CONTRÔLES MICROBIOLOGIQUES

D’UN ET BIOPRODUIT
 Législation
Règlement (CE) n°1223/2009, (entré en application dans sa totalité le 11 Juillet 2013)

Les produits cosmétiques devraient être sûrs dans des conditions d’utilisation normales ou raisonnablement prévisibles

• Elaboration d’un dossier d’information

– Rapport sur la sécurité du produit cosmétique, personne responsable = pharmacien/médecin

• Obligation de respecter les BPF : norme NF EN ISO 22 716 (publiée en janvier 2008)

• Un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des micro-

organismes pathogènes peut avoir des conséquences graves sur l’écologie
cutanée de l’utilisateur, surtout sur une peau lésée ou chez des individus
peu résistants.
• De nombreux produits cosmétiques ont une composition et une teneur en
eau permettant la multiplication microbienne. Ils contiennent des
conservateurs afin de limiter cette prolifération.
• Différents contrôles et recherches microbiologiques sont réalisés sur les
produits cosmétiques afin d’évaluer leur niveau d’hygiène et de prévoir
leur comportement vis-à-vis d’éventuelles contaminations.
 Législation
Règlement (CE) n°1223/2009, (entré en application dans sa totalité le 11 Juillet 2013)

• Elaboration d’un dossier d’information
– Rapport sur la sécurité du produit cosmétique

• Obligation de respecter les BPF : norme NF EN ISO 22 716 (publiée en janvier 2008)

• Un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des micro-

organismes pathogènes peut avoir des conséquences graves sur l’écologie
cutanée de l’utilisateur, surtout sur une peau lésée ou chez des individus
peu résistants.
• De nombreux produits cosmétiques ont une composition et une teneur en
eau permettant la multiplication microbienne. Ils contiennent des
conservateurs afin de limiter cette prolifération.
• Différents contrôles et recherches microbiologiques sont réalisés sur les
produits cosmétiques afin d’évaluer leur niveau d’hygiène et de prévoir
leur comportement vis-à-vis d’éventuelles contaminations.
 Risque microbioogique
• L'analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs paramètres tels
que :
– l'altération potentielle des produits cosmétiques;
– le caractère pathogène des micro-organismes;
– le site d'application du produit cosmétique (cheveux, peau, yeux, muqueuses, etc.);
– la catégorie d'utilisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans, etc.).
• recherche d'agents pathogènes pour la peau
– Staphylococcus aureus,
– Pseudomonas aeruginosa
– Candida albicans
• recherche des indicateurs de contamination fécale pour détecter une
défaillance de l'hygiène au cours du processus de fabrication.
– Escherichia coli
 Analyses microbiologiques
Laboratoire de microbiologie
Principe actifs
Recherche conservateurs
Effet inhibiteur des conservateurs
R
& Sensibilité microbiologique (ISO 9621:2010)
D Challenge test (ISO 11930)
Fabrication en Validation du neutralisant pour le
Formulation pilote dénombrement

Contrôle d’atmosphère
Echelle
Fabrication industrielle
Contrôle des surfaces
Contrôle de l’hygiène du personnel
Contrôle microbiologique du produit vrac

Contrôle du produit fini

conditionnement - dénombrement et détection de la FMA
- dénombrement des levures /moisissures
- détection des pathogènes
 Contrôle des produits finis
Référentiels pour le contrôle
• Pharmacopée EU 8.0 (janvier 2014): (harmonisée)
Cosmétique = médicament à usage cutané
– paragraphe 2 .6.12 : Contrôle microbiologique des produits non stériles :essais de dénombrement microbien
– paragraphe 2.6.13 : Contrôle microbiologique des produits non stériles : recherche de microorganismes spécifies

• Normes ISO
– NF EN ISO 21 148 : généralités(2009)
– NF EN ISO 21 149 : dénombrement et détection de la flore mésophile aérobie (2009)
– NF EN ISO 16 212: dénombrement des levures moisissures (2011)
– NF EN ISO 22 718: détection Staphylococcus aureus (2009)
– NF EN ISO 21 717 : détection Pseudomonas aeruginosa (2009)
– NF EN ISO 21 148 : détection Escherichia coli (2009
– NF EN ISO18 416 : détection Candida albicans (2009)
– NF EN ISO18 415 : détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés (2011)
 Contrôle des Bioprodutis
Préparation de la suspension mère :
• le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation et le moment où l’inoculum
entre en contact avec le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 min
• La suspension mère est préparée à partir d’un échantillon d’au moins 1 g ou 1 ml
du produit d’essai mélangé avec soin.

Produit miscible à l’eau Produit non miscible à l’eau

V mL de diluant neutralisant + polysorbate 80

V mL de diluant-neutralisant

Dilution d= 1/10
Dilution d= 1/10
S (g ou mL) de produit
S (g ou mL) de produit

S = 1g produit de catégorie2
S= 5g produit de catégorie 1
 DÉNOMBREMENT ET DÉTECTION GERMES AEROBIES MESOPHILES
Norme ISO 21 149
Dénombrement Validation du Dénombrement
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus 1 mL
V mL de diluant neutralisant
à 103 UFC/mL(masse) V mL de diluant neutralisant
à 104 UFC/mL ( surface)
Dilution d= 1/10 à 102 UFC/mL (filtration) Dilution d= 1/10
S (g ou mL) de produit
S (g ou mL) de produit Témoin sans produit

1 mL en masse
1 mL en masse
0,1 ml en surface
0,1 ml en surface
10 mL filtration
10 mL filtration Si inefficacité du neutralisant

Géloses TSA

Réfrigérateur N T
(détection des particules)

72 H ± 6H
72 H ± 6H
32,5 °C ± 2,5°C
32,5 °C ± 2,5°C
Validation si N >50% (0,3 log)de T
S = 1g produit de catégorie2
S= 5g produit de catégorie 1
 DÉNOMBREMENT ET DÉTECTION GERMES AEROBIES MESOPHILES
Norme ISO 21 149
Détection Validation de la Détection
Pseudomonas aeruginosa
1 mL
V mL de bouillon Eugon + Staphylococcus aureus
V mL de bouillon Eugon
à 102UFC/mL
Dilution d= 1/10 Dilution d= 1/10
S (g ou mL) de produit Témoin sans produit
S (g ou mL) de produit
1 ml en masse

20 H minimum
20 H minimum
32,5 °C ± 2,5°C
32,5 °C ± 2,5°C

0,1 ml en surface
0,1 ml en surface

Gélose TSA
20 à 24 H
32,5 °C ± 2,5°C
Validation si 100 à 500 UFC/mL

48H ± 6H
48 H ± 6H
32,5 °C ± 2,5°C
32,5 °C ± 2,5°C
Validation si présence de colonies caractéristiques
S = 1g produit de catégorie2 Jaunes pour St.aureus
S= 5g produit de catégorie 1 Verdâtres pour Ps aeruginosa
Et absence de colonie sur le témoin
 DÉNOMBREMENT des levures et moisissures
Norme ISO 16 212
Dénombrement Validation du Dénombrement

Candida albicans 1 mL
V mL de diluant neutralisant
à 103 UFC/mL(masse) V mL de diluant neutralisant
à 104 UFC/mL ( surface)
Dilution d= 1/10 à 102 UFC/mL (filtration) Dilution d= 1/10
S (g ou mL) de produit
S (g ou mL) de produit Témoin sans produit

1 mL en masse
1 mL en masse
0,1 ml en surface
0,1 ml en surface
10 mL filtration
10 mL filtration

Géloses SDA
Sabouraud dextrose agar

Réfrigérateur N T
(détection des particules)

3 à 5 jours
3 à 5 jours
25 °C ± 2,5°C
25 °C ± 2,5°C
Validation si N >50% (0,3 log)de T
S = 1g produit de catégorie2
S= 5g produit de catégorie 1
 DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES

Validation de la Détection
Détection Pseudomonas aeruginosa
1 mL
Staphylococcus aureus
V mL de bouillon Eugon
E.coli V mL de bouillon Eugon

Candida albicans Dilution d= 1/10

Dilution d= 1/10
à 10 UFC/mL
2

S (g ou mL) de produit Témoin sans produit

1 ml en masse S (g ou mL) de produit

20 H minimum 20 H minimum
32,5 °C ± 2,5°C 32,5 °C ± 2,5°C
0,1 ml en surface

Gélose Cétrimide (ISO 21 150) 0,1 ml en surface

Gélose Baird parker (ISO 21 718) 20 à 24 H

Gélose Mac Conkey (ISO 21 148) 32,5 °C ± 2,5°C
Gélose SDA (ISO 18 416) Validation si 100 à 500 UFC/mL

48H ± 6H 48 H ± 6H
32,5 °C ± 2,5°C 32,5 °C ± 2,5°C
Validation si présence de colonie caractéristiques
Et absence de colonie sur le témoin
S = 1g produit de catégorie2
Identification S= 5g produit de catégorie 1
 DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES
Souche et Ps. aeruginosa St aureus E.Coli C.Albicans
norme (ISO 21 150) (ISO 21 718) (ISO 21 148) (ISO 18 416)
Milieu Cétrimide Baird parker Mac Conkey SDA
Colonies Pigment jaune-vert Colonies noires et Colonie rouge Colonies convexes et
caractéristiques (pyocyanine), brillantes, entourées brique; peut être crémeuses, de
fluorescent sous d'un halo clair (de 2 entourée d'une zone couleur blanche à
rayonnement UV mm à 5 mm) de bile précipitée. beige
Méthode Gram Gram Gram Gram
d’identification* Test enzymatique Test enzymatique Test enzymatique Test de filamentation
Isolement sur Test coagulase Isolement sur EMB Test de
« Pseudomonas P » (24 à 48 H à 32,5°C) chlamydosporulation
(24 à 48 H à 32,5°C)
Résultat Bacille Gram – Coque Gram+ Bacille Gram – Cellules ovoïdes
Oxydase + Catalase + Oxydase – violettes
Colonies entourées Coagulase + Colonies bleu noir Filaments
d’une zone bleu- à reflet métallique Chlamydospore
verte (pyocyanine) sur EMB Blastospore
ou rouge marron
(pyorubine)

* Minimale : galerie biochimique ou autre méthode validée possible

 Détection de micro-organismes spécifiés et non spécifiés
Enrichissement (Eugon)

Isolement (TSA)

Gram

Coque Bacille G- autre Levure

gram +

Non oxydase +
Catalase + oxydase -

Kit d’identification Kit d’identification Kit d’identification Kit d’identification

adapté adapté adapté adapté

Escherichia Non Non

Staphylococcus Non Non Pseudomonas Candida
aureus ? aeruginosa ? coli? albicans?

Présence de Présence de
Présence de Présence de
Escherichia Candida
Staphylococcus Pseudomonas
coli albicans
aureus aeruginosa

Présence d’un micro-organisme non spécifié

 Contrôle du produit fini
Critères microbiologiques
• Règlement (CE) n°1223/2009,
Spécifications microbiologiques de la substance ou du mélange et du produit cosmétique.
Une attention particulière est accordée aux produits cosmétiques utilisés sur le contour des yeux, sur les muqueuses
en général, sur une peau lésée, chez les enfants de moins de trois ans, chez les personnes âgées et chez les
personnes au système immunitaire fragilisé.

• BPF (ISO 22 716)

Il convient que les critères d'acceptation soient établis pour spécifier les exigences auxquelles
doivent répondre les matières premières, les articles de conditionnement, les produits vrac et les
produits finis.

• Lignes directrices du Comité Scientifique des Produits de Consommation

Catégorie de produit FMAT Germes pathogènes
catégorie 1* ≤102UFC/ g (ou mL) Absence dans 0,5 g ou mL
catégorie 2 : ≤103UFC/ g (ou mL) Absence dans 0,1g ou mL
* destinés aux enfants < 3 ans ou en contact avec les yeux et les muqueuses recommandation du SCCP

PR NF EN ISO 17516 (août 2013) Cosmétiques – Microbiologie – Limites microbiologiques

 A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.
5.1.4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des
CRITÈRES D’ACCEPTATION. (PH Eu 8.0 2014)
substances pour usage pharmaceutique non stériles (5.8.)

Les critères d’acceptation de la qualité microbiologique sont interprétés ainsi :

– 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20
– 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 etc….

DGAT DMLT Micro-organismes spécifiés

Voie d’administration UFC/g ou /mL UFC/g ou /mL Absence dans ( )

Orale : préparation non aqueuse 103 102 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
Orale : préparation aqueuse 102 101 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
Rectale 103 102
Buccale, Gingivale 102 101 Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)
Cutanée, Nasale, Auriculaire Pseudomonas aeruginosa(1g ou 1 mL)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Vaginale 102 101 Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)
Candida albicans (1g ou 1 mL)

Staphylococcus aureus(1 dispositif)

Transdermique 102 101 Pseudomonas aeruginosa (1 dispositif)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Inhalation 102 101 Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)
Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires (1g ou 1 mL)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Préparation à base de MP naturelle ne pouvant 104
102 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
subir de prétraitement antimicrobien Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 102 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL

Aliments médicamenteux vétérinaire ne Escherichia coli (1g ou 1 mL)

pouvant subir de prétraitement antimicrobien 105 104 Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 104 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL
 Contrôle du produit fini
Interprétation des résultats
BPF (ISO 22 716)

Dossier de lot ANALYSES

Produit finis, vrac, MP, article de

Résultats conformes conditionnement
hors spécification

Enquête
Retraitement

Libération de lot Destruction du lot

Challenge test
Risque microbiologique
Règlement (CE) n°1223/2009
• Concernant la sensibilité microbiologique, on distingue trois catégories de
produits:
– 1) les produits à faible risque microbiologique (par exemple, les produits dont la teneur
en alcool est > 20 %, les produits à base de solvants organiques, les produits à pH
élevé/faible), pour lesquels il n’est pas nécessaire de soumettre le produit fini à un
challenge test pour la conservation, ni à des contrôles microbiologiques. Une justification
scientifique est toutefois requise;
– 2) les produits à usage unique et les produits qui ne peuvent être ouverts (par exemple,
dont le conditionnement permet de doser le produit sans que celui-ci n’entre en contact
avec l’air), pour lesquels seuls des contrôles microbiologiques sur le produit fini sont
nécessaires. Une justification scientifique est toutefois requise;
– 3) tous les autres produits, pour lesquels un challenge test pour la conservation et des
contrôles microbiologiques sur le produit fini sont nécessaires.
C) Challenge test
ou test d’efficacité de la conservation antimicrobienne

• Etabli par la pharmacopée européenne ou pharmacopée US pour les médicaments et

les produits cosmétiques
• NORME ISO 11930 : 2012

• Ce test consiste en la contamination artificielle du produit cosmétique avec

différents micro-organismes en nombre connu et au suivi de l’évolution de ce
nombre en fonction du temps.
• Les souches utilisées sont celles habituellement trouvées dans les produits
cosmétiques et au niveau de l’épiderme :
– Candida albicans Aspergillus brasiliensis ATCC 16 404
– Aspergillus niger
– Escherichia coli
7, 14 et 28 jours
– Staphylococcus aureus
– Pseudomonas aeruginosa
• La population microbienne pour chaque souche est évaluée après 2, 7, 14, 21 et 28
jours.
 Challenge test
Pseudomonas aeruginosa 0,2 mL de N
Staphylococcus aureus
N0 =N/100
E.coli
Candida albicans T0 20 g de produit
10 3
10 UFC/mL
2
Aspergillus brasiliensis
7 jours à 22,5 °C ± 2,5°C
1 ml en masse
N
10 à 10 bactéries/mL
7 8

106 à 107 mycètes/mL

Calcul de N
T7
1 ml
Validation du en masse 48 à
neutralisant Gélose TSA ou SDA 72 H à
Nx
32,5 °C
± 2,5°C
10ml de diluant neutralisant 10ml de diluant

T14
1 g de produit
Essai Témoin Témoin inoculum 1 ml
1 ml en masse en masse 48 à
Nx 72 H à
32,5 °C
± 2,5°C

T28
48 à 72 H à 32,5 °C ± 2,5°C 1 ml
en masse 48 à
Nvf Nvn Nv Nx 72 H à
Validation si Nv  100 , Nvn proche de Nv et Nvf  0,5 Nvn 32,5 °C
± 2,5°C
 Taux de réduction logarithmique (Rx = lg N0– lg Nx) requis
Micro-organismes Bactéries C. albicans A. brasiliensis

Temps de
T7 T14 T28 T7 T14 T28 T14 T28
prélèvement

Critères A ≥3 ≥3 et PA ≥3 et PA ≥1 ≥1 et PA ≥1 et PA ≥0 ≥1 et PA

Non Non
Critères B ≥3 ≥3 et PA ≥1 ≥1 et PA ≥0 ≥0 et PA
réalisé réalisé

•critères A:
la formulation est protégée contre la prolifération microbienne pouvant présenter un risque potentiel pour l’utilisateur et aucun autre
facteur n’est pris en compte.
•critères B:
le niveau de protection est acceptable si l’analyse du risque démontre l’existence de facteurs de maîtrise non liés à la formulation indiquant que le
risque microbiologique est acceptable pour le produit cosmétique.

Exemple1 crème de soin + Staphylococcus aureus Exemple2 shampoing+ Candida albicans

Jour résultat Réduction Red log attendue interprétation
logarithmique

J0
J0 2,3.10
1,6.105
5

J14
J2 5.10
<1
4
<1
5 2
2 
J28
J7 3.10
<1 2 3
5 NI
3 
Conclusion
J28 <Conservateur
1 non efficace
5 sur les mycètesNI 
Conclusion Conservateur efficace sur Staphylococcus aureus