de la méthode, en particulier de
son incertitude. Cette limite d’acceptabilité λ est de 1% à 2% pour le dosage d’une
[20]
substance active dans une matière première et de 5% pour le dosage d’une
[21]
substance active dans un produit fini . Il est généralement admis qu’elle est de
15% pour le dosage de substance active dans des produits biologiques
Pour apporter les garanties que l’équation (Eq. 15) soit vérifiée, il faut que la

probabilité que X − Z < λ soit supérieure ou égale à une valeur minimale β (au

moins 80%)

Pr ( X − Z < λ ) ≥ β (Eq. 16)

I.6.2. PLAN D’EXPÉRIENCE DE VALIDATION, PLAN D’EXPÉRIENCE

D’ÉTALONNAGE

I.6.2.1. Plan d’expérience de validation

Le plan d’expérience de validation doit être choisi de manière à se situer en

situation de fidélité intermédiaire, en effectuant les mesures par séries en tenant
compte de diverses sources d’incertitude.
Le plus souvent, une série est équivalente à un jour, ce qui permet de prendre en
compte un certain nombre de sources d’incertitude : évolution des échantillons,
changements d’opérateurs, changement des étalonnages, évolution des réactifs,
modification des réglages instrumentaux, etc…

Il faut ensuite fixer le nombre de séries (jours) I de mesures, le nombre de

répétitions J par niveau et par jour, et le nombre de niveaux de concentration K.
Ces choix dépendent non seulement de contraintes statistiques, mais également
pratiques et économiques. Par exemple, le nombre de jours de travail va
dépendre de la stabilité de l’échantillon ; la durée de préparation de l’échantillon
et le temps d’analyse vont influencer le nombre de répétitions ; un minimum de

34
trois niveaux de concentrations est nécessaire pour vérifier si la justesse est bien
linéaire sur tout le domaine de validation.

Une fois le plan d’expérience de validation défini, en connaissance du coût d’une

analyse, le coût de la validation et sa durée peuvent être évalués. Les quantités
nécessaires d’échantillons et un calendrier des analyses à réaliser peuvent ainsi
être planifiés.

I.6.2.2. Plan d’expérience d’étalonnage

Le nombre de niveaux et de répétitions pour le plan d’étalonnage peut différer de

celui du plan de validation. En revanche, le nombre de séries I’ doit être identique
à celui du plan de validation puisque l’on va vérifier sur plusieurs jours si la
méthode est capable de quantifier de la même façon dans le temps les
échantillons de validation.
Le nombre de niveaux K’ est fixé suivant le modèle d’étalonnage étudié durant le
développement de la méthode.

I.6.3. ETALONNAGE INVERSE

Après collecte des données, et détermination du modèle d’étalonnage le mieux

adapté à la méthode comme présenté au chapitre I.3., on utilise la fonction
inverse du modèle d’étalonnage pour transformer les réponses mesurées en
concentrations calculées pour chaque mesurage.
Ce calcul s’effectue indépendamment pour chaque série de validation, en utilisant
les paramètres du modèle correspondant à la série.
Yijk − α i
Z ijk = (Eq. 17)
βi
Avec α i et β i les coefficients du modèle d’étalonnage de la série i, dans le cas

d’un modèle linéaire.

Les concentrations prédites calculées Z des échantillons de validation sont ainsi
obtenues.

35
A partir là, le biais de chaque mesurage peut être calculé grâce au Biais absolu
(Eq. 10) et au Biais relatif (Eq. 11) définis à la section I.5.1.
La droite de justesse vue à la section I.5.2 peut également être construite.

I.6.4. CRITÈRES DE VALIDATION ET INTERVALLE DE TOLÉRANCE

I.6.4.1. Justesse et fidélité par niveau

Nous avons vu précédemment que la justesse et la fidélité d’une méthode

pouvaient dépendre du niveau de concentration de l’analyte. Il serait donc
incorrect de calculer une valeur unique représentant la totalité des mesures
obtenues par cette méthode, comme les approches classiques de validation le
conseillent généralement.
La méthode du profil d’exactitude propose de déterminer la justesse et la fidélité
de la méthode en calculant les critères suivants pour chaque niveau de
concentration étudié [22] :
I J

∑∑ X
i =1 j =1
ij
Concentration introduite moyenne (Eq. 18)
X=
I×J
I J

∑∑ Z
i =1 j =1
ij
Concentration calculée moyenne (Eq. 19)
Z=
I×J
SCEr
sr = Ecart-type de répétabilité (Eq. 20)
I ( J − 1)

SCE B
− sr2
sB = I −1 Ecart-type inter-séries (Eq. 21)
J

s FI = s B2 + s r2 Ecart-type de fidélité intermédiaire (Eq. 22)

s FI Coefficient de variation de fidélité

CVFI = ×100
X intermédiaire (Eq. 23)

36
 Z
×100 Taux de recouvrement moyen (Eq. 24)
X
Avec : SCEr la somme des carrés des écarts résiduelle,
SCEB la somme des carrés des écarts inter-séries.
Les valeurs des critères calculés ne doivent pas être interprétées pour juger de la
validité de la méthode analytique. En effet, le profil d’exactitude regroupe les
notions de justesse et de fidélité dans le concept d’exactitude. On calcule ainsi
l’intervalle de tolérance des valeurs par niveau de concentration, en utilisant les
critères calculés précédemment.

I.6.4.2. Intervalle de tolérance par niveau

Comme défini à la section I.1.1, il s’agit d’un intervalle dans lequel on est capable
de prédire que se trouve en moyenne une proportion connue de mesures.
Cet intervalle peut être calculé de plusieurs façons, et la commission SFSTP a
retenu la méthode de calcul proposée par Mee [17].
On appelle β la proportion attendue de résultats futurs, comme vu à la section
I.6.1 concernant la limite d’acceptabilité.
L’intervalle de tolérance (IT) est calculé pour chaque niveau de concentration
selon la formule suivante :
[Biais% − Qt × s IT , Biais% + Qt × s IT ] Intervalle de tolérance (Eq. 25)

Les coefficients intervenant dans cette formule sont calculés comme suit :

R +1
B= Coefficient B (Eq. 26)
J × R +1
s B2
R= Coefficient R (Eq. 27)
sr2

1
s IT = s FI × 1 + Ecart-type de l’IT (Eq. 28)
IJ × B 2
Qt = t 1+ β Facteur de couverture de l’IT (Eq. 29)
ν,
2

37
Dans le calcul du facteur de couverture de l’intervalle de tolérance, la quantité
t 1+ β
représente le quantile de la distribution t de Student pour la probabilité 1 + β
ν, 2
2

et ν degrés de liberté. Ce nombre de degré de liberté est calculé selon la formule

suivante :

ν=
(R + 1)2
2
 1 1
R +  1− Nombre de degrés de liberté (Eq. 30)
 J
+ J
I −1 IJ
Le coefficient R représente le rapport des variances inter-séries et intra-série, et
traduit l’importance relative de l’effet de la série. Ainsi, si la méthode étudiée
comporte un effet série peu marqué, ces deux variances seront proches, le
coefficient R sera proche de 1 et aura donc peu d’impact dans les calculs. En
revanche, dans le cas d’une méthode présentant un effet série important, la
variance inter-séries va augmenter et le coefficient R également. Ceci aura une
conséquence importante dans le calcul du nombre de degrés de liberté, qui va
être diminué. Or, plus le degré de liberté est petit, plus le facteur de couverture Qt
va être élevé, ce qui induira un élargissement de l’intervalle de tolérance.
Une fois les calculs des coefficients effectués, on peut calculer les limites haute et
basse de l’intervalle de tolérance par niveau selon l’équation Intervalle de
tolérance (Eq. 25), qui vont nous permettre de construire le profil d’exactitude de
la méthode.

I.6.5. CONSTRUCTION DU PROFIL D’EXACTITUDE ET INTERPRÉTATION DES

RÉSULTATS

Une représentation graphique des résultats en valeurs relatives par rapport à la

valeur de référence du niveau est effectuée.
On reporte sur l’axe horizontal les valeurs de référence moyennes, et sur l’axe
vertical :
- les limites de tolérance relatives haute et basse ;
- les taux de recouvrement moyens ;
- les limites d’acceptabilité relatives haute et basse.

38
Figure 2 Profil d’exactitude
6.0

4.0
Recouvrement (%)

2.0

0.0
40 60 80 100 120 140 160

-2.0

-4.0

-6.0
Niveau de concentration (%)
Recouvrement % Intervalle tolérance Limites d'acceptabilité

L’interprétation du profil d’exactitude présenté à la Figure 2 est simple. Aussi

longtemps que l’intervalle de tolérance est compris entre les limites
d’acceptabilité, la probabilité que la différence entre la valeur Z trouvée par la
méthode en routine et la valeur de référence X reste inférieure à la limite
d’acceptabilité est supérieure à la valeur β choisie (en général 80%) : la méthode
reste valide.
Dans le cas de la Figure 2, on voit que la limite supérieure de l’intervalle de
tolérance coupe la limite supérieure d’acceptabilité vers le niveau de
concentration 70 %. Cela signifie que pour une concentration inférieure à ce
niveau, l’analyste ne peut plus garantir que la méthode est capable, en routine, de
produire en moyenne une probabilité β de résultats acceptables.
Le domaine de validité correspond aux concentrations pour lesquelles l’intervalle
de tolérance est compris dans les limites d’acceptabilité. Pour la Figure 2, le
domaine de validité de la méthode est donc compris entre les niveaux de
concentration 70 % et 140 %.

39
La Figure 2 montre également d’autres informations à partir desquels nous
pouvons effectuer un certain nombre de diagnostics pour la méthode
correspondante.
Tout d’abord, on note que le biais varie en fonction de la concentration. Il passe
de + 2 % à -2 % environ entre les niveaux de concentration 60 et 140%. Nous
avons vu à la section I.5.2 les biais de justesse pouvant être à l’origine de ce
phénomène, qu’il serait intéressant d’étudier.
Comme attendu, on remarque que la fidélité augmente avec la concentration,
conduisant à un profil d’exactitude élargi à la plus faible concentration, et qui se
rétrécit quand celle-ci augmente.
Une autre question peut être abordée à ce stade : le profil d’exactitude montre
clairement l’impact de la limite d’acceptabilité fixée pour la méthode, mais qu’en
est-il du deuxième critère de décision fixé en amont, à savoir la proportion β ?
Celle-ci est généralement fixée à 80 %, mais elle peut également être fixée à
d’autres valeurs telles que 90 % ou 95 %. On peut alors se demander quel est
l’impact de ce choix sur le profil d’exactitude.

Figure 3 Impact de la proportion β sur le profil d’exactitude

6.0 6.0
5.0 5.0
4.0 4.0
3.0 3.0
Recouvrement (%)

Recouvrement (%)

2.0 2.0
1.0 1.0

0.0 0.0
40 60 80 100 120 140 160 40 60 80 100 120 140 160
-1.0 -1.0
-2.0 -2.0
-3.0 β 80 % -3.0
β 95 %
-4.0 -4.0
-5.0 -5.0
-6.0 -6.0
Niveau de concentration (%) Niveau de concentration (%)

La Figure 3 montre à gauche, un profil d’exactitude construit avec une proportion

β fixée à 80 %, et à droite le même profil d’exactitude avec cette fois une
proportion β de 95 %. Une proportion β de 80 % signifie que l’on peut avoir 1
résultat sur 5 hors de l’intervalle de tolérance en routine, tandis qu’avec β fixée à
95 % ce risque tombe à 1 résultat sur 20.

40
Augmenter la proportion β revient donc à diminuer le risque d’avoir un résultat
hors des limites de l’intervalle de tolérance, et donc ce dernier est d’autant plus
large que β est élevée.

41
 I.7. INCERTITUDE DE MESURE
I.7.1. GÉNÉRALITÉS

L’estimation de l’incertitude de mesure, tout comme la validation analytique, est

une exigence fondamentale de la norme ISO 17025.
D’après la définition donnée en section I.1.1, l’incertitude de mesure est « un
paramètre qui caractérise la dispersion des valeurs attribuées à un mesurage ».
L’incertitude permet donc d’évaluer la dispersion des valeurs effectuées sur un
échantillon, tout comme la fidélité.
Il existe cependant des différences fondamentales entre ces deux notions :
- l’incertitude de mesure s’applique à une mesure, tandis que la fidélité
caractérise une méthode. En ce sens, l’incertitude de mesure est plus
proche de l’exactitude, qui concerne également un mesurage.
- l’estimation de l’incertitude de mesure ne fait pas partie de la validation
d’une méthode analytique.
- l’incertitude associée à une mesure va permettre à l’utilisateur final de ce
résultat de prendre une décision concernant sa conformité.
Bien que l’estimation de l’incertitude de mesure ne fasse pas partie du processus
de validation analytique, ces deux exigences peuvent être combinées. Le profil
d’exactitude illustre comment l’incertitude peut être obtenue à partir des données
générées durant la validation d’une méthode analytique.
Ainsi, les estimations de la fidélité et de la justesse obtenues lors de la validation
analytique peuvent être utilisées pour estimer l’incertitude de mesure de la
méthode.

I.7.2. UTILISATION DU PROFIL D’EXACTITUDE

Une approche classique de l’estimation de l’incertitude de mesure consiste à

identifier toutes les sources d’incertitude et à estimer leur impact sur la mesure.
On retrouve donc une démarche semblable à celle utilisée en validation pour
évaluer la fidélité de la méthode, où l’on se place en condition de fidélité
intermédiaire afin de tenir compte de diverses sources de variabilité.

42
On propose donc d’utiliser les données de validation recueillies en condition de
fidélité intermédiaire afin d’estimer l’incertitude de mesure. De plus, le profil
d’exactitude étant construit sur l’ensemble du domaine d’application de la
méthode, on peut estimer cette incertitude pour chaque niveau de concentration
étudié. Pour un niveau de concentration donné, l’incertitude-type élevée au carré
est donnée par la formule suivante :

u 2 ( Z ) = u 2 ( D) + s FI
2
(Eq. 31)

Avec : Z la valeur de la mesure,

D le biais absolu moyen.
En négligeant les incertitudes sur la valeur de référence, on démontre que :

 1
2
s FI − 1 −  sr2
u ( D) =  I (Eq. 32)
J
En réorganisant les calculs, on obtient l’équation suivante :

1
u ( Z ) = s FI × 1 + (Eq. 33)
IJ × B 2
On remarque que l’équation (Eq. 33) est identique à l’équation Ecart-type de l’IT
(Eq. 28) calculant l’écart-type de l’intervalle de tolérance. On peut donc conclure
que l’écart-type de l’intervalle de tolérance s IT permet une estimation de
l’incertitude de mesure.
Cependant, les composantes de l’incertitude prises en compte dans ce calcul ne
sont pas exhaustives et dépendent beaucoup des conditions de fidélité
intermédiaire choisies pour réaliser les essais. En particulier, l’incertitude sur les
valeurs de référence n’est pas prise en compte. C’est pourquoi cette méthode ne
remplace pas l’application d’une procédure exhaustive d’estimation de
l’incertitude, et il reste indispensable d’établir la liste des principales sources
d’incertitude sous la forme d’un diagramme causes/effets [4].

43
 PARTIE II. 2ÈME PARTIE : CONTRÔLE DE LA QUALITÉ DES
MÉDICAMENTS À BASE DE PLANTES

II.1. GÉNÉRALITÉS
II.1.1. DÉFINITIONS

La phytothérapie est une médecine traditionnelle ancestrale basée sur

l’utilisation des propriétés pharmacologiques naturelles des molécules contenues
dans les plantes. Il s’agit donc de l’art de soigner ou de prévenir une maladie par
les plantes médicinales.

La directive 2004/24/CE du Parlement européen et du Conseil donne une

définition claire du médicament à base de plantes (Herbal Medicinal Product ou
HMP) : « Tout médicament dont les substances actives sont exclusivement une
ou plusieurs substances végétales ou préparations à base de plantes ou une
association d’une ou de plusieurs substances végétales ou préparations à base
de plantes » [23].

Une Pharmacopée est un ouvrage réglementaire destiné à être utilisé par les
professionnels de santé. Il s’agit d’un recueil qui précise entre autres les normes
de qualité des plantes médicinales et de leurs préparations utilisées en
thérapeutique.
Elle définit notamment les critères de qualité des matières premières ou des
préparations entrant dans la fabrication des médicaments (à usage humain et
[24]
vétérinaire) et les méthodes d’analyse à utiliser pour en contrôler la qualité .
L’ensemble des critères est regroupé et publié sous forme de monographies.

La notion de chimiotype, officialisée en Union Européenne en 2006 avec

l’adoption du règlement REACH, désigne une entité chimique distincte au sein
d’une même espèce. En effet certaines espèces de plantes présentent des
variations chimiques de leurs métabolites secondaires en fonction des influences
de leurs écosystèmes (altitude, humidité, ensoleillement …) sans que leur
morphologie ou leur génétique ne soit changée [25].

44
Les métabolites secondaires sont des molécules qui ne participent pas
directement à l’assimilation des nutriments et au développement de la plante.
L’activité médicinale d’une plante est souvent due à ces métabolites secondaires,
qui sont soumis à des variations selon la notion de chimiotype définie ci-dessus,
ce qui va poser problème pour l’analyse de la plante [25].

La standardisation désigne l’ajustement d’une substance/préparation végétale à

une teneur définie pour un constituant ou un groupe de constituants d’activité
thérapeutique connue, soit par ajout d’excipients, soit par mélange de lots de
substance végétale et/ou de préparation à base de plante (e.g. les extraits
standardisés) [26].

Une spécification est un ensemble de tests, de références à des procédures

analytiques, et des critères d’acceptation appropriés, qui sont des limites
numériques, intervalles, ou autres critères pour les tests décrits. Elle établit
notamment l’ensemble des critères auxquels une substance ou préparation
végétale ou un HMP doit se conformer pour être considéré comme acceptable
pour son utilisation [26].

Les marqueurs d’une plante sont des constituants chimiquement définis ou

groupes de constituants d’une substance végétale, d’une préparation à base de
plantes ou d’un HMP qui sont d’intérêt pour son contrôle, qu’ils aient des activités
thérapeutique et pharmacologique ou non. Les marqueurs servent à calculer la
quantité de substance végétale ou de préparation à base de plantes dans les
HMP si le marqueur a été préalablement dosé quantitativement dans la substance
végétale ou la préparation à base de plantes [26].

II.1.2. CONTEXTE RÉGLEMENTAIRE

Comme tous les médicaments, les médicaments à base de plantes doivent

répondre à plusieurs exigences réglementaires concernant leur fabrication, leur
composition, les tests effectués pour leur contrôle, leur stockage et leur
distribution [6].

Les principaux référentiels concernant les médicaments à base de plantes sont,

d’une part, les monographies des plantes médicinales des différentes

45
Pharmacopées, et d’autre part les guidelines publiées par l’European Medicine
Agency (EMA).
En effet, au sein de l’EMA un comité d’experts spécialisés dans le domaine de la
phytothérapie, le Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC), est en charge
des questions concernant les HMP [24].
Ces derniers sont soumis à la réglementation générale s’appliquant aux
médicaments, mais le HMPC publie également des guidelines spécifiques aux
HMP, afin de porter un éclairage sur des points de la réglementation générale ne
prenant pas en compte les spécificités des HMP. Par exemple, le guideline
EMEA/HMPC/246816/2005 porte sur les bonnes pratiques agricoles et de récolte
(Good Agricultural and Collection Practice, GACP) pour les matières premières
d’origine végétale [27].
Les monographies des plantes médicinales peuvent être trouvées dans la
Pharmacopée Européenne, mais également dans les Pharmacopées nationales
des pays européens, la United States Pharmacopeia (USP), la Pharmacopée
Japonaise, ou toute autre Pharmacopée nationale.

Comme pour tous les médicaments, la commercialisation des HMP est soumise à
l’obtention d’une AMM. Cependant, une procédure d’enregistrement simplifiée a
été établie par la Directive 2004/24/CE pour les médicaments traditionnels à base
de plantes à usage humain, définis à l’article L5121-14-1 du Code de la Santé
Publique [26].
Cette procédure simplifiée autorise la démonstration de la qualité et de l’innocuité
du HMP uniquement sur la base de données bibliographiques, sans procéder à
une étude clinique.

Les principales problématiques concernant la réglementation des médicaments à

base de plantes sont d’une part, le manque d’harmonisation entre les contraintes
réglementaires des différents pays, et d’autre part le manque de guidelines
strictes sur le contrôle de la qualité, et sur l’évaluation de la sécurité et de
l’efficacité des produits à base de plantes.
Ainsi, selon les réglementations, une plante peut être définie comme un aliment,
un aliment fonctionnel, un complément alimentaire ou bien comme une plante
médicinale.

46
De plus, le terme de plantes médicinales inclut les plantes, les matières
végétales, les préparations végétales et les produits finis végétaux.
L’EMA définit la drogue végétale comme étant la plante entière, fragmentée ou
coupée, les parties de plantes, algues, champignons, lichens dans un état non-
traité, sous forme fraîche ou séchée. Un exsudat non traité est également
considéré comme une drogue végétale.
Lorsque la drogue végétale est soumise à un traitement tel que l’extraction, la
distillation, l’expression, le fractionnement, la purification, la concentration ou la
fermentation, elle devient alors une préparation végétale. Les plantes
pulvérisées, teintures, extraits, huiles essentielles, jus pressés et exsudats sont
des préparations végétales [28].

47
 II.1.3. CONSTITUANTS DES MÉDICAMENTS À BASE DE PLANTES

Selon la définition de l’EMA, une substance active est :

« Toute substance ou mélange de substances destinée à être utilisé pour la
fabrication d’un produit médicinal et qui, lorsqu’elle est utilisée pour la production
d’une drogue, devient un ingrédient actif du produit médicinal » [29].

Pour les médicaments d’origine chimique, la substance active est une molécule
bien définie, dont les propriétés thérapeutiques sont connues, qui est ajoutée en
quantité maîtrisée au médicament lors de sa fabrication.

Pour les HMP, selon la définition donnée à la section II.1.1, la substance active
est une ou plusieurs substance(s) végétale(s) ou préparation(s) à base de
plantes.
Or, les matériaux bruts végétaux et leurs extraits sont habituellement composés
de mélanges complexes de plusieurs molécules chimiques. Parmi ces nombreux
composants, le (ou les) composé(s) responsable(s) de l’effet pharmacologique
n’est (ne sont) pas connu(s) avec certitude. Il est vraisemblable que l’effet
rapporté soit dû à l’action synergique de plusieurs constituants.

[26] [30] [31] [32]

Les lignes directrices de l’EMA portant sur la qualité des HMP
définissent différents types de constituants :
- les constituants caractéristiques ;
- les constituants ayant une activité thérapeutique connue ;
- les marqueurs actifs et les marqueurs analytiques ;
- les constituants toxiques.

Les constituants caractéristiques sont des substances chimiquement définies

ou des groupes de substances qui sont spécifiques d’une plante médicinale et
peuvent être utilisés à des fins d’identification.

Les constituants ayant une activité thérapeutique connue sont des

substances chimiquement définies ou des groupes de substances généralement

48
considérées comme contribuant substantiellement à l’activité thérapeutique de la
substance végétale, la préparation à base de plante ou le HMP. Ces constituants
doivent obligatoirement être dosés.

Il existe deux catégories de marqueurs (définition en section II.1.1) :

• Les marqueurs analytiques, constituants ou groupes de constituants qui
servent uniquement à des buts analytiques ;
• Les marqueurs actifs, constituants ou groupes de constituants qui sont
généralement considérés comme contribuant à l’activité thérapeutique.

Nous verrons au chapitre II.4 que la présence ou non de certains types de

constituants dans un HMP va influencer son dosage.

La présence de constituants toxiques devra être étudiée, et le cas échéant leur

quantité doit être maîtrisée et limitée sur la base d’une évaluation toxicologique.

II.1.4. CATÉGORIES DE HMP

Les substances végétales/préparations à base de plantes sont essentiellement

définies par leur processus de fabrication, ainsi que par les constituants qui les
composent.

Ainsi il existe trois catégories de substances végétales et préparations à base de

plantes :

- Les substances végétales/préparations à base de plantes standardisées

contiennent des constituants ayant une activité thérapeutique connue. Ces
constituants sont ajustés à une teneur connue par l’ajout d’excipients ou
bien par mélange de différents lots de substance végétale / préparation à
base de plantes.

- Les substances végétales/préparations à base de plantes quantifiées

contiennent des marqueurs actifs ajustés à une teneur définie
exclusivement par mélange de différents lots de substance
végétale/préparation à base de plantes.

49
 - Les autres substances végétales/préparations à base de plantes n’ont pas
de constituants ayant une activité thérapeutique connue ni de marqueurs
actifs connus. La teneur en marqueur analytique n’est pas ajustée.

Ces trois catégories de substances actives peuvent également être classifiées en

deux groupes selon leur processus de fabrication :

- Les substances végétales/préparations à base de plantes constituées de

substance végétale broyée ou pulvérisée ;

- Les substances végétales/préparations à base de plantes dont la

préparation s’effectue par étapes, allant au-delà du broyage.

Cette classification va déterminer, entre autres, les spécifications de la matière

concernée, ainsi que le choix du constituant de la matière végétale à doser pour
son analyse quantitative [31].

50
 II.2. VARIABILITÉ DES PLANTES : NOTION DE CHIMIOTYPE
II.2.1. PRINCIPE

La notion de chimiotype définie en section II.1.1 introduit le concept de variation

chimique des constituants d’une plante. Ces variations peuvent être d’ordre
qualitatif, ou bien quantitatif. Or, comme vu à la section II.1.2, la plante ainsi que
ses différents composants constituent la substance active des HMP.

La fabrication de médicaments à base de plantes implique de travailler avec une

substance active qui peut subir des variations qualitatives et quantitatives suivant
un certain nombre de facteurs, par exemple :
- La plante en elle-même : espèce, organe, etc…
- L’environnement : degré d’humidité, type de terrain, ensoleillement,
température, méthode de culture, etc…
- La récolte : variations diurnes, saisonnières, méthode de collecte, etc…
- Les traitements apportés : contamination, substitution, frelatage, pratique
de production, etc…

Ainsi, la fabrication d’un produit avec une formulation constante, qui fournira l’effet
physiologique désiré est un des challenges les plus complexes pour les
entreprises fabricant des produits de phytothérapie.

La qualité du produit fini étant directement reliée à la qualité des matières

premières, le contrôle de la qualité d’un HMP sera fortement conditionné par
l’assurance de la qualité de la plante médicinale, notamment par son identification
précise et par la maîtrise des facteurs décrits précédemment [33].

II.2.2. IMPACT SUR LE CONTRÔLE QUALITÉ DES HMP

L’établissement des standards d’évaluation de la qualité des HMP sous-entend

que des standards initiaux pour la matière première à usage médical ont
également été établis.

51
Comme vu en section II.1.3., la matière première à usage médical d’un HMP peut
être soit une préparation à base de plantes issue d’une matière première
végétale, soit la drogue végétale brute elle-même.

Les spécifications applicables à ces matières premières seront retrouvées dans

des monographies pour les préparations végétales, mais également dans des
monographies pour les drogues végétales desquelles elles sont issues.

Par exemple, pour un HMP contenant de l’extrait sec de Millepertuis, la matière

première devra répondre aux exigences de la monographie Ph. Eur. 1874
« Millepertuis (extrait sec quantifié de) », et la matière végétale dont l’extrait est
issu devra répondre aux exigences de la monographie Ph. Eur. 1438
« Millepertuis ».

Les monographies concernant les drogues végétales doivent être très

spécifiques, et bien définir le genre et l’espèce dont la partie de plante est issue.
Une identification précise de la drogue est nécessaire compte tenu de la notion de
chimiotype vue précédemment.

De plus, des mesures de contrôle des conditions pouvant impacter la qualité de la

plante doivent être prises depuis le point d’approvisionnement en plante
médicinale jusqu’à son analyse, et la collecte doit s’effectuer sous les Bonnes
Pratiques Agricoles, dans un champ sauvage ou une culture [34].

52
 II.3. CONTRÔLE QUALITÉ DES MÉDICAMENTS À BASE DE PLANTES
II.3.1. PRINCIPE

Comme pour tout médicament, le contrôle de la qualité des HMP est essentiel
pour attester de la qualité, la sécurité et de l’efficacité du produit.

Comme vu en section II.2.2., le contrôle de la qualité d’un HMP se fera à

plusieurs étapes du processus de fabrication. Devront être contrôlés :
- La qualité de la drogue végétale utilisée ;
- Le cas échéant, la qualité de la préparation à base de plantes issue de
cette drogue ;
- Enfin, la qualité du HMP à libération.

Le contrôle qualité des substances végétales est basé sur des paramètres tels
que l’identification de la matière, la teneur en eau de la substance, le dosage, les
impuretés inorganiques, les limites microbiologiques, les mycotoxines, les
pesticides et autres.
Pour les HMP, en plus de ces tests s’ajoutent la désintégration, la dissolution, la
dureté et l’uniformité de teneur.

Ces spécifications sont bien souvent différentes de celles appliquées aux drogues
synthétiques ou hautement purifiées, dont les constituants actifs peuvent être plus
facilement identifiés chimiquement et quantifiés [28].

II.3.2. PROBLÈMES RENCONTRÉS

La nature particulière des médicaments d’origine végétale va engendrer un

certain nombre de problèmes concernant leur contrôle qualité [35].
Ces problèmes peuvent être d’origine externe au produit, ou bien être dus au
produit en lui-même.

53
Les problèmes externes rencontrés sont les suivants :
- La contamination du matériel végétal, par des métaux lourds, des
pesticides, des mycotoxines, des micro-organismes ou toute autre matière
étrangère. L’évaluation de ces différents types de contamination doit être
systématiquement effectuée.
- Le frelatage, d’origine frauduleuse, doit être contrôlé par des méthodes
adéquates d’identification de la plante.
- Les erreurs d’identification fortuites, également contrôlées par
l’identification du matériel végétal.

Les problèmes internes au produit sont les suivants :

- La complexité phytochimique des plantes qui peuvent synthétiser une
immense variété de composés tels que des acides gras, des alcaloïdes,
des flavonoïdes, des tanins, etc… Le matériel végétal à contrôler peut
donc contenir plusieurs centaines de composés chimiques organiques, ce
qui rend difficile la maîtrise de sa qualité.
- La variabilité des plantes, abordée au chapitre II.2.

Il est indispensable de trouver des solutions à ces problématiques. Les problèmes

externes peuvent être contrôlés par la maîtrise de l’origine de la plante,
l’évaluation des contaminants et l’identification rigoureuse du matériel végétal. Ce
dernier point est critique, du fait de la complexité du matériel végétal, des
techniques d’identification spécifiques sont donc requises, comme l’établissement
de fingerprint. Il s’agit d’une véritable « empreinte digitale » représentant
l’ensemble des constituants de la plante. Cette méthode est décrite au
paragraphe II.3.3.
Les problèmes internes vont avoir un impact important sur le dosage des HMP,
qui est étudié au chapitre II.4.

II.3.3. IDENTIFICATION PAR FINGERPRINT

La technique d’identification par fingerprint est une méthode qualitative utilisant

des profils chromatographiques obtenus par CLHP-UV, CLHP-MS, CPG ou

54
encore CCM, et permettant d’identifier une plante particulière, de la distinguer
d’espèces proches. Cette technique peut être utilisée pour surveiller la constance
de la composition de la plante.
En effet, un fingerprint chromatographique est, comme son nom l’indique, une
« empreinte digitale » présentant les constituants représentatifs de la plante.
Ainsi, l’identification de la plante peut se faire par comparaison à un fingerprint de
référence.
De plus, en utilisant les témoins appropriés, l’identification de composés
caractéristiques de la plante est possible.
Le suivi de l’évolution du fingerprint dans le temps donne également une
indication sur la stabilité de la composition de la plante.

Ainsi, l’utilisation de méthodes qualitatives de fingerprint et de méthodes

quantitatives est une approche complémentaire recommandée par la FDA et
l’EMA pour le contrôle de la qualité et l’évaluation de la stabilité des HMP [36] [37].

55
 II.4. DOSAGE DES HMP
II.4.1. PRINCIPE

La méthode de dosage des constituants des plantes et préparations à base de

plantes inscrites dans une Pharmacopée est indiquée dans la monographie
correspondante.
Pour les matières ne possédant pas de monographie Pharmacopée, des
procédures analytiques de dosage doivent être développées.

Lorsque la substance active d’un médicament est connue, comme pour les
médicaments produits par synthèse chimique, il est évident que le dosage du
médicament correspondra au dosage de cette substance active.

Or, comme nous l’avons vu précédemment, pour les médicaments à base de

plantes, la substance active ne peut pas être réduite à une entité chimique simple,
et les composés responsables de l’activité thérapeutique ne sont bien souvent
pas encore identifiés.
Le choix du, ou des constituants à doser se fera alors au cas par cas, en fonction
du type de constituants présents dans la plante à analyser [38].

II.4.2. CHOIX DU COMPOSÉ À DOSER

Le choix du composé à doser dans le cadre de l’étude quantitative du matériel

végétal est imposé par la classification décrite à la section II.1.4.

Ainsi, dans le cas d’un matériel végétal standardisé, les lignes directrices de
l’EMA relatives à la qualité des médicaments à base de plantes stipulent que les
constituants ayant une activité thérapeutique connue doivent être utilisés pour la
quantification [32].

Dans le cas d’un matériel végétal quantifié, le marqueur actif doit être choisi pour
la quantification.

56
Enfin, dans le cas d’un matériel végétal pour lequel ni le constituant ayant une
activité thérapeutique, ni le marqueur actif ne sont connus, le choix d’un marqueur
analytique s’impose.

II.4.3. UTILISATION DE MARQUEURS : PRINCIPE ET LIMITES

Les marqueurs sont des outils importants pour faire le lien entre la substance
active végétale et le médicament à base de plante, qu’ils possèdent une activité
thérapeutique ou non. En effet, en connaissant la quantité de marqueur présente
dans la substance active végétale, et celle présente dans le HMP, il est possible
de déduire la quantité de substance active végétale présente dans le médicament
final. Il s’agit donc d’une information cruciale pour le contrôle qualité du HMP.

Le choix du (ou des) marqueur(s) est une étape critique du développement de la

méthode de dosage d’un HMP, qui doit être justifiée.

Pour les substances végétales inscrites dans une Pharmacopée, le constituant à

doser ainsi que la méthode de dosage et le critère d’acceptation associé sont
décrits dans la monographie correspondante.

Pour les substances végétales non inscrites à la Pharmacopée, le choix d’un ou

de plusieurs marqueurs appropriés doit être effectué et justifié. Cependant, il
existe peu de guides relatifs aux exigences de qualité pour les marqueurs
permettant d’aider à faire ce choix.

Le guideline de l’EMA « Reflection paper on markers used for quantitative and

qualitative analysis of herbal medicinal products and traditional herbal medicinal
[30]
products » offre une base de réflexion en proposant les critères principaux
suivants :

- Le choix devra se porter en priorité sur des marqueurs spécifiques de la

substance active à analyser ;
- Le marqueur sert à calculer la quantité de substance active dans le produit
fini ;

57
 - La sélection de marqueurs pour l’analyse quantitative permet l’analyse
quantitative de chaque substance active dans le produit fini ;
- Le marqueur doit être présent constamment dans la substance active, et
être une entité chimiquement définie ;
- Le marqueur doit être analysable avec un équipement analytique de
routine ;
- Le marqueur doit être présent en teneur adéquate dans la substance active
pour permettre le développement d’une méthode quantitative valide et
reproductible, et être stable.

Plusieurs problématiques sont à l’origine de la complexité du choix des

marqueurs :

- Les constituants caractéristiques de la substance végétale ne sont pas

toujours clairement identifiés, et sont parfois présents en trop petite
quantité pour être quantifiés ;
- Les marqueurs peuvent être instables ou difficiles à définir chimiquement, il
peut aussi s’agir d’un groupe de constituants, ou ils peuvent ne pas être
caractéristiques de la substance végétale ;
- Les marqueurs caractéristiques ne sont pas toujours commercialement
disponibles ;
- Les marqueurs caractéristiques peuvent subir des pertes au cours de la
fabrication ou peuvent être masqués par d’autres composants du produit.

Une fois le choix du marqueur effectué, la limite d’acceptation associée à ce

marqueur doit être établie et justifiée en se basant sur la validation analytique de
la méthode [30] [39].

II.4.4. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE DE DOSAGE

- Préparation de l’échantillon : extraction

La préparation d’échantillon est toujours une étape clé du développement d’une

méthode analytique de dosage, a fortiori dans le cas d’un médicament à base de

58
plantes. En effet, il faut dans un premier temps extraire les composés de la
matrice de l’échantillon afin de pouvoir les doser.
Les monographies des Pharmacopées recommandent habituellement des
méthodes d’extraction comme le passage aux ultra-sons, le chauffage à reflux ou
l’extraction au Soxhlet.
De nouvelles techniques permettant de réduire le temps d’extraction, de diminuer
la consommation en solvants organiques et d’améliorer le rendement d’extraction
apparaissent, comme par exemple l’extraction automatisée ASE® (Accelerated
[40]
Solvent Extraction), utilisant de hautes températures et une pression élevée ,
ou bien l’extraction sur phase solide SPE (Solid Phase Extraction) permettant
notamment de minimiser l’effet matrice.

- Méthode d’analyse

La solution obtenue après extraction de la matière, ou extrait, peut être analysée

par des méthodes spectrophotométriques (spectrophotométrie UV), et/ou par des
méthodes chromatographiques (CPG, CHLP, CLUP).
L’extraction étant dans la plupart des cas non sélective du composé à doser, les
méthodes chromatographiques sont préférées car elles permettent de séparer les
différents composés en solution dans l’extrait.

- Effet de matrice

Lorsqu’une méthode ne permet pas de séparer le composé à doser du reste de la

matrice, l’évaluation de la teneur en composé va être faussée. Il s’agit d’un effet
de matrice, qui est un problème important pour l’analyse des HMP. En effet, il est
impossible d’avoir des échantillons de matrice végétale seule, exempte de
composés à doser. Il est donc impossible d’obtenir des blancs d’analyse pour les
matières végétales, rendant les problèmes d’effet de matrice plus difficiles à
détecter et à corriger.
Il est donc crucial de développer des méthodes d’analyse des HMP permettant
d’éviter au maximum cet effet de matrice [38].

59
 II.4.5. VALIDATION DE LA MÉTHODE DE DOSAGE

Une fois développée, la méthode de dosage d’un HMP doit être validée selon les
exigences réglementaires en vigueur citées à la section I.1.2.
Les problématiques spécifiques à la validation analytiques des méthodes de
dosage des HMP sont détaillées dans la Partie III.

II.4.6. CRITÈRES D’ACCEPTATION

Une fois la procédure analytique de dosage établie et validée, les critères

d’acceptation de ce dosage doivent être établis.
Les exigences de la réglementation européenne sur la teneur en substance active
du produit fini sont très strictes, et l’erreur liée à la procédure analytique s’ajoutant
à la variabilité des plantes, il est très difficile de satisfaire ces exigences.

Pour les substances végétales, qui constituent les matières premières des HMP,
une teneur minimale en constituants ayant une activité thérapeutique connue ou
en marqueurs est requise [31].

Pour les produits finis, la directive 75/318/CEE amendée stipule :

« Sauf justification appropriée, les écarts maximaux tolérables de la teneur

en substance active ne peuvent dépasser ± 5% dans les produits finis au
moment de la fabrication. […] Les limites excédant ± 5% au moment de la
libération doivent être justifiées dans la partie « Développement du procédé
de fabrication » par des résultats expérimentaux habituellement basés sur
un intervalle de confiance de 95%. Les limites élargies incluent également
les variations liées à la production et à la procédure analytique » [21].

Cette directive s’applique aux médicaments dont les substances actives sont
chimiquement définies. Compte tenu de ce qui a été décrit précédemment sur la

60
variabilité naturelle des teneurs en constituants des plantes, on comprend
aisément qu’un écart maximal tolérable de ± 5% à libération pour la teneur en
substance active du produit fini peut difficilement être applicable aux
médicaments à base de plantes.
Des exceptions peuvent être acceptées, si justifiées et autorisées. Pour les HMP,
des limites élargies peuvent être fixées au cas par cas, mais aucune limite
générale ne peut être recommandée car la variation dépend de la substance
végétale utilisée.

61
 PARTIE III. 3ÈME PARTIE : VALIDATION ANALYTIQUE DES PRODUITS
À BASE DE PLANTES

III.1. GÉNÉRALITÉS

Aucune ligne directrice spécifique expliquant comment effectuer la validation

analytique des produits d’origine végétale n’a été publiée à ce jour [41].
La validation d’une procédure analytique non décrite à la Pharmacopée suit la
même réglementation que les médicaments renfermant des substances actives
chimiquement définies, et doit donc satisfaire aux exigences de la norme ICH Q2
(R1) [2]. L’utilisation des guides de validation de la SFSTP est également possible.
Or, comme vu en Partie I, ces lignes directrices et ces guides s’appliquent aux
médicaments renfermant des substances actives chimiquement définies, ou aux
produits biologiques, mais ils gardent une portée générale et ne tiennent donc pas
compte des spécificités des HMP.
L’application de ces normes et guides de validation peut alors conduire à des
situations problématiques pour la validation d’un HMP.
Compte tenu de leur matrice complexe, les HMP se rapprochent plus des produits
biologiques et nous pouvons être tentés de valider leurs méthodes de dosage
analytique en suivant les procédures des guides adaptés aux produits
biologiques.
Cependant ceux-ci ne sont pas idéaux pour les HMP, d’une part en raison des
variations naturelles d’une matrice végétale en termes qualitatif et quantitatif, et
d’autre part en raison de l’impossibilité de se procurer une matrice exempte de
l’analyte à doser, contrairement au produit biologique pour lequel la matrice seule
peut être disponible.

Une réflexion s’impose donc afin de proposer des protocoles de validation

[41]
applicables aux médicaments à base de plante(s) . Une étude de l’applicabilité
du protocole de validation SFSTP 2003-2006 à la validation des médicaments à
base de plantes est présentée au chapitre III.2. Le chapitre III.3 présente une
proposition de protocole de validation adapté au dosage d’un médicament à base

62
de plantes, ainsi qu’une discussion sur l’application de ce protocole et sur les
résultats obtenus.

63
 III.2. APPLICABILITÉ DU PROTOCOLE DE VALIDATION SFSTP 2003-
2006 À LA VALIDATION DES MÉDICAMENTS À BASE DE PLANTES

Ce chapitre met en lumière les propositions présentées dans les guides de

validation SFSTP 2003 et 2006, nécessitant des adaptations afin d’être utilisées
pour la validation d’une méthode de dosage d’un médicament à base de plantes.
Les propositions des guides de validation pouvant être directement appliquées à
cette fin, car non impactées par les spécificités des produits considérés, ne seront
pas abordées.

III.2.1. ETABLISSEMENT DU PROTOCOLE DE VALIDATION

III.2.1.1. Préparation des standards d’étalonnage

Le guide de validation SFSTP 2003 présente une démarche permettant de

sélectionner un protocole expérimental de validation en fonction des contraintes
ou des spécificités liées à la procédure de dosage à valider (voir figure 7 et
tableau 3 du guide SFSTP 2003) [3].
Dans le cas où la procédure de dosage présente un effet de matrice, il est
proposé de réaliser un étalonnage avec la matrice du produit, c’est-à-dire de
préparer les standards d’étalonnage en ajoutant les excipients du produit à une
quantité connue de témoin de substance active.
Or, dans les matières végétales, la matrice est intrinsèquement liée aux
substances actives. En considérant les principes énoncés à la section II.1.3, la
plante ne peut être considérée que dans son ensemble, et l’obtention d’une
matrice végétale exempte de substance active paraît irréalisable.
Il est donc impossible de soumettre les standards d’étalonnage à l’effet matrice,
ce qui représente un problème capital pour la validation analytique des
médicaments à base de plantes.

64
 III.2.1.2. Niveaux de concentration

Plusieurs choix de niveaux de concentration sont proposés (voir Figure 4 ci-

dessous) en fonction du type de procédure à valider.

Figure 4 Exemples de choix possibles pour les niveaux de concentration

des standards en fonction du type de procédure (Reproduction du Tableau
IV du guide SFSTP 2003 [3])

La procédure 1 correspond au « dosage d’une substance chimique seule dont la

référence est disponible ou dosage d’une substance chimique (principe actif,
agent conservateur) dans une spécialité pharmaceutique (matrice) ».
La procédure 6 correspond au « dosage d’une substance chimique dans une
matrice complexe (exemple : principe actif et ses métabolites dans le plasma
[médicaments], résidus médicamenteux ou autres contaminants dans les
aliments, etc.) ».

On peut alors se demander quelle procédure convient le mieux pour un

médicament à base de plantes.

65
En effet, le dosage étant appliqué à un médicament, la procédure 1 semble la
mieux indiquée. Mais pour certaines plantes, les marqueurs sont présents en
faibles quantités, et la substance végétale étant une matrice complexe, la
procédure 6 pourrait être plus adaptée.

Le choix des niveaux de concentration des standards ne peut donc pas être
formalisé de manière générale, mais doit être étudié au cas par cas.

III.2.1.3. Prévalidation de la méthode

Une étude préalable à la validation analytique de la méthode est proposée, la

prévalidation. Contrairement à ce qui est établi, cette étude ne peut pas être
réalisée sur les standards d’étalonnage pour les médicaments à base de plantes
compte tenu de l’effet de matrice, mais plutôt sur un échantillon de concentration
connue afin d’étudier cet effet.
Ainsi la prévalidation d’une méthode de dosage d’un médicament à base de
plante sera plutôt remplacée par une étude d’optimisation de la méthode.
Cette optimisation portera notamment sur les conditions d’extraction de la
matière, qui est une étape cruciale pour évaluer correctement la quantité de
marqueur contenue dans la plante.
Ensuite, la minimisation de l’effet de matrice et l’amélioration de la spécificité de la
méthode pourront être étudiées.

III.2.1.4. Nombre optimal d’expériences en phase de validation

Plusieurs choix de nombre de séries et de répétitions par série pour les standards
de validation sont proposés en fonction de la fidélité observée de la méthode (voir
Figure 5 ci-après).

66
Figure 5 Nombres recommandés de séries et de répétitions par série
(Reproduction du Tableau VII du guide SFSTP 2003 [3])

En pratique, les méthodes utilisées pour le dosage des médicaments ont

rarement des coefficients de variation de fidélité élevés, et le plan de validation
retenu sera généralement trois séries de validation avec quatre répétitions par
séries.
Comme vu à la sous-section I.6.2.1, le nombre de répétitions va également
dépendre du temps de préparation de l’échantillon. Pour le dosage des
médicaments à base de plantes, cette étape, avec notamment la phase
d’extraction, peut être relativement longue et ainsi accroître considérablement la
durée d’une série de validation.
Dans ce contexte, le nombre de répétitions sera généralement ramené à trois par
séries pour les HMP.

67
 III.2.2. STATISTIQUES

Après la réalisation des essais de validation et l’estimation des paramètres

d’étalonnage, le guide de validation SFSTP 2006 indique que, dans le cas où les
quantités introduites ne sont pas identiques, il faut aligner les concentrations sur
la concentration moyenne du niveau par interpolation.
Pour le dosage des médicaments à base de plante, il semble préférable de
procéder autrement pour s’affranchir des différences de pesées.
En effet, afin d’obtenir des résultats plus facilement exploitables, les quantités de
marqueurs calculées par étalonnage inverse vont être exprimées sous forme de
recouvrement par rapport à la quantité théorique introduite.
Cette méthode est expliquée dans la proposition présentée au chapitre III.3.

III.2.3. CONCLUSION

La méthodologie statistique proposée par les guides de validation SFSTP 2003 et

2006 est dans l’ensemble bien adaptée au dosage des médicaments à base de
plantes. En effet, la construction du profil d’exactitude ne nécessite pas
d’adaptation pour s’appliquer à la validation du dosage de ce type de produits.
Le guide de validation SFSTP 2003 présente bien la difficulté d’établir un
protocole de validation approprié permettant de démontrer les qualités
fonctionnelles de la méthode. Or, les propositions présentées ne tiennent pas
compte des spécificités du travail sur du matériel végétal, et doivent donc être
adaptées pour les validations de médicaments à base de plantes.
Il apparaît alors important d’établir des guides aidant à la préparation des
standards de validation adaptés aux produits végétaux, car si les données
obtenues à l’issu des essais de validation sont insuffisantes ou inadaptées, les
outils statistiques, aussi performants soient-ils, ne pourront pas permettre
d’évaluer correctement la qualité de la méthode d’analyse.

68
 III.3. ETUDE PRATIQUE : VALIDATION ANALYTIQUE D’UN PRODUIT DE
PHYTOTHÉRAPIE

Le but de cette étude était de valider la méthode de dosage d’un marqueur

analytique par chromatographie liquide en mode gradient avec une détection UV,
dans un produit fini composé à 100 % de poudre de plante. Pour des raisons de
confidentialité, aucun détail sur le produit fini concerné ne peut être communiqué
dans cette thèse.
Cette validation a ensuite été présentée aux autorités dans le cadre de la
soumission du dossier d’autorisation de mise sur le marché du médicament, et a
été acceptée sans remarques ou demande d’informations complémentaires.

III.3.1. MATÉRIEL ET MÉTHODES

III.3.1.1. Domaine de validation

La plante contenue dans le produit fini possédant une monographie à la

Pharmacopée Européenne, le marqueur utilisé est celui préconisé par cette
monographie.
Le domaine de validation a été calculé en tenant compte de la spécification
concernant la teneur du marqueur proposé par la monographie Ph. Eur., de la
perte à la dessiccation maximale admise sur la substance végétale, ainsi que de
la teneur maximale obtenue sur le recul historique de la teneur des lots.

Il a donc été choisi de valider :

- de 80 % de la spécification minimale corrigée par la perte à la dessiccation,
soit 0,036 % m/m sur la substance telle que ;
- à 120 % de la teneur maximale observée sur l’historique des lots, soit
0,075 % m/m sur la substance telle que.

Nous avons travaillé sur un lot de produit fini quantifié en interne à une teneur en
marqueur de 0,053 % m/m sur la substance telle que.
Ainsi, pour couvrir le domaine de validation choisi, les prises d’essai de produit fini
ont été adaptées.

69
 III.3.1.2. Plans d’expérience

Pour cette validation, le nombre I de séries de validation a été fixé à 3, en

considérant qu’une série est équivalente à un jour.

Pour le plan d’expérience de validation, le nombre J de répétitions a été fixé à 3 et

le nombre de niveaux de concentration K est de 5 : 60%, 80%, 100%, 120% et
140% de la teneur en marqueur de la matière utilisée pour effectuer la validation.

Pour le plan d’expérience d’étalonnage, le nombre J’ de répétitions est fixé à 2 et

le nombre de niveaux de concentration K’ est de 1 : 100% de la teneur en
marqueur de la matière utilisée pour effectuer la validation.

III.3.1.3. Appareillage

Le dosage du marqueur dans le produit fini est réalisé à l’aide d’une chaîne HPLC
Waters Alliance (appareillage A), et d’une UHPLC Dionex (appareillage B).
La colonne utilisée sur ces deux appareillages est de type Hypersil C18 provenant
de chez Thermo-Hypersil-Keystone.

III.3.1.4. Echantillons, réactifs et matériaux

La forme pharmaceutique reconstituée est obtenue à partir d’un lot de produit fini.
Le témoin utilisé provient de chez Extrasynthèse, et est déclaré à une pureté
de 100,00 %.
Les solvants utilisés proviennent de chez Sigma-Aldrich et sont tous de qualité
HPLC.
Les filtres utilisés sont des filtres de 0,45µm en PTFE et des filtres de 0,22µm en
PVDF provenant de chez Millipore.

70
 III.3.1.5. Méthode d’extraction

Le produit est extrait trois fois en utilisant du méthanol R, par extraction à reflux
au bain-marie pendant 30 minutes.
La solution est ensuite filtrée, puis complétée par du méthanol R à un volume de
250,0 ml. 50,0 ml de filtrat sont évaporés à siccité, puis le résidu est repris dans
5,0 ml de phase mobile A composée d’eau R, de méthanol R, de
tétrahydrofuranne R et d’acide acétique R. Cette solution est ensuite filtrée sur un
filtre membranaire 0,45 µm en PTFE avant injection.

Les témoins sont préparés par dissolution du composé témoin dans de la phase
mobile.

III.3.1.6. Méthode de dosage

Le dosage est effectué par chromatographie liquide (Ph. Eur. 2.2.29).

L’analyse quantitative du marqueur est effectuée par un détecteur UV couplé au
système chromatographique.
La séparation chromatographique est réalisée sur une précolonne de type C18
suivie d’une colonne Hypersil C18 (250 mm × 4,6 mm de diamètre interne, taille
des particules de 5 µm).
L’élution se fait à un débit de 0,5 ml/min, avec une phase mobile A composée
d’eau R, de méthanol R, de tétrahydrofuranne R et d’acide acétique R (42/45/5/8
V/V/V/V), et une phase mobile B composée de méthanol R. Le profil du gradient
d’élution est indiqué dans le Tableau 2.
La colonne est maintenue à une température de 25°C et le volume d’injection est
de 20 µl.

71
Tableau 2 Profil du gradient d’élution pour l’analyse quantitative par HPLC
du marqueur
Phase mobile A Phase mobile B
Temps (min)
(% V/V) (% V/V)
0 100 0
40 100 0
41 30 70
60 30 70
61 100 0
75 100 0

La détection s’effectue à la longueur d’onde fixe de 258 nm, correspondant à un

maximum d’absorption du marqueur, et également en barrette de diodes sur la
zone spectrale entre 200 nm et 450 nm.

Le calcul de la teneur en marqueur en mg/gélule de produit tel que, s’effectue en

utilisant l’expression suivante :
Ae × mt × P × Ve × PM
TPF (%) = At × me × Vt

Avec :
Aire du pic de marqueur dans le chromatogramme obtenu avec la
Ae :
solution à examiner ;
Aire du pic de marqueur dans le chromatogramme obtenu avec la
At :
solution témoin ;
me : Prise d’essai de forme pharmaceutique reconstituée, en grammes ;
mt : Prise d’essai de témoin, en grammes ;
P : Pureté du témoin, en % ;
Ve : Volume de dilution de la solution à examiner, en millilitres ;
Vt : Volume de dilution de la solution témoin, en millilitres ;
PM : Masse théorique du contenu d’une gélule.

72
 III.3.2. RÉSULTATS

III.3.2.1. Spécificité

La spécificité de la méthode de dosage du marqueur dans le produit est étudiée

par comparaison des chromatogrammes obtenus à partir d’une solution de blanc
de dilution (phase mobile A), d’une solution de standard d’étalonnage, et d’une
solution de standard de validation.
De plus, la superposition spectrale (200-450 nm) des pics de marqueur des
chromatogrammes obtenus à partir des standards d’étalonnage et de validation
est effectuée.

Les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau 3 :

Tableau 3 Résultats de l’étude de spécificité

TR pic de marqueur Superposition spectrale
Solution
(min) (200-450 nm)
Blanc de dilution Absence
Standard d’étalonnage 20.353
Conforme
Standard de validation 20.380

La spécificité de la méthode est confirmée par :

- l’absence de pic au temps de rétention du pic de marqueur dans le
chromatogramme obtenu avec le solvant de dilution ;
- les temps de rétention du pic de marqueur pour le standard d’étalonnage et
le standard de validation sont comparables ;
- les spectres du pic de marqueur pour le standard d’étalonnage et le
standard de validation sont comparables (200-450 nm).

La méthode de dosage est spécifique et permet le dosage du marqueur dans le

produit.

73
 III.3.2.2. Concentrations inverses prédites

Les concentrations inverses prédites ou concentrations retrouvées Z des

standards de validation sont calculées en utilisant la fonction inverse du modèle
d’étalonnage.
Ces concentrations retrouvées permettent de calculer le biais de chaque
mesurage, et également de vérifier la linéarité de la méthode.

III.3.2.3. Linéarité

La linéarité de la méthode de dosage est vérifiée sur l’intervalle de validation, en

utilisant les données des premières répétitions de chaque niveau de
concentration, pour les trois séries de validation.
La linéarité est, dans un premier temps, évaluée par comparaison visuelle des
représentations graphiques des réponses instrumentales Y en fonction des
concentrations introduites X selon la fonction [Y = f ( X )] , pour la forme
pharmaceutique reconstituée et pour les standards d’étalonnage.
Dans un deuxième temps, la linéarité de la relation entre les concentrations
retrouvées Z et les concentrations introduites X est évaluée en représentant
graphiquement la fonction [Z = f ( X )] pour les trois séries de validation
conjointement. Une analyse statistique de la droite obtenue est effectuée, la pente
est comparée à la valeur de référence 1, l’ordonnée à l’origine est comparée à la
valeur de référence 0, et la vérification de l’ajustement est effectuée.

Les résultats obtenus pour la comparaison des droites [Y = f ( X )] pour les

standards d’étalonnage (SE) et les standards de validation (SV) sont résumés
dans le Tableau 4:

74
Tableau 4 Résultats des comparaisons des droites [Z = f ( X )]

Séries de validation Superposition visuelle des droites SE et SV

1 Conforme

2 Conforme

3 Conforme

La droite [Z = f ( X )] est représentée à la Figure 6, et les résultats de l’analyse

statistique sont résumés dans le Tableau 5:

Figure 6 Droite [Z = f ( X )]

75
Tableau 5 Résultats de l’étude statistique sur la droite [Z = f ( X )]

Paramètre calculé Résultat

Pente 0.9554
Ordonnée à l’origine 2.0514
Coefficient de détermination 0.9938
Intervalle de confiance (risque 5%) : [0.9063; 1.0032]
La pente est significativement différente de zéro, il existe une
Comparaison de la pente à 1 relation linéaire
La pente n’est pas significativement différente de 1 (risque
5%)
Intervalle de confiance (risque 5%) : [-0.6158; 4.7865]
Comparaison de l’ordonnée à
L’ordonnée à l’origine n’est pas significativement différente
l’origine à zéro
de zéro (risque 5%)
Test de validité de l’ajustement Somme des carrés résiduels : 0.7% < 1%
Le modèle d’étalonnage est bien adapté à la réponse

La comparaison des droites [Y = f ( X )] pour les standards d’étalonnage et les

standards de validation est satisfaisante. Le système d’étalonnage choisi est
satisfaisant.

La linéarité des droites [Z = f ( X )] pour les trois séries est confirmée par :
- un coefficient de détermination acceptable de 0,9938 ;
- la pente est comparable à 1 au risque 5% ;
- l’ordonnée à l’origine est comparable à zéro au risque 5% ;
- le pourcentage de résidus est satisfaisant 0,7% < 1%, le modèle
d’étalonnage est bien adapté à la réponse.

La méthode de dosage est linéaire pour l’intervalle de validation, soit pour une
teneur en marqueur allant de 0,030 à 0,075 % m/m sur la substance telle que.

76
 III.3.2.4. Construction du profil d’exactitude

III.3.2.4.1. Fidélité par série

La fidélité de la méthode est évaluée sur chaque série de validation, en utilisant

les données obtenues pour les trois répétitions des niveaux de concentrations
60%, 100% et 140%.
Les recouvrements entre les concentrations introduites X et les concentrations
retrouvées Z sont calculés pour les trois séries, puis une analyse statistique est
effectuée sur ces résultats.

Les résultats obtenus sont représentés dans le Tableau 6, et les résultats de

l’étude statistique sont donnés dans le Tableau 7 :

Tableau 6 Recouvrements entre X et Z

Standards de validation Recouvrements (%)

Niveau de
Répétition Série 1 Série 2 Série 3
concentration
1 102,01 104,22 97,02
60% 2 103,00 104,15 97,83
3 104,44 104,74 98,88
1 101,19 102,79 97,85
100% 2 99,11 101,56 98,76
3 98,46 101,78 98,39
1 96,92 100,29 97,16
140% 2 97,16 100,23 97,72
3 97,40 100,63 97,56

77
Tableau 7 Etude statistique de fidélité par série

Paramètre calculé Résultat

Nombre de groupes 3

Nombre de valeurs par groupe 9

Nombre de valeurs 27

Somme des moyennes 300,14

Somme des variances 11,28

Variance de répétabilité 3,76

Variance inter-groupes 4,33

Variance de fidélité intermédiaire 8,10

Ecart-type de fidélité intermédiaire 2,85

Recouvrement moyen 100,05

Test de Cochran
Homogénéité des variances
Variances statistiquement homogènes (α = 0,01)
CV% de répétabilité 1,9

CV% de fidélité intermédiaire 2,8

Intervalle de confiance du m ± 1,13 [98,92 ; 100,05 ; 101,17]
recouvrement moyen
Intervalle de confiance d’une valeur m ± 5,69 [94,36 ; 100,05 ; 105,74]
individuelle

Les résultats de l’analyse statistique montrent que la méthode est fidèle, avec un
écart-type de répétabilité de 1,9% et un écart-type de fidélité intermédiaire de
2,8%.

III.3.2.4.2. Justesse et fidélité par niveau de concentration

La fidélité de la méthode pouvant dépendre du niveau de concentration de

l’analyte, une analyse de la variance à un facteur (one-way ANOVA) est effectuée
pour les niveaux de concentration 60%, 100% et 140%.

78
Les écart-types de répétabilité et de fidélité intermédiaire, ainsi que le biais relatif
des résultats sont évalués.
La justesse de la méthode sur l’intervalle de validation considéré est évaluée en
calculant l’intervalle de confiance du recouvrement moyen par niveau de
concentration, et en vérifiant que la valeur cible 100 % est inclue dans cet
intervalle.
Dans le cas où les valeurs sont très faiblement dispersées, l’intervalle de
confiance peut être très étroit et exclure la valeur 100 % sans pour autant signifier
que la méthode n’est pas juste. Un biais relatif inférieur à 2 % est alors considéré
comme acceptable.

Les résultats sont représentés dans le Tableau 8:

Tableau 8 Etude statistique de justesse et de fidélité par niveau de

concentration

Résultat
Paramètre calculé
60 % 100 % 140 %
Moyenne des recouvrements
101,81 99,63 98,34
moyens
Biais relatif (%) 1,81 -0,37 -1,66
Variances Variances Variances
Homogénéité des variances statistiquement statistiquement statistiquement
Test de Cochran homogènes (α = homogènes (α = homogènes (α =
0,05) 0,05) 0,05)
Intervalle de confiance du [99,1 ; 101,8 ; 104,5] [98,3 ; 99,6 ; 101,0] [97,0 ; 98,3 ; 99,7]
recouvrement moyen
CV de répétabilité (%) 0,9 1,1 0,3
CV de répétabilité
3,3 1,4 1,7
« intergroupe » (%)
CV de fidélité intermédiaire (%) 3,4 1,8 1,7

Les résultats de l’analyse statistique montrent que la méthode est fidèle pour
chaque niveau de concentration, avec des coefficients de variation de répétabilité

79
inférieurs à 2% et des coefficients de variation de fidélité intermédiaire ne
dépassant pas 3%.
La justesse par niveau de concentration est satisfaisante, compte tenu du fait que
les biais relatifs sont inférieurs à 2% pour les trois niveaux et que les intervalles
de confiance du recouvrement moyen contiennent ou sont très proches de la
valeur cible 100%.

III.3.2.4.3. Intervalle de tolérance et profil d’exactitude

Les limites inférieure et supérieure de l’intervalle de tolérance sont calculées pour

les niveaux de concentration 60%, 100%, et 140%, avec une probabilité β de
80%.

Les résultats sont présentés dans le Tableau 9:

Tableau 9 Calcul de l’intervalle de tolérance

Ecart-type de
Limite
Niveau de Biais relatif l’intervalle de Facteur de Limite
supérieure
concentration (%) tolérance sIT couverture kIT inférieure (%)
(%)
(%)
60 1,81 3,96 1,89 -5,66 9,28

100 -0,37 2,00 1,64 -3,64 2,91

140 -0,66 2,10 1,89 -5,61 2,29

Le profil d’exactitude est représenté graphiquement avec en abscisse les niveaux

de concentration étudiés, en ordonnée le biais relatif (%), et en y reportant le biais
relatif moyen par niveau de concentration, les limites de l’intervalle de tolérance
ainsi que les limites d’acceptabilité de la méthode.

Le profil d’exactitude obtenu est représenté en Figure 7 :

80
Figure 7 Profil d’exactitude

Validation
Accuracy / Precision Profile
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
Bias (%)

2.0
0.0
-2.0 40 60 80 100 120 140 160

-4.0
-6.0
-8.0
-10.0
-12.0
Level (% / nominal)

Bias CI Acceptability limits

Les limites inférieure et supérieure de l’intervalle de tolérance sont incluses dans

la limite d’acceptabilité fixée à ± 10%.
Comme vu à la section I.6.1, cette limite d’acceptabilité λ devrait être de 5% pour
le dosage d’une substance active dans un produit fini. Cependant, compte tenu
de la faible concentration du marqueur analytique dans le produit et de la
variabilité induite par la préparation d’échantillon, une limite d’acceptabilité élargie
à ± 10% est justifiable.

III.3.2.5. Stabilité des solutions

La stabilité des solutions utilisées pour la validation analytique a été vérifiée.

Les solutions sont stables durant 7 jours conservées au réfrigérateur (+4°C).

81
 III.3.3. CONCLUSIONS

III.3.3.1. Synthèse des résultats

La spécificité, la linéarité et l’exactitude de la méthode de dosage du marqueur

analytique dans le produit fini sont démontrées sur les intervalles :
- 0,030 à 0,075 % m/m de marqueur analytique dans la poudre de plante ;
- 0,10 à 0,24 mg/gélule de marqueur analytique dans le produit fini.

Ces intervalles sont cohérents avec les critères d’acceptation :

- ≥ 0,05% m/m de marqueur dans la poudre de plante desséchée ;
- ≥ 0,14 mg/gélule de marqueur dans le produit fini ;
- Au cours des études de stabilité, teneur initiale en marqueur ± 10%.

La méthode analytique est validée pour les limites d’acceptation définies, et sur
les intervalles décrits. La méthode de dosage du marqueur analytique dans le
produit fini par chromatographie liquide est validée en termes de spécificité,
linéarité, justesse et fidélité.

III.3.3.2. Commentaires sur le protocole de validation établi

Le protocole de validation développé à partir des guides de validation analytique

SFSTP 2003-2006 est bien applicable aux validations analytiques des méthodes
de dosage des médicaments à base de plante(s).
L’utilisation du profil d’exactitude comme outil de décision permet de visualiser
rapidement et clairement les caractéristiques des résultats qui seront obtenus en
utilisant la méthode analytique validée.
Cette représentation va pouvoir aider l’analyste à justifier que les critères
d’acceptation établis sont adéquats, adaptés à la méthode analytique et au
produit auquel elle est appliquée.
Par exemple, comme vu au chapitre 4.6 de la partie II de cette thèse, la directive
75/318/CEE amendée stipule pour les médicaments que :

82
 « Sauf justification appropriée, les écarts maximaux tolérables de la teneur
en substance active ne peuvent dépasser ±5% dans les produits finis au
moment de la fabrication. […] Les limites excédant ±5% au moment de la
libération doivent être justifiées dans la partie « Développement du procédé
de fabrication » par des résultats expérimentaux habituellement basés sur
un intervalle de confiance de 95%. Les limites élargies incluent également
les variations liées à la production et à la procédure analytique. »

Le profil d’exactitude obtenu à partir des résultats de validation peut permettre de

soutenir la justification d’un écart de teneur en substance active supérieur à ±5%
dans le cas des méthodes de dosage où la variabilité est relativement importante,
du fait de l’erreur analytique et/ou du produit considéré. Il est en effet plus aisé de
commenter une représentation visuelle des résultats obtenus, plutôt qu’une liste
de performances diverses de la méthode, dont il peut être difficile de voir l’impact
sur les résultats.

III.3.3.3. Perspectives

Ce protocole de validation a été approuvé par le responsable du laboratoire de

R&D et est désormais utilisé pour les validations analytiques au sein du
laboratoire de R&D.
Il n’est cependant pas figé et doit être adapté au produit et à la méthode d’analyse
à valider.
La mise en place du profil d’exactitude comme outil de décision pour les
validations analytique est une avancée majeure consécutive à l’implémentation de
ce protocole de validation.
Ce protocole pourra par exemple servir de base au développement d’une
procédure plus adaptée aux méthodes analytiques permettant de doser de faibles
quantités de marqueurs, en utilisant par exemple la méthode des ajouts dosés. Le
profil d’exactitude pourra cependant être conservé comme outil de décision, en
raison des multiples avantages qu’il offre et qui ont été décrits dans cette thèse.

83
 CONCLUSION

La validation des procédures analytiques est aujourd’hui un principe accepté et

utilisé dans tous les domaines d’activité générateurs de résultats de mesures.

Cependant, bien que ce principe soit reconnu comme indispensable à la gestion

de la Qualité dans l’industrie pharmaceutique, son application pratique n’est pas
toujours aisée.
En effet, bien qu’il existe de nombreux documents officiels décrivant les critères
de validation à tester, les sources proposant des solutions pratiques en termes de
protocoles expérimentaux sont rares.

De plus, le protocole expérimental de validation devant être adapté au produit

étudié, ces quelques guides ne peuvent pas offrir une solution exhaustive
applicable sans adaptation à tous les produits possibles.
Les médicaments à base de plante(s) représentent l’un de ces cas particuliers
dont les guides de validation, ainsi que les guidelines actuellement en vigueur, ne
tiennent pas compte. L’adaptation de ces textes est donc nécessaire afin de
mener à bien les validations analytiques pour ce type de produits, nécessitant une
réflexion importante et une bonne connaissance à la fois de la validation
analytique, et des spécificités de ces produits.
C’est dans ce cadre que ce travail a trouvé toute sa justification.

Une proposition de protocole de validation s’appuyant sur les guides de validation

SFSTP 2003-2006 et adaptée aux médicaments à base de plante(s) a été testée
en conditions réelles, pour la validation d’un médicament constitué à 100% de
poudre de plante.
Cet essai s’est révélé concluant, et a permis de démontrer que les outils
statistiques proposés par les guides de validation SFSTP 2003-2006 pouvaient
être appliqués à la validation analytique des médicaments à base de plante(s).

Ce travail représente une porte entrouverte sur ce qui peut être fait dans le
domaine de la validation analytique des médicaments à base de plante(s), et
propose une solution exploitable permettant de satisfaire aux exigences
réglementaires en vigueur.

84
 BIBLIOGRAPHIE

[1] Exigences générales concernant la compétence des laboratoires

d’étalonnages et d’essais . ISO/CEI 17025:2005.

[2] Note for guidance on validation of analytical procedures: Text and

methodology. ICH Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures: Text and
Methodology. CPMP/ICH/381/95.

[3] Hubert P., Nguyen-Huu J.J., Boulanger B. et al., 2003. Validation of

quantitative analytical procedures: harmonization of approaches. STP Pharma
Pratiques. 2003, 13, 3, 101-138.

[4] Feinberg M., Labo-stat, Guide de validation des méthodes d’analyse. s.l. :
Editions Lavoisier, 2009, 384 pages.

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commentaires. STP Pharma Pratiques. 2012, 22, 1, 3-15.

89
 SERMENT DE GALIEN

Je jure, en présence des maîtres de la Faculté, des conseillers de l’ordre

des Pharmaciens et de mes condisciples :

D’honorer ceux qui m’ont instruit(e) dans les préceptes de mon art et de
leur témoigner ma reconnaissance en restant fidèle à leur enseignement;

D’exercer, dans l’intérêt de la santé publique, ma profession avec

conscience et de respecter non seulement la législation en vigueur, mais aussi les
règles de l’honneur, de la probité et du désintéressement ;

De ne jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs envers le malade et

sa dignité humaine.

En aucun cas, je ne consentirai à utiliser mes connaissances et mon état

pour corrompre les mœurs et favoriser des actes criminels.

Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à mes

promesses.

Que je sois couvert(e) d’opprobre et méprisé(e) de mes confrères si j’y

manque.

90
Isabelle PINGUET

Validation analytique : application de la procédure SFSTP 2003-2006 au

domaine de la phytothérapie

RESUME :
Le contrôle analytique avant libération d’un médicament sur le marché est une
étape importante et nécessaire pour garantir la qualité du produit qui va être
délivré aux patients.

Les laboratoires pharmaceutiques sont tenus de prouver que les méthodes

utilisées lors de ce contrôle sont parfaitement valides et fiables, en procédant à
leur validation.

L’utilisation du profil d’exactitude couplé à l’intervalle de tolérance comme outil de

décision de validation est une méthode développée par une commission de la
SFSTP parue en 2003 et en 2006 dans les guides STP Pharma Pratiques. Cet
outil de décision permet de prévoir avec quelle garantie une proportion donnée
des résultats futurs obtenus avec la méthode seront compris dans des limites
d’acceptabilité fixées au préalable.

Cette thèse propose une application pratique de la procédure publiée par la

SFSTP en 2003 et 2006 utilisant le profil d’exactitude, à la validation analytique
de produits aux caractéristiques bien spécifiques et jusqu’alors oubliés des
guides de validation : les produits de phytothérapie, ou médicaments à base de
plante(s).

MOTS CLES : Validation analytique – Médicaments à base de plante(s) – Profil

d’exactitude – Industrie pharmaceutique

91
Isabelle PINGUET

Analytical validation : application of SFSTP 2003-2006 procedure to herbal

medicines

SUMMARY:

Analytical control of a medicinal product before its release on the market is an

important and necessary step to guarantee the quality of the product that is going
to be delivered to patients.
Pharmaceutical laboratories are required to prove that analytical procedures used
for this control are highly valid and reliable, by performing an analytical validation.

The use of accuracy profile based on tolerance interval as decision tool for
validation is a procedure developed by a SFSTP commission, published in 2003
and 2006 in STP Pharma Pratiques guides. This decision tool allows to anticipate
the guarantee that a given proportion of future results obtained with the
procedure will be within pre-established acceptability limits.

This thesis provides a practical application of the procedure published by SFSTP

in 2003 and 2006 using accuracy profile, to the analytical validation of products
with very specific characteristics and up to now neglected of validation guides:
herbal medicinal products, or HMPs.

KEY WORDS: Analytical validation – Herbal medicinal products – Accuracy

profile – Pharmaceutical industry

92