KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI DAN KROMATOGRAFI GAS

2008 BAGIAN KIMIA ANALITIK

KCKT & KG

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC)

Materi:

1. Mekanisme
2. Instrumentasi 3. Jenis KCKT: pertukaran ion, pertukaran ligan, adsorpsi, partisi

KCKT & KG

Mekanisme
Adsorpsi

Liquid-solid chromatography: fase gerak cair, fase diam padat

Jenis komponen: nonpolarsangat polar terutama untuk sampel larut dalam pelarut nonpolar atau sedikit polar (heksana, kloroform, dietil eter) interaksi yang terjadi via ikatan hidrogen atau interaksi dipoldipol komponen polar non ionik contohnya: silika gel, alumina teraktivasi

Fase diam

Solut teradsorpsi pada permukaan fase diam

KCKT & KG

Partisi

Liquid-liquid chromatography: fase gerak cair, fase diam cair Fase normal (normal phase): fase diam polar (sering hidrofilik), fase gerak nonpolar. Senyawa polar terikat pada fase diam lebih lama daripada yang kurang polar Fase terbalik (reverse phase): fase diam nonpolar, fase gerak polar. Senyawa nonpolar terikat pada fase diam lebih lama daripada yang lebih polar

KCKT & KG

Pertukaran ion

Fase diam penukar ion (matriks + gugus fungsi + counter ion): asam/basa kuat; asam/basa lemah) Fase gerak bervariasi: bufer, bufer + pengkompleks, bufer + garam, pengkompleks Sampel: ion/dapat diionkan dengan interaksi muatan

KCKT & KG

Eksklusi/Permeasi
Fase diam mempunyai pori ukuran dimensi molekular Komponen ada yang tertahan, ada yang terekslusi, tergantung pada ukuran molekul (sangat kecil, sedang, sangat besar) Fase gerak: eluen tunggal

KCKT & KG

Pemilihan metode KCKT

KCKT & KG

KCKT & KG

Instrumentasi KCKT
Berikut diagram skematik sistem KCKT
Mobile phase Reservoir Pump

Injector

Pre-Column

Column

Detector

Data

KCKT & KG

Instrumentasi KCKT

Skema instrumen KCKT

KCKT & KG

Reservoir fase gerak

Umumnya dilengkapi oleh instrumen untuk menghilangkan gas yang terlarut dalam fase gerak (sistem vakum dan sistem distilasi). Gas perlu dihilangkan karena dapat membentuk gelembung pada kolom, menyebabkan pelebaran pita, dan mengganggu kinerja detektor.
Elusi isokratik Eluen tunggal atau campuran dengan komposisi konstan

Fase gerak/ eluen/solvent

Elusi Gradien

Eluen campuran dengan rasio komposisi berubah untuk mendapatkan gradien kepolaran

KCKT & KG

Sistem pompa
Syarat-syarat yang harus dipenuhi sistem pompa KCKT:
Tekanan yang dihasilkan tinggi Keluaran tekanan bebas dari pulsa/ pulse-free output Laju alir berada pada kisaran 0,1-10 mL/menit Kontrol laju alir dan keterulangan laju alir baik Komponen instrumen yang tahan korosi

KCKT & KG

Terdapat 3 jenis sistem pompa: Pompa piston timbal-balik eluen dipompa dengan gerakan timbal-balik (mundurmaju) oleh piston

Gambar Pompa piston timbal-balik

KCKT & KG

Keuntungan pompa piston timbal-balik: tekanan yang dihasilkan tinggi, dapat digunakan pada elusi gradien, laju alir yang dihasilkan konstan serta independen dari viskositas eluen dan tekanan balik kolom Kerugian pompa piston timbal-balik : menghasilkan aliran yang memiliki pulsa Displacement pump/pompa pergeseran pompa menyerupai semprit (syringe) besar yang terdiri atas bejana dan alat penyedot, menghasilkan aliran yang bebas dari viskositas eluen

KCKT & KG

Pneumatic pump/pompa pneumatik eluen dalam kontainer didorong oleh tekanan gas/udara Pompa jenis ini bebas dari pengaruh viskositas eluen dan tekanan balik kolom, namun tidak dapat digunakan untuk elusi gradien dan tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi.

Saat ini ketiga sistem pompa tersebut dikontrol dengan komputer dalam pengoperasiannya

KCKT & KG

Pada awalnya injeksi dilakukan dengan sistem sederhana berupa semprit (syringe) yang menginjeksikan sampel ke dalam kolom melalui septum elastomerik, namun keterulangannya sangat buruk Saat ini yang banyak digunakan ialah sistem injeksi dengan menggunakan simpal pencuplikan (sampling loop). Sistem ini terintegrasi dalam instrumen KCKT

Sistem Injeksi sampel

KCKT & KG

Sistem injeksi sampel

KCKT & KG

Kolom
kolom KCKT dapat dikemas dalam bentuk koil ataupun tidak. Beberapa buah kolom dapat digabung (coupling column) Secara mendasar, jenis kolom untuk KCKT dikategorikan sebagai: Kolom kemas, (packed column) Kolom kapiler (open tubular/capillary column) Kolom preparatif
Ingat kembali teori PELAT !!! N = L/H

Kolom penjaga (Guard column), berfungsi menyingkirkan kontaminan dalam eluen dan matriks sampel yang terikat tidak reversibel pada kolom. Bertujuan memperpanjang umur kolom Thermostat kolom, menjaga suhu operasi kolom. Keberadaannya tidak mutlak, tapi sangat berguna untuk analisis senyawa yang memerlukan suhu tertentu yang konstan saat dipisahkan.

KCKT & KG

Kolom
a. Kolom umum terbuat dari tabung baja b. Panjang antara 10 - 30 cm c. Diameter dalam umumnya 4 - 40 mm; untuk generasi terbaru kolom KCKT saat ini antara 1 4,6 mm d. Ukuran partikel partikulat (fase diam) umumnya adalah 5 - 10 mikrometer

KCKT & KG

Detektor
Sifat limbak (bulk property): membandingkan perubahan keseluruhan perubahan fisis fase gerak dengan dan tanpa zat yang dielusi - relatif insensitif - perlu kontrol suhu yang baik - contoh: detektor indeks refraksi (refractive index detector, RID) Sifat solut (solute property): respon terhadap sifat fisis solut yang tidak ditunjukkan oleh fase gerak 1000 kali lebih sensitif dari bulk property, bisa mendeteksi dalam jumlah ng

KCKT & KG

Detektor
Detektor fluoresens: radiasi datang-fluoresens lurus/900 senyawa: aromatik polinuklir, steroid, pigmen tumbuhan, vitamin, alkaloid dsb

Detektor elektrokimia: karakteristik voltametri molekul dalam fase gerak polar aq atau alkohol aq pada permukaan elektrode
senyawa: amina aromatik, asam askorbat, asam urat, sistein dsb Detektor fotometri absorpsi UV-Vis; UV 254/280 nm; sensitivitas tinggi (ng), tidak sensitif terhadap perubahan suhu, laju alir, komposisi fase gerak senyawa kimia/biologis: aromatik, senyawa yang mengandung karbonil, tiokarbonil, nitroso, azo

KCKT & KG

Detektor UV

- most common - simple systems : intense 254 nm emission of a mercury lamp. - high-quality detectors fullscale absorbance range 0.0005-3 absorbance units with a noise level near 1% of full scale. - good for gradient elution with nonabsorbing solvents

KCKT & KG

Jenis KCKT
KCKT Pertukaran Ion
Fase diam : penukar ion (polimer gugus fungsi counter ion)

Komponen

: ion/dapat diionkan/ligan

Eluen/fase gerak: variasi pH (bufer)

variasi kekuatan ion C garam

pengkompleks (sitrat, EDTA): untuk kation logam

Mn+ + pengkompleks (X)y-1 MX(n-m)

(kation/anion/netral) pH; Kf

KCKT & KG

Jenis KCKT
Kuat - SO3-H+ penukar kation kuat
- CH2N+(CH3)Cl- penukar anion kuat mengion sempurna kekuatan pertukaran pH

kapasitas pertukaran pH
Lemah - COO-H+ penukar kation lemah - CH2N(CH3)2 penukar anion lemah

pengionan tidak sempurna kapasitas pertukaran pH

- COO-H+ pH tinggi - CH2N(CH3)2 pH rendah

Kapasitas pertukaran = jumlah gugus fungsi tersedia untuk pertukaran per satuan massa (atau v) penukar ion

KCKT & KG

KCKT Pertukaran Ligan Penukar kation: resin-Cu2+/Ni2+/Zn2+

Komponen
Eluen

: ligan (misal: kafein, guanin)

afinitas terhadap ion : ligan

R-Cu2+ + NH3 R-[Cu(NH3)4]2+ R-[Cu(NH3)4]2+ + kafein R-[Cu(kafein)4]2+ + NH3 Pemisahan metabolit purin: guanin, xanthine, adenine, hypoxanthine, asam urat kolom : resin-Cu2+ eluen : NH3

VR

: guanin 30 ml
adenine 44 ml

xanthine 34 ml
hypoxanthine 75 ml

KCKT & KG

KCKT Adsorpsi Prinsip Fase diam Fase gerak : analat teradsorpsi pada fase diam padat, bersaing dengan molekul fase gerak : silika dan alumina (tidak selalu) tR komponen lebih polar > tR komponen kurang polar : komposisi beragam

Kemampuan khas: Memisahkan campuran isomer misalnya turunan benzena tersubstitusi meta dan para

KCKT & KG

KCKT Partisi

Fase diam
Fase gerak Sistem

: cair (disangga dengan pengisi kolom)

: air :

Fase normal fase diam polar (mis: trietilena glikol, air); fase gerak nonpolar (mis: heksana, propileter) kepolaran komponen tR kepolaran fase gerak waktu elusi
Fase terbalik fase diam polar (mis: hidrokarbon); fase gerak polar (mis: air, metanol, asetonitril) kepolaran komponen tR kepolaran fase gerak waktu elusi

KCKT & KG

Contoh Aplikasi

KCKT & KG

Typical applications of bonded-phase chromatography. (a) Soft-drink additives. (b) Organophosphate insecticides.

KCKT & KG

Ion chromatogram of a mixture of cations.

Ion chromatogram of a mixture of anions.

KCKT & KG