Martinelli Filho

JOSÉ EDUARDO MARTINELLI FILHO
A associação entre o zooplâncton e Vibrio cholerae no
complexo estuarino de Santos - Bertioga e Plataforma
adjacente
Dissertação apresentada ao Instituto

Oceanográfico da Universidade de São
Paulo, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências,
área de Oceanografia Biológica.
Orientador:
Prof. Dr. Rubens Mendes Lopes
São Paulo
2007
ii
Universidade de São Paulo
Instituto Oceanográfico
A associação entre o zooplâncton e Vibrio cholerae no complexo
estuarino de Santos - Bertioga e Plataforma Adjacente
José Eduardo Martinelli Filho
Dissertação apresentada ao Instituto Oceanográfico da

Universidade de São Paulo, como parte integrante dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em Ciências, área de
Oceanografia Biológica.
Aprovada em 23/08/2007.
____________________________
Prof. Dr. Rubens Mendes Lopes
____________________________
Prof. Dr. Jean Louis Valentin
_____________________________
Prof. Dr. Fabiano Lopes Thompson
iii
Essa dissertação é dedicada ao meu pai, por sempre ter acreditado em

mim e por ter me apoiado durante todos esses anos na universidade. Pai, você
é o maior exemplo de dedicação e paixão de um homem pela sua profissão.
iv
O senhor... Mire veja: o mais importante e bonito, do mundo, é isto: que

as pessoas não estão sempre iguais, ainda não foram terminadas – mas que
elas vão sempre mudando. Afinam ou desafinam. Verdade maior. É o que a
vida me ensinou. Isso que me alegra, montão.
(Guimarães Rosa, Grande Sertão: Veredas)
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao professor Rubens Mendes Lopes, que me incentivou a trilhar os

caminhos da pesquisa planctônica desde meados de 2003, quando ainda estava na
graduação. Agradeço igualmente aos membros da banca, pelas sugestões, críticas e
elogios.
À Capes (através do programa PAE) e ao CNPq pelas bolsas concedidas durante
a pós-graduação. Aos professores Ana Vanin, Thais Corbisier, Rubens Lopes e Paulo
Sumida por me aceitarem como monitor nas disciplinas Invertebrados Marinhos e
Sistema Pelágico. Agradeço também aos docentes do IO e do IB que foram importantes
durante minha formação desde a graduação até os dias de hoje e pela amizade: José
Carlos de Freitas, Flávio Berchez, Carlos Rocha, June Dias, Ana Vanin, Thais
Corbisier, Phan Van Ngan, Vicente Gomes, Sérgio Bueno, Janet Reid, Paulo Sumida,
Salvador Gaeta, Kam Tang e Tagea Björnberg.
Toda a equipe do Laboratório de Produção Secundária, que auxiliou direta ou
indiretamente a realização desse trabalho: Mauro, Adriana, Lilian, Dani, Newton, Kenji,
Naira, André (Cazão), Masami, Sabine e Rubens, valeu pela força! Maurolicus, muito
obrigado pela meticulosa revisão do léxico (nerd!). Lila, obrigado pela ajuda na
formatação na reta final desse trabalho; Nairita, pelo auxílio na triagem das amostras da
campanha de verão da plataforma; Masami, valeu pela ajuda no tratamento das imagens
e discussões sobre rock e cerveja!
À equipe do laboratório de Ecologia Microbiana Molecular (Microbiologia
Ambiental), coordenado pela professora Irma Rivera. Valeu meninas pela força durante
os testes de padronização dos métodos. Agradeço em especial à Mariela pelo auxílio
durante os testes de extração de ADN e PCR. Meus sinceros agradecimentos também à
Claudiana, Zelma, Bianca, Solange, Mário, Carol, Gislaine e Lílian. Professora Irma,
obrigado por disponibilizar o laboratório para desenvolvimento dos experimentos e pelo
auxílo com a bibliografia.
Esse trabalho só foi possível devido ao auxílio dos inúmeros funcionários do
Instituto Oceanográfico. Listá-los não caberia nessa dissertação! Agradeço à tripulação
do Navio Oceanográfico “W. Besnard”, dos barcos de pesquisa “Véliger II” e
“Albacora”, os funcionários do setor de logística e transporte, oficina, biblioteca e do
departamento de Oceanografia Biológica, em especial ao Tomás, Artur, Maysa,
vi
Luizinho, Valter Miyagi, Sandrinha, Maria Pureza, Raimunda (dona Rai), Wagner e à
Marta Stephan (Martinha). Agradeço também a paciência das funcionárias da secretaria
de pós-graduação, Ana Paula e Silvana!
Agradeço em especial a Lourdes, por estar sempre disposta a ajudar, ser minha
fonte constante de cafeína e pelas aulas particulares sobre o Surfer (Suffer!!!) 8.0.
Lourdes, sem você teria sido mais difícil! Professor Mário Katsuragawa, agradeço
igualmente por estar sempre disposto a ajudar e acolher as pessoas em seu laboratório.
A todos os moradores, ex-moradores e agregados da república mais tradicional
do I.O., a famigerada Estação 69. República onde já nasceram 2 dissertações e uma tese
até o momento! Todos vocês auxiliaram (ou dificultaram) o andamento dessa obra!. Em
ordem alfabética: Ada, Adriana (Miss Lindóia), Bũrcio (King Kong), Caio Caciporé,
Careca, Coelho, Denis (Meio-quilo), Daniel Moita, Daniel Piu-piu, Dutsch, Enrique
(Oraporfavor), Ghandi, Hélvio, Hermínio, Juarez (Gavião Guloso), Lucas (Tião),
Marcos (Bebarrão de Caruaru), Maurolicus, Michael, Mônica, Nirtão, Olaf the Viking,
Robinho e Sueco.
Agradeço também a todos meus amigos que fiz nessa universidade, desde a Poli
(incluindo o Politreco) até a FFLCH. Não posso citar um a um, seria uma
irresponsabilidade perante ao meio ambiente pela quantidade de tinta e papel utilizados.
Um muito obrigado também aos amigos da pós: Paulinha, Frango, Keyi, Débora,
Gominha, Marquinho, Cintia Ancona e Cintia Quintana, André Bemloco, Carol di
Paolo, Fábio (Limão), Thais, Sebastian, Fabrício, Naty, Patrick e Ricardo.
A toda a minha família, por apoiar, de uma maneira ou outra, a minha escolha
pela biologia marinha. Aos meus pais José Eduardo e Anete Martinelli, avôs, irmão e
irmãs, tios e tias, primos e primas, por constituírem uma família unida e acolhedora.
Não poderia esquecer também meus amigos de Jundiaí: Gustavo, Rafael, Cássio, os
irmãos Gasparotto, irmãos Peroni, Flávia, Gaúcho, Noctilucas, Lilian, Tropeço e Pererê.
Agradeço por fim a família Carolino em especial a Kátia, por todo o amor,
carinho, incentivo e paciência durante esses anos de pós-graduação. Obrigado por
acreditar nesta e nas futuras conquistas por vir.
vii
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS.................................................................................................. ix
ÍNDICE DE TABELAS ............................................................................................... xiii
RESUMO...................................................................................................................... xvi
ABSTRACT ................................................................................................................ xvii
1) INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
1.1) Víbrios no ambiente marinho: interações com fatores bióticos e abióticos......... 1
1.2) Estados metabólicos bacterianos: viabilidade, dormência e cultivo ..................... 6
1.3) Vibrio cholerae: identificação e genômica............................................................ 9
1.4) A Cólera e sua epidemiologia no mundo e no Brasil.......................................... 11
1.5) Finalidade da pesquisa de Vibrio cholerae associada ao zooplâncton e a escolha
da região de estudo. .................................................................................................... 14
2) OBJETIVOS............................................................................................................. 15
2.1) Objetivo principal................................................................................................ 15
2.2) Objetivos específicos........................................................................................... 15
3) CARACTERIZAÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO .................................................. 16
4) MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 19
4.1) Seleção das estações de coleta ............................................................................ 19
4.2) Variáveis ambientais ........................................................................................... 22
4.2.1) Coleta de dados ambientais e zooplâncton................................................... 22
4.2.2) Aquisição e análise de dados........................................................................ 23
4.3) Determinação e enumeração dos táxons zooplanctônicos .................................. 23
4.4) Ensaio de imunofluorescência direta (DFA)....................................................... 24
4.5) DVC-DFA (Contagem direta de bactérias viáveis, associada ao ensaio de
imunofluorescência direta) ......................................................................................... 27
4.6) Tratamento numérico e estatístico dos dados...................................................... 28
4.6.1) Cálculo do volume de água filtrado ............................................................. 28
4.6.2) Cálculo da densidade de organismos zooplanctônicos e densidade relativa 28
4.6.3) Freqüência de ocorrência ............................................................................. 29
4.6.4) Diversidade e eqüitatividade do zooplâncton............................................... 29
4.6.5) Análise estatística......................................................................................... 30
5) RESULTADOS ........................................................................................................ 32
5.1) Variáveis ambientais ........................................................................................... 32
5.2) Análise do zooplâncton ....................................................................................... 36
5.2.1) Determinação dos táxons zooplanctônicos .................................................. 36
5.2.2) Freqüência relativa dos organismos zooplanctônicos .................................. 36
5.2.3) Densidade do zooplâncton ........................................................................... 44
5.2.4) Densidade total e relativa dos grupos mais representativos......................... 47
5.2.5) Holoplâncton x Meroplâncton...................................................................... 53
5.2.6) Perfil horizontal de distribuição da densidade zooplanctônica para a
plataforma............................................................................................................... 55
5.2.7) Índice de diversidade de Shannon e eqüitatividade ..................................... 57
5.3) Variabilidade dos fatores ambientais e bióticos por ambientes e grupos de
estações (ANOVA)..................................................................................................... 61
5.4) Análise de dissimilaridade .................................................................................. 62
5.5) Ensaio de imunofluorescência direta................................................................... 66
5.5.1) Distribuição dos sorogrupos O1 e O139 sobre a plataforma continental..... 68
5.5.2) Relação entre a detecção de Vibrio cholerae O1 e O139 e parâmetros
ambientais............................................................................................................... 69
viii
5.5.3) Relação entre a detecção de Vibrio cholerae O1 e O139 e variáveis

ecológicas ............................................................................................................... 72
5.6) Testes com táxons específicos............................................................................. 75
5.7) Ensaio de imunofluorescência direta, associada à contagem direta de bactérias
(DVC-DFA)................................................................................................................ 76
6) DISCUSSÃO............................................................................................................ 80
6.1) Relação entre as variáveis da comunidade zooplanctônica e a associação de
Vibrio cholerae ........................................................................................................... 80
6.2) O método de imunofluorescência direta (DFA) e detecção de dos sorogrupos O1
e O139. ....................................................................................................................... 84
6.3) Bactérias viáveis e viáveis não cultiváveis (VNC) ............................................. 85
6.4) Detecção de sorogrupos toxigênicos sobre o plâncton........................................ 87
6.5) Presença de Vibrio cholerae O1 e O139 em relação aos parâmetros ambientais 90
6.6) Especificidade da associação entre Vibrio cholerae e táxons zooplanctônicos e
adesão aos diversos substratos.................................................................................... 94
6.7) Relevância do projeto para a área de estudo ....................................................... 98
7) CONCLUSÕES ..................................................................................................... 100
8) BIBLIOGRAFIA..................................................................................................... 102
9) APÊNDICES .......................................................................................................... 120
9.1) Temperatura ...................................................................................................... 120
9.2) Perfis horizontais de distribuição de temperatura ............................................. 121
9.3) Salinidade .......................................................................................................... 123
9.4) Perfis horizontais de distribuição de salinidade ................................................ 124
9.5) Densidade do zooplâncton ................................................................................ 126
9.6) Diversidade e eqüitatividade ............................................................................. 129
9.7) Coordenadas das estações de coleta .................................................................. 130
9.8) Informações adicionais sobre as estações de coleta .......................................... 131
9.8.1) Coletas realizadas no complexo estuarino ................................................. 131
9.8.2) Coletas realizadas na plataforma continental adjacente............................. 133
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Síntese de variáveis que atuam no estado metabólico de Vibrio cholerae. A

bactéria passa do estado VNC para VC quando associada ao epitélio intestinal de
mamíferos. O copépode representa o zooplâncton vivo, que pode induzir o estado VNC
durante a adesão. A seta é bidirecional porque copépodes podem adquirir as bactérias do
meio e funcionar como um “hotspot”de produção microbiana. A seta entre copépode e
epitélio faz referência a ingestão acidental........................................................................8
Figura 2: A Baixada Santista. A imagem foi obtida através da composição de fotos de
satélite (Landsat), obtidas no site da EMBRAPA e evidencia a aglomeração de núcleos
urbanos em torno da baía e canal de Santos. .................................................................. 16
Figura 3: Mapa do complexo estuarino Santos-Bertioga com os pontos amostrados
durante junho a dezembro de 2005, com exceção do mês de setembro ......................... 20
Figura 4: Mapa com as estações de coleta sobre a plataforma continental adjacente à
Baixada Santista, durante o cruzeiro de inverno (19 a 24 de setembro de 2005)........... 20
Figura 5: Mapa com as estações de coleta sobre a plataforma continental adjacente à
Baixada Santista, durante o cruzeiro de verão (11 a 16 de março de 2006)................... 21
Figura 6: Lâmina e componentes do kit de DFA. .......................................................... 26
Figura 7: Exemplo de lâmina contendo amostras de plâncton. Os espaços entre as
amostras evitam que ocorra contaminação durante a deposição da lamínula. ............... 26
Figura 8: Valores médios de temperatura, seguidos pelos respectivos desvios- padrão,
para as estações analisadas no complexo estuarino de Santos-Bertioga. ....................... 32
Figura 9: Valores médios de temperatura (°C), seguidos pelos respectivos desvios
padrão, para as estações na plataforma adjacente durante a campanha de setembro de
2005. ............................................................................................................................... 33
Figura 10: Valores médios de temperatura (°C), seguidos pelos respectivos desvios-
padrão, para as estações na plataforma adjacente durante a campanha de março de 2006.
........................................................................................................................................ 33
Figura 11: Valores médios de salinidade, seguidos pelos respectivos desvios-padrão,
para as estações analisadas no complexo estuarino de Santos-Bertioga. ....................... 34
para a plataforma adjacente durante a campanha de setembro de 2005......................... 35
para a plataforma adjacente durante a campanha de março de 2006.............................. 35
Figura 14: Freqüência de ocorrência dos grupos zooplanctônicos para o complexo
estuarino. Urochordata refere-se aos grupos Thaliacea e Doliolida, excluindo
Apendicularia e as larvas de Ascidiacea......................................................................... 42
Figura 15: Freqüência de ocorrência dos grupos zooplanctônicos para a plataforma
adjacente. O grupo Gastropoda faz referências às larvas véliger e exclui grupos como
Heteropoda e Pteropoda. Urochordata refere-se apenas aos grupos Thaliacea e
Doliolida. ........................................................................................................................ 43
Figura 16: Densidade zooplanctônica para as amostras analisadas durante o mês de
julho.................................................................................................................................46
agosto...............................................................................................................................46
outubro............................................................................................................................46
novembro........................................................................................................................46
x

dezembro.........................................................................................................................47
Figura 21: Densidade média zooplanctônica por estação de coleta para o complexo
estuarino Santos-Bertioga................................................................................................47
Figura 22: Densidade do zooplâncton nas amostras coletadas na plataforma, durante a
campanha de inverno (setembro de 2005)...................................................................... 46
Figura 23: Densidade do zooplâncton nas amostras coletadas na plataforma, durante a
campanha de verão (março de 2006).............................................................................. 47
Figura 24: Abundância relativa dos principais grupos zooplanctônicos no complexo
estuarino Santos-Bertioga durante o mês de julho de 2005............................................ 48
estuarino Santos-Bertioga durante o mês de agosto de 2005. ........................................ 49
estuarino Santos-Bertioga durante o mês de outubro de 2005. ...................................... 49
estuarino Santos-Bertioga durante o mês de novembro de 2005.................................... 50
Figura 29: Abundância relativa dos principais grupos zooplanctônicos para a plataforma
adjacente durante a campanha de inverno de 2005. ....................................................... 52
adjacente durante a campanha de verão de 2006............................................................ 52
Figura 31: Densidade relativa do holoplâncton (exceto Copepoda), copépodes pelágicos
e meroplâncton durante a amostragem no sistema estuarino de Santos-Bertioga.......... 53
Figura 32: Densidade relativa do holoplâncton (exceto Copepoda e Cladocera),
copépodes pelágicos, cladóceros e meroplâncton durante a amostragem na plataforma
adjacente, campanha de setembro de 2005..................................................................... 54
Figura 33: Densidade relativa do holoplâncton (exceto Copepoda e Cladocera),
copépodes pelágicos, cladóceros e meroplâncton durante a amostragem na plataforma
adjacente, campanha de março de 2006. ........................................................................ 54
Figura 34: Distribuição dos valores de densidade do zooplâncton (org. m-3), obtidos
para as estações amostradas durante a campanha de inverno (setembro de 2005)......... 55
Figura 35: Distribuição dos valores de densidade do zooplâncton (org. m-3), obtidos
para as estações amostradas durante a campanha de inverno (setembro de 2005)......... 56
Figura 36: Índice de diversidade de Shannon (bits . ind.-1) calculado por estação para o
complexo estuarino de Santos-Bertioga durante os 5 meses de coleta........................... 58
Figura 37: Índice de diversidade de Shannon (bits . ind.-1) calculado por estação para a
plataforma adjacente durante a campanha de setembro de 2005.................................... 58
Figura 38: Índice de diversidade de Shannon (bits . ind.-1) calculado por estação para a
plataforma adjacente durante a campanha de março de 2006. ....................................... 59
Figura 39: Valores de eqüitatividade calculado por estação para o complexo estuarino
de Santos-Bertioga.......................................................................................................... 59
Figura 40: Valores de eqüitatividade calculado por estação para a plataforma adjacente,
durante a campanha de setembro de 2005. ..................................................................... 60
Figura 41: Valores de eqüitatividade calculado por estação para a plataforma adjacente,
durante a campanha de março de 2006........................................................................... 60
Figura 42: Dendrograma de dissimilaridade (distância euclidiana), calculado pelo
método de Ward, para as estações amostradas no complexo estuarino de Santos-
Bertioga. ......................................................................................................................... 63
Figura 43: Dendrograma de dissimilaridade(distância euclidiana), calculado pelo
método de ligação completa, para as estações amostradas no complexo estuarino de
Santos-Bertioga. ............................................................................................................. 63
xi

método de Ward, para as estações amostradas na plataforma durante a campanha de
inverno (setembro de 2005)............................................................................................ 64
método de ligação completa, para as estações amostradas na plataforma durante a
campanha de inverno (setembro de 2005)...................................................................... 64
verão (março de 2006).................................................................................................... 65
verão (março de 2006).................................................................................................... 65
Figura 48: Distribuição das amostras positivas para Vibrio cholerae. O1 durante o
inverno.............................................................................................................................69
inverno.............................................................................................................................69
verão................................................................................................................................70
Figura 51: Distribuição das amostras positivas para Vibrio cholerae. O139 durante o de
verão................................................................................................................................70
Figura 52: Influência da salinidade sobre a detecção do sorogrupo O1 em amostras
totais de plâncton.............................................................................................................72
Figura 53: : Influência da salinidade sobre a detecção do sorogrupo O139 em amostras
Figura 54: Influência da temperatura sobre a detecção do sorogrupo O1 em amostras
Figura 55: Influência da temperatura sobre a detecção do sorogrupo O139 em amostras
Figura 56: Relação entre a detecção de Vibrio cholerae. O1 e a densidade
zooplanctônica.................................................................................................................74
Figura 57: Relação entre a detecção de Vibrio cholerae. O139 e a densidade
zooplanctônica.................................................................................................................74
Figura 58: Relação entre a porcentagem de crustáceos nas amostras e a detecção de
Vibrio cholerae.O1..........................................................................................................75
Figura 59: Relação entre a porcentagem de crustáceos nas amostras e a detecção de
Vibrio cholerae O139......................................................................................................75
Figura 60: Relação entre a porcentagem de copépodes nas amostras e a detecção de
Vibrio cholerae.O1.........................................................................................................75
Figura 61: Relação entre a porcentagem de copépodes nas amostras e a detecção de
Vibrio cholerae.O139....................... .............................................................................75
Figura 62: Vibrio cholerae alongada, através da técnica de DVC-DFA Aumento
aproximado de 2.000 x para A e 3.000 x para B (aumento digital)................................ 78
Figura 63: Controle positivo do kit de DFA para Vibrio cholerae O1(a); e apêndice de
microcrustáceo carregando Vibrio cholerae, provavelmente no estado VNC(b).
Aumento de aproximadamente 2.000 x para A e B........................................................ 78
Figura 64: bactérias no estado VNC, através do método DVC-DFA. Notar brilho mais
intenso na periferia da célula (parede celular). Aumento aproximado de 3.000. ........... 79
Figura 9.2.1: Valores de temperatura à 5 metros de profundidade, para a campanha de
inverno (setembro de 2005). .........................................................................................121
xii

verão. ............................................................................................................................122
verão. ............................................................................................................................122
verão. ............................................................................................................................122
verão. ............................................................................................................................122
Figura 9.4.1: Valores de salinidade à 5 metros de profundidade, durante a campanha de
inverno. .........................................................................................................................124
inverno. .........................................................................................................................124
Figura 9.4.3: Valores de Salinidade à 15 metros de profundidade, durante a campanha
de inverno. ....................................................................................................................124
inverno. .........................................................................................................................124
verão. ............................................................................................................................125
verão. ............................................................................................................................125
verão. ............................................................................................................................125
verão. ............................................................................................................................125
xiii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Variedade de fatores descritos que conferem virulência para Vibrio cholerae.
........................................................................................................................................ 10
Tabela 2: Freqüência de ocorrência dos organismos zooplanctônicos nas amostras para
ambos os ambientes (plataforma e estuário). * : Organismo subestimado, removido das
amostras no momento da coleta. **: Organismos que não foram identificados até o nível
representado para a plataforma; ***: Organismos não identificados até o nível
representado para o estuário. .......................................................................................... 36
Tabela 3: Síntese dos valores de p para as variáveis analisadas entre os diferentes
ambientes e agrupamento de amostras. S.D.: Sem dados. %: Densidade relativa. ........ 61
Tabela 4: Presença do sorogrupo O1 nas amostras de plâncton coletadas no complexo
estuarino Santos-Bertioga. -: amostra negativa, +: 5 a 9 campos contendo víbrios; ++:
10 a 15 campos; +++ acima de 15 campos. Vintes campos foram analisados por
amostra. S. D.: Sem dados.............................................................................................. 66
Tabela 5: Presença do sorogrupo O139 nas amostras de plâncton coletadas no complexo
estuarino Santos-Bertioga. Campos determinados como descrito para a Tabela 4. ....... 66
Tabela 6: Presença dos sorogrupos O1 e O139 nas amostras de plâncton coletadas
durante a campanha de inverno (setembro de 2005). Campos determinados como
descrito para a tabela 4. .................................................................................................. 67
Tabela 7: Presença dos sorogrupos O1 e O139 nas amostras de plâncton coletadas
durante a campanha de verão (março de 2006). Campos determinados como descrito
para a Tabela 4................................................................................................................ 67
Tabela 8: Valores de probabilidade (p) dos testes t de Student e Mann-Whitney entre
variáveis bióticas e abióticas em relação à detecção de Vibrio cholerae. O1. E: Estuário;
P: Plataforma; I: Campanha de inverno; V: Campanha verão....................................... 70
Tabela 9: Valores de probabilidade (p) dos testes t de Student e Mann-Whitney entre
variáveis bióticas e abióticas em relação à detecção de Vibrio cholerae. O139. ........... 70
Tabela 10: Valores de probabilidade (p) dos testes t de Student para a temperatura e
salinidade em diversas profundidades, em relação à detecção de Vibrio cholerae.O1 e
O139. .............................................................................................................................. 70
Tabela 11: Táxons testados, número de testes e resultados positivos obtidos através do
DFA. ............................................................................................................................... 75
Tabela 14: Resultados obtidos durante os três meses de coleta, utilizando o método
DVC-DFA. RC__: cepas utilizadas como controle (detalhes em materiais e métodos). 77
Tabela 15: Detecção (%) de Vibrio cholerae. O1 e O139 sobre o plâncton estuarino e
costeiro em diversas amostragens ambientais. + : Os autores não forneceram dados
quantitativos; S.D. : Ausência de dados. ........................................................................ 89
Tabela 9.1.1: Valores médios de temperatura, seguidos pelos respectivos desvios-
padrão, para as estações analisadas no complexo estuarino de Santos-Bertioga. ........ 120
Tabela 9.1.2: Valores de temperatura (média e desvio padrão) para ambas as campanhas
na plataforma adjacente. ............................................................................................... 120
Tabela 9.3.1: Valores médios de salinidade, seguidos pelos respectivos desvios-padrão,
para as estações analisadas no complexo estuarino de Santos-Bertioga. ..................... 123
Tabela 9.3.2.: Valores de salinidade (média e desvio padrão) para ambas as campanhas
Tabela 9.5.1: Densidade de organismos por metro cúbico dos táxons mais abundantes
durante o mês de julho para o complexo estuarino Santos-Bertioga............................ 126
Tabela 9.5.2: Densidade (org. m-3) dos táxons mais abundantes durante o mês de agosto
para o complexo estuarino Santos-Bertioga. ................................................................ 126
xiv
Tabela 9.5.3: Densidade (org. m-3) dos táxons mais abundantes durante o mês de
outubro para o complexo estuarino Santos-Bertioga.................................................... 126
novembro para o complexo estuarino Santos-Bertioga................................................ 127
dezembro para o complexo estuarino Santos-Bertioga. ............................................... 127
Tabela 9.5.6: Densidade (org. m-3) dos táxons mais abundantes durante o inverno de
2005 na plataforma adjacente. ...................................................................................... 128
Tabela 9.5.7: Densidade (org. m-3)dos táxons mais abundantes durante o verão de 2006
Tabela 9.6.1: Índice de diversidade de Shannon (bits . ind.-1) e eqüitatividade,
calculados por estação para o complexo estuarino de Santos-Bertioga. H: Índice de
Shannon; J: Eqüitatividade; 7: Julho; 8: Agosto; 10: Outubro; 11: Novembro; 12:
Dezembro. O cálculo considera todos os táxons analisados. ....................................... 129
Tabela 9.6.2: Índice de diversidade de Shannon e eqüitatividade para as estações
amostradas durante a campanha de Inverno. H: Índice de diversidade; J: Eqüitatividade;
C: grupo Copepoda; T: todos os táxons analisados...................................................... 129
Tabela 9.6.3: Índice de diversidade de Shannon e eqüitatividade para as estações
amostradas durante a coleta de Verão. H: Índice de diversidade; J: Eqüitatividade; C:
grupo Copepoda; T: todos os táxons analisados........................................................... 130
Tabela 9.7.1: Coordenadas geográficas das estações de coleta sobre o complexo
estuarino de Santos-Bertioga. ....................................................................................... 130
Tabela 9.7.2: Coordenadas geográficas das estações de coleta sobre a plataforma
continental adjacente à Baixada Santista. I: estação amostrada durante o inverno; V:
estação amostrada durante o verão e I + V: estação amostrada durante ambas as
campanhas. ................................................................................................................... 131
Tabela 9.8.1.1: Informações sobre a coleta realizada durante o mês de julho de 2005.131
Tabela 9.8.1.2: Informações sobre a coleta realizada durante o mês de agosto de 2005.
...................................................................................................................................... 132
Tabela 9.8.1.3: Informações sobre a coleta realizada durante o mês de outubro de 2005.
...................................................................................................................................... 132
Tabela 9.8.1.4: Informações sobre a coleta realizada durante o mês de novembro de
2005. ............................................................................................................................. 132
Tabela 9.8.1.5: Informações sobre a coleta realizada durante o mês de dezembro de
2005. ............................................................................................................................. 133
Tabela 9.8.2.1: Dados referentes à campanha de inverno, durante o mês setembro de
2005. ............................................................................................................................. 133
Tabela 9.8.2.2: Dados referentes à campanha de verão, durante o mês de março de 2006.
...................................................................................................................................... 134
xv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
µL – Microlitro
µm – Micrômetro
°C – Graus Celsius
CTD – perfilador para medição de condutividade, temperatura e profundidade, do

inglês “Conductivity, Temperature, Depth”
CT – cholera toxin (toxina colérica)
CTX – Cholera toxin factor (conjunto de genes que conferem virulência e que
transcreve a toxina colérica)
DFA – Direct Fluorescence Assay (ensaio de imunofluorescência direta)
DVC-DFA – Direct Viable Count – Direct Fluorescence Assay
ECOSAN – Projeto “A influência do complexo estuarino da Baixada Santista sobre o

ecossistema de plataforma continental adjacente”
FITC – Isotiocianato de fluoresceína
IMO – International Maritime Organization
bits . ind.-1 – bits por indivíduo, unidade de diversidade de Shannon
Kb – Quilo pares de bases
LPS – Lipopolissacarídeo
m² – Metro quadrado
mL – mililitro
Org. m-³ – Organismos por metro cúbico
PBS – Solução tampão de fosfato (phosphate buffered saline)
RTX – Repeat in toxin (conjunto de genes que conferem virulência em Vibrio cholerae)
V.c. O1; V.c. O139 – Vibrio cholerae O1 e Vibrio cholerae O139
VNC – Estado viável mas não cultivável (do inglês VBNC: viable but non culturable)
VPI – Vibrio Pathogenicity Island (Ilha de Patogenicidade, um dos conjuntos de genes

que conferem virulência em V. cholerae)
xvi
RESUMO
Vibrio cholerae é uma bactéria autóctone do ambiente aquático e pode causar

sérios riscos à saúde quando cepas patogênicas são acidentalmente consumidas. V.
cholerae se encontra associada aos copépodes em concentrações que podem alcançar
mais de 1000 vezes a densidade das bactérias livres na água. Se ingerido, um único
copépode pode conter a dose mínima de bactérias necessária para a manifestação da
doença. Verificar a presença e a distribuição dos sorogrupos O1 e O139 no complexo
estuarino de Santos-Bertioga e plataforma continental adjacente em associação com o
zooplâncton e seus distintos grupos taxonômicos foi o objetivo desse trabalho. O
zooplâncton (>330 µm) foi coletado e a detecção dos sorogrupos O1 e O139 realizada
nas amostras totais e nos táxons mais abundantes através das técnicas DVC-DFA e DFA
(Contagem direta de bactérias viáveis e ensaio de imunofluorescência direta). Amostras
fixadas em formol foram maceradas e preservadas numa solução tampão estéril,
previamente aos experimentos. Para o DVC-DFA, animais vivos foram selecionados,
lavados, macerados e uma alíquota transferida para meio de cultura. A presença da
bactéria no zooplâncton foi correlacionada a parâmetros abióticos e bióticos. O
sorogrupo O1 foi detectado em 88% e O139 em 77% das amostras de plâncton no
complexo estuarino de Santos-Bertioga, valores mais altos do que os publicados na
literatura mundial para outros estuários. Para a plataforma, a presença dos sorogrupos
foi menor devido à salinidade mais elevada. Foram testados isoladamente 43 táxons,
pertencentes a 9 filos. Dados inéditos da associação entre Vibrio cholerae e
quetognatos, estágios larvas de equinodermos, urocordados e ovos de peixes foram
registrados. Este trabalho sugere a existência de um gradiente costa-oceano para V.
cholerae aderido ao zooplâncton de águas costeiras e ampla capacidade de V. cholerae
O1 e O139 em aderir a diversos táxons do zooplâncton marinho.
Palavras-chave: Vibrio cholerae, sorogrupos O1 e O139, zooplâncton, DFA, Baixada
Santista, Atlântico Sudoeste

xvii
ABSTRACT
Vibrio cholerae is an autochthonous bacterium in the sea and may cause serious
health problems when pathogenic strains are accidentally ingested. V. cholerae are
found associated with copepods in concentrations up to a thousand times higher than the
free bacteria in the water. If ingested, a single copepod may have enough bacteria
necessary for human infection. The objective of this study was to verify the presence
and distribution of Vibrio cholerae O1 and O139 serogroups over Santos-Bertioga
estuarine complex and adjacent continental shelf in association with zooplankton and
over its distinct taxa. Zooplankton (>330 µm) sampling was carried out and detection of
V. cholerae O1 and O139 assessed in whole samples and on most abundant taxa by the
DFA and DVC-DFA (Direct Viable Count and Direct Fluorescence Assay) methods.
Briefly, formalin-fixed samples were grinded and preserved in a sterilized buffer
solution previously to the experiments. Live animals were selected, washed and grinded
and an aliquot transferred to culture media for the DVC-DFA assay. Presence of these
bacteria on zooplankton was correlated with physical and biological parameters of the
seawater. Serogroup O1 was found on 88% while O139 on 77% of the samples from
Santos-Bertioga estuarine complex, values higher than the ones found in other estuaries
in global literature. For the adjacent shelf, detection was smaller due to higher salinity.
43 taxa, belonging from 9 phyla were individually tested. Inedited data from the
association of V. cholerae and chaetognaths, Urochordata, larval stages of Polychaeta,
Echinodermata, and fish eggs were documented. This study suggests the existence of an
inshore-offshore gradient in V. cholerae attached to zooplankton from coastal waters
and the high ability of V. cholerae O1 and O139 to adhere on diverse marine
zooplanktonic taxa.
Keywords: Vibrio cholerae, serogroups O1 and O139, zooplankton, DFA, Santos
lowland, South-eastern Atlantic.

1
1) INTRODUÇÃO
1.1) Víbrios no ambiente marinho: interações com fatores bióticos e

abióticos
Bactérias da família Vibrionaceae são naturais de ambientes aquáticos, algumas

são patogênicas para vertebrados e invertebrados e a maioria tem papel importante nos
processos ecológicos como a alça microbiana. Uma importante função ecológica dessas
bactérias é a degradação da quitina, o segundo biopolímero mais comum no mundo e o
mais abundante no ambiente aquático (Meilbom et al., 2004). Aeromonas (família
Aeromonadaceae) e Vibrio são os gêneros mais estudados no ambiente marinho,
principalmente o segundo, porque possui representantes patogênicos para o homem (V.
cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus) e outros animais.
A família Vibrionaceae abriga 8 gêneros (Vibrio, Allomonas, Catenococcus,
Enterovibrio, Grimontia, Listonella, Photobacterium e Salinivibrio), sendo o gênero
Vibrio o mais abundante e mais diverso, comportando 65 espécies (Thompson &
Swings, 2006).
O ambiente estuarino é considerado como reservatório de populações de Vibrio,
tanto de bactérias em suspensão na água, quanto àquelas agregadas a partículas de
quitina ou associadas aos microcrustáceos, especialmente os copépodes (Huq et al.,
1983; Roszak & Colwell, 1987; Tamplin, et al., 1990; Tarsi & Pruzzo, 1999).
Acreditava-se que Vibrio cholerae procedente de ambientes aquáticos eram
advindos do trato intestinal do homem, paradigma que foi rompido a partir da
publicação de Colwell et al. (1977). Os autores comprovaram que este microorganismo
é autóctone de ecossistemas aquáticos, tendo sido isolado em águas costeiras, estuarinas
e corpos de água doce ao redor do mundo.
Além da descoberta de ambientes aquáticos, especialmente os estuarinos como
reservatórios da bactéria, diversos organismos multicelulares e até unicelulares foram
revelados como hospedeiros da bactéria. A pesquisa de víbrios associadas ao
zooplâncton é relativamente recente, sendo que o primeiro trabalho foi publicado na
década de 70 por Simidu et al. (1971). Os gêneros Vibrio e Aeromonas foram os mais
comuns entre as bactérias associadas ao plâncton neste estudo pioneiro.
Segundo Dumontet et al. (1996), o gênero Vibrio é o dominante sobre a
superfície de copépodes vivos, enquanto que Aeromonas e fungos como Aerobasidium
2
tornam-se mais abundantes nos animais mortos. A associação do gênero Vibrio com
diversos substratos vivos como fito- e zooplâncton, macroalgas e zoobentos, além de
fungos é conhecida e bem documentada (Bartlet & Azam, 2005; entre outros). Tamplin
et al. (1990) encontraram bactérias do sorogrupo O1 aderidas a vários organismos do
plâncton em Bangladesh, como em copépodes (Acartia spp., Cyclops sp e Diaptomus
sp), cladóceros (Bosmina sp, Daphnia sp, entre outros), o rotífero Brachionus sp, a
clorófita Volvox sp e outras espécies fitoplanctônicas como Pediastrum simplex,
Spirulina sp e cianobactérias unicelulares. A aderência de Vibrio cholerae às
fanerógamas aquáticas, algas e diatomáceas (as quais contém quitina em suas testas)
também são documentadas (Islam, et al. 1989, 1996).
Outro importante reservatório seriam os biofilmes, formados numa infinidade de
superfícies. Substratos quitinosos são locais ideais para o desenvolvimento de biofilmes
de Vibrio cholerae, o que foi demonstrado com copépodes e cladóceros em laboratório
(Huq et al., 1990; Chiavelli et al., 2001 e Kirn et al., 2005). O sistema bentônico
funcionaria como reservatório da bactéria, devido também a presença de biofilmes
quitinosos. Vários trabalhos registrando diversas espécies de víbrios na fauna bentônica,
especialmente em bivalves filtradores, também foram publicados (e.g. Barboni, 2003).
Reservatórios naturais distintos foram descritos também para ambientes
límnicos. A detecção de Vibrio cholerae não-O1, não-O139 em ovos de insetos da
família Chironomidae (Halpern et al., 2004) e de V. cholerae O139 e outros sorogrupos
em amebas das espécies Acanthamoeba polyphaga e Naegeria gruberi (Thom et al.,
1992; Abd et al., 2005) são os exemplos mais recentes.
Todas as espécies de Vibrio produzem uma quitinase extracelular e também se
sabe que várias apresentam certa especificidade em aderir aos copépodes ao invés de
outros grupos de animais planctônicos, favorecendo a sobrevivência e multiplicação
dessas bactérias. Huq et al. (1990) notaram que a colonização de V. cholerae foi maior
nos copépodes do que em cladóceros e rotíferos. Em amostras onde os copépodes não
eram dominantes os outros grupos eram colonizados mais extensivamente. Kaneko &
Colwell (1975) estudaram a fixação de V. parahaemolyticus em quitina particulada. A
concentração inicial de bactérias dissolvidas na água foi de 107 a 108 e esses valores
caíram para 104 a 105 bactérias/mL após 6 horas numa cultura de água estuarina
contendo quitina particulada. Vibrio parahaemolyticus associa-se às partículas ao invés
de permanecer livre na coluna da água.
3
A predileção de Vibrio cholerae em fixar-se em substratos quitinosos pode ser

interpretada como vantagem ecológica. A associação dos microorganismos às partículas
de quitina provém um mecanismo de transporte das bactérias para o sedimento, em
períodos de grande concentração de matéria orgânica na coluna de água. Esse tipo de
transporte também ocorre quando um microcrustáceo planctônico morre e afunda,
carregando a microbiota associada. No sedimento as células entram em maior contato
com os nutrientes, estando mais aptas a sobreviver e reproduzir por longos períodos.
Huq et al. (1983) encontraram concentrações de V. cholerae cerca de 4 a 5 ordens de
grandeza maior na presença de copépodes do que em sua ausência, em amostras de água
do mar provenientes de um estuário. As espécies estudadas por estes autores (Acartia
tonsa, Eurytemora affinis e Scottolana spp.), não apresentaram diferenças significativas
quanto ao número de bactérias associadas ao exoesqueleto dos organismos.
Binsztein et al. (2004) analisaram diretamente o sorogrupo O1 de Vibrio
cholerae associado às principais espécies de copépodes na região do Mar del Plata,
Argentina. As espécies A. tonsa, Diaptomus sp, Parvocalanus crassirostris e
Paracalanus parvus foram analisadas nas estações estuarinas, enquanto que Corycaeus
amazonicus, Centropages furcatus e Ctenocalanus vanus foram escolhidas para a
estação costeira. O sorogrupo O1 foi encontrado em todos esses copépodes através da
técnica de DVC-DFA (Direct Viable Count – Direct Fluorescence Assay; contagem
direta de bactérias associadas à imunofluorescência direta). Os víbrios, quando
associados à copépodes vivos em laboratório, sobreviveram por mais tempo e
permaneceram cultiváveis. Quando associados aos animais mortos ou à alga
Pseudoisochrysis sp, a sobrevivência e viabilidade destas bactérias foram menores (Huq
et al. 1983). Recentemente Louis et al. (2003) correlacionaram a porcentagem de
amostras de zooplâncton positivas para V. cholerae O1 com táxons zooplanctônicos
como copépodes, náuplios de cirripédios e rotíferos. Os maiores valores encontrados
foram em amostras onde náuplios, juvenis e adultos de copépodes calanóides eram os
grupos mais abundantes.
A alta adaptabilidade às variações de temperatura e salinidade favorece a
ocorrência de elevadas concentrações de víbrios em águas com características estuarinas
(Colwell, 1996). Por exemplo, temperaturas acima de 19°C e salinidades entre 2 a 14
são as condições mais propícias para Vibrio cholerae na baía de Chesapeake (E.U.A.)
(Louis et al., 2003).
4
Embora a maioria das bactérias torna-se inviável em altas temperaturas (25 a 37

ºC), foi demonstrado que para Vibrio cholerae esse fenômeno ocorre em temperaturas
baixas. Valores de 4 a 6ºC reduzem drasticamente a viabilidade dessa bactéria (Xu et
al., 1982). Sato et. al. (1995) observaram que a espécie suporta ampla variação de
temperatura e estabeleceram 10ºC como valor ideal para a sobrevivência em
microcosmos (bactérias viáveis por um numero maior de dias).
Singleton et al. (1982 a e b) reportaram que a viabilidade de Vibrio cholerae é
maior na faixa de salinidade entre 15 a 35 e que o maior crescimento ocorreu em 25, em
microcosmos com a temperatura controlada (10, 15 e 20ºC). Diferentes cepas testadas,
O1 e não-O1, comportaram-se de maneira semelhante quanto à variação da salinidade.
Os autores também demonstraram que a disponibilidade de nutrientes (triptona)
aumenta a viabilidade de V. cholerae para uma ampla faixa de salinidade (15 a 45).
Variação de salinidade, temperatura, pH e concentração de sais em diferentes
cepas de Vibrio cholerae foram analisadas por Miller et al. (1984). A concentração
final necessária de sais nutrientes ((NH4)2SO4, NaCl, MgSO4.7H2O E K2HPO4) nas
soluções para a manutenção do número de unidades formadoras de colônias variou entre
0,25 e 3,0%. Algumas cepas também possuíram maior aptidão para sobreviver em
baixas salinidades (de 0,05 a 1), justificando a presença dessas bactérias em corpos de
água doce. Para o experimento, os autores diminuíram a concentração de NaCl,
enquanto aumentavam a de KCl, mantendo a osmolaridade da solução constante. Nessas
baixas concentrações, o aumento de temperatura favoreceu a sobrevivência das
bactérias. Os valores de pH entre 7,0 e 8,5, os ideais para o crescimento de V. cholerae,
correspondem justamente aos valores encontrados para águas costeiras (7,5 a 8,5; ver
Valiela, 1995) e estuarinas (atingem até 6,9 para o complexo estuarino de Santos,
segundo Aguiar & Braga, 2007) .
A influência dessas variáveis no crescimento de Vibrio cholerae O1 associadas
externamente aos copépodes também foi estudada (Huq et al., 1984). É demonstrado
que, em condições de temperaturas elevadas (30ºC), salinidade de 15 (foram testadas
salinidades de 5, 10 e 15) e pH alcalino (8,5) foi atingida a maior concentração das
bactérias, tanto na presença quanto na ausência desses crustáceos nos microcosmos.
Em artigo mais recente, Huq et al. (2005) concluíram que o aumento da
temperatura da água em 5ºC elevou o fator de risco da cólera entre 2 a 4 vezes nas
semanas subseqüentes de amostragem em corpos de água doce em Bangladesh. Os
casos de cólera geraram uma correlação negativa com a precipitação, provavelmente por
5
resultar em valores muito baixos de salinidade (menos de 0,10). O trabalho ainda

correlaciona significativamente o aumento do número de copépodes com os casos de
cólera para a maioria dos ambientes amostrados.
Alam et al. (2006 b) demonstraram que amostras expostas à temperatura
ambiente (variando de 31 a 35ºC, para a região do lago Dhanmondi, Bangladesh)
durante 20 horas previamente ao processamento alteram a quantidade de bactérias
viáveis, quando comparada com amostras processadas uma hora após a coleta, através
de métodos que possibilitam quantificar as bactérias em ambos os estados metabólicos
(DVC-DFA, contagem associada ao corante laranja de acridina e reação em cadeia da
Polimerase do tipo “multiplex”). O trabalho foi realizado com amostras de água e
plâncton provenientes de ambientes límnicos e notifica a importância de temperaturas
elevadas no crescimento e/ou viabilidade de Vibrio cholerae.
A radiação solar, tanto da luz visível quanto da luz ultravioleta são fatores
bactericidas conhecidos. Alguns estudos foram realizados com outras espécies
bacterianas, como os trabalhos de Barcina et al. (1989 e 1990), porém nenhum foi
encontrado utilizando Vibrio cholerae como organismo alvo.
Bactérias livres no ambiente aquático, principalmente no mar, em camadas
superficiais são limitadas pela concentração de nutrientes. O estudo de Baker et al.
(1983) foi um dos primeiros a verificar o efeito da privação de nutrientes em Vibrio
cholerae. Os autores concluíram que em água da mar filtrada e na ausência de nutrientes
as bactérias reduziam drasticamente de volume e se multiplicavam. Quando os
nutrientes eram adicionados, as células rapidamente readquiriam volume e a forma
vibrióide. Os resultados foram interpretados como um mecanismo de sobrevivência em
ambientes oligotróficos.
O víbrio da cólera necessita de concentrações relativamente altas de nutrientes
(Gauthier, 2000), porém é capaz de entrar no estado viável, mas não cultivável (VNC);
uma provável adaptação para ambientes aquáticos oligotróficos. Essas bactérias
marinhas são denominadas de eutróficas ou copiotróficas (Martin & MacLeod, 1984).
Jahid et al. (2006) produziram uma deleção do gene responsável pela biosíntese de
polifosfato em Vibrio cholerae e verificaram que a cepa resultante foi mais sensível a
variação de parâmetros ambientais em microcosmos com concentrações mínimas de
fosfato; um exemplo da adaptação da espécie em condições de baixa trofia.
Já o recente trabalho de Worden et al. (2006) aborda a importância da regulação
trófica sobre as populações dessa bactéria. A predação por protistas presentes na água
6
do mar contrabalanceou o crescimento das bactérias em experimentos de microcosmos.

Os resultados obtidos indicam que a cadeia alimentar possui papel importante na
regulação de patógenos na água do mar e que deve ser considerada em modelos de
predição.
Resultados desses diversos artigos, obtidos tanto no meio ambiente quanto em
microcosmos, levam a afirmação de que Vibrio cholerae sobrevive por vários dias e até
semanas em ambientes estuarinos e costeiros, caso a temperatura seja igual ou superior
a 10ºC e na presença de concentrações relativamente baixas de nutrientes. Outras
espécies de Vibrio, como V. mimicus, V. parahaemolyticus e V. vulnificus também
parecem estar adaptadas a condições estuarinas (Colwell et al., 1977; Oliver et al.,
1982; Marco-Noales et al., 1999). Por fim, conclui-se que o ambiente costeiro,
principalmente o estuarino, é um potencial reservatório natural de víbrios patogênicos,
os quais podem estar associados a diversos compartimentos do ecossistema como o
zooplâncton.
1.2) Estados metabólicos bacterianos: viabilidade, dormência e cultivo
As bactérias se adaptam de maneira dinâmica às mudanças ambientais como

alterações na radiação, temperatura, pH, salinidade e concentrações de nutrientes,
utilizando ampla variedade de mecanismos genéticos e fisiológicos. Um desses
mecanismos é denominado de estado viável, mas não cultivável (VNC, “viable but non-
culturable”) no qual as bactérias reduzem drasticamente seu volume celular e adquirem
uma forma cocóide. O fenômeno VNC representa, além de tudo, um estado de
dormência, sobrevivência e persistência no meio ambiente e pode ainda representar uma
etapa antecessora a morte da célula. Nesta situação o método convencional de cultivo
em placas torna-se pouco adequado, sendo necessária utilização de técnicas de biologia
molecular para sua detecção (Colwell & Huq, 1994). Além disso, o método
convencional, segundo Bloomfield et al. (1998), não seria o mais adequado para a
detecção de víbrios, em relação aos métodos de imunofluorescência direta ou de reação
em cadeia da polimerase (PCR), porque o meio de cultura enriquecido pode ser
estressante para as bactérias adaptadas às baixas concentrações de nutrientes no
ambiente natural.
7
As células que não podiam ser cultivadas eram geralmente tidas como mortas,
porém técnicas de microscopia de imunofluorescência revelaram que células no estado
VNC continuam viáveis por meses e até anos (Mai et al. 1990).
Bactérias geralmente são encontradas no estado VNC quando associadas a
organismos vivos do zooplâncton. Signoretto et al. (2005) demonstraram que a adesão
de Enteroccocus faecalis em copépodes acelera a entrada das células no estado não
cultivável. Bactérias nesse estado ainda podem ser detectadas por métodos de
imunofluorescência, pois as estruturas celulares responsáveis pela adesão são mantidas
(lipopolissacarídeos, proteínas e outras moléculas na parede celular) (Chaiyanan et al.,
2001; Chaiyanan, 2002). Por outro lado, Huq et al. (1983) sugeriram que Vibrio
cholerae mantém a viabilidade e é capaz de se multiplicar na superfície de copépodes.
A viabilidade de Vibrio cholerae depende também de fatores bióticos como o
antagonismo. Uma diversidade de bactérias isoladas de partículas pelágicas apresentou
freqüência de inibição de V. cholerae mais alta do que bactérias livres isoladas da água
do mar (Long, et al.; 2005). Existe ainda um relaxamento da atividade inibitória com o
aumento da temperatura da água (de 20 a 30ºC), favorecendo a colonização de
partículas por V. cholerae nos períodos mais quentes.
Tentativas de correlacionar variáveis ambientais e biológicas com a presença de
Vibrio cholerae e suas influências na passagem da bactéria do estado viável cultivável
para o não cultivável têm sido publicadas (Xu et al., 1982; Miller et al. 1984; Ravel et
al. 1995; Gauthier, 2000; Louis et al. 2003; Long et al., 2005; Huq et al. 2005; Alam et
al., 2006 a e b; Gonzáles-Escalona et al., 2006).
A Figura 1 sintetiza os vários parâmetros bióticos e abióticos que influenciam a
passagem do estado viável não cultivável (VNC) para o viável cultivável (VC) e vice-
versa.
8
VC VNC
Radiação
Salinidade
pH
Temperatura
Antagonismo bacteriano
[Plâncton]
[Nutrientes]
Quitina
Epitélio
Intestinal
Figura 1: Síntese de variáveis que atuam no estado metabólico de

Vibrio cholerae. A bactéria passa do estado VNC para VC quando
associada ao epitélio intestinal de mamíferos. O copépode representa o
zooplâncton vivo, que pode induzir o estado VNC durante a adesão. A
seta é bidirecional porque copépodes podem adquirir as bactérias do
meio e funcionar como um “hotspot”de produção microbiana. A seta
entre copépode e epitélio faz referência a ingestão acidental.
A
bactéria geralmente se apresenta no estado VNC quando associada à superfície externa
de crustáceos planctônicos, mas passa para o estado viável no intestino humano
(Colwell et al., 1996). Esse fato, associado às mais altas concentrações de víbrios nos
copépodes do que na coluna de água, faz com que a ingestão acidental desses
microcrustáceos seja provavelmente responsável pela manifestação da cólera. Huq &
Colwell (1996) sugeriram fortemente que a ingestão de copépodes presentes em corpos
de água doce de Bangladesh é responsável por desencadear surtos ou epidemias de
cólera naquela região. A hipótese é reforçada, pois a partir da utilização do sari (tecido
comum na Índia e países vizinhos) para filtração da água de uso doméstico visando a
remoção de grande parte do plâncton, diminuiu a incidência dos casos de cólera (Huq et
al., 1996).
A descoberta de uma proteína mediadora da associação da bactéria, a qual se liga
a um açúcar presente tanto em células epiteliais do zooplâncton quanto do intestino
humano reforça a hipótese da ingestão de zooplâncton como causa do surgimento de
epidemias (Kirn et al., 2005).
9
Sabe-se também que a quitina estimula a transformação natural (ou competência

bacteriana) em Vibrio cholerae (Meilbom et al., 2005), um mecanismo que favorece a
adaptação da bactéria em diferentes ambientes, como o marinho, em associação a
biofilmes, animais bentônicos e planctônicos ou no trato digestório de mamíferos. A
associação com quitina ainda aumenta a resistência bacteriana a sais de cloro e alumínio
(Chowdhury et al., 1997). A adesão da bactéria ao zooplâncton pode ser classificada
como comensalista, pois favorece o microorganismo e aparentemente não prejudica
seus hospedeiros crustáceos.
Quanto à associação dos víbrios com o plâncton marinho no Brasil os únicos
trabalhos são o de Rubin (2000), ANVISA (2002), Gonçalves et al. (2004 a e b) e Souza
(2007), os quais encontraram os sorogrupos O1 e O139 associados aos copépodes em
diversos portos e amostras de água de lastro, em um estuário no Maranhão e na região
de São Sebastião.
1.3) Vibrio cholerae: identificação e genômica.
O reconhecimento de Vibrio cholerae é baseado no antígeno somático LPS O

(porção terminal O do lipopolissacarídeo) da parede celular. Já foram identificados 206
sorogrupos (Rivera et al., 2003) sendo apenas dois deles, O1 e O139, causadores da
cólera epidêmica. A presença desse polissacarídeo não é o único fator que determina a
patogenicidade das cepas de V. cholerae É essencial para as cepas causadoras da cólera
portarem dois elementos genéticos em seu DNA, os quais são responsáveis pela síntese
de diversos fatores associados a virulência. São eles: VPI (“Vibrio Pathogenicity
Island”) ou ilha de patogenicidade e o CTX (“Cholera toxin factor”) ou “cassete de
virulência” (Karaolis et al., 1998). Também existe um terceiro elemento genético, um
agrupamento denominado RTX (“repeat in toxin”) (Lin et al., 1999).
O VPI corresponde a uma região do genoma de um vírus (o vibriófago VPI Φ)
com 40 Kb, abrigando os genes tcp, acf (codificam um pilus que funciona como fator
acessório de colonização), toxT e tcpPH (codificam proteínas que atuam na regulação de
virulência); int e orf1 (codificam fatores que conferem mobilidade). Já o CTX é um
segmento de 7,0 a 9,7 Kb, presente no genoma do vibriófago CTX Φ e que abriga os
genes ctxAB (codifica a toxina colérica), zot, ace, cep e orfU, os quais codificam
toxinas acessórias (Karaolis et al., 1998).
10
O terceiro agrupamento, o RTX, contém apenas quatro genes e codifica

citotoxinas. A atividade citotóxica conferida por esse elemento foi encontrada nos
sorogrupos O1 biótipo El Tor e O139, os quais são emergentes comparados ao
sorogrupo O1 do biótipo clássico. Esse fato indica que o RTX deve ter fornecido uma
vantagem seletiva, durante o período de emergência desses novos grupos patogênicos
(Lin et al., 1999).
Os principais fatores associados à virulência são a toxina colérica (CF) e um
importante fator de colonização, o pilus do tipo IV (TCP). Outros fatores que conferem
a virulência são a toxina zona ocludens (ZOT), toxina colérica acessória (ACE),
enterotoxina termoestável (ST), toxina “Shiga-like” (SLT) entre outros (Tabela 1).
Tabela 1: Variedade de fatores descritos que conferem virulência para

Vibrio cholerae.
Nome/Tipo do fator Autores
Toxina colérica (CT) Mekalanos, 1985
Pilus (TCP) Taylor et al., 1987
Zonula occludens (ZOT) Fasano et al., 1991
Toxina colérica acessória (ACE) Trucksis et al., 1993
Enterotoxina termoestável (ST) Arita et al., 1986
"Shiga-like toxin" O'brien et al., 1984
Hemolisina Gallut, 1974
Hemaglutininas Datta roy et al., 1986
Proteínas de membrana externa Sperandio et al., 1996
Neuraminidase Holmgren et al., 1975
Além dos grupos O1 e O139, outros podem provocar casos esporádicos e

pequenos surtos de diarréia e outras enfermidades extra-intestinais (Morris et al., 1994,
1990; Dhar et al., 1989; Dumler et al., 1989 e Pitrak & Gindorf, 1989). Esses outros
sorogrupos também podem causar enfermidades por possuírem fatores de virulência e
maquinaria genômica incompletas, como, por exemplo, possuir apenas VPI ou CTX.
Sabe-se que o fator CTX é transferido entre as bactérias através do bacteriófago
CTX Φ (Waldor & Mekalanos, 1996), o qual necessita de um sítio receptor na bactéria,
o TCP (“Toxin Corregulated Pilus”). Da mesma forma, o TCP pode ser adquirido por
transmissão horizontal dos genes do fago VPI Φ para os víbrios (Karaolis et al., 1998).
Cepas ambientais não patogênicas podem tornar-se patogênicas e até epidêmicas
se adquirirem os conjuntos de genes de virulência. A dispersão de ambos os fagos num
ambiente o torna um reservatório dos genes que conferem patogenicidade e um risco
11
eminente do surgimento de bactérias patogênicas (Waldor & Mekalanos, 1996 e

Faruque & Mekalanos, 2003).
A importância das hemaglutininas já havia sido investigada quanto à sua
virulência (e.g. Datta-Roy et al., 1986), entretanto a importância dessas moléculas na
adesão da bactéria foi estuda posteriormente. Finkesltein et al. (1992) concluíram que a
virulência persistiu na ausência de hemaglutininas, mas que as mesmas são importantes
durante a adesão e dissociação das bactérias com células do epitélio intestinal. Outro
fator importante associado à virulência e persistência dos sorogrupos de Vibrio cholerae
no ambiente é a produção de um pilus de superfície. Os grupos O1 biótipo El Tor e
O139 sintetizam a hemaglutinina manose-sensitiva (MSHA), um pilus que contribui
com a adesão da bactéria ao zooplâncton. Chiavelli et al. (2001) concluíram que a
síntese de MSHA é fundamental na adesão do sorogrupo O139, afeta parcialmente o O1
biótipo El Tor e não afeta o grupo O1 biótipo clássico, havendo portanto mais fatores de
aderência importantes nos diversos sorogrupos.
A competência microbiana, mecanismo pela qual algumas espécies bacterianas
conseguem adquirir material genético por transformação natural, isto é, transportar
ADN do meio aquático para dentro da célula e incorporá-lo, foi encontrado em Vibrio
cholerae (Meilbom, et al., 2005). Tal descoberta pode explicar a grande diversidade
genética de Vibrio spp. no bacterioplâncton de regiões costeiras (Thompson et al.,
2005).
Além disso, o trabalho de Meilbom et al. (2005) elucida que a ausência de
nutrientes, populações muito grandes da bactéria (gerando competição intraespecífica) e
a quitina são os fatores que desencadeiam a competência microbiana em Vibrio
cholerae, justificando ainda mais a importância de se explorar a interação dessa bactéria
com crustáceos e outros organismos que produzem quitina.
1.4) A Cólera e sua epidemiologia no mundo e no Brasil.
A infecção intestinal por Vibrio cholerae resulta na perda de grande quantidade

de água através das fezes, levando a uma rápida e progressiva desidratação. A toxina
colérica estimula a secreção de fluidos ricos em sódio, bicarbonato e potássio, em
volumes muito superiores à capacidade de absorção do intestino (Sack et al., 2004),
levando à óbito 1,72% dos casos (WHO, 2006).
12
A Índia é a região onde a cólera tem sido endêmica por vários séculos, até sua
disseminação a partir de 1817, durante a primeira pandemia da doença. Em 1961,
iniciou-se a sétima pandemia, a partir da Indonésia e se espalhando para os continentes
asiáticos, africano, europeu e americano. Essa epidemia de cólera atingiu a América do
Sul apenas em 1991 pelo Peru mas rapidamente se disseminou para a maioria dos países
do subcontinente (Tauxe et al. 1994).
As atuais áreas de endemismo da cólera são o subcontinente indiano e vários
países da África e América latina (Colwell, 1996; PAHO, 2004). A incidência da cólera
é maior nos países em desenvolvimento devido a falta de saneamento básico e
temperatura da água mais elevada, favorecendo o crescimento das populações de
víbrios.
No Brasil, a cólera já esteve presente desde as primeiras pandemias, como a
terceira em 1853, a quarta em 1866 e a quinta em 1868 (Tauxe et al. 1994), sendo que a
sétima ocorreu a partir de 1991. A sexta pandemia, entre 1899 e 1923, não atingiu o
continente americano (PAHO, 1991). No Estado de São Paulo surgiram os primeiros
casos autóctones de cólera em 1993 (CETESB, 1997). Embora sejam poucas as vítimas
levadas a óbito nas regiões sul e sudeste, um foco da doença surgiu em Paranaguá (PR)
no ano de 1999, resultando em 466 ocorrências e 3 óbitos (Passos, 1999). Casos mais
antigos também foram documentados, como a incidência de um surto em Teixeira de
Freitas em 1974 no sul da Bahia (Hofer, 1987).
O continente americano apresentou cerca de 1,2 milhões de casos de cólera de
1991 a 2004 durante a sétima pandemia e aproximadamente 12 mil mortes (OPAS,
2007), fato que demonstra o risco de mortalidade durante surtos epidêmicos.
Em 1993 foi sugerido o início da suposta oitava pandemia de cólera, através do
isolamento de um novo sorogrupo, denominado O139 ou “Bengal”. A bactéria isolada
inicialmente na baía de Bengal provocou uma epidemia de cólera na Índia e Bangladesh
(Ramamurthy et al., 1993; Swerdlow & Ries, 1993). Sack et al. (2004) descartaram a
hipótese de uma nova pandemia, visto que a cólera estava restrita a uma região,
comportando-se como uma epidemia.
McCarthy & Kambathy (1994) verificaram que a água de lastro é um importante
vetor na disseminação de sorogrupos toxigênicos e endêmicos de Vibrio cholerae. O
sorogrupo O1 foi detectado em navios atracados no porto de Mobile, Alabama (E.U.A.)
e a água de lastro coletada procedeu de países como Brasil, Colômbia, Chile e Porto
Rico. Cepas endêmicas da América Latina foram identificadas nessas amostras.
13
Segundo a IMO (International Maritime Organization), bioinvasões são

consideradas como um dos quatro maiores impactos ambientais no meio marinho.
Devido às proporções enormes que o comércio mundial marítimo desenvolveu no
século XX, a água de lastro passou a ser o principal vetor de transporte de espécies no
ambiente aquático, não havendo equivalentes para o meio terrestre (Carlton & Geller,
1993).
Água de lastro também é considerada um mecanismo responsável pela
transferência de microrganismos patogênicos para o homem e animais, contribuindo
para a disseminação de doenças de veiculação hídrica (Ruiz et al., 2000). A
probabilidade é maior em países em desenvolvimento, onde é comum o despejo de
esgoto urbano sem tratamento em águas costeiras (Rivera & Martins, 1996). Este vetor
de transporte já é considerado responsável pela introdução de espécies desde o início do
século XX (Ostenfeld, 1908).
É comum a ocorrência de grande quantidade de organismos mortos na água de
lastro, pois muitos não sobrevivem à viagem (Lavoie et al., 1999; Gollasch et al., 2000).
A maioria dos táxons sofreu acentuado declínio em sua densidade, com algumas
exceções como copépodes, diatomáceas e dinoflagelados em determinadas viagens. Os
dois primeiros grupos possuem quitina em suas composições, servindo como
reservatório para Vibrio cholerae durante a viagem.
Os organismos mortos, principalmente os copépodes, também servem de
substrato para a fixação dos víbrios, o que poderia acarretar uma maior concentração da
bactéria diluída na água e agregadas a partículas de quitina no momento final da
viagem. Durante o deslastre desse material em portos receptores, poderá ocorrer a
disseminação de cepas não endêmicas (McCarthy & Kambathy, 1994) e possível
manifestação da cólera em populações costeiras, gerando epidemias.
A região do complexo estuarino de Santos recebe grande aporte de nutrientes de
origem continental, além de água de lastro, esgotos, efluentes domésticos e industriais,
potenciais vetores de introdução de cepas toxigênicas de Vibrio no ambiente, tornando-
se uma área de possível surgimento de surtos de cólera. Segundo Souza (2007), a alta
diversidade genética obtida de cepas isoladas de amostras de água de lastro reflete a
diversidade de origens do lastro que deságua sobre o porto. A alta diversidade de
bactérias que é introduzida na região confere o risco de introdução tanto de cepas
patogênicas quanto de fatores de virulência. A presença de cepas de áreas portuárias
14
similares às cepas de origem clínica de V. cholerae O1 toxigênicas confirmam que

cepas ambientais podem adquirir genes responsáveis pelo potencial epidêmico.
Variações globais de larga escala também influenciam o número de casos de
cólera. Eventos como o El Niño foram positivamente correlacionados com o aumento
da cólera (Lipp et al., 2002). Isso ocorre provavelmente devido ao aumento da
temperatura das águas costeiras durante a duração do evento climático.
Concomitantemente, índices pluviométricos também são maiores para algumas regiões
do globo durante o El Niño, aumentando o aporte de nutrientes e bactérias transportadas
pela água da chuva. Para o ambiente marinho, além desses aportes, a redução da
salinidade também favorece o desenvolvimento de Vibrio cholerae (Colwell, 1996).
1.5) Finalidade da pesquisa de Vibrio cholerae associada ao zooplâncton

e a escolha da região de estudo.
A caracterização da associação de Vibrio cholerae com o zooplâncton é

importante para entender as interações ecológicas entre o zooplâncton e o
bacterioplâncton no ambiente marinho. Após a descoberta de que esses víbrios são
autóctones do ambiente aquático, pesquisas sobre a ecologia, dispersão e estado
metabólico dessas bactérias foram impulsionadas.
Muitos estudos também foram direcionados a ecologia do bacterioplâncton e a
dinâmica das bactérias na colonização-dissociação à substratos quitinosos e neve
marinha. A associação de víbrios com copépodes também vem sendo detalhada em
nível ecofisiológico. A determinação das espécies do zooplâncton que atuem como
vetores da cólera, especialmente dos sorogrupos patogênicos, é importante devido às
suas implicações na saúde pública, como modelos de predição das bactérias no
ambiente aquático e o risco de surgimentos de novas endemias.
A Baixada Santista já foi objeto de pesquisas de Vibrio cholerae desde 1974,
com o monitoramento realizado pela CETESB, em colaboração com a Universidade de
São Paulo (Martins et al., 1991). Vibrio cholerae O1 foi isolada em Santos 4 vezes, e
uma vez em Bertioga, entre 1978 e 1983, através do método convencional de cultivo em
placas. As cepas não foram toxigênicas e a região não tinha relatos de cólera naquela
época.
O estudo recente de Souza (2007) verificou a presença de cepas toxigênicas de
Vibrio cholerae, tanto em amostras de água e zooplâncton de lastro quanto amostras
15
coletadas na região portuária de Santos, ressaltando a importância de monitorar a

qualidade microbiológica dos ambientes aquáticos da Baixada Santista.
A área também carece de estudos sobre a ecologia do zooplâncton, sendo que
poucos trabalhos foram realizados nesta porção central do litoral do estado de São Paulo
(Moreira, 1969; Alvarez, 1976; Sinque, 1976 e Rocha, 1982 e 1983). Esses trabalhos
tratam de grupos específicos, ou migração vertical do plâncton, carecendo para a região
estudos que abordem a ecologia geral da comunidade zooplanctônica (apenas os
trabalhos de Carvalho, na década de 40 e 50, sobre a comunidade de copépodes).
Trabalhos que dizem respeito a patógenos associados ao plâncton para a área também
são escassos (Souza, 2007; ANVISA, 2002).
2) OBJETIVOS
2.1) Objetivo Principal
O principal objetivo do projeto é verificar a prevalência e seletividade de Vibrio

cholerae O1 e O139 associada aos diversos grupos de metazoários planctônicos
marinhos no complexo estuarino de Santos-Bertioga e na plataforma continental
adjacente.
2.2) Objetivos Específicos
• Analisar a presença de Vibrio cholerae O1 e O139 nas amostras de zooplâncton

no complexo estuarino de Santos-Bertioga e plataforma adjacente e verificar se
há influência da composição e da abundância do zooplâncton na detecção das
bactérias.
• Verificar se existe seletividade na adesão dos sorogrupos O1 e O139 de Vibrio
cholerae sobre táxons zooplanctônicos dominantes, nas amostras de zooplâncton
total positivas para essas bactérias.
• Verificar a presença de bactérias viáveis e não-viáveis em organismos
zooplanctônicos vivos.
• Correlacionar a presença dos sorogrupos toxigênicos com parâmetros ecológicos
da comunidade zooplanctônica e as características físico-químicas da água.
16
3) CARACTERIZAÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO
O complexo estuarino de Santos está localizado na Baixada Santista (23º40’S -

24º10’S e 46º05’W - 46º30’W), englobando as baías de Santos e São Vicente, no setor
central do litoral de São Paulo. A região apresenta uma série de núcleos urbanos
independentes que constituem uma região metropolitana, englobando os municípios de
Santos, São Vicente e Cubatão (Figura 2). As cidades de Praia Grande, Guarujá,
Bertioga, Mongaguá, Itanhaém e Peruíbe também estão relacionadas à Baixada e à
região metropolitana, devido à sua constituição hidrográfica (Tommasi, 1979).
Figura 2: A Baixada Santista. A imagem foi obtida através da composição de fotos de satélite
(Landsat), obtidas no site da EMBRAPA e evidencia a aglomeração de núcleos urbanos em
torno da baía e canal de Santos.
A posição geográfica da Baixada, entre o oceano e as escarpas da Serra do Mar,

desempenha papel fundamental no condicionamento de suas características climáticas.
A área é afetada pela atuação de três massas de ar: subtropical, polar e equatorial
continental. A massa equatorial tem ação máxima durante o verão, enquanto que a
subtropical e a polar atuam com maior intensidade no restante do ano (CETESB, 1985).
17
Estando próxima ao Trópico de Capricórnio, e sendo banhada pelas águas do

Oceano Atlântico, a Baixada Santista apresenta “clima litorâneo” quente e úmido,
sujeito à ampla oscilação térmica, sob ação direta do sistema de brisas e sem estação
seca definida. Fevereiro é considerado o mês mais quente, com média de 25,3º C e julho
o mês mais frio, com média de 18,2º C, ficando a temperatura média anual em 22º C. Os
períodos de transição são extremamente curtos e praticamente inexistem estações de
primavera e outono climatologiamente delimitadas nesta região (Santos, 1965).
O sistema estuarino de Santos possui diversos tipos de transição, porém um fluxo
unidirecional resultante de correntes fluviais canalizadas pelo canal de Santos pode ser
assinalado. A circulação na baía de Santos e áreas adjacentes é bastante complexa, com
contribuições de marés, ventos e do campo de densidade (Harari & Camargo, 1995;
Harari et al., 1999). Águas oriundas da plataforma continental, através da corrente de
deriva litorânea, entram na baía pela face oeste, enquanto que águas mais salobras
provenientes do estuário de Santos entram pela face leste. Ainda segundo Harari et al.
(1999), as correntes de superfície invadem o canal de Santos, atingindo a região do
porto e perdendo suas influências apenas no interior do estuário. A maré é semi-diurna,
com amplitude entre -0.2 e 2.3 metros para o período de 2007 (INPE, 2007).
Já a plataforma adjacente, denominada Plataforma Continental Sudeste do Brasil,
abriga as massas de Água Costeira, Água Tropical e Água Central do Atlântico Sul
(ACAS). A Água Costeira ocupa a região mais interna da plataforma e é resultante da
mistura da descarga continental de água doce, o que resulta nos menores valores de
salinidade da área. É a massa de água de maior influência na região e possui teores
relativamente altos de nutrientes como silicato, nitrato e fosfato (Braga & Niencheski,
2006).
A Água Tropical, situada externamente à Água Costeira e nas camadas
superficiais apresenta valores altos de temperatura (>20ºC), salinidade (>36) e baixas
concentrações de nutrientes ao longo do sudeste brasileiro. A Água Central do Atlântico
Sul situa-se nas camadas inferiores e é mais expressiva durante o verão. A temperatura e
salinidade são mais baixas, além da concentração de nutrientes ser mais alta,
ocasionando em aumentos sazonais da produtividade do ecossistema, quando ocorre a
ressurgência dessa massa de água (Castro et al., 2006; Braga & Niencheski, 2006).
A cidade de Santos adquiriu importância no cenário nacional a partir de meados
do século XIX, com a implantação da ferrovia Santos-Jundiaí, que transportava
diretamente as zonas produtoras paulistas do café ao porto, produto que impulsionou a
18
economia do país naquela época. Em um intervalo relativamente curto, Santos se

transformou de uma vila comercial para um grande centro receptor e distribuidor de
riquezas. A enorme expansão ocorrida no século passado deu-se também pela cultura de
casas de veraneio e a abertura das rodovias Anchieta nos anos 40 e Imigrantes nos anos
70 (CETESB, 2002).
A região metropolitana da Baixada Santista é habitada por 1.637.565 residentes e
a cidade de Santos atualmente abriga 418 mil habitantes permanentes, número que se
eleva durante o Verão para cerca de 500 mil habitantes (prefeitura de Santos e IBGE,
2006), devido ao seu potencial turístico e proximidade a cidade de São Paulo. Grande
aporte de nutrientes e patógenos via esgoto chega ao estuário, mesmo havendo estações
de tratamento de esgoto e um emissário submarino.
O estudo desta região é importante por suas características sócio-culturais e por
sua história ambiental como pólo turístico e industrial. O mal uso do solo, ocupação
irregular do meio e o estabelecimento do parque industrial de Cubatão, levaram a um
acelerado processo de degradação do ambiente. A intensa urbanização associada às
atividades turísticas, à cultura da segunda moradia e a ampliação do porto de Santos
com desmatamento de extensos trechos de manguezal, colaboraram também na
composição dos fatores determinantes, que levaram a região à uma situação de estresse
ambiental extremamente crítica em décadas anteriores (Tommasi, 1979).
O emissário de Santos possui apenas 4 quilômetros de extensão, despejando seu
conteúdo ainda dentro da baía. É responsável pela contaminação da região despejando
alta carga de nutrientes, surfactantes e metais pesados (Abessa et al., 2005). O emissário
de Guarujá atende apenas parte da Ilha de Santo Amaro. Municípios adjacentes como
Peruíbe e Bertioga não possuem tal sistema de tratamento. Outra fonte de contaminação
são as ligações clandestinas de esgoto por toda a Baixada Santista.
A baía de Santos ainda recebe grande aporte de nutrientes através dos canais de
São Vicente e de Santos. O canal de Santos também é responsável pela dispersão de
metais pesados para o sedimento adjacente ao canal até a Ilha da Moela, devido ao
transporte executado pelas embarcações que fazem a dragagem do canal (Argentino-
Santos, 2006).
19
4) MATERIAL E MÉTODOS
4.1) Seleção das estações de coleta
As estações de coleta no complexo estuarino foram selecionadas em regiões de

intensa atividade antropogênica (baía e canal de Santos) e uma área relativamente livre
da ação direta de populações humanas, o canal de Bertioga. Coletas mensais foram
realizadas durante os meses de julho a dezembro de 2005, exceto pelo mês de setembro,
sendo que no mês de junho uma coleta de padronização foi realizada nas estações 1 a 6.
Os pontos de coletas são provenientes do projeto temático ECOSAN (A influência do
complexo estuarino da Baixada Santista sobre o ecossistema de plataforma continental
adjacente), financiado pela FAPESP/PRONEX.
Os pontos de coleta das saídas mensais seguem conforme a Figura 3. Para os
meses de setembro de 2005 e março de 2006 (cruzeiros de inverno e de verão do projeto
ECOSAN, respectivamente), as estações amostradas sobre a plataforma estão plotadas
nas Figuras 4 e 5. A amostragem na plataforma continental adjacente foi realizada com
o objetivo de comparar a incidência de víbrios sobre o zooplâncton entre águas com
características neríticas e estuarinas e verificar a existência de um padrão ou gradiente
de dispersão da presença da bactéria no zooplâncton para a região.
20
Rio Ipapanhaú
Julho a Dezembro de 2005

8 7
9
10
11
12 -23.9 S
I. de São Vicente
Ilha de Sto Amaro
Santos 6
2 4 5
-24.0
1 3
-24.1
-46.5 W -46.4 -46.3 -46.2 -46.1
0Km 5Km 10Km
Figura 3: Mapa do complexo estuarino Santos-Bertioga com os

pontos amostrados durante junho a dezembro de 2005, com
exceção do mês de setembro.
23.5º S
INVERNO
São Sebastião
Bertioga
Santos
17
30 m
18
Praia Grande 24º
11 16
Peruíbe 10
3 9 12
8
1
7 15
14
4
6 24.5º
5
25º
47º W 46.5º 46º 45.5º
0Km 20Km 40Km 60Km 80Km 100Km
Figura 4: Mapa com as estações de coleta sobre a plataforma

continental adjacente à Baixada Santista, durante o cruzeiro de
inverno (19 a 24 de setembro de 2005).
21
VERÃO
Santos
Bertioga
Praia Grande 24º S

11
10
2 3 9 12
8
13
7
14
4
6 24.5º
5
30 m
25º
19
47º W 46.5º 46º 45.5º 45º
Figura 5: Mapa com as estações de coleta sobre a plataforma continental

adjacente à Baixada Santista, durante o cruzeiro de verão (11 a 16 de
março de 2006).
22
4.2) Variáveis ambientais
4.2.1) Coleta de dados ambientais e zooplâncton
Em cada estação foram anotados os horários das coletas, posições geográficas

utilizando GPS (Sistema de Posicionamento Global), condições meteorológicas
(pressão, velocidade e direção do vento) e profundidade. Perfis verticais contínuos de
hidrografia, para a obtenção de dados físicos (temperatura e salinidade), foram
realizados a partir de um perfilador do tipo CTD (Conductivity, Temperature, Depth;
Falmouth Scientific Inc.) sustentado por cabo eletromecânico. Para o estuário, o
equipamento utilizado foi o micro-CTD MCTD 3.0 (Falmouth Scientific Inc.).
Os resultados obtidos pelo CTD foram trabalhados a fim de correlacionar a
presença de Vibrio cholerae O1 e O139 associada ao zooplâncton com parâmetros
ambientais no momento da coleta das amostras. As características físicas da água
estudadas foram a salinidade e a temperatura, fatores ambientais importantes para a
persistência de V. cholerae no ambiente aquático (Singleton et al., 1982 b; Xu et al.,
1982).
Partindo do pressuposto de que a rede Bongô perfila de maneira homogênea a
coluna de água, foi obtida a média, seguida pelo seu respectivo desvio padrão para a
temperatura e salinidade de cada estação amostrada. Os cálculos foram realizados
utilizando os valores obtidos desde a superfície até a profundidade máxima alcançada
pela rede (profundidade de coleta).
De julho a dezembro de 2005 (exceto para setembro e novembro), amostras de
zooplâncton foram coletadas com rede do tipo bongô de malha equivalente a 330 µm
em superfície e meia água (perfil diagonal), na baía de Santos e no canal de Bertioga.
Os arrastos foram oblíquos, da superfície até cerca de um a 4 metros do fundo. A
amostragem foi executada a bordo dos barcos de pesquisa Véliger II e Albacora, do
Instituto Oceanográfico. Durante o mês de novembro as coletas foram realizadas com
uma rede cilíndrico-cônica comum, de malha equivalente a 300 µm, em arrastos
horizontais. As campanhas na plataforma continental adjacente à Baixada Santista
ocorreram nos dias 22 a 24 de setembro de 2005 (cruzeiro de inverno) e entre os dias 14
e 16 de março de 2006 (cruzeiro de verão), a bordo do navio oceanográfico W. Besnard.
A amostragem também foi feita com a rede bongô (330 µm). Um fluxômetro (General
23
Oceanics) sempre esteve equipado junto às redes durante as campanhas de estuário e de

plataforma para determinação do volume de água filtrado. As amostras foram
armazenadas em formol P. A. (Synth) numa concentração final de 4%. O pH do formol
era previamente medido e ajustado com Tetraborato de Sódio (Synth) quando
necessário.
Durante os meses de janeiro a março de 2007, coletas de zooplâncton foram
realizadas na baía de Santos, nas estações 2, 3 e 4 para realização dos experimentos de
DVC-DFA. O material foi coletado através de uma rede cônico-cilíndrica, de 300 µm de
malha na subsuperfície, diluído em água do mar do local de coleta e armazenado em
garrafas estéreis de 3 litros em geladeira térmica até o retorno ao laboratório, onde os
grupos mais abundantes foram triados e utilizados nos experimentos.
4.2.2) Aquisição e análise de dados
Foram calculados valores médios de temperatura e salinidade para cada metro de

profundidade perfilado. A partir desses dados foi possível descrever perfis horizontais
desses parâmetros em diversas profundidades (5, 10, 15 e 20 metros).
A aquisição de dados do CTD e cálculo das médias foram realizados através do
programa FSI Post (Falmouth Scientific, Inc.). Para a elaboração dos perfis horizontais
de temperatura e salinidade na plataforma continental foi utilizado o programa Surfer,
versão 8.0 (Golden Software). Neste trabalho é utilizada a escala de salinidade prática,
segundo as recomendações da UNESCO (1985).
4.3) Determinação e enumeração dos táxons zooplanctônicos
Primeiramente as amostras foram divididas em duas partes, uma destinada para

os experimentos de detecção das bactérias e outra para identificação e contagem do
zooplâncton. A divisão foi realizada utilizando um quarteador do tipo Motoda
(Boltovskoy, 1981) de acrílico, previamente higienizado e a amostra destinada para o
estudo bacteriológico foi armazenada novamente no frasco de origem. A outra parte foi
fracionada para a contagem e identificação do zooplâncton.
Foram contadas frações de amostras de diversos tamanhos (1/8 a 1/1.024) para a
contagem e identificação do zooplâncton. Numa fração de amostra, um mínimo de 30
24
indivíduos de cada táxon dominante foi contado, totalizando no mínimo 300 animais.
Esse valor, estipulado por Frontier (1981), reduz a introdução de erros devido ao
tamanho da subamostra, delimitando um número mínimo de organismos que deve ser
contado para que o erro devido ao fracionamento da amostra não seja significativo.
Foram utilizados um estereomicroscópio (Olympus, modelo SD-ILK) para
realização da triagem e identificação, além de um microscópio (Olympus, modelo BX-
50) para auxiliar a identificação dos organismos. A determinação das espécies e grupos
taxonômicos do zooplâncton foi feita com base em literatura pertinente (Williamson,
1957; Boltovskoy, 1981, 1999; Huys et al., 1996; Boxshall & Halsey, 2004). Os
copépodes e cladóceros foram identificados ao nível de espécie ou gênero, enquanto que
os outros grupos geralmente foram identificados em categorias taxonômicas superiores
(e.g. Família, Ordem).
Foram analisadas as amostras das campanhas estuarinas, dos meses de julho,
agosto, outubro, novembro e dezembro (quantitativas), além das amostras coletadas na
plataforma continental, durante o inverno de 2005 e o verão de 2006.
4.4) Ensaio de imunofluorescência direta (DFA)
Para as análises de imunofluorescência foram utilizados os kits de análise por

DFA comercializados pela New Horizons Diagnostics Corp. (Columbia, MD, E.U.A.).
Os resultados foram obtidos rapidamente (cerca de duas horas após o preparo da
lâmina) e foram confiáveis, pois os anticorpos são monoclonais e específicos para a
cadeia O dos lipopolissacarídeos da membrana externa de V. cholerae, os quais
determinam a especificidade dos sorogrupos.
Os kits de DFA consistem em anticorpos específicos para os sorogrupos
toxigênicos O1 e O139 (Bengal) marcados com FITC (isotiocianato de fluoresceína). O
controle positivo é dado por Vibrio cholerae O1 ou O139 e o controle negativo por
outros sorogrupos não toxigênicos inativados em formaldeído (2%).
As amostras de plâncton foram homogeneizadas e alíquotas de 5 mL separadas
em frascos estéreis. Cada amostra foi filtrada e lavada sobre redes de 300 µm com
solução PBS 1% (“Phosphate buffered saline”, Solução tampão fosfato). O plâncton foi
transferido para um volume conhecido de solução PBS 1% com formol (2%) e
macerado em tubos de vidro esterilizados. Dependendo da densidade da amostra, a
mesma pode ter sido diluída novamente em igual volume de PBS.
25
Primeiramente foram adicionados 5 µL de macerado de uma amostra num poço

de lâmina (Figuras 6 e 7). A mesma foi incubada a 37ºC ou a temperatura ambiente até
a secagem das amostras. Adicionou-se 7 µL de etanol absoluto para fixação das
amostras a temperatura ambiente. Após essa etapa, as lâminas receberam 7 µL do
reagente DFA e foram incubadas a 37°C no escuro em câmara úmida, por cerca de 30
minutos. Posteriormente, as lâminas foram lavadas duas vezes em PBS 1% para
remover o excesso de material. Foi adicionada uma etapa extra na estufa a 37°C,
durante 5 a 10 minutos, para reduzir o volume nos poços e conseqüentemente o risco de
contaminação entre as amostras. Ainda no escuro, adicionou-se a cada poço da lâmina
uma pequena gota do meio fluorescente. Finalmente a lamínula foi lacrada sobre a
lâmina e a análise do resultado foi realizada em até 24 horas após a elaboração. Se a
amostra contivesse o sorogrupo em questão, o anticorpo se ligaria a ele e o resultado era
verificado em microscópio de epifluorescência através do brilho verde emitido a partir
da superfície das bactérias.
Controles positivos e negativos (Vibrio cholerae não-O1, não-O139) do “kit”
foram preparados juntamente com as amostras e observados no momento da análise das
mesmas. Os procedimentos técnicos foram seguidos de acordo com as instruções do
fabricante (Hasan et al., 1994; New Horizons Diagnostic corp., 1994 e 1995) com
algumas alterações nas quantidades de reagentes utilizados. A observação dos
resultados foi feita com o auxílio de um microscópio de imunofluorescência (Leica
DML, departamento de Microbiologia, instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo) com aumento de 1000 vezes. Vinte campos visuais foram
analisados, sendo a amostra positiva aquela em que pelo menos 5 campos contenham
víbrios. Esse número de campos foi escolhido para minimizar algum resultado “falso
positivo”, que pode ocorrer na fluorescência de pequenos aglomerados de conjugados
durante a elaboração das lâminas.
Testes preliminares também foram realizados com duas cepas ambientais de
Vibrio cholerae O1, denominadas de RC 24 e RC 26, isoladas do Peru em 1971 e do Irã
em 1991 respectivamente, fornecidas pelo laboratório de Microbiologia Ambiental, do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. As cepas foram
semeadas em caldo lúria por 24 horas, à temperatura ambiente, ressuspendidas e 10µL
foram utilizados para o ensaio. A forma alongada das bactérias e a formação de cadeias
foram facilmente visualizadas.
26
Figura 6: Lâmina e componentes do kit de DFA.
Figura 7: Exemplo de lâmina contendo amostras de plâncton.

Os espaços entre as amostras evitam que ocorra
contaminação durante a deposição da lamínula.
Confirmada a presença dos grupos O1 e/ou O139 numa amostra, um

determinado número de indivíduos de táxons selecionados foi macerado com um bastão
de vidro e testado isoladamente. Uma série de grupos zoológicos e espécies foram
utilizadas para o teste em amostras positivas, para verificar a presença das bactérias
nesses diversos grupos.
Durante os testes de padronização do protocolo, experimentos também foram
realizados para verificar a eficácia da lavagem das amostras. Para tal, a amostra de
zooplâncton foi filtrada através de uma malha de 300 µm esterilizada e lavada com
solução P.B.S. 1%. O material retido foi macerado na mesma solução e testado em
comparação com o zooplâncton que não passou pelo processo de lavagem. Em ambos
27
os casos as bactérias foram detectadas, porém a quantidade foi menor no material

lavado, tanto na quantidade de bactérias por campo quanto na quantidade de campos
onde as mesmas foram presentes. Portanto, essa etapa não remove totalmente as
bactérias associadas aos animais, mas reduz a quantidade de bactérias, possivelmente
associadas às outras frações do plâncton presentes na amostra total.
4.5) DVC-DFA (Contagem direta de bactérias viáveis, associada ao ensaio

de Imunofluorescência Direta)
A técnica foi utilizada como a descrita inicialmente por Brayton & Colwell
(1987) e, posteriormente, por Chowdhury et al. (1995) e Binsztein et al. (2004), com
pequenas modificações. O método consiste na utilização do ácido nalidíxico, um
inibidor da enzima DNA girase. O bloqueio dessa enzima impede a divisão celular, o
que torna as células alongadas, devido ao crescimento, quando as mesmas se encontram
viáveis e cultiváveis num meio de cultura.
O material coletado durante o verão de 2007 (janeiro, fevereiro e março) foi
triado ainda vivo sob estereomicroscópio. Foram selecionados indivíduos saudáveis,
que exibiam atividade natatória, livres de epibiontes visíveis ao estereomicroscópio e
íntegros. Cerca de 30 a 50 espécimes dos táxons dominantes foram lavados em solução
PBS 1% e macerados com um bastão de vidro previamente esterilizado em tubos de
ensaio contendo 2 ml da mesma solução. Do macerado, um mililitro foi adicionado a
um tubo de ensaio contendo 2 ml de um meio de cultura de extrato de levedura (Difco),
atingindo uma concentração final de 0,025% do extrato de levedura e de 0,002% de
ácido nalidíxico (Sigma).
Os tubos foram incubados à temperatura ambiente, durante cerca de 12 a 14
horas após a adição do macerado. Após esse período, os tubos foram homogeneizados e
uma alíquota de 15 µL foi utilizada para a confecção das lâminas. Duas cepas de Vibrio
cholerae O1 e duas de O139 foram previamente semeadas em meio APA (Água
Peptonada Alcalina) líquido, durante 24 horas, para serem utilizadas como controles
positivos. As cepas de referência RC 46 e RC 107 foram provenientes de amostras
clínicas do sorogrupo O 139, coletadas na Índia em 1993. Já as cepas RC 223 e RC 231
foram isoladas de esgoto em Bangladesh e pertencem ao sorogrupo O1. As cepas foram
cedidas pelo laboratório de Microbiologia Ambiental, do instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo.
28
4.6) Tratamento numérico e estatístico dos dados
4.6.1) Cálculo do volume de água filtrado
A fórmula a seguir foi utilizada para calcular a quantidade de metros cúbicos de

água amostrados pela rede:
V = Valor fluxômetro (final – inicial) x A x C
onde o Valor fluxômetro corresponde à diferença entre o valor final e inicial de rotações
dada pelo instrumento acoplado a rede, A representa a área da boca da rede e C o fator
de calibração do fluxômetro utilizado. A área da boca da rede bongô equivale a 0,2729
m² e o fator de calibração do fluxômetro utilizado para todas as coletas foi igual a
0,25325.
4.6.2) Cálculo da densidade de organismos zooplanctônicos e densidade

relativa
Para cada amostra de zooplâncton, foi subamostrada uma fração contendo acima
de 300 indivíduos. Cada subdivisão da amostra original introduz erros, pois a divisão
nunca é perfeita e a probabilidade de uma espécie rara ser contada numa fração é
sempre menor. Para reduzir a introdução de erros dessa natureza os táxons que
apresentaram menos de 10 indivíduos foram contados novamente numa fração maior de
amostra, para evitar que fossem estimados erroneamente (Frontier, 1981). A densidade
dos organismos (Do) foi calculada multiplicando o número de indivíduos contados (N)
pela fração da amostra analisada (fr) e posteriormente dividindo o valor pelo volume
filtrado (V).
Do = N x fr x V-1
A densidade relativa (Dr) dos grupos zooplanctônicos foi calculada dividindo a

densidade do grupo em questão pela densidade total do zooplâncton (Dt) numa dada
amostra. O resultado é dado em porcentagem:
29
Dr = Do x Dt-1 x 100
4.6.3) Freqüência de ocorrência
A freqüência de ocorrência do zooplâncton foi obtida através da fórmula:
Fo = To x Ta-1 x 100
Onde Fo corresponde a Freqüência de ocorrência, Ta ao total de amostras

analisadas e To às amostras onde há a ocorrência de determinado táxon. Os resultados
foram fornecidos em porcentagem. Os organismos foram classificados como
esporádicos (< de 10%), pouco freqüentes (de 10 a 40%), freqüentes (40 a 70%) e muito
freqüentes (acima de 70%).
4.6.4) Diversidade e Eqüitatividade do zooplâncton
O índice de diversidade específica de Shannon foi calculado através da fórmula:
H = Σ pi x log2pi
Onde pi = ni x N-1 (probabilidade de coleta da espécie i na população, estimada a

partir de sua freqüência relativa na amostra). Utilizando-se os logaritmos na base 2, o
valor do índice de diversidade é expresso em bit por indivíduo. Consideram-se valores
acima de 3 bits. ind.-1 altos, entre 1 e 3 moderados e menores que 1 baixos (Shannon,
1948).
A eqüitatividade (J) de Pielou (1977) foi calculada a partir do índice de Shannon

(H), através da fórmula:
J= H x (log S)-1
30
A letra S representa o número total de táxons identificados na amostra. Os

valores de eqüitatividade variam entre 0 e 1, sendo que valores acima de 0,5 são
considerados altos (as populações dos táxons são mais semelhantes entre si
numericamente, o que reflete numa menor dominância).
4.6.5) Análise Estatística
Todas as variáveis analisadas (salinidade, temperatura, densidade total do

zooplâncton, crustáceos totais e copépodes, diversidade, eqüitativade e densidade
relativa de crustáceos e copépodes) foram testadas quanto à normalidade dos dados.
Para as variáveis de distribuição normal, o teste t de Student foi aplicado para
verificar a relação entre as variáveis e a detecção de Vibrio cholerae O1 e O139. Para os
dados de distribuição diferente da normal foi utilizado o teste U (Mann-Whitney).
A análise de variância unifatorial (ANOVA unifatorial) foi aplicada para
comparar se a variabilidade dos dados foi significativa na detecção dos sorogrupos
estudados. As variáveis bióticas e abióticas foram tratadas como variáveis dependentes
e a presença dos sorogrupos O1 e O139 como fatores (variáveis independentes). As
análises foram feitas agrupando os resultados obtidos nos dois ambientes e de maneira
isolada. O complexo estuarino foi analisado separadamente entre as amostras da baía de
Santos, canal de Santos e canal de Bertioga. A plataforma foi divida entre as campanhas
de setembro de 2005 e março de 2006 e também em relação à profundidade da estação
de coleta em dois grupos, abaixo e acima de 30 metros.
As variáveis ambientais, temperatura e salinidade, foram submetidas a análises
de dissimilaridade. O cálculo foi efetuado através do método de aglomeração
hierárquica, com base nas medidas de distância euclidiana e a construção dos
dendrogramas foi feita através do método de ligação de Ward e de ligação completa. O
primeiro método foi escolhido por ser altamente eficaz na formação de grupos e o
segundo por gerar dendrogramas compactos (Valentin, 2000). Ambos os métodos são
consagrados na literatura por fornecerem resultados consistentes (Milligan & Cooper,
1987). Os dendrogramas permitem visualizar agrupamentos de amostras que tem
relações entre si, quanto as variáveis ambientais analisadas.
Foram utilizados os programas Statistica 7.0 (Statsoft Corporation) para cálculo
dos testes univariados e ANOVA. Planilhas, gráficos, tabelas e dendrogramas de
31
dissimilaridade foram confeccionados utilizando o programa Excel, MS Office 2.000

Premium (Microsoft) e o suplemento Xlstat 5.0.
32
5) RESULTADOS
5.1) Variáveis ambientais
Temperatura
As médias e desvios padrão dos valores de temperatura para as estações obtidas

no complexo estuarino são fornecidas para cada mês e ponto de coleta (Apêndice 9.1.1).
A temperatura média nas estações variou de 20,4 a 24,2°C, sendo que os valores mais
baixos foram registrados durante o mês de outubro e os mais altos durante dezembro. A
Figura 8 ilustra os valores médios obtidos por estação para os 5 meses de coleta.
Temperatura (°C)
23,5
23,0
22,5
22,0
21,5
21,0
20,5
20,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Baia Canal Bertioga
Estações
Figura 8: Valores médios de temperatura, seguidos pelos respectivos desvios

padrão, para as estações analisadas no complexo estuarino de Santos-
Bertioga.
As médias e desvios padrão dos valores de temperatura para as estações obtidas

na plataforma adjacente em ambas as campanhas são fornecidas em apêndice (9.1.2). Os
valores variaram entre 19,52 e 20,62°C, sendo o valor médio igual a 20,25 ± 0,12°C
durante a campanha de setembro de 2005. Para a campanha de março de 2006 esses
valores foram superiores, estando entre 20,06 a 27,54°C e a média igual a 23,91 ±
2,11°C. A variação de temperatura também foi maior para a segunda campanha (Figuras
9 e 10).
33
Temperatura (°C)
21,0
20,5
20,0
19,5
19,0
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18
Estações
Figura 9: Valores médios de temperatura (°C), seguidos pelos respectivos

desvios padrão, para as estações na plataforma adjacente durante a campanha
de setembro de 2005.
Temperatura (°C)
29
27
25
23
21
19
17
15
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 19
Estações
Figura 10: Valores médios de temperatura (°C), seguidos pelos respectivos

desvios-padrão, para as estações na plataforma adjacente durante a campanha
de março de 2006.
34
Perfis horizontais de temperatura para diferentes profundidades: 5, 10, 15 e 20

metros foram elaborados para melhor visualização da distribuição dos valores e
conseqüentemente da possível influência de massas de água ou estratificação para a área
durante as campanhas de inverno e verão (Apêndice 9.2 ).
Salinidade
As médias e desvios padrão dos valores de salinidade para as estações obtidas no

complexo estuarino são fornecidas para cada mês de coleta (Apêndice 9.3.1). Valores
médios variaram entre 21,8 e 34,6 , sendo que os mais altos foram obtidos para o mês de
julho e os mais baixos durante dezembro. As estações de 1 a 4 (baía de Santos)
apresentaram valores superiores aos encontrados nas estações amostradas no canal de
Santos e canal de Bertioga (Figura 11).
Salinidade
35
30
25
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Baia Canal Bertioga
Estações
Figura 11: Valores médios de salinidade, seguidos pelos respectivos desvios
padrão, para as estações analisadas no complexo estuarino de Santos-Bertioga.
As médias e desvios padrão dos valores de salinidade para as estações obtidas na

plataforma adjacente são fornecidas nas tabelas em apêndice (9.3.2). Também foram
elaborados perfis horizontais de salinidade, em diferentes profundidades (5, 10, 15 e
20m), para auxiliar na interpretação dos dados (Apêndice 9.4).
Em geral, a campanha de março de 2006 apresentou valores maiores de
salinidade, quando comparada com a campanha de setembro de 2005 (Figuras 12 e 13),
35
sendo que a média para a primeira foi de 35,18 ± 0,42, enquanto que para a segunda foi
de 32,23 ± 0,34.
Salinidade
35,0
34,5
34,0
33,5
33,0
32,5
32,0
31,5
31,0
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18
Estações
Figura 12: Valores médios de salinidade, seguidos pelos respectivos

desvios padrão, para a plataforma adjacente durante a campanha de
setembro de 2005.
Salinidade
36,5
36,0
35,5
35,0
34,5
34,0
33,5
33,0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 19
Estações
Figura 13: Valores médios de salinidade, seguidos pelos respectivos

desvios padrão, para a plataforma adjacente durante a campanha de março
de 2006.
36
5.2) Análise do zooplâncton
5.2.1) Determinação dos táxons zooplanctônicos
No presente trabalho foram determinados 139 táxons, 121 para a plataforma e

111 para o estuário. Foram identificados 51 táxons de copépodes para plataforma e 35
para o complexo estuarino. Para alguns copépodes, apenas o gênero foi determinado,
para facilitar a contagem nas amostras. Uma lista dos táxons identificados é fornecida,
com as respectivas freqüências de ocorrência nas amostras para o ambiente estuarino e
para a plataforma adjacente (Tabela 2).
5.2.2) Freqüência relativa dos organismos zooplanctônicos
A freqüência de ocorrência foi fornecida isoladamente para o complexo

estuarino e para a plataforma adjacente, por serem ecossistemas diferentes e
apresentarem características físicas e biológicas distintas.
Tabela 2: Freqüência de ocorrência dos organismos zooplanctônicos nas amostras para

ambos os ambientes (plataforma e estuário). * : Organismo subestimado, removido das
amostras no momento da coleta. **: Organismos que não foram identificados até o nível
representado para a plataforma; ***: Organismos não identificados até o nível
representado para o estuário. Plataforma n = 30; estuário n = 50.
Grupo zoológico Plataforma Estuário

Filo Granuloreticulosa
foraminíferos planctônicos 48% 8%
Filo Dinoflagellata
Noctiluca scintillans (Kofoid, 1920 ) 90% 78%
Filo Cnidaria
Superclasse Hydrozoa
Hidromedusas 94% 66%
Liriope tetraphylla (Chamisso & Eysenhardt, 1821) 13% 20%
Ordem Siphonophora
pneumatóforos e nectóforos 100% 10%
Superclasse Scyphozoa
Lychnorhiza lucerna Haeckel, 1880 6% 4%
Chrysaora lactea Eschscholtz, 1829 6% 4%
outras cifomedusas 3% 2%
Filo Ctenophora
Ordem Beroidea
Beroe sp Browne, 1756 3% 14%
Ordem Lobata
Mnemiopsis leyidi A. Agassiz, 1865 0 20% *
37
Tabela 2: Continuação.
Filo Platyhelmintes
Classe Turbellaria
Ordem Polycladida
não identificados 6% 4%
Filo Annelida
Classe Polychaeta
larvas da família Spionidae 19% ***
larvas não identificadas 90% 88%
Adultos Não Identificados 16% 8%
Filo Mollusca
Classe Gastropoda
véliger 90% 54%
Família Cavoliniidae 81% 0
Superfamília Heteropoda
Pterotrachea sp Förskal, 1775 3% 0
Classe Bivalvia
véliger 77% 60%
Classe Cephalopoda
paralarva 3% 4%
Filo Arthropoda
Classe Chelicerata
Ordem Acari
Ácaros 0 6%
Subfilo Hexapoda
Ordem Hemiptera
Subfamília Halobatinae Bianchi, 1896 0 4%
Subfilo Crustacea
Superordem Peracarida
Ordem Amphipoda
Subordem Hipperidea 81% 18%
Subordem Gammaridea 42% 70%
Subordem Caprellidea 0% 24%
Ordem Isopoda
Família Munidae Sars, 1899 6% 40%
Superfamília Epicaridea Latreille, 1831 0 48%
Ordem Mysidacea 42% 52%
Ordem Cumacea 10% 18%
Classe Malacostraca
Ordem Stomatopoda
antizoea 16% 8%
Ordem Euphausiacea
juvenis 6% 2%
Ordem Decapoda
larvas N. I. 55% 46%
Subordem Dendrobranchiata
Penaeoidea juvenis 16% 42%
Caridea juvenis 71% 98%
Periclimenes paivai Chace, 1969 6%
Sergestoidea juvenis 65% 42%
Lucifer faxoni Borradaile, 1915 71% 30%
L. faxoni juvenis 81% 40%
38
Tabela 2: Continuação
Subordem Pleocyemata
Infraordem Brachyura
Zoea 90% 100%
Megalopa 16% 66%
Infraordem Anomura
Porcelanidae Zoea 10% 84%
Paguroidea megalopa 6% 12%
Infraordem Thalassinidea
Zoeas 39% 70%
Classe Branchiopoda
Ordem Ctenopoda
Família Sididae Baird, 1850
Penilia avirostris (Dana, 1852) 94% 66%
Ordem Onychopoda
Família Podonidae Mordukhai-Boltovskoi, 1968
Pseudevadne tergestina (Claus, 1877) 100% 32%
Evadne spinifera (Muller, 1867) 10% 4%
Pleopis schmackeri (Poppe, 1889) 55% 12%
Classe Maxillopoda
Subclasse Copepoda
Ordem Calanoida
Copepoda náuplios 32% 32%
Copepoditos N. I. 3% 0
Família Calanidae (Dana, 1849)
Juvenis 23% 4%
Calanoides carinatus (Kröyer, 1849) 19% 2%
Nannocalanus minor (Claus, 1863) 65% 4%
Neocalanus gracilis (Dana, 1849) 3% 0
Undinula vulgaris (Dana, 1849) 10% 0
Família Paracalanidae Giesbrecht, 1892
Paracalanus spp. Boeck, 1865 94% 92%
Parvocalanus crassirostris Andronov, 1970 13% 40%
Família Calocalanidae (Bernard, 1958)
Acrocalanus sp Giesbrecht, 1888 26% 0
Calocalanus sp Giesbrecht, 1888 10% 0
Família Mecynoceridae Andronov, 1973
Mecynocera clausi Thompson, 1888 3% 0
Família Eucalanidae Giesbrecht, 1892
Subeucalanus pileatus (Giesbrecht, 1888) 90% 72%
S. pileatus juvenis 97% 84%
Paraeucalanus sewelli (Fleminger, 1973) 26% 6%
Família Rhincalanidae Geletin, 1976
Rhincalanus sp Dana, 1853 13% 0
Família Clausocalanidae Giesbrecht, 1892
Clausocalanus furcatus (Brady, 1883) 77% 10%
Ctenocalanus sp (Giesbrecht, 1888) 84% 20%
Família Aetideidae Giesbrecht, 1892
Aetidus acutus Farran, 1929 3% 0
Família Euchaetidae Giesbrecht, 1892
Euchaeta marina (Prestandrea, 1883) 23% 0
E. marina juvenis 45% 4%
39
Família Phaennidae Sars, 1902
Phaenna spinifera Claus, 1863 3% 0
Família Scolecitrichidae (Giesbrecht, 1892)
Scolecithrix danae (Lubbock, 1856) 10% 0
Família Augaptilidae Sars, 1905
Haloptilus sp Giesbrecht & Schmeil, 1898 3% 0
Família Heterorhabddidae Sars, 1902
Heterorhabdus sp Giesbrecht & Schmeil, 1898 3% 0
Família Metridinidae (Sars, 1902)
Pleuromamma sp juvenis Giesbrecht & Schmeil, 1898 3% 2%
Família Centropagidae Giesbrecht, 1892
Centropages velificatus de Oliveira, 1946 90% 66%
C. velificatus juvenis 39% 54%
Família Pseudodiaptomidae Sars, 1902
Pseudodiaptomus acutus (F. Dahl, 1894) 3% 84%
P. acutus juvenis 0 68%
P. richardi (F. Dahl, 1894) 0 14%
Família Temoridae Giesbrecht, 189)
Temora stylifera adultos (Dana, 1849) 100% 44%
T. stylifera juvenis 100% 42%
T. turbinata (Dana, 1849) 94% 98%
T. turbinata juvenis 90% 100%
Família Candaciidae Giesbrecht, 1892
Juvenis 16% 4%
Candacia pachydactyla (Dana, 1849) 13% 0
Família Pontellidae Dana, 1853
Labidocera fluviatilis F. Dahl, 1894 29% 58%
L. fluviatilis Juvenis 26% 76%
Pontella marplatensis (Ramírez, 1966) 3% 6%
P. marplatensis juvenis 0 8%
Calanopia americana F. Dahl, 1894 71% 10%
Pontellopsis brevis (Giesbrecht, 1889) 26% 4%
Pontellopsis villosa (Brady, 1883) 10% 2%
Família Acartidae Sars, 1903
Acartia danae Giesbrecht, 1889 23% 0
A. lilljeborgi Giesbrecht, 1889 55% 98%
A. lillijeborgi juvenis 10% 96%
A. tonsa Dana, 1849 0 100%
Ordem Harpacticoida Sars, 1903
Família Miraciidae Dana, 1846
Macrosetella gracilis (Dana, 1848) 13% 0
Família Euterpinidae Brian, 1921
Euterpina acutifrons (Dana, 1852) 10% 22%
Família Clytemnestridae Scott, 1909
Clytemnestra scutellata Dana, 1848 6% 0
Ordem Cyclopoida Burmeister, 1834
Família Oithonidae Dana, 1853
Oithona plumifera Baird, 1843 97% 60%
O. plumifera juvenis 19% 6%
Oithona spp. Baird, 1843 3% 20%
O. oswaldocruzi (Oliveira, 1945) 0 22%
O. hebes (Giesbrecht, 1891) 0 40%
40
Família Oncaeidae Giesbrecht, 1892
Oncaea venusta Philippi, 1843 84% 4%
O. mediterranea (Claus, 1863) 6% 0
Oncaea spp. Philippi, 1843 26% 2%
Triconia conifera (Giesbrecht, 1891) 29% 0
Família Corycaeidae (Dana, 1852)
Corycaeus speciosus (Dana, 1842) 65% 4%
Onychocorycaeus giesbrechti F. Dahl, 1894 97% 34%
Ditrichocorycaeus amazonicus F. Dahl, 1894 13% 18%
Corycaeus spp. Dana, 1846 16% 6%
Juvenis 13% **
Farranula gracilis (Dana, 1853) 3% 0
Família Sapphirinidae Thorell, 1859
Sapphirina sp Thompson, 1829 23% 0
Copilia miriabilis Dana, 1849 45% 0
Copilia quadrata (Dana, 1842) 6% 0
Família Clausidiidae Emblenton, 1901
Hemicyclops thalassius Vervoot & Ramirez, 1966 0 10%
Ordem Siphonostomatoida
Família Caligidae Burmeister, 1835 0 14%
Família Ergasilidae von Nordmann, 1832 0 2%
Ordem Monstriloida
Não Identificado 6% 6%
Subclasse Ostracoda
Ostrácodes 77% 14%
Infraclasse Cirripedia
náuplios 26% 90%
larva cypris 0 14%
Filo Echinodermata
larvas pluteus 39% 24%
Classe Asteroidea
larvas Bipinaria 16% 4%
Filo Chaetognatha
Família Sagittidae Claus & Grobben, 1905
Parasagitta spp. (Quoy & Gaimard, 1827) 97% 2%
P. tenuis (Conant, 1896) ** 94%
P. friderici (Ritter-Záhony, 1911) ** 18%
Flaccisagitta. enflata (Grassi, 1881) 97% 28%
Filo Ectoprocta
larvas cyphonauta 23% 30%
"Filo Hemichordata"
Classe Enteropneusta
larvas 13% 2%
Subfilo Urochordata
Classe Appendicularia
Família Oikopleuridae Lohmann, 1915
Oikopleura dioica Fol, 1827 94% 20%
Oikopleura longicauda (Vogt, 1854) 42% 4%
Oikopleura sp Mertens, 1831 19% 2%
Família Fritillaridae Seeliger, 1895
Fritillaria spp. Quoy & Gaimard, 1827 45% 0
41
Classe Thaliacea
Ordem Salpida
Thalia democratica (Förskal, 1775) 81% 12%
Ordem Doliolida 74% 6%
Classe Ascidiacea
larvas 0 12%
Subfilo Vertebrata
Classe Teleostei
larvas 58% 80%
Ovos 68% 66%
42
Calanoida
Brachyura
Decapoda: outros
Muito freqüente
Chaetognata
Cirripedia
Cyclopoida
Polychaeta
Anomura
Apendicularia
Pisces larvas
Noctiluca sp
Amphipoda
Cladocera
Hidromedusae
Pisces Ovos
Freqüente
Isopoda
Classe Bivalvia
Classe Gastropoda
Mysidacea
Poecilostomatoida
Ectoprocta (larvas)
Echinodermata
Pouco freqüente
Harpacticoida
Urochordata
Cumacea
Ctenophora
Ostracoda
Siphonostomatoida
Ascidiacea (larvas)
Phoronida (larvas)
Stomatopoda (larvas)
Esporádico
foraminíferos
Monstriloida
Acari
Siphonophora
Hemiptera
Cephalopoda
Turbellaria
Hemichordata
Euphausiacea
Scyphomedusae
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Frequência de Ocorrência
Figura 14: Freqüência de ocorrência dos grupos zooplanctônicos para o complexo

estuarino. Urochordata refere-se aos grupos Thaliacea e Doliolida, excluindo
Appendicularia e as larvas de Ascidiacea.
43
Chaetognata
Poecilostomatoida
Cyclopoida
Calanoida
Cladocera
Siphonophora
Urochordata
Muito freqüente
Appendicularia
Decapoda outros
Hidromedusae
Brachyura
Gastropoda
Noctiluca sp
Amphipoda
Pteropoda
Ostracoda
Bivalvia
Freqüente
Pisces Ovos
Pisces(larvas)
foraminíferos
Mysidacea
Echinodermata (larvas)
Thalassinidea
Pouco freqüente
Polychaeta
Cirripedia (larvas)
Ectoprocta (larvas)
Harpacticoida
Hemichordata (larvas)
Anomura
Stomatopoda
Cumacea
Esporádico
Isopoda
Monstriloida
Ordem Euphausiacea
Heteropoda
Turbellaria
Scyphomedusae
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Frequência de Ocorrência
Figura 15: Freqüência de ocorrência dos grupos zooplanctônicos para a plataforma

adjacente. O grupo Gastropoda faz referências às larvas véliger e exclui grupos como
Heteropoda e Pteropoda. Urochordata refere-se apenas aos grupos Thaliacea e Doliolida.
44
5.2.3) Densidade do zooplâncton
A densidade dos táxons zooplanctônicos analisados (org. m-3) é fornecida em

Apêndice nas Tabelas 9.5.1 a 9.5.5 (estuário) e 9.5.6 e 9.5.7 (plataforma). Para o
complexo estuarino a densidade do zooplâncton foi agrupada por mês e na plataforma
agrupada entre inverno e verão. Os valores de densidade variaram entre 32 e 15.968 org.
m-3 para o complexo estuarino e entre 68 e 9.181 org. m-3 para a plataforma.
O zooplâncton total foi mais abundante nas estações estuarinas (2.510 ± 3.482
org. m-3) quando comparadas às estações localizadas na baía e canal de Santos (886 ±
1.059 org. m-3), como observado na Figura 21. Para o mês de julho, a densidade média
foi de 2.663 ± 1.583 org. m-3, sendo que apenas as estações 1 a 5 foram analisadas
(Figura 16). Já o mês de agosto apresentou um valor médio de 1.458 ± 1.647 org. m-3.
Apenas a estação 11 não pode ser analisada e a variação na densidade zooplanctônica
entre as amostras foi muito grande (Figura 17), entre 178 e 5.577 org. m-3.
Durante o mês de outubro todas as estações foram analisadas e os valores de
densidade foram menores do que os obtidos nos meses anteriores (Figura 18). A
densidade média foi de 843 ± 717 org. m-3. O mês seguinte apresentou valores médios
de densidade zooplanctônica semelhantes a outubro (854 ± 737 org. m-3). Durante o mês
de novembro (Figura 19) as estações 5 e 6 não foram analisadas devido a problemas
durante a coleta. Por fim o mês de dezembro apresentou maior valor de densidade
média (2821 ± 4.729 org. m-3), porém também apresentou a maior variação entre as
amostras (Figura 20).
Para a plataforma adjacente durante a campanha de setembro de 2005, os valores
variaram entre 103 e 2.014 org. m-3 (936 ± 572 org. m-3). Para a coleta de março de
2006, os valores estiveram entre 68 e 9.181 org. m-3 (3.218 ± 2.485). Para a maioria das
estações, os valores obtidos durante a campanha de verão foram maiores do que os
obtidos durante o inverno (Figuras 22 e 23).
45
Complexo estuarino:
Agosto de 2005
Julho de 2005
5000
5000
4000
4000
-3
Or 3000
-3
g. 3000
Org. m
m
2000 2000
1000 1000
0 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12
Estações
Estações
Figura 16: Densidade zooplanctônica para as Figura 17: Densidade zooplanctônica para as
amostras analisadas durante o mês de julho. amostras analisadas durante o mês de agosto.
Outubro de 2005 Novembro de 2005

3000 2500
2500
2000
-3
2000
Org. m-3
Org. m
1500
1500
1000
1000
500
500
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 7 8 9 10 11 12
Estações Estações
Figura 18: Densidade zooplanctônica para Figura 19: Densidade zooplanctônica para
amostras analisadas durante o mês de outubro. amostras analisadas durante o mês de novembro.
46
7.202
8000
Dezembro de 2005 7000

15.968
10000 6000
5000
Org. m -3
8000
4000
-3
6000
Org. m
3000
4000
2000
2000 1000
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Estações Estações
Estações
Figura 20: Densidade zooplanctônica para as Figura 21: Densidade média zooplanctônica
amostras analisadas durante o mês de dezembro por estação de coleta para o complexo
estuarino Santos-Bertioga.
2500
2000
1500
-3
Org. m
1000
500
0
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18
Estações
Figura 22: Densidade do zooplâncton nas amostras coletadas na plataforma,

durante a campanha de inverno (setembro de 2005).
47
12000
10000
8000
-3
6000
Org. m
4000
2000
0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 19
Estações
Figura 23: Densidade do zooplâncton nas amostras coletadas na plataforma,

durante a campanha de verão (março de 2006).
5.2.4) Densidade total e relativa dos grupos mais representativos
Complexo Estuarino
Copepoda foi o grupo dominante para a maioria das amostras (60%),

principalmente para os meses de julho e dezembro. Para o mês de julho o gênero
Acartia contribuiu com mais de 85% da densidade zooplanctônica nas 5 estações
analisadas (Figura 24). A espécie A. lilljeborgi prevaleceu sobre A. tonsa, atingindo
valores de até 89% da densidade total do zooplâncton para a estação 1. A densidade de
A. lilljeborgi variou entre 524 e 2799 org. m-3 e para A. tonsa os valores variaram entre
114 e 716 org. m-3.
Já em agosto os copépodes foram dominantes em 7 das 11 amostras contadas. O
meroplâncton, assim como outros grupos holoplanctônicos exceto Copepoda foram
mais expressivos (Figura 25). Larvas de Brachyura (280 ± 416 org. m-3), náuplios de
48
Cirripedia (155 ± 264 org. m-3), apendiculárias (48 ± 41 org. m-3), e quetognatos (88 ±
109 org. m-3), foram os animais mais representativos do meroplâncton. O copépode
Temora turbinata esteve presente em maior densidade comparado ao mês de agosto.
Em outubro, Copepoda foi dominante em 6 de 12 amostras analisadas. O gênero
Acartia (293 ± 457 org. m-3), novamente foi o mais abundante entre os copépodes,
exceto por 3 estações onde T. turbinata foi o organismo mais representativo (Figura 26),
com densidade de 111 org. m-3. A estação 2 representa uma exceção, foi a única onde o
organismo dominante foi uma espécie de anfípode gamarídeo representado 41,63% da
densidade zooplanctônica (283 org. m-3). Chaetognatha, náuplios de Cirripedia, larvas
de Brachyura e Noctiluca scintillans. também apresentaram contribuições importantes
em diversas estações.
Para o mês de novembro, os estágios de zoea da infraordem Brachyura, com
densidade numérica média de 624 ± 673 org. m-3, foram os táxons mais representativos,
variando entre 24,5 e 91,1 % da abundância relativa, exceto para a estação 12 (menos de
1%), onde outros grupos de Decapoda, Copepoda e Chaetognatha foram mais
abundantes. O grupo foi dominante em 6 das 10 amostras analisadas (Figura 27).
Já no mês de dezembro os copépodes retornaram a ser o grupo dominante (em
10 das 12 estações). Acartia tonsa (2.215 ± 4.223 org. m-3), A. lillijeborgi (256 ± 367
org. m-3), Centropages furcatus (36 ± 49 org. m-3) e Temora turbinata (55 ± 77 org. m-
3
), foram as espécies mais abundantes. As duas estações que fizeram exceção a esse
resultado demonstraram um número elevado de quetognatos, larvas de decapoda
(Pleocyemata) e do dinoflagelado Noctiluca scintillans (Figura 28).
Julho de 2005
100%
80%
60%
40%
20%
0%
1 2 3 4 5
Baia Canal
Acartia lilljeborgi Acartia tonsa
Copépodes exceto Acartia spp Chaetognata
Larvas de Decapoda Outros grupos
Figura 24: Abundância relativa dos principais

grupos zooplanctônicos no complexo estuarino
Santos-Bertioga durante o mês de julho de 2005.
49
Agosto de 2005
100%
80%
60%
40%
20%
0%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12
Baia Canal Bertioga
Acartia lilljeborgii Acartia tonsa Temora turbinata

Temora stylifera Brachyura Zoea Penillia avirostris
Cirripedia: náuplios Chaetognata Oikopleuridae
Outros grupos
Figura 25: Abundância relativa dos principais grupos

zooplanctônicos no complexo estuarino Santos-Bertioga durante o
mês de agosto de 2005.
Outubro de 2005
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Canal Baia Bertioga
Acartia spp Temora turbinata

Subeucalanus pileatus Pseudodiaptomus acut
Noctiluca sp Brachyura Zoea
Cirripedia náuplios Chaetognata
Outros grupos
Figura 26: Abundância relativa dos principais grupos

zooplanctônicos no complexo estuarino Santos-Bertioga durante o
mês de outubro de 2005.
50
Novembro de 2005
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1 2 3 4 7 8 9 10 11 12
Baia Bertioga
Acartidae Temora turbinata Labidocera fluviatilis

Brachyura Zoea Pisces: ovos e larvas Família Oikopleuridae
Outros grupos
Figura 27: Abundância relativa dos principais grupos zooplanctônicos no

complexo estuarino Santos-Bertioga durante o mês de novembro de 2005.
Dezembro de 2005
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Baia Canal Bertioga
Acartia tonsa Acartia lilljeborgii

Centropages furcatus Temora turbinata
Subeucalanus pileatus Penneoidea e Caridea juvenis
Brachyura Zoea Sagitta spp total
Noctiluca sp Outros grupos
Figura 28: Abundância relativa dos principais grupos zooplanctônicos no

complexo estuarino Santos-Bertioga durante o mês de dezembro de 2005.
51
Plataforma adjacente
Para a campanha de inverno foram analisadas 17 estações, sendo que os

copépodes foram dominantes em 10, cladóceros em 6 e outros grupos em apenas uma
estação (Figura 29). A densidade de copépodes variou entre 15,45 e 73,51%, enquanto
que dos cladóceros variou entre 2,73 e 70,76%.
Entre os copépodes, as espécies Temora stylifera (56 ± 46 org. m-3) e T.
turbinata (108 ± 145 org. m-3), foram as mais representativas para a maioria das
amostras. Outras espécies que apresentaram densidades elevadas foram Paracalanus
spp. (13 ± 21 org. m-3), Ctenocalanus sp, (49 ± 67 org. m-3) Clausocalanus furcatus (27
± 33 org. m-3), Oithona plumifera (38 ± 39 org. m-3) e Oncaea venusta (26 ± 33 org. m-
3
). Já Penilia avirostris foi o cladócero dominante em todas as amostras, com densidade
numérica de 303 ± 362 org. m-3, seguida posteriormente por Pseudevadne tergestina (25
± 37 org. m-3).
Para a campanha de verão foram analisadas 14 estações, das quais Copepoda foi
o grupo dominante em 7 e Cladocera nas outras 7 estações restantes. A soma desses dois
grupos resulta na maior parte da densidade do zooplâncton durante essa campanha,
variando de 44,76 a 87,69 % (Figura 30).
Temora stylifera (49 ± 67 org. m-3), T. turbinata (553 ± 650 org. m-3),
Subeucalanus pileatus (83 ± 91 org. m-3), Ctenocalanus sp (57 ± 100 org. m-3) e
Oithona plumifera (86 ± 68 org. m-3) foram os copépodes mais abundantes. Entre os
cladóceros P. avirostris figura novamente como o organismo mais abundante (1414 ±
1576 org. m-3), exceto pela estação 15.
52
Inverno (Setembro de 2005)

100%
80%
60%
40%
20%
0%
10 11 12 15 17 19 20 21 22 23 24 25 26 29 30 31 32
Estações
Copepoda Cladocera Noctiluca sp Chaetognata
Outros grupos Mollusca Larva de Decapoda
adjacente durante a campanha de inverno de 2005.
Verão (Março de 2006)
100%
80%
60%
40%
20%
0%
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 19
Estações
Copepoda Cladocera Outros grupos
Larva de Decapoda Chaetognata Mollusca
Cnidaria
adjacente durante a campanha de verão de 2006.
53
5.2.5) Holoplâncton x Meroplâncton
A densidade relativa de Copepoda, holoplâncton (exceto copépodes) e

meroplâncton foram comparadas para o complexo estuarino (Figura 31) e plataforma
adjacente (Figuras 32 e 33). Fica evidente a maior ocorrência do meroplâncton para o
estuário, quando comparado com a plataforma, principalmente devido às coletas de
agosto, outubro e novembro no complexo estuarino (Figuras 25 a 27).
A densidade numérica do holoplâncton variou entre 161 ± 183 org. m-3
(novembro) e 2.694 ± 4.592 org. m-3 (dezembro). Já o meroplâncton apresentou uma
amplitude de 70 ± 59 org. m-3 (julho) a 692 ± 685 org. m-3 (novembro).
Para as campanhas na plataforma, foram analisados separadamente os grupos
Copepoda e Cladocera dos outros organismos do holoplâncton Para a campanha de
setembro de 2005, o holoplâncton total (incluindo Copepoda e Cladocera) variou entre
893 ± 549 org. m-3 e o meroplâncton entre 207 ± 198 org. m-3. Durante a campanha de
março de 2006 os valores foram de 2993 ± 2347 org. m-3 e 1045 ± 827 org. m-3 para o
holo- e meroplâncton respectivamente.
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Julho Agosto Outubro Novembro Dezembro
Copepoda Holoplâncton Meroplâncton
Figura 31: Densidade relativa do holoplâncton (exceto Copepoda),
copépodes pelágicos e meroplâncton durante a amostragem no sistema
estuarino de Santos-Bertioga.
54
100%
80%
60%
40%
20%
0%
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18
Estações
Copepoda Cladocera Holoplâncton Meroplâncton
Figura 32: Densidade relativa do holoplâncton (exceto Copepoda e

Cladocera), copépodes pelágicos, cladóceros e meroplâncton durante a
amostragem na plataforma adjacente, campanha de setembro de 2005.
100%
80%
60%
40%
20%
0%
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 19
Estações
Copepoda Cladocera Holoplâncton Meroplâncton
Figura 33: Densidade relativa do holoplâncton (exceto Copepoda e
Cladocera), copépodes pelágicos, cladóceros e meroplâncton durante a
amostragem na plataforma adjacente, campanha de março de 2006.
A abundância numérica dos grupos zooplanctônicos analisados para todas as

estações de coleta é fornecida nas Tabelas 9.5.1 a 9.5.7 (Apêndices).
55
5.2.6) Perfil horizontal de distribuição da densidade zooplanctônica para a

plataforma
Perfis de distribuição do zooplâncton foram elaborados para melhor visualização

desse parâmetro na plataforma adjacente à Baixada Santista. Pelo número de estações
analisadas e variação na densidade planctônica, não foi possível observar uma tendência
de distribuição durante a campanha de inverno (Figura 34).
23.5º S
INVERNO
São Sebastião
Bertioga
Santos
17
30 m
18
Praia Grande 24º
11 16
Peruíbe 10
3 9 12
8
1
7 15
14
4
75 a 400
6 24.5º
400 a 700 5
700 a 1000
1000 a 1500
1500 a 2030
25º
47º W 46.5º 46º 45.5º
Figura 34: Distribuição dos valores de densidade do zooplâncton (org. m-3),

obtidos para as estações amostradas durante a campanha de inverno
(setembro de 2005).
Já para a campanha de verão foi possível observar um gradiente costa-oceano da

distribuição do zooplâncton. A densidade diminui em direção às estações mais distantes
da costa (Figura 35).
56
VERÃO
Santos
Bertioga
Praia Grande 24º S

11
10
2 3 9 12
8
13
7
14
4
6 24.5º
5
30 m
60 a 1600 25º
1600 a 2100
2100 a 3000
3000 a 5500
5500 a 9200
19
47º W 46.5º 46º 45.5º 45º
Figura 35: Distribuição dos valores de densidade do zooplâncton (org. m-3),

obtidos para as estações amostradas durante a campanha de verão (março de
2006).
57
5.2.7) Índice de diversidade de Shannon e Eqüitatividade
Ambos os índices foram calculados a fim de comparar esses parâmetros entre as

estações e diferentes ambientes amostrados e também verificar se existe a probabilidade
dos mesmos com relação a presença dos sorogrupos de Vibrio cholerae estudados.
Foram utilizados todos os táxons na determinação dos índices, pois a detecção da
bactéria foi realizada em amostras totais de zooplâncton. Os resultados foram
sintetizados na Tabela 9.6.1, para o complexo estuarino e 9.6.2 e 9.6.3 para a plataforma
adjacente.
Para o complexo estuarino, os valores de diversidade (H) variaram entre 1,85 ±
1,48 para a estação 11 e 4,05 ± 0,18 bits.ind.-1 para a estação 6 (Figura 36). Em média
(3,01 ± 1 bits.ind.-1) foram inferiores aos valores encontrados para a plataforma (3,73 ±
0,64 bits.ind.-1 para setembro de 2005 e 3,6 ± 0,66 bits.indivíduo-1 para março de 2006).
Os valores mais elevados foram encontrados para as estações 14 da campanha de
setembro e 19 da campanha de março, correspondendo a 4,68 e 4,82 bits.ind.-1
respectivamente. Ambas as estações estão entre as mais distantes da costa. Os valores
para calculados para cada estação de coleta no complexo estuarino são fornecidos em
Apêndice na Tabela 9.6.1.
A eqüitatividade, em geral, foi menor para o sistema estuarino, sendo a média
igual a 0,6 ± 0,18 (Figura 39), enquanto que para a plataforma adjacente este valor foi
de 0,71 ± 0,11 para a primeira campanha e de 0,66 ± 0,12 para a segunda. Os valores
refletem uma maior dominância entre os táxons para o complexo estuarino, em
comparação com as amostragens na plataforma adjacente.
58
Diversidade de Shannon (H)
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Baia Canal Bertioga
Estações
Figura 36: Índice de diversidade de Shannon (bits . ind.-1) calculado por

estação para o complexo estuarino de Santos-Bertioga durante os 5 meses de
coleta.
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18
Estações
Figura 37: Índice de diversidade de Shannon (bits . ind.-1) calculado por

estação para a plataforma adjacente durante a campanha de setembro de
2005.
59
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 19
Estações
Figura 38: Índice de diversidade de Shannon (bits . ind.-1) calculado por estação
para a plataforma adjacente durante a campanha de março de 2006.
Equitatividade (J)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Baia Canal Bertioga
Estações
Figura 39: Valores de eqüitatividade calculado por estação para o complexo
estuarino de Santos-Bertioga.
60
Equitatividade (J)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18
Estações
Figura 40: Valores de eqüitatividade calculado por estação para a plataforma
adjacente, durante a campanha de setembro de 2005.
Equitatividade (J)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 19
Estações
Figura 41: Valores de eqüitatividade calculado por estação para a plataforma
adjacente, durante a campanha de março de 2006.
61
5.3) Variabilidade dos fatores ambientais e bióticos por ambientes e

grupos de estações (ANOVA)
A ANOVA, modo unifatorial, foi utilizada para verificar se as diferenças de

valores de cada variável foram significativas entre diferentes ambientes e grupos de
estações. Para as variáveis cuja distribuição não era normal o teste Kruskal Wallis foi
utilizado. Os resultados foram sintetizados na Tabela 3 e os grupos comparados foram:
1) Complexo estuarino e plataforma adjacente

2) Complexo estuarino: baía de Santos (estações 1 a 4), canal de Santos (estações 5
e 6) e canal de Bertioga (estações 7 a 12)
3) Complexo estuarino: Meses de coleta
4) Plataforma adjacente: Campanha de inverno e de verão
5) Plataforma adjacente: Dois grupos de estações, divididos pela batimetria (menor
e maior que 30 m).
6) Plataforma adjacente: Conjunto de transectos. (norte, central e sul)
Tabela 3: Síntese dos valores de p para as variáveis analisadas entre os diferentes

ambientes e agrupamento de amostras. S.D.: Sem dados. %: Densidade relativa.
Variável 1 2 3 4 5 6
Temperatura média 0,51 0,14 <0,01 <0,01 0,1 0,77
Salinidade média <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,01 0,21
Densidade Total 0,53 0,74 0,25 <0,01 0,07 0,85
Densidade Crustacea 0,67 0,3 0,22 <0,01 0,06 0,88
Densidade Copepoda 0,3 0,09 0,06 <0,01 0,12 0,82
Diversidade (H) <0,01 0,05 <0,01 0,72 0,01 0,39
Eqüitatividade (J) 0,05 0,11 <0,01 0,40 0,04 0,43
% Crustacea 0,01 0,22 <0,01 0,03 0,17 0,65
% Copepoda 0,01 0,66 <0,01 0,59 0,03 0,44
% Cladocera S.D. S.D. S.D. 0,2 0,08 0,6
A temperatura média apresentou variabilidade significativa apenas quando

comparada entre os meses de coleta no complexo estuarino e entre as campanhas na
plataforma. Já a variação de salinidade só não foi significativa quando comparada
quanto aos transectos delimitados na plataforma interna (p = 0,21).
A densidade de copépodes, crustáceos totais e a densidade total do zooplâncton
variaram de maneira significativa apenas entre as campanhas de inverno e verão na
plataforma adjacente. Esses parâmetros apresentaram baixos valores de probabilidade
62
também entre os grupos de estações separados pela batimetria na plataforma (Tabela 3),
embora os valores não sejam significativos (p > 0,05).
O índice de diversidade de Shannon e eqüitatividade comportaram-se de maneira
semelhante e a variabilidade desses fatores foi significativa quando comparados o
complexo estuarino com a plataforma adjacente, os meses de coleta no complexo
estuarino e os grupos da plataforma separados pela profundidade. Entre os ambientes do
complexo estuarino, a diversidade também se apresentou variável (p = 0,046).
A variabilidade da densidade relativa de crustáceos totais e copépodes são
notáveis quando comparada entre o estuário e plataforma e também entre os meses de
coleta no estuário. Para os copépodes a diferença também é significativa entre as
campanhas de inverno e verão e para os crustáceos entre os grupos divididos pela
profundidade (isóbatas) na plataforma interna.
A variação entre a densidade relativa dos cladóceros, um dos grupos dominantes
na plataforma, não foi significativa (Tabela 3). Esse fator não foi calculado para o
complexo estuarino devido a densidade dos animais terem sido baixas (Apêndices 9.5.1
9.5.5).
5.4) Análise de dissimilaridade
Dendrogramas estabelecendo a relação entre as amostras, quanto aos parâmetros

ambientais analisados (temperatura e salinidade) foram elaborados. A análise permitiu a
visualização de agrupamentos de estações, que se comportam de maneira semelhante
quanto aos fatores analisados. As estações do complexo estuarino foram separadas em
dois grupos, um constituído pelos pontos de coleta na baía e canal de Santos e outro
com os pontos no canal de Bertioga (Figuras 42 e 43)
63
Estuário
4
5
3
1
2
6
7
9
8
11
10
12
0
12
15
18
3
Dissimilaridade
Figura 42: Dendrograma de dissimilaridade (distância euclidiana), calculado pelo método

de Ward, para as estações amostradas no complexo estuarino de Santos-Bertioga.
Estuário
3
4
5
1
2
6
7
9
8
11
10
12
0
Dissimilaridade
Figura 43: Dendrograma de dissimilaridade(distância euclidiana), calculado pelo método
de ligação completa, para as estações amostradas no complexo estuarino de Santos-
Bertioga.
Para a plataforma continental adjacente, as amostras formaram dois grupos

principais. A divisão das estações ocorreu de acordo com a distância da costa. O
primeiro agrupamento corresponde às estações mais próximas e o segundo às estações
mais distantes (Figuras 44 e 45).
64
Plataforma: inverno
11
10
3
9
18
17
1
12
8
4
16
7
6
14
5
15
0
12
15
18
Dissimilaridade

inverno (setembro de 2005).
Plataforma: inverno
11
10
3
9
18
17
1
4
8
12
16
7
6
14
5
15
0
Dissimilaridade

campanha de inverno (setembro de 2005).
O mesmo ocorreu para a campanha de verão na plataforma, porém o ponto 19,

que representa a maior distância da costa, forma um terceiro grupo, relacionado com as
estações mais distantes (Figuras 46 e 47).
65
Plataforma: verão
2
3
9
11
8
10
12
7
5
13
4
6
14
19
0
12
15
18
Dissimilaridade

verão (março de 2006).
Plataforma: verão
2
3
9
11
8
10
12
7
5
13
4
6
14
19
0
Dissimilaridade
campanha de verão (março de 2006).
66
5.5) Ensaio de imunofluorescência direta
Foram analisadas todas as amostras coletadas durante as campanhas do estuário

e da plataforma adjacente para ambos os sorogrupos O1 e O139, totalizando 82
amostras. Nas tabelas abaixo foram representadas as estações testadas e a presença ou
ausência de Vibrio cholerae.
Tabela 4: Presença do sorogrupo O1 nas amostras de plâncton coletadas no

complexo estuarino Santos-Bertioga. -: amostra negativa, +: 5 a 9 campos
contendo víbrios; ++: 10 a 15 campos; +++ acima de 15 campos. Vinte campos
foram analisados por amostra. S. D.: Sem dados.
Estação Julho Agosto Outubro Novembro Dezembro
1 ++ + +++ +++ +++
2 + ++ + +++ +++
3 - +++ ++ +++ ++
4 - +++ ++ + ++
5 ++ ++ ++ S. D. ++
6 + ++ ++ S. D. +++
7 - - ++ + +
8 S. D. + + ++ -
9 S. D. ++ + ++ ++
10 S. D. + ++ +++ ++
11 S. D. S. D. ++ ++ ++
12 S. D. ++ ++ + ++
Controle positivo + + + + +
Controle negativo - - - - -
Tabela 5: Presença do sorogrupo O139 nas amostras de plâncton coletadas no

complexo estuarino Santos-Bertioga. Campos determinados como descrito para
a Tabela 4.
Número da estação Julho Agosto Outubro Novembro Dezembro
1 + + +++ ++ +
2 - - ++ ++ ++
3 + ++ ++ ++ ++
4 - ++ ++ - ++
5 + ++ ++ S. D. ++
6 - ++ ++ S. D. ++
7 + + - + +++
8 S. D. + - ++ ++
9 S. D. + + ++ ++
10 S. D. ++ - ++ +
11 S. D. S. D. + ++ ++
12 S. D. +++ + - ++
Controle positivo + + + + +
Controle negativo - - - - -
67
Tabela 6: Presença dos sorogrupos O1 e O139 nas amostras de plâncton

coletadas durante a campanha de inverno (setembro de 2005). Campos
determinados como descrito para a tabela 4.
Número da estação O1 O139
1 - ++
3 - -
4 + +
5 + +
6 - -
7 + +
8 + -
9 + +
10 ++ ++
11 + +
12 + +
14 + ++
15 - +
16 + ++
17 + ++
18 + +
Controle positivo + +
Controle negativo - -
Tabela 7: Presença dos sorogrupos O1 e O139 nas amostras de plâncton

coletadas durante a campanha de verão (março de 2006). Campos determinados
como descrito para a Tabela 4.
Número da estação O1 O139
2 + +
3 + +
4 + +
5 - +
6 + +
7 + -
8 + -
9 - -
10 ++ +
11 + -
12 - -
13 - +
14 - -
19 - -
Controle positivo + +
Controle negativo - -
68
Para as 52 amostras analisadas no complexo estuarino, 47 (88,1%) foram

positivas para o sorogrupo O1 e 43 (76,9%) para o sorogrupo O139. A maior parte das
amostras negativas esteve concentrada no mês de julho (6 de 14). O resultado positivo
prevaleceu para todas as estações, em ambos os sorogrupos.
Foram analisadas 30 estações sobre a plataforma adjacente. Para a campanha de
inverno foram analisadas 16 estações, sendo que 12 (75%) foram positivas para o grupo
O1 e 13 para o grupo O139 (81%). Já para a campanha de verão foram testadas 14
amostras, sendo que 8 (57,1%) foram positivas para o sorogrupo O1 e 7 (50%) para o
sorogrupo O139.
5.5.1) Distribuição dos sorogrupos O1 e O139 sobre a plataforma

continental
Os resultados obtidos com a detecção das bactérias foram plotados no mapa para
observar se existiu um padrão de distribuição da associação. Era esperado que a
detecção diminuísse em direção a águas oceânicas, o que não foi possível afirmar
apenas pela visualização dos mapas (Figuras 48 a 51). A estação 19, analisada durante o
Verão, foi retirada dos mapas devido à sua distância da costa ser maior e os resultados
serem negativos para os dois sorogrupos de Vibrio cholerae.
23.5º S 23.5º S
INVERNO INVERNO
São Sebastião São Sebastião
Bertioga Bertioga
Santos Santos
17 17
18 Praia Grande 18 24º
Praia Grande 24º
11 16 11 16
Peruíbe 10 Peruíbe 10
3 9 12 3 9 12
8 8
1 1
7 15 7 15
14 14
4 4
6 24.5º 6 24.5º
5 5
30 m 30 m
25º 25º
47º W 46.5º 46º 45.5º 47º W 46.5º 46º 45.5º
Figura 48: Distribuição das amostras Figura 49: Distribuição das amostras positivas
positivas (círculos) para o sorogrupo O1 (círculos) para o sorogrupo O139 durante o
durante o inverno.
69
VERÃO VERÃO
23.7º S 23.7º S
Bertioga Bertioga
Santos San tos
Praia Grande Praia Gran de
30 m 11 30 m 11
10 10
2 3 9 12 2 3 9 12
24.2º 8
24.2º
8
13 13
7 7
14 14
4 4 Estação hidrográfica
Estação hidrográfica
6 6
5 5
24.7º 24.7º
25.5º 25.5º
19 19
26º 26º
47º 46.5º 46º 45.5º 45º W 47º 46.5º 46º 45.5º 45º W
Figura 50: Distribuição das amostras positivas Figura 51: Distribuição das amostras positivas
(círculos) para o sorogrupo O1 durante o verão. (círculos) para o sorogrupo O139 durante o
verão.
5.5.2) Relação entre a detecção de Vibrio cholerae O1 e O139 e

parâmetros ambientais
O teste t de Student foi utilizado para comparar as variáveis de distribuição

normal (salinidade, temperatura, densidade, diversidade e eqüitatividade) com a
detecção dos sorogrupos de Vibrio cholerae. Para a comparação com as variáveis não
paramétricas (densidade relativa de crustáceos totais, Copepoda e Cladocera) foi
utilizado o teste de Mann-Whitney. As amostras foram analisadas em conjunto e
também isoladas quanto ao ambiente (complexo estuarino, plataforma adjacente e
campanhas de inverno e verão).
Os resultados foram sintetizados na Tabelas 8 e 9. A Tabela 10 traz observações
adicionais sobre a relação entre a temperatura e salinidade em diferentes profundidades
para ambas as campanhas de coleta na plataforma interna e a detecção dos sorogrupos
estudados.
70
Tabela 8: Valores de probabilidade (p) dos testes t de Student e Mann-Whitney

entre variáveis bióticas e abióticas em relação à detecção de V. cholerae O1. E:
Estuário, n = 50; P: Plataforma, n = 30; I: Campanha de inverno, n = 16; V:
Campanha verão, n = 14. S.D.: Sem dados.
Ambiente E+ P E P PI PV
T média 0,796 0,952 0,665 0,982 0,737
S média 0,063 0,864 0,253 0,583 0,843
D total 0,699 0,747 0,985 0,622 0,443
D Crustacea 0,696 0,707 0,972 0,601 0,491
D Copepoda 0,941 0,566 0,559 0,681 0,099
% Crustacea 0,527 0,707 0,509 0,716 1
% Copepoda 0,732 0,566 0,218 1 0,093
% Cladocera S.D. S.D. 0,403 0,716 0,121
H 0,878 0,379 0,689 0,512 0,302
J 0,76 0,434 0,394 0,625 0,187
Tabela 9: Valores de probabilidade (p) dos testes t de Student e Mann-Whitney

entre variáveis bióticas e abióticas em relação à detecção de V. cholerae O139.
S.D.: Sem dados.
Ambiente E+ P E P PI PV
T média 0,685 0,171 0,791 0,91 0,056
S média 0,623 0,91 0,162 0,816 0,117
D total 0,725 0,583 0,915 0,349 0,596
D Crustacea 0,756 0,628 0,966 0,363 0,539
D Copepoda 0,601 0,728 0,949 0,219 0,577
% Crustacea 0,972 0,491 0,965 0,491 0,484
% Copepoda 0,628 0,578 0,253 0,56 0,697
% Cladocera S.D. S.D. 0,567 0,791 0,815
H 0,493 0,891 0,968 0,702 0,688
J 0,509 0,734 0,996 0,72 0,923
Tabela 10: Valores de probabilidade (p) dos testes t de Student para a temperatura
e salinidade em diversas profundidades, em relação à detecção de V. cholerae O1 e
O139.
Ambiente P I O1 P V O1 P O1 P I O139 P V O139 P O139
T média 0,982 0,737 0,665 0,91 0,056 0,791
T 5m 0,653 0,347 0,409 0,655 0,225 0,285
T 10m 0,48 0,537 0,282 0,843 0,129 0,38
T 15m 0,703 0,516 0,282 0,724 0,414 0,488
S média 0,583 0,843 0,253 0,816 0,117 0,162
S 5m 0,858 0,105 0,186 0,557 0,331 0,743
S 10m 0,308 0,352 0,104 0,783 0,378 0,387
S 15m 0,547 0,876 0,351 0,991 0,058 0,364
71
A detecção parece diminuir com o aumento dos valores de salinidade, embora

essa diminuição não seja significativa para níveis de probabilidade de 0,05 (p = 0,06
para Vibrio cholerae O1 e 0,62 para. O139). Para a plataforma, a salinidade parece ter
influência na detecção dos sorogrupos, quando analisados os valores em profundidades
distintas (Tabela 10).
Amostras negativas na plataforma geralmente apresentaram salinidade superior a
34. Essa tendência pode ser observada nas Figuras 52 e 53. Para o complexo estuarino,
das 50 amostras testadas apenas 4 foram negativas, sendo que 2 apresentaram
salinidades mais elevadas do que a faixa de amplitude de salinidade registrada para as
amostras positivas.
Vibrio cholerae O139

100%
V. cholerae O1 n=31
100% n =31 n=34
n =34 80%
n=19
80%
n =19
60%
60%
40%
40%
20% 20%
0% 0%
21 a 32 32 a 34 > 34 21 a 32 32 a 34 > 34
Salinidade
Salinidade
Figura 52: Influência da salinidade sobre a Figura 53: Influência da salinidade sobre a
detecção do sorogrupo O1 em amostras totais detecção do sorogrupo O139 em amostras
de plâncton. totais de plâncton.
72
Considerando todo o conjunto de dados, incluindo estuário e plataforma, não

houve influência da temperatura na detecção dos sorogrupos (p = 0,8 para Vibrio
cholerae O1 e 0,69 para V. cholerae O139). A temperatura provavelmente apresentou
influência sobre a detecção apenas para as amostras analisadas durante a campanha de
verão, para o sorogrupo O139 (p= 0,06).
Vibrio cholerae O1
100% Vibrio cholerae O139
n =33 n =31 100%
n =22
80% n =33
80% n=18
n =31
60%
60%
40%
40%
20%
0% 20%
19,5 a 21,5 21,5 a 23 > 23 19,5 a 21,5 21,5 a 23 > 23
Temperatura (ºC) Temperatura (ºC)
Figura 54: Influência da temperatura Figura 55: Influência da temperatura

sobre a detecção do sorogrupo O1 em sobre a detecção do sorogrupo O139 em
amostras totais de plâncton. amostras totais de plâncton.
5.5.3) Relação entre a detecção de Vibrio cholerae O1 e O139 e variáveis

ecológicas
Densidade do zooplâncton
A densidade total de organismos zooplanctônicos não está relacionada com a

detecção dos sorogrupos nas amostras (p = 0,70 para O1 e 0,72 para O139). Os gráficos
de detecção em diferentes categorias de densidade evidenciam o resultado (Figuras 56 e
57).
73
Vibrio cholerae O139

Vibrio cholerae O1
100%
100%
n =40
n =7 n =40 n =25
n =25 80% n =7
80%
n =8
n =8
60%
60%
40% 40%
20% 20%
0% 0%
32 a 1000 1001 a 2.500 2.501 a 5.000 > 5.000 32 a 1000 1001 a 2.500 2.501 a 5.000 > 5.000
- -
Org m 3 Org m 3
Figura 56: Relação entre a detecção de V.c. Figura 57: Relação entre a detecção de V.c.
O1 e a densidade zooplanctônica. O139 e a densidade zooplanctônica.
Composição, diversidade e eqüitatividade do zooplâncton
Testes foram realizados para correlacionar a composição, diversidade e

eqüitatividade com a presença de Vibrio cholerae O1 e O139. Quanto à composição,
foram testadas se as contribuições relativas e densidades de crustáceos totais e de
copépodes influíram na detecção dos sorogrupos. As densidades de crustáceos totais não
foram relevantes estatisticamente para a ocorrência das bactérias (p = 0,79 para O1 e
0,76 para O139), o mesmo ocorreu para os valores de densidade de copépodes (p = 0,94
para O1 e 0,60 para O139; Figuras 58 a 61). Para a densidade de copépodes, parece
haver uma fraca probabilidade durante a campanha de verão, para o sorogrupo O1 (p =
0,1). Os dados não são suficientes para afirmar que existe a probabilidade de relação
entre a detecção de V. cholerae O1 e O139 com a densidade de copépodes nas amostras.
74
Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O139

n =11
100% n =11
100%
n =36 n =36
n =29 n =29
80%
80%
60% 60% n =4
n =4
40% 40%
20% 20%
0% 0%
0-50 50-75 75-90 > 90 0-50 50-75 75-90 > 90
% Crustáceos % Crustáceos
Figura 58: Relação entre a porcentagem de Figura 59: Relação entre a porcentagem
crustáceos nas amostras e a detecção de V.c. de crustáceos nas amostras e a detecção
O1. de V.c. O139.
Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O139

100% 100%
90% 90%
80% 80%
70% 70%
60% 60%
50% 50%
0 a 25 26 a 50 51 a 75 > 75 0 a 25 26 a 50 51 a 75 > 75
Copepoda (%) Copepoda (%)
Figura 60: Relação entre a porcentagem de Figura 61: Relação entre a porcentagem de
copépodes nas amostras e a detecção de V.c. copépodes nas amostras e a detecção de V.c.
O1. O139.
A diversidade de Shannon foi outra variável testada e que não influenciou na

detecção de Vibrio cholerae nas amostras de zooplâncton (p = 0,88 para O1 e 0,49 para
O139). O mesmo ocorreu utilizando os valores de eqüitatividade das mesmas amostras
(p = 0,76 para O1 e 0,51 para O139).
75
5.6) Testes com táxons específicos
Foram realizados 116 testes, abordando 43 táxons que compõem o zooplâncton.

A Tabela 11 sintetiza os grupos que foram testados durante o presente estudo, o número
de testes e porcentagem de resultados positivos para ambos os sorogrupos.
Tabela 11: Táxons testados, número de testes e resultados

positivos obtidos através do DFA (%).
Táxons n O1 + O139 +
Acartia lilljeborgi 7 85,7 85,7
A. tonsa 6 66,7 83,3
Bivalvia véliger 1 - -
Calanopia americana 1 + +
Centropages furcatus 1 + +
Clausocalanus furcatus 1 + -
Onichocorycaeus giesbrechti 1 + +
Ctenocalanus sp 2 100 100
Cumacea 1 + +
Echinopluteus 3 33,4 67
Euchaeta marina 1 + +
Foraminifera 3 100 67
Amphipoda: Gammaridea 2 100 100
Gastropoda véliger 2 0 0
Hidromedusae 3 0 0
Amphipoda:Hyperiidea 1 + +
Decapoda juvenis* 1 + +
Labidocera fluviatilis 1 + +
Larvas de peixes 3 67 33
Larvas de Polychaeta 3 100 100
Lucifer faxoni 3 66,7 100
Mysidacea 1 + +
Náuplio de Cirripedia 3 66,7 66,7
Noctiluca scintillans 3 0 0
Oikopleura spp. 4 0 75
Oithona plumifera 2 50 50
Oithona spp. 2 100 100
Oncea venusta 1 + +
Ostracoda 3 100 100
Ovos de peixes 3 33,3 33,3
Penilia avirostris 6 83,3 100
Paracalanus spp. 1 + +
Pleopis schmackeri 2 67 100
Pseudevadne tergestina 2 100 100
Pseudodiaptomus acutus 1 + +
Chaetognatha 7 57,1 71,4
Sergestoidea larvas 1 + +
Subeucalanus pileatus 1 - -
Temora stylifera 1 + +
T. turbinata 11 81,8 100
Thalia democratica 1 - +
Zoea de Brachyura 12 75 91,7
Zoea de Porcelanidae 1 + +
76
Uma ampla diversidade de táxons foi testada, abordando filos como

Granuloreticulosa (subfilo Foraminifera), Dinoflagellata, Cnidaria, Arthropoda,
Mollusca, Chaetognatha, Echinodermata e Chordata. Os únicos grupos onde Vibrio
cholerae não foi detectado foram em dinoflagelados (Noctiluca scintillans), Cnidaria
(hidromedusas), Mollusca (véliger de Bivalvia e Gastropoda) e Thaliacea.
Grupos que apresentaram altas taxas de detecção foram os crustáceos, larvas de
poliquetos e quetognatos. Os sorogrupos também foram encontrados em Pisces,
Echinodermata e Appendicularia. A Tabela 12 sintetiza os resultados por filos (ou
subfilos e classes) de animais zooplanctônicos analisados. Como a ênfase foi dada aos
crustáceos, animais dominantes da comunidade zooplanctônica, um maior número de
testes de táxons desse subfilo foi analisado. Os resultados são descritos na Tabela 13.
Tabela 12: Síntese dos resultados obtidos com Tabela 13: Síntese dos resultados obtidos
táxons, agrupados por filos ou subfilos (%). com crustáceos, agrupados por táxons (%).
Grupo n O1 + O139 + Grupo n O1 + O139 +

Dinoflagelada 3 0 0
Calanoida 27 82,6 78,3
Foraminifera 3 100 67
Cnidaria 3 0 0 Cyclopoida 8 83,3 83,3
Mollusca 3 0 0 Cirripedia 3 66,7 66,7
Polychaeta 3 100 100 Cladocera 8 87,5 100
Crustacea 68 82,8 87,1 Peracarida 5 100 100
Chaetognatha 7 57,1 71,4
Decapoda 17 76,5 94,1
Echinodermata 3 33,4 67
Urochordata 4 0 80
Chordata 4 50 50
5.7) Ensaio de imunofluorescência direta, associada à contagem direta de

bactérias (DVC-DFA)
Durante os três experimentos foram selecionados cerca de 30 indivíduos dos

táxons mais abundantes nas amostras. Os táxons selecionados e os resultados de
detecção de ambos os sorogrupos estão representados na Tabela 14.
77
Tabela 14: Resultados obtidos durante os três meses de coleta,

utilizando o método DVC-DFA. RC__: cepas utilizadas como
controle (detalhes em materiais e métodos). V.c.: Vibrio
cholerae
Estação Janeiro O1 O139
1 Acartia lillijeborgi + -
1 Larvas de Brachyura - -
2 Ovos de peixe + +
2 A. lillijeborgi + +
3 A. lillijeborgi + -
RC 223 V.c. O1 + -
RC 231 V.c. O1 + -
RC 46 V.c. O139 - +
RC 107 V.c. O139 - +
Fevereiro O1 O139
1 Acartia lillijeborgi - +
1 Larvas de Brachyura - +
2 A. lillijeborgi + -
2 Larvas de Brachyura - -
RC 223 V.c. O1 + -
RC 231 V.c. O1 + -
RC 46 V.c. O139 - +
RC 107 V.c. O139 - -
Março O1 O139
1 Copepoda: náuplios - -
1 Oithona spp. - +
2 Temora turbinata - +
2 Acartia spp. Juvenis - +
3 Copepoda: náuplios - +
3 Oithona spp. - +
RC 223 V.c. O1 ++ -
RC 231 V.c. O1 ++ -
RC 46 V.c. O139 - +
RC 107 V.c. O139 - ++
Ao todo foram testados 6 táxons, todos foram positivos em pelo menos um dos
experimentos. De um total de 15 testes com os táxons, 5 (33,3%) foram positivos para
Vibrio cholerae O1 e 9 (60%) para V. cholerae O139. Durante o mês de março apenas o
sorogrupo O139 foi detectado em associação com o zooplâncton.
Foram observadas formas alongadas, muito maiores do que as células do
controle positivo, que provavelmente representam bactérias viáveis e cultiváveis devido
a utilização do ácido nalidíxico (Figura 62).
78
A B
Figura 62: Vibrio cholerae alongada, através da técnica de DVC-DFA. Aumento
aproximado de 2.000 x para A e 3.000 x para B (aumento digital).
Formas vibrióides características foram visualizadas com mais facilidade

no controle positivo do kit (Figura 63 a). Nesse material, a maioria das células se
encontravam no estado viável, embora algumas apresentassem volume reduzido.
A observação das bactérias e obtenção de imagens em amostras de zooplâncton
(Figura 63 b) foi mais difícil.
A B
Figura 63: Controle positivo do kit de DFA para Vibrio cholerae O1(a); e apêndice de
microcrustáceo carregando Vibrio cholerae, provavelmente no estado VNC(b). Aumento de
aproximadamente 2.000 x para A e B.
Bactérias possivelmente no estado VNC foram observadas tanto em amostras

fixadas quanto em amostras frescas (identificadas pelo tamanho e formato), mas as
fotografias são referentes ao segundo tipo de material, pois a técnica de DVC-DFA
permitiu melhor visualização das células (Figura 64).
79
Figura 64: bactérias no estado VNC, através do método DVC-DFA. Notar brilho mais
intenso na periferia da célula (parede celular). Aumento aproximado de 3.000 x.
80
6) DISCUSSÃO
6.1) Relação entre as variáveis da comunidade zooplanctônica e a

associação de Vibrio cholerae
Em termos mundiais, raros estudos levaram em consideração parâmetros

ecológicos como a composição, estrutura, diversidade e eqüitatividade do zooplâncton e
suas relações com a presença e densidade de Vibrio cholerae nessas comunidades
(Heidelberg et al., 2002; Louis et al., 2003).
No presente estudo, os táxons mais freqüentes para o complexo estuarino
(freqüência acima de 50%) foram: Noctiluca scintillans, hidromedusas, larvas de
poliquetos, larva véliger de bivalves e gastrópodes, anfípodes gamarídeos, misidáceos,
larvas de decápodes (Caridea, Brachyura e Anomura: Porcelanidae e Thalassinidea),
Penilia avirostris, Paracalanus spp., Subeucalanus pileatus, Centropages velificatus,
Pseudodiaptomus acutus, Temora turbinata, Labidocera fluviatilis, Acartia lilljeborgi,
A. tonsa, Oithona plumifera, náuplios de cirripédios, Sagitta tenuis e ovos e larvas de
peixes. Dentre esses táxons mais freqüentes, Vibrio cholerae só não foi encontrado em
N. scintillans, hidromedusas e larvas de gastrópodes e bivalves.
A plataforma adjacente foi caracterizada por exibir maior diversidade e
eqüitatividade entre os táxons. Diversos grupos foram freqüentes apenas para a
amostragem na plataforma interna: sifonóforos, pterópodes, anfípodes (Hyperiidea),
larvas de decápodes da família Sergestidae, Lucifer faxoni, Pseudevadne tergestina,
Pleopis schmackeri, Nannocalanus minor, Clausocalanus furcatus, Ctenocalanus sp,
Temora stylifera, Calanopia americana, Oncaea venusta, Corycaeus speciosus,
Onychocorycaeus giesbrechti, ostrácodes, Sagitta spp., Oikopleura dioica¸ Thalia
democratica e dolíolos. Dentre eles, L. faxoni, P. tergestina C. furcatus, Ctenocalanus
sp, T. stylifera, C. americana, O. venusta O. giesbrechti, ostrácodes, Sagitta spp. e O.
dioica foram positivos para pelo menos um dos sorogrupos analisados.
Alguns organismos ticoplanctônicos ou de hábitos bentônicos foram registrados
e a freqüência fornecida juntamente com os outros táxons estritamente planctônicos na
Tabela 2. Os táxons do ticoplâncton foram: Acari, Amphipoda: Caprellidea; Isopoda:
Munidae e Epicaridae e Cumacea. Esses organismos, por possuírem densidades muito
81
baixas nas amostras, não foram testados isoladamente para detecção das bactérias
(exceto Cumacea).
Das espécies de cladóceros encontrados para a costa brasileira, foram registradas
Penilia avirostris, Pleopis schmackeri, Evadne spinifera e Pseudevadne tergestina. O
cladócero P. avirostris esteve entre os organismos mais abundantes na plataforma
adjacente (máximo de 5.439 org. m-3), mas foi pouco representativo no complexo
estuarino (máximo de 70 org. m-3). As espécies analisadas quanto à associação com
víbrio foram P. avirostris, P. schmackeri e P. tergestina e todas elas apresentaram altas
taxas de detecção (Tabela 11).
Para o grupo Copepoda, apenas a espécie Subeucalanus pileatus não apresentou
associação com Vibrio cholerae. Porém a espécie foi utilizada em um único teste, sendo
necessários mais estudos para verificar esse resultado.
Outros táxons de crustáceos planctônicos também foram determinados pelo
menos em grandes grupos (e. g. Ordem). Esses táxons compuseram importante
componente do meroplâncton e do zooplâncton total, principalmente as larvas de
Brachyura devido à elevada densidade no mês de dezembro para o estuário. Os estágios
larvais de Brachyura, Anomura (Porcelanidae), camarões peneídeos, carídeos e
sergestídeos e náuplios de cirripédios foram todos positivos para Vibrio cholerae O1 e
O139.
A densidade do zooplâncton apresentou ampla variação na área de estudo, fato
comum em outros trabalhos que estimaram esse parâmetro em regiões estuarinas
semelhantes como o estuário de Paranaguá (Lopes, 1997; Abrahão, 2000; entre outros).
Porém, como demonstrado, essa variação não foi significativa quanto a presença de
Vibrio cholerae em associação com o zooplâncton.
A densidade de bactérias associadas variou de forma independente da
composição do zooplâncton no estudo de Heidelberg et al. (2002), resultados que
concordaram com os obtidos para detecção de Vibrio cholerae O1 e O139 neste estudo.
É sugerido que amostras de zooplâncton positivas para Vibrio cholerae estejam
relacionadas à dominância de microcrustáceos, principalmente copépodes, quanto à
concentração dessas bactérias. Esses animais liberam maior quantidade de quitina no
ambiente do que outros crustáceos do plâncton devido ao elevado número de ecdises
(um copépode geralmente apresenta 6 estágios naupliares e 6 estágios de copepoditos).
Além disso, copépodes produzem quitina como revestimento de suas pelotas fecais,
espermatóforos e sacos ovígeros (Mauchline, 1998). Huq et al. (2005) apontaram a
82
abundância de copépodes como um fator de risco significante em regiões onde a cólera

é endêmica.
Contudo, vale ressaltar que trabalhos sobre a concentração de víbrios em outros
táxons que compõem o zooplâncton são escassos ou inexistentes (larvas de cirripédios,
poliquetos, entre outros) e afirmar que o número de víbrios associados à copépodes seja
maior do que em outros organismos ainda é questionável. Quantificar as bactérias
associadas tanto internamente quanto externamente aos animais é uma tarefa complexa
e imprecisa (Heidelberg et al., 2002; Tang, 2005).
Huq et al. (1983) quantificaram Vibrio cholerae em associação com copépodes
através da contagem de unidades formadoras de colônia, adicionando alíquotas de
soluções de copépodes macerados a meios de cultura. Porém os resultados desses
autores abordaram apenas as ufcs (unidades formadoras de colônias), as quais
representaram apenas as bactérias viáveis e cultiváveis que originaram colônias no
momento em que os experimentos foram realizados.
Heidelberg et al. (2002) estimaram a densidade do grupo V. cholerae - V.
mimicus em 1,9.104 a 6,4.107 células m-3 de superfície do macrozooplâncton (> 202 µm)
e de 3.100 a 4.103 células por copépode calanóide. Os autores efetuaram a estimativa
através da marcação dos grupos bacterianos com oligonucleotídeos específicos (FISH).
Os grupos bacterianos foram estimados por citometria de fluxo e os valores divididos
pelas estimativas de área de superfície do zooplâncton.
No presente estudo, a densidade zooplanctônica não apresentou interferência na
detecção das bactérias (Tabela 3). Um único copépode pode abrigar na ordem de 105
células bacterianas, estimado através da técnica de número mais provável (Tang, 2005),
deste modo poucos indivíduos abrigando Vibrio cholerae nas amostras já seriam
suficientes para a detecção pelo método de DFA. Entretanto, quanto maior o número de
copépodes colonizados por amostra, maior serão as chances de animais nessa condição
serem selecionados na alíquota utilizada para realização do ensaio. Portanto, se a
proporção de copépodes colonizados numa determinada amostra for baixa, é possível
que a mesma seja negativa, simplesmente devido a ausência de animais colonizados na
alíquota utilizada.
Provavelmente as variáveis de densidade do zooplâncton analisadas estejam
correlacionadas com a densidade das bactérias aderidas nas amostras. Mais estudos
serão necessários para confirmar essa hipótese, utilizando um conjunto de métodos
83
quantitativos mais precisos como citometria de fluxo, hibridização in situ fluorescente

(FISH), “microarrays” e “real time PCR” (Thompson et al., 2004).
Não houve relação (p > 0,10) entre os índices de diversidade de Shannon e
eqüitatividade e a detecção de V. cholerae, embora exista variação significativa desses
fatores entre a plataforma e o estuário e também no estuário entre os ambientes e os
meses de coleta. Essas variáveis não interferem na presença dos víbrios, já que a
bactéria é capaz de aderir a diversos tipos de substratos e organismos (Tamplin et al.,
1990; Halpern et al., 2003; Meilbom et al., 2004; Zampini et al., 2005; Gancz et al.,
2005).
Os valores encontrados correspondem com o fato de que a diversidade do
zooplâncton aumenta, do sentido de um ambiente estuarino em direção à águas costeiras
e oceânicas e que a dominância de espécies é menor, refletindo a condição de maior
estabilidade do ambiente (Whittaker, 1972). No complexo estuarino, por exemplo, a
dominância de copépodes ou das larvas de Brachyura é bem acentuada. Tal dominância
é menor para a amostragem realizada na plataforma interna, refletindo em valores
maiores de eqüitatividade.
A ausência de relação entre esses fatores e a presença da bactéria também se dá
devido a concentração de bactérias associadas ao zooplâncton. Novamente, tais fatores
podem estar correlacionados com a densidade de Vibrio cholerae associada ao
zooplâncton, mas não interferem na presença/ausência da bactéria.
Além de reportar informações sobre a interação zooplâncton-Vibrio cholerae, o
presente estudo contribuiu para acrescentar dados sobre a ecologia do zooplâncton,
principalmente para o complexo estuarino de Santos-Bertioga, região carente em
pesquisas na área da planctologia, podendo ser citados apenas os trabalhos de Carvalho
(1939, 1940 e 1952) e de Moreira (1969) para a baía de Santos. Poucos estudos
realizados na área também focaram em grupos zoológicos específicos (Sinque, 1976;
Rocha, 1982 e 1983). Já para a plataforma continental sudeste, os dados fortalecem o
conhecimento sobre o plâncton, que fora objeto de estudo de diversos trabalhos
(Brandini et al., 1997; Lopes et al., 2006).
84
6.2) O método de imunofluorescência direta (DFA) e detecção dos

sorogrupos O1 e O139.
O método mostrou-se adequado e de rápida obtenção de resultados, custo

relativamente baixo e rápida padronização. O “kit”, fornecido pela empresa New
Horizons Diagnostic é comercializado desde 1992 para o sorogrupo O1 e 1995 para o
sorogrupo O139, sendo que resultados obtidos com o mesmo foram publicados por
vários autores (Colwell et al., 1992; Hasan, et al., 1994; Chowdhury et al., 1995; Rubin,
2000; Gonçalves et al., 2004 a; Alam et al., 2006).
Embora o “kit” tenha sido desenvolvido para testes em amostras clínicas e de
águas contaminadas (esgotos, rios, entre outros), a utilização da técnica em amostras de
plâncton tem sido satisfatória (Huq et al., 1990; Binsztein et al., 2004; entre outros). É
necessário apenas padronizar um protocolo para ser utilizado em amostras de plâncton.
A amostra deve ser macerada e diluída em solução tampão, além de ser cuidadosamente
homogeneizada antes do uso.
Entretanto, o sitio de ligação do anticorpo monoclonal na molécula LPS 139
não foi elucidado1, o que poderia resultar em reação cruzada para esse sorogrupo com
outros LPS (e.g. se o sitio de ligação for no “core” da molécula, a probabilidade de
reação cruzada com outros sorogrupos é alta, levando a resultados do falso-positivos).
Portanto, os resultados obtidos para o sorogrupo O139 relatados no presente
trabalho devem ser considerados com devida cautela até que ensaios mais específicos
sejam realizados (técnicas de identificação através do genoma como o “PCR
multiplex”).
É importante que as amostras de plâncton ou de espécies testadas isoladamente
sejam cuidadosamente separadas e lavadas, a fim de evitar contaminação por bactérias
livres ou associadas às outras frações que não correspondam ao zooplâncton, como
fitoplâncton e matéria orgânica particulada. A eficiência da lavagem na remoção de
bactérias associadas foi observada através de microscopia de varredura por Huq et al.
(1983). Porém, as fotografias não podem cobrir toda a superfície do animal e bactérias
aderidas a regiões mais protegidas continuariam associadas, além de que a lavagem não
remove as bactérias associadas internamente.
1
Cheryl Trudil, representante da New Horizons Diagnostics Corp.; mensagem recebida por
zedu@io.usp.br em 08/2007.
85
As bactérias nas amostras fixadas em formaldeído podem romper ou serem

lentamente degradas, havendo perda da parede celular e seus componentes como os
LPS, essenciais para detecção através do DFA. Os lipopolissacarídeos das bactérias
gram negativas são as moléculas mais abundantes na parede celular (Siebling et al.,
1984), o que possivelmente é o principal fator que permite que células de Vibrio
cholerae possam ser detectadas em amostras fixadas e armazenadas durante mais de 10
meses.
Ainda que o método tenha apresentado bons resultados em amostras fixadas
neste estudo e em trabalhos anteriores (Brayton & Colwell, 1987; Huq et al., 1990), é
recomendável que a mesma seja aplicada em amostras frescas de plâncton, como
realizado no método de DVC-DFA. É sugerido no presente estudo que o DFA em
amostras fixadas seja realizado no menor tempo possível após a fixação, a fim de evitar
a perda da adesão e integridade das bactérias. A filtração do macerado, para remover
partículas maiores também é sugerido, para facilitar a visualização dos resultados.
A grande vantagem do DFA é de ser um dos melhores métodos quando se
trabalha com amostras fixadas. Metodologias que dependem de ácidos nucléicos não
são recomendadas, pois o formol degrada essas estruturas, dificultando a extração e
ainda inibindo a Reação em Cadeia da Polimerase (Romero, 1994; Douglas, 1997; Erin
Lipp, comunicação pessoal2). Tentativas de padronizar um protocolo de extração de
ADN, a partir de amostras de zooplâncton fixadas foram realizadas durante o percurso
dessa dissertação, mas não forneceram resultados satisfatórios.
As altas taxas de detecção dos sorogrupos O1 e O139 são um alerta sobre a
qualidade do ambiente, embora não seja o suficiente para afirmar que a área de estudo
esteja comprometida do ponto de vista da presença de víbrios patogênicos.
6.3) Bactérias viáveis e viáveis não cultiváveis (VNC)
O estágio VNC é comumente encontrado em amostragens ambientais (Martins et

al., 1993; Rivera & Rubin, 1997; Rubin, 2000; Binsztein et al., 2004; Gonçalves, et al.,
2004 a; entre outros). A presença desse estado metabólico ocorre quando bactérias não
2
Lipp, E., PhD, University of Georgia. Mensagem recebida por zedu@io.usp.br em 15/11/2006.
86
são detectadas por métodos convencionais de cultivo, mas são encontradas através de
métodos de biologia molecular como DFA, PCR ou citometria de fluxo.
No presente trabalho foi possível visualizar Vibrio cholerae O1 e O139 no
estágio VNC, a partir do método DVC-DFA (Figura 64). O método de DFA, quando
empregado com amostras fixadas, apresentou resultado satisfatório, porém a refletância
detectada pelo microscópio de imunofluorescência foi menor, dificultando a captura de
imagens de boa qualidade tanto de bactérias viáveis quanto não viáveis (Figura 63).
Bactérias no estágio viável foram mais fáceis de visualizar devido ao maior
tamanho, forma vibrióide da célula, e maior refletância, tanto em amostras fixadas
quanto no experimento de DVC-DFA (Figuras 62 e 63). É nítida a vantagem da
utilização do ácido nalidíxico no método de DVC-DFA, pois as bactérias apresentaram
um comprimento de cerca de 2 a 4 vezes maior do que o comum para víbrios viáveis
(cerca de 6 a 15 µm Figura 62).
O sinal de detecção é mais fraco quando as bactérias se encontravam no estado
VNC, pois as mesmas diminuem drasticamente de volume (Chaiyanan, 2002). Por esse
motivo o método DVC-DFA ou a utilização de amostras frescas torna-se mais
apropriado. A visualização das bactérias sobre o exoesqueleto de crustáceos também
tornou-se difícil (Figura 63 b). Os controles positivos fornecidos pelos kits apresentaram
melhores resultados, pois foram utilizadas bactérias viáveis, fixadas em solução de
formaldeído a 2% (Figura 63 a).
A maioria das bactérias onde o fenômeno VNC foi registrado pertence à
B C
subclasse das γ-Proteobacteria, espécies gram-negativas. Enterobactérias e bactérias
heterotróficas adaptadas a ambientes oligotróficos estão classificadas nesse grupo e por
sua vez são dominantes em ambientes aquáticos naturais (Gauthier, 2000), uma forte
evidência de que o estado VNC é um mecanismo de persistência e que provavelmente
conferiu vantagem evolutiva a essas bactérias.
Embora o estágio viável tenha sido identificado em associação com copépodes
(Huq et al., 1983), a maioria dos estudos aponta que essas bactérias geralmente se
apresentam no estado VNC, quando associadas externamente a esses animais (e.g. Huq
et al., 1990; Signoretto et al., 2004 e 2005).
87
6.4) Detecção de sorogrupos toxigênicos sobre o plâncton
Trabalhos publicados que utilizaram o método de imunofluorescência direta em

amostragens ambientais foram comparados quanto aos índices de detecção dos
sorogrupos O1 e O139 em amostras de plâncton.
Gonçalves et al. (2004 a) detectaram a presença do sorogrupo O1 em 71,1% e do
O139 em 32,7% das amostras de zooplâncton coletadas em estuários no Maranhão. O
trabalho confirma a dispersão do sorogrupo O139 para o Estado, onde não havia sido
registrado anteriormente nesse tipo de reservatório.
Vibrio cholerae não-O1 também foi isolado do zooplâncton na baía de São
Marcos e São Luis, Maranhão e as bactérias analisadas quanto à presença dos genes
toxigênicos (Gonçalves et al., 2004 b). Uma grande diversidade genética foi encontrada,
embora os genes ctx, ace e zot, principais fatores de virulência, não tenham sido
detectados.
Em trabalho preliminar no complexo estuarino de Paranaguá, durante o outono
de 1999, o sorogrupo O1 foi detectado em 70% das amostras de zooplâncton e o
sorogrupo O139 não foi detectado (Lopes & Rivera, em preparação). Um surto de
cólera ocorria na região na época deste trabalho (Passos, 1999). Embora os autores não
tenham determinado os fatores de virulência, as bactérias associadas ao plâncton
apresentam grande probabilidade de serem toxigênicas devido ao surto.
Em ambientes de água doce, Huq et al. (1990) detectaram a presença de Vibrio
cholerae O1 em 63% das amostras de plâncton em Bangladesh, num estudo de
monitoramento com coletas quinzenais entre 1987 e 1990. Alam et al. (2006 a)
encontraram o sorogrupo O1 em 19,1% e o O139 em 11,2% das amostras de
zooplâncton de lagoas e rios em Bangladesh. A presença dos sorogrupos sobre o
zooplâncton também foi monitorada em 6 lagoas utilizadas pela população local em
Mathbaria, Bangladesh. Vibrio cholerae O1 foi detectada em 55,6% e V. cholerae O139
em 35,3 % das amostras (Alam et al., 2006 b). Huq et al. (1995) ainda observaram a
ocorrência simultânea dos sorogrupos O1 e O139 numa mesma amostra de plâncton,
fato também demonstrado neste trabalho para 75% das amostras processadas no
complexo estuarino.
Com base em trabalhos anteriores, como o de Rubin (2000), esperava-se que o
sorogrupo O1 fosse encontrado com maior freqüência que o O139. A autora encontrou o
sorogrupo O1 em 70,8% e o O139 em 23% das amostras de copépodes no canal de São
88
Sebastião, enquanto que Gonçalves et. al. (2004 a) detectaram o grupo O1 71,1% e o
grupo O 139 em 32,7% das amostras de zooplâncton em um sistema estuarino. Valores
máximos encontrados na baía de Chesapeake (Estados Unidos) ocorreram no verão e
outono de 1999, atingindo até 77,8 % para Vibrio cholerae O1 em amostras de plâncton
(Louis et al., 2003). Os resultados encontrados para a região estuarina de Santos
demonstram um maior número de detecções, principalmente para o sorogrupo O139.
Um total de 52 amostras totais foram analisadas, sendo que 88,1% foram positivas para
o sorogrupo O1 enquanto que 76,9% foram positivas para o O139. O valor encontrado
para o sorogrupo O 139 é o mais alto até o momento, com base na literatura pesquisada.
Os elevados valores podem ser justificados pela natureza do ambiente, um estuário que
apresenta as condições ideais para a sobrevivência de Vibrio cholerae e pela presença
do porto de Santos, porta de entrada para diversas cepas de diferentes localidades
diariamente.
Já nas estações amostradas na plataforma continental adjacente, 75% foram
positivas para o grupo O1 e 81% para o O139 durante o inverno (setembro de 2005).
Para o verão (março de 2006), 57% foram positivas para O1 e 50% para O139. Essas
proporções também são bastante elevadas, uma vez que representam locais de
amostragem na plataforma interna, entre cerca 15 a 80 quilômetros de distância da
costa. Vale ressaltar que este é o primeiro estudo que detectou o sorogrupo O139 para a
Baixada Santista e plataforma adjacente e o segundo para ambientes costeiros de
plataforma na região sudeste do Brasil, através do método de DFA. É necessária a
confirmação
A quantidade de bactérias detectadas geralmente foi maior para as amostras do
complexo estuarino. Para a maioria das amostras, uma escala categórica da quantidade
de bactérias foi utilizada, o que permite dizer que as estações estuarinas provavelmente
apresentaram uma densidade de Vibrio cholerae em associação com o zooplâncton
maior do que as estações costeiras.
A seguinte Tabela fornece uma síntese dos trabalhos que utilizaram a técnica de
DFA para detectar Vibrio cholerae O1 e O139 sobre o zooplâncton.
89
Tabela 15: Detecção (%) de Vibrio cholerae O1 e O139 sobre o plâncton

estuarino e costeiro em diversas amostragens ambientais. + : Os autores não
forneceram dados quantitativos; S.D. : Ausência de dados; V.c.: Vibrio cholerae
Autor Plâncton estuarino Plâncton costeiro
V.c. O1 V.c. O139 V.c. O1 V.c. O139
Martins et al. (1993) S.D. S.D. + S.D.
Rivera & Rubin (1997) S.D. S.D. 37,2 S.D.
Lopes & Rivera (em prep.) 70 0 S.D. S.D.
Rubin (2000) S.D. S.D. 70,8 23
Louis et al. (2003) 25,9 S.D. S.D. S.D.
Binsztein et al. (2004) 21,4 S.D. 35,7 S.D.
Gonçalves et al. (2004 a) 71,1 32,70 S.D. S.D.
Presente pesquisa 88,1 76,9 66,7 66,7
Dados de presença do sorogrupo O1 na água na região de Santos e São Sebastião

foram obtidos desde 1981 (Martins, 1988), porém o método utilizado foi o isolamento
das cepas através de cultivo em meio APA. De 288 amostras de água do mar analisadas,
166 foram positivas para Vibrio cholerae, porém apenas 11 cepas do sorogrupo O1
foram isoladas. As técnicas mais atuais de DFA e PCR fornecem valores maiores de
detecção, pois são capazes de revelar pequenas concentrações de bactérias, além de
detectarem os organismos no estágio VNC.
Souza (2007) encontrou a bactéria associada ao zooplâncton em 4 amostras
coletadas em diferentes estações sobre a baía e canal de Santos. A autora também isolou
o sorogrupo O1 de 5 cepas de amostras de zooplâncton provenientes de água de lastro,
sendo duas amostras do porto de Santos. Em ambas as amostras as cepas também foram
encontradas nas amostras de água. Porém não há nenhuma informação de como foi
tratada a amostra de zooplâncton posteriormente ao cultivo e isolamento em meio de
cultura. Para afirmar que as cepas estavam associadas ao zooplâncton seria necessário
separar determinados indivíduos da amostra, a qual contém outras frações que poderiam
interferir no resultado (fitoplâncton, trípton, material orgânico particulado, entre outros).
Nesta atual dissertação, os táxons zooplanctônicos foram devidamente preparados e
analisados, confirmando a adesão das bactérias aos animais, nas amostras totais que
foram previamente testadas e positivas. Também é levantada nesse estudo a hipótese da
introdução de Vibrio cholerae O139 na região da Baixada Santista e plataforma
adjacente, através da água de lastro, repetidas vezes, o que poderia justificar os elevados
valores de detecção. O porto de Santos recebe anualmente quantidades enormes de água
de lastro, mais de 2 milhões de metros cúbicos em apenas 7 meses (Germano, 2007),
fato que auxilia a hipótese de introduções recorrentes.
90
Segundo Vital Brazil et al. (2002), as cepas ambientais isoladas em diversos

Estados brasileiros possuem grande polimorfismo para VPI e CTX e as bactérias do
sorogrupo O1 isoladas do ambiente podem ser provável fonte de transferência
horizontal de genes, resultando no surgimento de novas cepas com potenciais
epidêmicos.
É importante ressaltar que a presença de grupos toxigênicos de Vibrio cholerae
não corresponde necessariamente com a presença da bactéria patogênica na região de
estudo. Os lipopolissacarídeos de membrana O1 e O139 são favoráveis a patogenicidade
das bactérias e possuem atitividade citotóxica, podendo ser citados também como um
fator virulência (Chatterjee & Chaudhuri, 2005), embora os mesmos não sejam
determinantes da patogenicidade.
Outro fato importante é a soroconversão de cepas não-O1 em O1 (Colwell et al.,
1995), através de mutações dos genes que controlam a expressão do LPS, que aliada à
transmissão horizontal de genes toxigênicos, pode transformar bactérias não patogênicas
em potencialmente patogênicas.
Conforme apontado anteriormente, uma bactéria da espécie Vibrio cholerae
necessita de vários fatores para ser patogênica. Portanto, a detecção dos sorogrupos O1
e O139 apenas não fornece informação suficiente sobre a patogenicidade das bactérias.
Um estudo posterior seria necessário para identificar os fatores de virulência associados
aos sorogrupos O1 e O139 e para verificar se a presença dessas bactérias pode
comprometer a qualidade microbiológica da água do mar na região de Santos.
6.5) Presença de Vibrio cholerae em relação aos parâmetros ambientais
Os menores índices de detecção dos sorogrupos durante as campanhas na

plataforma interna provavelmente devem-se a vários fatores como a transparência e
salinidade mais elevadas, menor concentração de nutrientes dissolvidos na água e menor
quantidade de matéria orgânica dissolvida e particulada.
Sabe-se que a radiação induz o estágio VNC e pode levar as bactérias à morte.
Esses efeitos foram analisados nas camadas superficiais de corpos de água (Chamberlin
& Mitchell, 1978; Barcina et al., 1989 e 1990; entre outros) Portanto, a radiação pode
interferir nos resultados de detecção das bactérias, pois pode reduzir o número e
viabilidade das mesmas. No complexo estuarino, a penetração de luz variou entre menos
de 1 a 2,5 metros, enquanto que na plataforma os valores variaram entre 1,5 a mais de
91
25 metros (Saldanha, com. pessoal)3, dependendo da distância da costa, evidenciando

que o efeito da penetração de luz foi mais intenso no segundo ambiente. Tal fator pode
ter sido um dos responsáveis pelos índices mais baixos de detecção para a plataforma
adjacente quando comparada com o estuário. Essa hipótese é baseada em literatura onde
o objeto de estudo foram as bactérias livres, e não as associadas a substratos como o
zooplâncton. As bactérias associadas provavelmente devem sofrer um impacto menor
da radiação, devido ao sombreamento fornecido pelo substrato irregular (zooplâncton).
Diversos trabalhos enfatizaram a importância do aumento da temperatura para a
sazonalidade de Vibrio cholerae, sendo que a bactéria é mais abundante nos meses mais
quentes (Colwell, 1996; Louis et al., 2003; Huq et al., 2005). No presente estudo, os
valores de temperatura da água analisados não foram positivamente correlacionados
com a detecção das bactérias (Tabelas 9 e 10), sendo que o espectro de valores
encontrado, entre 17 e 28ºC (valores pontuais, mínimo e máximo encontrado levando
em consideração ambos os ambientes analisados), permite o crescimento normal de V.
cholerae (Colwell & Huq, 1994).
Souza (2007) concluiu em seu trabalho que a salinidade não influenciou a
prevalência de víbrios sobre o zooplâncton. Quanto à concentração de víbrios, foi
registrada uma redução para as amostras de zooplâncton provenientes de águas costeiras
e oceânicas, ou seja, as que apresentaram valores de salinidade superiores a 33. A
temperatura, entretanto, não apresentou influência na detecção de víbrios. A autora
ainda afirma que para a maioria das amostras (75%) onde a bactéria foi detectada, a
mesma ocorreu em salinidades superiores a 33, sendo que esse fator variou entre 4,8 e
36,9 e a temperatura entre 20 e 32ºC.
A associação de Vibrio cholerae com a carapaça de crustáceos aumenta a
resistência da bactéria a variações de temperatura e pH (Castro-Rosas & Escartín,
2005), o que auxilia a justificar que a temperatura não está relacionada com os índices
de detecção. A adesão das bactérias a quitina também aumenta a resistência a exposição
a ácidos, sugerindo uma maior resistência a acidez do trato digestório (Nalin et al.,
1979). Essa hipótese foi confirmada por Colwell et al (1996), que descobriram a
reversibilidade de V. cholerae, do estado VNC para o viável cultivável no intestino
humano.
3
Dra. Flávia Marisa P. Saldanha-Corrêa, Laboratório de Fitoplâncton e Produção Primária do IOUSP.
92
Vibrio cholerae pode sobreviver em valores muito diversos de salinidade, entre

0,1 e 45 (Singleton et al., 1982 a e b; Miller et al., 1984; Gauthier, 2000). Também é
descrito que salinidades elevadas (acima de 35) passam a ser um fator de estresse no
crescimento dessas bactérias, o que pode ser verificado por valores menores de p para as
amostras da plataforma (0,25 para O1 e 0,16 para O139). A variação de salinidade entre
o estuário e a plataforma foi significativa (p < 0,001) e das variáveis analisadas
possivelmente foi a que pode ter sido responsável pelos resultados negativos de
detecção, já que valores superiores a 35 foram encontrados principalmente na campanha
de março de 2006, onde os níveis de detecção foram os mais baixos. O fato de que todas
as espécies patogênicas de Vibrio estão adaptadas à ambientes com salinidade entre 5 e
30 (Colwell, 1996) reforça a hipótese.
A influência da disponibilidade de matéria orgânica na sobrevivência e
viabilidade de Vibrio cholerae também foi pesquisada (Miller et al., 1984; Singleton a e
b 1982). A baixa concentração de matéria orgânica na água do mar (cerca de 1 a 15 mg
de carbono por litro) induz o estado VNC. Também sabe-se que o víbrio possui
estratégias metabólicas que auxiliam a sobrevivência em ambientes oligotróficos, como
o armazenamento de polifosfato (Jahid et al., 2006), embora necessitem de altas
concentrações de nutrientes quando viáveis. O gradiente de nutrientes, reduzindo em
direção ao oceano, também deve favorecer a redução da detecção de víbrios. Não foi
possível obter os dados de nutrientes e matéria orgânica do projeto ECOSAN durante a
elaboração desta dissertação.
Das 52 amostras analisadas para o complexo estuarino, apenas 5 foram negativas
para Vibrio cholerae O1 e 9 para O139. O valor muito baixo de amostras negativas
nesse ambiente dificultou as análises estatísticas, na tentativa de descobrir a
significância das variáveis analisadas quanto à presença das bactérias. Os resultados
negativos estão distribuídos entre os dois grupos de estações bem delimitados (Figuras
42 e 43), canal de Bertioga com 7 e baía e canal de Santos com 6 resultados negativos
Esses números elevados levam à conclusão de que essas variáveis não foram
importantes na presença da bactéria em associação com o zooplâncton no ambiente
estuarino.
As estações 5 e 6 correspondem aos pontos de coleta no canal de Santos.
Embora essa seja a região mais impactada em termos de substâncias tóxicas como
compostos clorados, metais pesados e surfactantes (Abessa et al., 2005), ela apresentou
os maiores valores de detecção para ambos os sorogrupos (100% para O1 e 87,5% para
93
O139, n = 8). Tal resultado reforça a hipótese de que a associação de Vibrio cholerae
aos animais do zooplâncton aumenta a sobrevivência das bactérias e conferem maior
proteção contra essas substâncias, provavelmente devido à indução ao estágio VNC
(Chowdhury et al., 1997; Alexander et al., 1999). Porém, a concentração de poluentes
no momento da coleta na coluna de água não é conhecida e talvez não fosse suficiente
para causar algum efeito sobre os víbrios aderidos ao zooplâncton.
Ainda para o complexo estuarino, embora houvesse variabilidade entre as
variáveis ambientais analisadas como temperatura e salinidade (Tabela 3, Figuras 42 e
43), elas não estiveram correlacionadas com a detecção dos sorogrupos O1 e O139
(Tabela 9), os quais estiveram presentes em elevadas proporções em todos os casos
estudados.
Para a plataforma continental adjacente, os índices de detecção para ambos os
sorogrupos foram mais baixos. De 30 amostras analisadas, somando-se as duas
campanhas, 10 foram negativas para o sorogrupo O1 e O139, resultando em 66,67 % de
amostras positivas. Sete amostras foram negativas durante a campanha de inverno, e 13
foram para o verão. Esses resultados podem ser relacionados à variabilidade de fatores
abióticos analisados, quando comparados entre as campanhas de inverno e verão. A
salinidade foi, das variáveis analisadas, a mais provável de estar relacionada com os
índices de detecção. Durante o verão os valores foram de 35,18 ± 0,42, chegando a 37
para a estação mais distante da costa, enquanto que para o inverno a média foi de 32,23
± 0,34.
Os dendrogramas forneceram 3 agrupamentos de estações para a campanha de
inverno, sendo que a divisão corresponde com a distância da costa (um grupo mais
interno, um intermediário e um mais externo). O primeiro e segundo grupo
representaram 6 dos 7 resultados negativos, enquanto que o agrupamento de estações
mais externas representaram apenas um resultando de ausência das bactéria. Deve-se
levar em consideração que esse último agrupamento foi composto apenas por 3
estações, enquanto que o primeiro e segundo foram compostos por 7 e 6 estações
respectivamente. Já para a campanha de Verão é possível visualizar dois agrupamentos
distintos, também formados em relação à distância da costa. Ambos os grupos se
comportaram de maneira semelhante quanto a distribuição dos resultados negativos.
Por fim, conclui-se que a temperatura não influenciou a presença de Vibrio
cholerae sobre o zooplâncton, enquanto que a salinidade apresentou valores de
94
probabilidade significativos, sendo que quanto mais altos os valores de salinidade,

menores os índices de detecção.
6.6) Especificidade da associação entre Vibrio cholerae e táxons

zooplanctônicos e adesão aos diversos substratos
Devido ao método de coleta do zooplâncton, as bactérias aderidas aos

microcrustáceos, a outras partículas ou livres na água do mar poderiam ter contaminado
as amostras de outros táxons, quando testados isoladamente. Para diminuir o risco de
contaminação, foram introduzidas as etapas de lavagem dos animais triados e só foram
consideradas positivas as amostras que apresentaram as bactérias em 5 ou mais campos
visuais.
A análise em nível específico entre a associação dos víbrios e o zooplâncton foi
pouco estudada. São inéditos os dados de detecção dos sorogrupos para as espécies
Acartia lilljeborgi, Temora turbina, T. stylifera, Labidocera fluviatilis e Penilia
avirostris. Resultados positivos inéditos também foram encontrados para outros grupos
zoológicos como os Chaetognatha (Parasagitta spp.), larva pluteus de Echinodermata,
larvas de Polychaeta e ovos de peixes. Tais dados demonstram o sucesso de colonização
da bactéria a substratos variados e ausentes de quitina, como é o caso da superfície dos
ovos de peixes e larvas de equinodermos. É normalmente considerado que a associação
entre víbrios e organismos planctônicos seja mais comum nos artrópodes devido ao
exoesqueleto quitinoso, o que resultou em um enfoque maior nesses grupos (Huq et al.,
1984; Tamplin et al., 1990; Louis et al., 2003; Binsztein et al., 2004; Huq et al., 2005).
Resultados obtidos neste estudo mostram que táxons provenientes de outros filos
também podem ser colonizados.
Mesmo os microcrustáceos planctônicos foram estudados de maneira parcial
quanto à detecção das bactérias, sendo que a atenção foi focada nos copépodes e
cladóceros (Kaneko & Colwell, 1975; Huq et al., 1984; Huq et al., 1986),
desconsiderando a presença das bactérias em outros grupos de invertebrados marinhos
(Huq et al., 1983; Tamplin et al., 1990; Huq et al., 2005). No presente estudo foram
obtidos resultados positivos com diversos grupos de larvas de Decapoda, anfípodes,
juvenis de misidáceos e larvas de cirripédios.
Ainda sim, os crustáceos apresentaram as maiores taxas de detecção,
provavelmente devido à interação entre Vibrio cholerae e a quitina (Meilbom et al.,
95
2004 e 2005). Esse polissacarídeo também reveste parte do trato digestório de

crustáceos da classe Malacostraca (Rupert & Barnes, 1996) e copépodes (Mauchline,
1998) permitindo a associação de V. cholerae tanto internamente quanto externamente
aos animais desse subfilo. Durante o processo de digestão, bactérias internas aos
copépodes encontram um microcosmo rico em nutrientes, o que favorece o crescimento
(Tang, 2005). Essas bactérias podem ser envolvidas por quitina, durante o processo de
formação das pelotas fecais e serem eliminadas dos animais.
Tal condição supriria a necessidade de nutrientes além de proporcionar um
ambiente rico em quitina para os víbrios. A associação com pelotas fecais também
representaria um mecanismo de transporte das bactérias para o sedimento e ainda uma
possível via de contágio para animais filtradores e suspensívoros. Pesquisas sobre a
transmissão vertical da bactéria na trama trófica aquática são necessárias, para
determinar o possível contágio através da interação entre presas e predadores.
Os víbrios também apresentam uma grande capacidade de colonização de
superfícies livres de quitina, sendo encontrados também em micro e macroalgas,
colonizando substratos silicosos e perifíticos (Islam et al. 1989).
A detecção em grupos animais que não produzem quitina pode ser justificada
através da colonização de diversos tipos de substratos, presença da bactéria no trato
digestório associada diretamente ao epitélio ou aderida ao alimento ingerido.
O amido por exemplo, é um substrato que vem sendo estudado para o tratamento
da cólera, pois os víbrios aderem aos grãos, o que remove até 98% das células livres
numa solução (Gancz et al., 2005). Halpern et al. (2003) descobriram que Vibrio
cholerae também é capaz de colonizar e degradar a matriz de açúcares que envolvem
os ovos de insetos da família Chironomidae.
Quitina de diversas fontes, testas fragmentadas de diatomáceas, celulose,
pectina, além de 35 espécies de algas e fanerógamas marinhas e substratos artificiais
foram testados quanto a adesão de Vibrio cholerae (Hood & Winter, 1997). As bactérias
apresentaram adesão a todos os substratos naturais, exceto algumas espécies de algas
vermelhas. Substratos artificiais como acetato de celulose, nylon, poliéster, poliuretano
entre outros semelhantes não apresentaram associação.
Aspectos anatômicos, morfológicos, fisiológicos e ecológicos dos organismos
zooplanctônicos estudados são discutidos a seguir para a elaboração de hipóteses que
justificasse a presença ou ausência de associação com Vibrio cholerae.
96
Os foraminíferos são protistas tecados, as células são revestidas por uma

estrutura formada principalmente por carbonato de cálcio ou de uma matriz orgânica
aglutinante (Brusca & Brusca, 2003). Ambos os casos representam substratos viáveis
para colonização por bactérias. Embora esses protistas se alimentem de bactérias como
Vibrio (Nomaki et al., 2006), essas podem estar aderidas à teca de maneira que estejam
fora de alcance dos reticulópodes.
A ausência da detecção de Vibrio cholerae no dinoflagelado Noctiluca
scintillans necessita de mais estudos afim de elucidar esse resultado (apenas três testes
foram realizados), já que uma diversidade de bactérias endocíticas foram identificadas
para a espécie (Seilbold et al., 2001), inclusive bactérias do gênero Vibrio. Ainda não há
estudos sobre a interação entre Noctiluca e V. cholerae.
Já a ausência da detecção das bactérias em hidromedusas pode ser justificada
pela produção de compostos de ação antimicrobiana. A presença de substâncias que
inibem o crescimento bacteriano já foi registrada para algumas medusas (Titelman et
al., 2006; Ovchinnikova et al., 2006).
A associação entre Vibrio cholerae e larvas de Polychaeta era esperada, já que
esses animais possuem estruturas rígidas e compostas por quitina (além de
escleroproteínas e outros compostos), como as cerdas e a cutícula que reveste
externamente o epitélio dos animais (Purschke, 2002). Essas larvas podem ser muito
abundantes em determinadas épocas, servindo como um reservatório natural de víbrios.
A ocorrência de víbrios em diversas espécies de moluscos filtradores já foi
documentada exaustivamente (Dutt et al., 1971; Miller et al., 2006; Souza, 2007; entre
outros). Também sabe-se que bivalves bioacumulam bactérias, dependendo da
disponibilidade das mesmas no ambiente (Marino et al., 2004). As bactérias estão
associadas tanto no corpo do animal quanto nas conchas. A presença de quitina na
constituição das conchas dos moluscos (Machado et al., 1991) muito provavelmente
auxilie na associação de víbrios na superfície dessas estruturas.
No presente estudo foram analisadas as larvas das classes Bivalvia e Gastropoda,
enquanto que a literatura sempre focou na análise dos organismos adultos. Os resultados
foram negativos e necessitam de mais estudos para confirmação da ausência da bactéria
em véligers, devido ao número reduzidos de testes (n = 3).
O alto índice de detecção em quetognatos (57,1% para O1 e 71,4% para O139)
pode ser explicado devido à presença de quitina na constituição dos ganchos e cirros
bucais (Hyman, 1958). Animais vorazes, chegam a ingerir as presas por inteiro
97
(copépodes, outros crustáceos e até outros quetognatos). Foram selecionados animais

que não apresentavam conteúdo estomacal visível ao estereomicroscópio, para evitar
que a detecção possivelmente ocorresse devido a bactérias associadas às presas. Uma
hipótese é de que bactérias associadas às presas sobrevivam e se associem internamente
ou externamente aos quetognatos. Tal questão necessita de mais estudos para ser
explorada. Além disso outras espécies de víbrios, como Vibrio alginolyticus, são
comensais em quetognatos e produzem a tetrodotoxina, utilizada pelos animais para
paralisar suas presas (Thuesen et al., 1998), reforçando a hipótese de que V. cholerae
também se adere a esses animais.
A presença das bactérias nas larvas do tipo pluteus de equinodermos foi
inesperada, pois o grupo não sintetiza quitina. Porém os pluteus desenvolvem um
esqueleto interno de carbonato de cálcio. Em estágios mais avançados, as porções
terminais de algumas espículas são expostas, devido à retração dos braços. Além disso,
larvas próximas ao estágio de metamorfose também podem apresentar placas calcárias
exteriorizadas (Emlet et al., 2006), que serviram de substrato para fixação de bactérias.
Algumas larvas do tipo pluteus, presentes nas classes Ophiuroidea e Echinoidea,
são lecitotróficas, enquanto que outras se alimentam de células do fitoplâncton (Byrne
& Selvakumaraswamy, 2006; Emlet et al., 2006). Uma das espécies mais comuns de
equinóides na costa brasileira, Lytechinus variegatus, é planctívora e se alimenta por
filtração. A presença de Vibrio cholerae talvez esteja relacionada com o hábito
alimentar filtrador dessas espécies, ainda que literatura sobre bactérias como ítem
alimentar dessas larvas não tenha sido encontrada.
A presença das bactérias em apendiculárias pode ser justificada devido à grande
quantidade de muco produzido pelos animais, que agregaria diversos microorganismos.
A “casa” de muco é uma estrutura complexa utilizada na alimentação dos animais e
constantemente descartada e produzida (Alldredge, 1976). Essas estruturas
correspondem a um importante compartimento que forma a neve marinha (Hansen et
al., 1996) e que serve de substrato para a microbiota associada. Embora os animais
tivessem sido cuidadosamente separados e lavados, certa quantidade de muco (onde as
bactérias estariam presentes) pode ter sido macerada juntamente com os organismos. As
bactérias também poderiam estar colonizando a superfície dos animais. Análises como
microscopia de varredura são necessárias para confirmar essa idéia.
98
Além disso, as bactérias podem ter sido detectadas diretamente nos organismos,
por ser um dos recursos alimentares utilizado por esses larváceos (Alldredge, 1977),
capazes de se alimentar de células de até 0,1 µm de diâmetro.
As salpas apresentaram resultado negativo para o sorogrupo O1 e positivo para
O139. Os resultados se devem ao número muito baixo de testes com o grupo (n=1). Da
mesma maneira que as apendiculárias, a detecção pode ser resultado da atividade
alimentar do animal ou da produção de muco, que agregaria microorganismos presentes
na água.
É importante realçar a detecção de ambos os sorogrupos em ovos de peixes,
entre outros táxons, confirmando os resultados obtidos com as amostras fixadas.
Algumas espécies de Vibrio, como V. splendidus, V. alginolyticus, V. anguillarum e V.
fischeri, já foram registradas em ovos de peixes e no trato digestório das larvas (Verner-
Jeffreys et al., 2003; Miguéz & Combarro, 2003), embora a adesão de V. cholerae ainda
não tenha sido registrada.. Novamente, existiu um risco das bactérias detectadas estarem
associadas aos itens alimentares das larvas ou a eventual matéria orgânica particulada
para os testes realizados com amostras fixadas.
6.7) Relevância do projeto para a área de estudo
Vale ressaltar que o estudo de detecção dos sorogrupos patogênicos de Vibrio

cholerae sobre o plâncton é um dos pioneiros para a Baixada Santista. A detecção do
sorogrupo O139 para região é também um resultado inédito, de acordo com a revisão da
literatura. A técnica de detecção de bactérias toxigênicas em amostras ambientais
utilizando DFA também é pouco empregada para o litoral brasileiro em geral. A
velocidade de obtenção de resultados faz da técnica uma excelente ferramenta para
programas de monitoramento ambiental, necessárias em regiões altamente impactadas e
que abrigam grandes populações humanas como a Baixada Santista.
Embora a ingestão de plâncton seja mais comum associada ao uso de água doce,
(Huq & Colwell, 1996) organismos do plâncton marinho podem ser ingeridos
acidentalmente por banhistas em regiões onde ocorrem os sorogrupos O1 e O139. Como
a concentração dessas bactérias nos copépodes é elevada, bastaria apenas que as
mesmas fossem patogênicas para que haja possibilidade de desenvolvimento da doença
após a ingestão dos copépodes (Huq et al., 1983).
99
Outros fatores relevantes ao projeto ser executado nessa área é a presença do

porto de Santos, o maior porto brasileiro, recebendo navios de várias partes do globo. O
deslastre de águas estuarinas e costeiras de diferentes regiões é um fator de risco,
introduzindo sorogrupos toxigênicos e patogênicos de Vibrio cholerae. Sorogrupos não
O1, contendo os genes ctx e tcp foram encontrados em amostras de água de lastro
provenientes deste porto (Souza, 2007).
A região portuária também é receptora de vibriófagos, reservatórios naturais dos
genes que conferem a patogenicidade. A presença desses vírus, se confirmada para a
Baixada Santista, aumentaria ainda mais o risco de um surto de cólera ocorrer na região.
Populações de baixa renda em diferentes regiões da Baixada Santista não são
atendidas por nenhum tipo de tratamento de esgoto. Algumas dessas populações se
instalaram à beira do canal de Santos, além de ocupar outras regiões em meio ao
manguezal localizado nas cidades de Santos e Bertioga. Essas periferias contribuem
diretamente para o aporte de matéria orgânica e patógenos para o complexo estuarino de
Santos-Bertioga e áreas ao redor. Como um fator ainda mais relevante, o emissário da
cidade de Santos não atende a toda região e introduz poluentes e elevada carga de
nutrientes na baía de Santos. A elevada quantidade de matéria orgânica liberada pelo
emissário dentro da baía gera uma produção bacteriana muito elevada (Pinto, 2003).
Como conseqüência da alta concentração de nutrientes, a produção fito e zooplanctônica
na área de influência desses aportes deve ser mais elevada, o que aumentaria os riscos
de ingestão acidental da bactéria através da água do mar.
Além disso, outras espécies de víbrios patogênicos para o homem e emergentes
em relação à Vibrio cholerae, também foram encontrados associados ao zooplâncton,
como V. parahaemolyticus e V. vulnificus (Baffone, et al.. 2006).
Devido a todos esses fatores, a região deve ser monitorada. É recomendável uma
prospecção pelos grupos toxigênicos, seguida pela identificação dos elementos
genéticos de virulência, presente tantos nas bactérias quanto em vírus, como uma
medida de prevenção da ocorrência de surtos de cólera.
A detecção deve ser realizada em amostras de água, animais bentônicos
utilizados como recursos alimentares e principalmente em amostras de zooplâncton,
pois representam um importante e ainda subestimado reservatório de Vibrio cholerae.
100
7) CONCLUSÕES
O presente trabalho fornece o primeiro registro do sorogrupo O139 de Vibrio

cholerae para o complexo estuarino de Santos-Bertioga e para a plataforma
continental interna adjacente. O sorogrupo esteve presente em 76,8% das 82
amostras de plâncton analisadas, enquanto que o grupo O1 foi detectado em
81,7%.
Altos índices de detecção de ambos sorogrupos indicaram a possibilidade de

Vibrio cholerae patogênico estar amplamente distribuído tanto no complexo
estuarino de Santos-Bertioga quanto na plataforma adjacente, em associação
com o zooplâncton.
As bactérias se encontram associadas com diversos táxons que constituem a rica

comunidade zooplanctônica. A detecção dos sorogrupos em foraminíferos,
larvas de poliquetos, larvas pluteus de equinodermos, quetognatos e ovos de
peixes são dados inéditos e ampliam a diversidade de reservatórios naturais de
Vibrio cholerae no ambiente marinho.
A velocidade de obtenção de resultados obtidos pela técnica DFA demonstra ser

esta uma excelente ferramenta para programas de monitoramento ambiental,
necessárias em regiões altamente impactadas, que abrigam grandes populações
humanas ou possuem portos internacionais, como a Baixada Santista.
Aliada à técnica de DFA, devem também ser realizadas técnicas para

identificação dos fatores de virulência, (e.g. “real time PCR”), para determinar a
patogenicidade de Vibrio cholerae no ambiente amostrado.
A detecção dos sorogrupos O1 e O139 não apresentou relação (p > 0,1) com a
temperatura e variáveis biológicas (densidade Total, de crustáceos, do grupo
Copepoda, respectivas densidades relativas, diversidade e eqüitatividade)
estudadas.
101
Utilizando um nível de significância de 10%, pode ser notada a relação entre a

detecção de Vibrio cholerae com a salinidade, nos casos de V. cholerae O1 para
os dados analisados em conjunto e para a plataforma adjacente, ambos os
sorogrupos, quando analisadas profundidades distintas. As amostras que
apresentaram maiores valores de salinidade durante a amostragem na plataforma
foram negativas para ambos os sorogrupos.
102
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120
9) APÊNDICES
9.1) Temperatura
Tabela 9.1.1: Valores médios de temperatura, seguidos pelos respectivos desvios-padrão, para
as estações analisadas no complexo estuarino de Santos-Bertioga.
Estações Julho Agosto Outubro Novembro Dezembro
1 21,74 ± 0,18 21,95 ± 0,17 20,59 ± 0,37 21,44 ± 0,54 24,14 ± 0,47
2 21,75 ± 0,09 21,94 ± 0,12 20,65 ± 0,54 21,27 ± 0,47 23,99 ± 0,13
3 21,61 ± 0,06 21,79 ± 0,22 20,36 ± 0,15 21,4 ± 0,42 23,76 ± 0,46
4 21,81 ± 0,16 21,91 ± 0,22 20,80 ± 0,55 S.D. 24,11 ± 0,09
5 21,84 ± 0,06 21,98 ± 0,17 20,74 ± 0,39 S.D. 24,04 ± 0,07
6 S.D. 22,02 ± 0,06 20,82 ± 0,44 21,27 ± 0,46 23,92 ± 0,16
7 S.D. 22,42 ± 0,01 21,66 ± 0,22 22,01 ± 0,42 23,74 ± 0,47
8 S.D. 22,55 ± 0,02 21,67 ± 0,13 22,05 ± 0,66 23 ± 0,6
9 S.D. 22,66 ± 0,01 21,84 ± 0,10 22,1 ± 0,63 23,87 ± 0,05
10 S.D. 23 ± 0,20 22,13 ± 0,17 22,02 ± 0,49 23,36 ± 0,56
11 S.D. S.D. 21,78 ± 0,01 21,96 ± 0,33 23,8 ± 0,06
12 S.D. 23,01 ± 0,02 22,01 ± 0,10 21,98 ± 0,51 23,82 ± 0,17
Tabela 9.1.2: Valores de temperatura (média e desvio padrão) para

ambas as campanhas na plataforma adjacente.
Inverno Temperatura (°C) Verão Temperatura (°C)
1 20,57 ± 0,1 2 27,54 ± 0,48
3 20,17 ± 0,19 3 26,52 ± 1,33
4 20,16 ± 0,03 4 20,76 ± 0,04
5 19,74 ± 0,25 5 21,3 ± 3,52
6 20,47 ± 0,05 6 20,23 ± 3,17
7 20,45 ± 0,07 7 22,14 ± 2,90
8 20,32 ± 0,06 8 24,16 ± 2,98
9 20,2 ± 0,1 9 26,23 ± 1,48
10 20,31 ± 0,17 10 25,64 ± 1,79
11 20,35 ± 0,11 11 26,2 ± 1,99
12 20,37 ± 0,12 12 25,18 ± 2,7
14 19,52 ± 0,19 13 21,53 ± 3,21
15 19,79 ± 0,19 14 20,06 ± 3,04
16 20,46 ± 0,14 19 27,38 ± 0,31
17 20,62 ± 0,01
18 20,56 ± 0,11
121
9.2) Perfis horizontais de distribuição de temperatura
23.5º S 23.5º S
INVERNO 21 INVERNO
Bertioga
20.8
Bertioga
Santos Santos
17 17
20.6
18 18
Praia Grande 24º Praia Grande 24º
11 16 20.4 11 16
3 9 12 3 9 12
8 20.2
8
1 1
20
7 15 7 15
14 14
4 19.8 4
6 24.5º 24.5º
6
5 19.6 5
30 m 30 m
19.4
19.2
25º 19 25º
47º W 46.5º 46º 45.5º 47º W 46.5º 46º 45.5º
Figura 9.2.1: Valores de temperatura à 5 metros Figura 9.2.2: Valores de temperatura à 10

de profundidade, para a campanha de inverno. metros de profundidade, para a campanha de
inverno.
23.5º S 23.5º S
INVERNO INVERNO
Bertioga Bertioga
Santos Santos
17 17
18 18
11 16 11 16
3 9 12 3 9 12
8 8
1 1
7 15 7 15
14 14
4 4
6 24.5º 6 24.5º
5 5
30 m 30 m
25º 25º
47º W 46.5º 46º 45.5º 47º W 46.5º 46º 45.5º
Figura 9.2.3: Valores de temperatura à 15 Figura 9.2.4: Valores de temperatura à 20

metros de profundidade, para a campanha de metros de profundidade, para a campanha de
inverno. inverno.
122
23.5º S 23.5º S
27.4
VERÃO VERÃO
São Sebastião 26.7 São Sebastião
Bertioga Bertioga
26
Santos 11 25.3 Santos 11
Praia Grande 10 24º Praia Grande 10 24º
2 3 9 12 2 3 9 12
24.6
13 23.9 13
7 7
14
23.2 14
4 4
6 22.5 6
5 24.5º 5 24.5º
21.8
30 m 30 m
21.1
20.4
Estação hidrográfica 19.7 Estação hidrográfica
25º 19 25º
47º W 46.5º 46º 45.5º 47º W 46.5º 46º 45.5º

metros de profundidade, para a campanha de metros de profundidade, para a campanha
verão. de verão.
23.5º S 23.5º S
VERÃO VERÃO
Bertioga Bertioga
Santos 11 Santos 11
Praia Grande 10 24º Praia Grande 10 24º
2 3 9 12 2 3 9 12
13 13
7 7
14 14
4 4
6 6
5 24.5º 5 24.5º
30 m 30 m
Estação hidrográfica Estação hidrográfica
25º 25º
47º W 46.5º 46º 45.5º 47º W 46.5º 46º 45.5º

metros de profundidade, para a campanha de metros de profundidade, para a campanha de
verão. verão.
123
9.3) Salinidade
Tabela 9.3.1: Valores médios de salinidade, seguidos pelos respectivos desvios-padrão, para as
estações analisadas no complexo estuarino de Santos-Bertioga.
Estações Julho Agosto Outubro Novembro Dezembro

1 34,59 ± 0,17 33,41 ± 0,47 31,89 ± 1,31 31,59 ± 1,46 33,33 ± 0,47
2 33,98 ± 0,77 33,53 ± 0,33 31,69 ± 1,47 31,4 ± 1,72 31,19 ± 0,94
3 34,51 ± 0,19 33,81 ± 0,14 32,65 ± 0,86 30,9 ± 1,56 32,91 ± 1,07
4 34,17 ± 0,42 33,59 ± 0,24 31,42 ± 1,59 31,75 ± 1,85 31,52 ± 1,65
5 34,21 ± 0,19 33,64 ± 0,17 31,78 ± 0,86 S.D. 31,63 ± 1,52
6 S.D. 33,41 ± 0,13 30,9 ± 1,62 S.D. 30,31 ± 2,84
7 S.D. 32,76 ± 0,12 29,21 ± 2,01 32,91 ± 0,77 30,05 ± 5,49
8 S.D. 28,26 ± 0,22 24,42 ± 1,65 33,08 ± 0,65 21,84 ± 6,42
9 S.D. 28,51 ± 0,04 24,33 ± 1,47 32,93 ± 0,62 31,91 ± 0,92
10 S.D. 28,04 ± 0,13 23,76 ± 1,54 32,7 ± 0,68 22,9 ± 4,51
11 S.D. S.D. 24,55 ± 0,17 32,16 ± 0,71 24,32 ± 1,67
12 S.D. 28,38 ± 0,15 23,8 ± 0,52 32,22 ± 1,21 21,99 ± 2,51
Tabela 9.3.2.: Valores de salinidade (média e desvio padrão)

para ambas as campanhas na plataforma adjacente.
Inverno Salinidade Verão Salinidade

1 32,96 ± 0,78 2 34,07 ± 0,12
3 32,78 ± 0,57 3 34,51 ± 0,64
4 33,73 ± 0,00 4 35,98 ± 0,01
5 34,12 ± 0,64 5 35,6 ± 0,41
6 33,9 ± 0,03 6 35,75 ± 0,41
7 33,91 ± 0,04 7 35,6 ± 0,38
8 33,36 ± 0,59 8 35,25 ± 0,77
9 32,55 ± 0,77 9 34,82 ± 0,5
10 32,08 ± 0,39 10 35,05 ± 0,54
11 32,17 ± 0,36 11 34,8 ± 0,58
12 33,64 ± 0,11 12 35 ± 0,71
14 33,69 ± 0,37 13 35,6 ± 0,36
15 34,02 ± 0,47 14 35,67 ± 0,26
16 33,83 ± 0,04 19 34,45 ± 0,11
17 32,69 ± 0,01
18 32,37 ± 0,24
124
9.4) Perfis horizontais de distribuição de salinidade
23.5º S
23.5º S
INVERNO INVERNO
São Sebastião
34.3
São Sebastião
Bertioga 34
Santos Bertioga
17 Santos
33.7 17
18
Praia Grande 24º 18
11 16 33.4
Praia Grande 24º
Peruíbe 10 11 16
3 9 12 Peruíbe 10
33.1 3 9 12
8
8
1 32.8
1
7 15
32.5 7 15
14
4 14
6 24.5º 4
32.2 6 24.5º
5
31.9 5
30 m
30 m
31.6
31.3
25º 31
25º
47º W 46.5º 46º 45.5º
47º W 46.5º 46º 45.5º
Figura 9.4.1: Valores de salinidade à 5 Figura 9.4.2: Valores de salinidade à 10

metros de profundidade, durante a metros de profundidade, durante a
campanha de inverno. campanha de inverno.
23.5º S 23.5º S
INVERNO INVERNO
Bertioga Bertioga
Santos Santos
17 17
18 18
11 16 11 16
3 9 12 3 9 12
8 8
1 1
7 15 7 15
14 14
4 4
6 24.5º 6 24.5º
5 5
30 m 30 m
25º 25º
47º W 46.5º 46º 45.5º 47º W 46.5º 46º 45.5º
Figura 9.4.3: Valores de Salinidade à 15 Figura 9.4.4: Valores de salinidade à 20

metros de profundidade, durante a metros de profundidade, durante a
campanha de inverno. campanha de inverno.
125
23.5º S 23.5º S
VERÃO 36
VERÃO
Bertioga Bertioga
35.7
Santos Santos 11
11 Praia Grande
Praia Grande 10 24º 10 24º
3 9 12 2 3 9 12
2 35.4
13 13
35.1 7
7
14 14
4 4
6 6
34.8
24.5º 5 24.5º
5
30 m 34.5 30 m
34.2
33.9 25º
25º
47º W 46.5º 46º 45.5º
47º W 46.5º 46º 45.5º

metros de profundidade, durante a campanha metros de profundidade, durante a campanha
de verão. de verão.
23.5º 23.5º S
VERÃO VERÃO
Be rtioga Be rtioga
Santos Santos
Praia G rande 24º Praia G rande 24º
25 25
24 24
14 15 22 14 15 22
21 21
27 27
20 20
28 28
17 17
19 24.5º 19 24.5º
30 m 18 30 m 18
Estaçã o hidrográfica Estaçã o hidrográfica
25º 25º
47º W 46.5º 46º 45.5º 47º W 46.5º 46º 45.5º

metros de profundidade, durante a campanha metros de profundidade, durante a
de verão. campanha de verão.
126
9.5) Densidade do zooplâncton
Tabela 9.5.1: Densidade de organismos por metro cúbico dos táxons mais
abundantes durante o mês de julho para o complexo estuarino Santos-Bertioga.
Número da estação 1 2 3 4 5
Penneoidea e Caridea juvenis 26 3 27 6 11
Brachyura Zoea 2 5 28 152 76
Eucalanidae 1 5 1 4 3
Pseudodiaptomidae 3 19 3 3 39
Temoridae 32 10 18 27 17
Acartidae 1869 698 1849 4417 3515
Chaetognatha 31 29 39 37 61
-3
Tabela 9.5.2: Densidade (org. m ) dos táxons mais abundantes durante o mês de agosto para o
complexo estuarino Santos-Bertioga.
Número da estação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12
Brachyura Zoea 45 3 12 18 20 101 78 609 947 112 1137
Penilia avirostris 12 1 31 8 69 37 44 0 0 1 0
Temoridae 5 27 40 92 101 109 111 0 1 5 32
Acartidae 85 120 17 260 138 118 709 470 525 1242 2533
Cirripedia: náuplios 4 12 3 22 6 19 1 395 229 163 853
Chaetognatha 5 5 6 23 43 31 53 157 107 361 174
Appendicularia 0 21 5 19 106 78 5 103 42 90 58
-3
Tabela 9.5.3: Densidade (org. m ) dos táxons mais abundantes durante o mês de outubro para
o complexo estuarino Santos-Bertioga.
Número da estação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Noctiluca sp 9 16 35 14 33 28 17 7 9 2 1 11
Cnidaria total 4 42 1 6 5 3 3 1 18 6 0 0
Gammaridea 0 283 1 2 1 7 49 0 2 0 1 0
Brachyura Zoea 15 19 15 11 53 66 56 225 212 83 75 232
Porcelanidae Zoea 3 28 10 10 10 12 0 1 0 1 0 0
Eucalanidae 7 36 45 11 23 25 3 1 1 0 1 0
Pseudodiaptomidae 0 3 2 1 4 7 196 20 156 30 20 99
Temoridae 6 40 111 6 52 80 66 22 59 20 9 48
Acartidae 34 75 21 25 19 47 612 416 1312 359 309 1193
Cirripedia náuplios 1 2 0 3 2 18 143 287 511 228 88 208
Chaetognatha 44 69 58 25 94 84 35 3 28 30 3 24
Appendicularia 0 0 0 0 1 1 35 10 13 19 73 40
127
Tabela 9.5.4: Densidade (org. m-3) dos táxons mais abundantes durante o mês de novembro
para o complexo estuarino Santos-Bertioga.
Número da estação 1 2 3 4 7 8 9 10 11 12
Noctiluca sp 9 9 6 9 19 6 2 1 1 1
Brachyura Zoea 137 73 115 321 1006 934 316 1297 2040 0
Pseudodiaptomidae 0 0 0 0 3 0 2 0 0 3
Temoridae 20 9 40 2 11 1 2 11 1 1
Acartidae 2 1 1 0 5 43 578 369 97 5
Pontelidae 0 31 31 14 0 0 0 0 0 0
Chaetognatha 0 0 1 3 1 0 0 1 0 5
Appendicularia 11 102 3 37 16 1 2 9 24 0
Pisces: larvas 3 1 2 1 1 0 1 1 1 1
Tabela 9.5.5: Densidade (org. m-3) dos táxons mais abundantes durante o mês de dezembro para
o complexo estuarino Santos-Bertioga.
Número da estação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Noctiluca sp 9 3 10 7 7 0 1 1 2 2 0 0
Cnidaria total 0 0 0 1 0 0 2 5 3 0 0 0
Amphipoda: Gammaridea 7 6 0 0 1 0 2 1 3 0 0 0
Penneoidea e Caridea juvenis 4 29 14 13 41 28 3 9 4 68 42 24
Brachyura Zoea 32 160 66 31 55 24 0 88 0 483 96 30
Penilia avirostris 0 0 19 2 9 0 0 26 0 0 0 0
Eucalanidae 2 14 14 56 27 41 0 0 0 1 1 0
Centropagidae 15 64 149 88 85 29 1 1 2 2 1 0
Temoridae 10 18 89 203 108 169 0 5 0 56 10 7
Acartidae 475 879 161 320 139 362 0 171 0 14945 6401 5791
Chaetognatha 12 42 3 27 28 94 6 1 9 193 46 186
Pisces: larvas 5 3 1 0 5 23 4 1 6 3 5 6
128
Tabela 9.5.6: Densidade (org. m-3) dos táxons mais abundantes durante o inverno de 2005 na plataforma adjacente.
Táxon/estação 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18
Noctiluca sp 47 0 147 41 50 76 178 22 10 26 45 22 83 152 25 22
Mollusca 38 0 29 23 5 5 16 3 1 11 40 18 23 28 3 1
Decapoda larvas 81 9 43 11 9 13 26 54 19 36 68 6 30 31 94 15
Penilia avirostris 1059 2 237 10 35 99 210 263 126 983 1053 9 292 270 274 124
Pseudevadne tergestina 79 1 33 2 10 4 28 1 10 11 96 2 120 11 7 2
Paracalanus spp. 9 0 17 12 3 11 90 5 5 10 6 22 6 23 3 3
Clausocalanus furcatus 32 0 86 97 70 26 50 0 0 0 5 50 5 35 1 0
Ctenocalanus spp. 143 0 195 187 97 35 49 4 3 14 20 114 242 9 1 0
Temora spp. 90 13 82 90 112 85 115 100 218 516 114 34 486 49 310 33
Oithona plumifera 26 2 72 32 62 44 113 16 5 18 6 10 129 33 7 4
Oncaea venusta 23 0 38 46 31 35 94 0 0 2 2 17 112 13 0 0
Chaetognatha 67 48 22 13 15 11 30 66 73 71 30 8 38 20 61 39
Outros grupos 320 4 114 108 141 98 243 53 44 86 140 81 372 88 112 26
Tabela 9.5.7: Densidade (org. m-3)dos táxons mais abundantes durante o verão de 2006 na plataforma adjacente.
Táxon/estação 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 19
Cnidaria total 239 101 54 27 37 19 33 83 17 113 17 34 27 3
Mollusca total 122 61 120 21 23 46 201 12 31 188 36 26 34 1
Decapoda total 734 772 3 25 12 5 128 437 239 311 108 7 2 1
Penilia avirostris 5394 0 351 1156 605 445 2412 4069 455 1748 1348 1068 750 0
Pseudevadne tergestina 52 252 57 57 51 74 240 153 33 219 52 34 63 0
Subeucalanus pileatus 52 136 9 53 42 19 119 338 150 142 69 12 17 0
Ctenocalanus spp. 12 0 13 110 283 19 10 12 4 0 0 54 282 1
Temora spp. 1998 837 190 133 207 153 916 1399 951 1989 450 173 260 8
Oithona plumifera 29 35 241 92 133 111 152 83 50 0 249 232 212 7
Oncaea venusta 12 55 95 60 55 28 53 0 35 0 39 8 63 1
Chaetognatha 99 61 76 113 92 56 132 70 46 0 8 50 38 8
Outros grupos 437 398 342 322 496 403 969 343 492 14 381 11 161 37
129
9.6) Diversidade e Eqüitatividade
Tabela 9.6.1: Índice de diversidade de Shannon (bits . ind.-1) e eqüitatividade, calculados por
estação para o complexo estuarino de Santos-Bertioga. H: Índice de Shannon; J: Eqüitatividade; 7:
Julho; 8: Agosto; 10: Outubro; 11: Novembro; 12: Dezembro. O cálculo considera todos os táxons
analisados.
Meses 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
7H 1,599 2,232 2,053 2,255 2,157 S.D. S.D. S.D. S.D. S.D. S.D. S.D.
7J 0,37 0,475 0,467 0,492 0,47 S.D. S.D. S.D. S.D. S.D. S.D. S.D.
8H 3,265 3,713 3,934 3,608 3,874 4,186 3,205 3,260 2,849 3,481 S.D. 3,338
8J 0,647 0,693 0,725 0,661 0,71 0,81 0,594 0,671 0,599 0,703 S.D. 0,702
10 H 3,996 3,510 3,864 4,214 3,801 4,111 3,798 3,050 3,160 3,225 3,537 3,547
10 J 0,785 0,696 0,696 0,772 0,724 0,767 0,760 0,641 0,680 0,639 0,736 0,671
11 H 2,749 3,154 3,470 1,875 S.D. S.D. 0,869 0,695 1,941 1,408 0,799 4,441
11 J 0,555 0,605 0,657 0,355 S.D. S.D. 0,189 0,146 0,449 0,290 0,157 0,934
12 H 3,089 3,186 3,665 3,639 4,263 3,837 4,309 2,815 4,370 1,535 1,215 1,186
12 J 0,650 0,663 0,704 0,698 0,801 0,767 0,854 0,563 0,859 0,327 0,272 0,255
Tabela 9.6.2: Índice de diversidade de Shannon e

eqüitatividade para as estações amostradas durante a
campanha de Inverno. H: Índice de diversidade; J:
Eqüitatividade; C: grupo Copepoda; T: todos os táxons
analisados.
Estações HC EC HT ET
1 1,164 0,285 3,246 0,595
3 1,237 0,372 3,931 0,779
4 1,950 0,477 3,996 0,746
5 2,741 0,645 3,945 0,732
6 2,698 0,588 4,472 0,805
7 2,404 0,588 4,485 0,832
8 2,362 0,578 4,324 0,818
9 1,216 0,366 3,263 0,653
10 1,788 0,538 3,376 0,688
11 1,452 0,372 2,675 0,510
12 0,965 0,253 2,518 0,480
14 2,789 0,645 4,679 0,852
15 2,129 0,521 3,864 0,712
16 1,514 0,345 3,613 0,666
17 1,434 0,400 3,476 0,702
18 1,148 0,310 3,168 0,604
130
Tabela 9.6.3: Índice de diversidade de Shannon e

eqüitatividade para as estações amostradas durante a coleta
de Verão. H: Índice de diversidade; J: Eqüitatividade; C:
grupo Copepoda; T: todos os táxons analisados.
Estações HC JC HT JT
2 1,033 0,253 2,499 0,458
3 1,8 0,542 4,115 0,847
4 2,026 0,486 4,129 0,776
5 1,468 0,34 3,223 0,583
6 1,975 0,45 4,1 0,734
7 1,970 0,464 4,022 0,766
8 1,537 0,356 3,533 0,623
9 1,302 0,319 2,774 0,511
10 2,468 0,571 4,101 0,727
11 1,756 0,439 3,657 0,67
12 1,734 0,416 3,276 0,604
13 1,118 0,254 2,659 0,484
14 1,74 0,403 3,56 0,652
19 2,424 0,481 4,816 0,822
9.7) Coordenadas das estações de coleta
Tabela 9.7.1: Coordenadas geográficas das estações de coleta

sobre o complexo estuarino de Santos-Bertioga.
Estação Latitude (S) Longitude (W)
1 24°00'26" 47°22'37"
2 23°59,'09" 46°21'45"
3 24°01'03" 46°19'46"
4 23°59'20" 46°19'28"
5 23°59'35" 46°17'59"
6 23°57'31" 46°18'10"
7 23°51'27" 46°07'58"
8 23°51'32" 46°08'54"
9 23°51'59" 46°09'21"
10 23°52'41" 46°09'56"
11 23°53'28" 46°11'11"
12 23°54'07" 46°11'35"
131
Tabela 9.7.2: Coordenadas geográficas das estações de coleta sobre a

plataforma continental adjacente à Baixada Santista. I: estação amostrada
durante o inverno; V: estação amostrada durante o verão e I + V: estação
amostrada durante ambas as campanhas.
Nº Estação Latitude (S) Longitude (W) Período
1 24º15'01" 46º27'04" I
2 24°05'28'' 46°27'28" V
3 24º05'02" 46º21'2" I+V
4 24º24'0" 46º16'02" I+V
5 24º32'05" 46º11'02" I+V
6 24º27'04" 46º0'0" I
7 24º18'05" 46º07'01" I+V
8 24º09'52" 46º12'31" I+V
9 24º05'03" 46º15'25" I+V
10 24º02'31" 46º10'41" I+V
11 23º59'58" 46º06'04" I+V
12 24º04'38" 46º03'11" I+V
13 24°13'34'' 45°57'05'' V
14 24º22'24" 45º52'46" I+V
15 24º19'42" 45º42,02" I
16 23º59'32" 45º53'56" I
17 23º50'09" 45º59'28" I
18 23º55'04" 46º02'22" I
19 25º46'24" 45º16'48" V
9.8) Informações adicionais sobre as estações de coleta
9.8.1) Coletas realizadas no complexo estuarino
Tabela 9.8.1.1: Informações sobre a coleta realizada durante o mês de

julho de 2005.
Hora Prof (m) Prof (m) Hora coleta
Estação Data
local local coleta início final
1 23 10:17 8,5 7,0 10:33 10:57
2 23 11:27 6,0 4,5 11:38 11:57
3 23 07:32 12,5 11,5 07:59 08:30
4 23 12:35 5,5 4,5 13:00 13:07
5 23 13:30 15,0 13,5 14:18 14:37
6 23 15:09 13,0 11,5 15:30 15:54
7 24 09:46 11,5 10,0 10:30 10:55
132
Tabela 9.8.1.2: Informações sobre a coleta realizada durante o mês de agosto de 2005.
Hora Prof (m) Prof (m) Hora coleta
Estação Dia
1 20 09:35 8,5 7,5 09:59 10:02
2 20 08:30 6,0 5,0 09:05 09:08
3 20 11:30 12,0 11,0 11:53 12:00
4 20 12:55 6,0 5,0 13:28 13:31
5 20 14:04 15,0 14,0 14:33 14:38
6 20 15:50 15,0 13,0 17:18 17:24
7 21 08:00 11,0 10,0 09:03 09:10
8 21 09:55 2,7 1,5 10:20 10:23
9 21 10:40 4,3 3,0 11:03 11:05
10 21 11:25 5,0 4,0 12:02 12:04
12 21 14:58 6,7 5,5 15:15 15:18

outubro de 2005.
Hora Prof (m) Prof(m) Hora coleta
Estação Dia
1 01 09:22 10,0 8,0 09:43 09:50
2 01 10:40 7,0 5,5 10:55 11:03
3 01 07:55 12,0 10,0 08:13 08:17
4 01 11:23 7,0 6,0 11:30 11:35
5 01 13:10 14,0 10,0 13:47 14:00
6 01 14:40 14,0 10,0 14:55 15:02
7 02 08:30 12,0 9,0 09:07 09:10
8 02 09:24 5,0 4,0 09:35 09:40
9 02 10:46 5,5 4,5 10:52 10:55
10 02 10:10 7,0 6,0 10:17 10:21
11 02 12:25 8,0 7,0 12:31 12:36
12 02 12:55 10,0 8,0 13:00 13:03

novembro de 2005.
Hora Prof(m) Prof(m) Hora coleta
Estação Dia
1 17 09:30 9,0 7,0 09:52 09:56
2 17 07:45 6,5 5,0 07:52 07:57
3 17 06:50 12,0 9,0 07:00 07:05
4 17 10:18 6,5 4,0 10:25 10:30
7 16 07:55 11,5 9,0 08:07 08:13
8 16 09:30 3,5 2,0 09:50 09:53
9 16 10:12 5,0 3,0 10:31 10:35
10 16 11:14 5,5 4,0 11:30 11:37
11 16 12:58 5,0 4,0 13:30 13:34
12 16 13:44 7,0 4,5 13:55 14:01
133

dezembro de 2005.
Hora Prof(m) Prof(m) Hora coleta
Estação Dia
1 13 09:45 9,0 6,5 09:56 10:04
2 13 10:40 6,5 5,5 10:53 10:59
3 13 07:55 12,0 7,5 08:10 08:30
4 13 11:31 6,0 5,0 11:40 11:48
5 13 13:00 14,0 12,0 13:25 13:40
6 13 14:26 13,0 11,0 14:36 15:00
7 14 09:10 11,5 9,0 10:30 10:40
8 14 11:13 3,0 1,0 11:20 11:25
9 14 11:40 4,5 2,5 11:45 11:51
10 14 12:05 5,5 3,5 12:15 12:20
11 14 15:13 4,0 2,0 15:19 15:25
12 14 15:40 5,0 3,0 15:45 15:52
9.8.2) Coletas realizadas na plataforma continental adjacente
Tabela 9.8.2.1: Dados referentes à campanha de inverno, durante o mês

setembro de 2005.
Estação N da Hora Prof.(m) Prof. (m) Hora
Dia
oceanográfica Estação Local Local Coleta Coleta
7774 17 22 4:50 15 10 5:10
7775 18 22 6:20 18 15 6:43
7776 16 22 8:05 28 20 9:00
7779 15 22 14:07 60 50 15:27
7780 14 22 17:20 57 40 19:27
7782 12 23 23:45 30 25 1:25
7783 11 23 2:17 20 15 3:02
7784 10 23 3:45 20 15 4:42
7785 9 23 5:50 25 25 6:18
7786 8 23 7:15 32 25 9:10
7787 7 23 12:55 41 25 14:16
7788 6 23 15:35 57 40 16:44
7789 5 23 18:30 55 40 19:24
7790 4 23 20:35 40 25 21:30
7791 1 23 22:50 31 15 23:40
7792 3 24 1:04 20 20 1:31
134
Tabela 9.8.2.2: Dados referentes à campanha de verão, durante o mês de

março de 2006.
Estação N da Hora Prof.(m) Prof. (m) Hora
Dia Local Local Coleta Coleta
oceanográfica Estação
bongô bongô
7973 5 14 10:45 55 50 11:02
7974 4 14 13:00 40 35 13:30
7976 2 14 18:25 16 11 19:05
7977 3 14 19:55 20 15 20:27
7978 9 14 21:18 24 15 21:48
7979 8 14 22:40 31 25 23:05
7980 7 15 0:50 42 35 1:38
7981 6 15 03:35 57 50 4:48
7982 14 15 6:55 57 52 8:15
7983 13 15 10:01 46 40 10:28
7984 12 15 12:40 28 20 13:10
7985 10 15 14:40 21 15 15:20
7986 11 15 16:00 21 15 16:38
8001 19 17 09:47 200 145 10:15

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JOSÉ EDUARDO MARTINELLI FILHO

A associação entre o zooplâncton e Vibrio cholerae no

complexo estuarino de Santos - Bertioga e Plataforma

Dissertação apresentada ao Instituto

Universidade de São Paulo

A associação entre o zooplâncton e Vibrio cholerae no complexo

estuarino de Santos - Bertioga e Plataforma Adjacente

José Eduardo Martinelli Filho

Dissertação apresentada ao Instituto Oceanográfico da

Essa dissertação é dedicada ao meu pai, por sempre ter acreditado em

O senhor... Mire veja: o mais importante e bonito, do mundo, é isto: que

Agradeço ao professor Rubens Mendes Lopes, que me incentivou a trilhar os

5.5.3) Relação entre a detecção de Vibrio cholerae O1 e O139 e variáveis

Figura 1: Síntese de variáveis que atuam no estado metabólico de Vibrio cholerae. A

Figura 20: Densidade zooplanctônica para as amostras analisadas durante o mês de

Figura 44: Dendrograma de dissimilaridade (distância euclidiana), calculado pelo

Figura 9.2.2: Valores de temperatura à 10 metros de profundidade, para a campanha de

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

CTD – perfilador para medição de condutividade, temperatura e profundidade, do

CT – cholera toxin (toxina colérica)

DFA – Direct Fluorescence Assay (ensaio de imunofluorescência direta)

DVC-DFA – Direct Viable Count – Direct Fluorescence Assay

ECOSAN – Projeto “A influência do complexo estuarino da Baixada Santista sobre o

FITC – Isotiocianato de fluoresceína

IMO – International Maritime Organization

bits . ind.-1 – bits por indivíduo, unidade de diversidade de Shannon

Kb – Quilo pares de bases

Org. m-³ – Organismos por metro cúbico

PBS – Solução tampão de fosfato (phosphate buffered saline)

V.c. O1; V.c. O139 – Vibrio cholerae O1 e Vibrio cholerae O139

VPI – Vibrio Pathogenicity Island (Ilha de Patogenicidade, um dos conjuntos de genes

Vibrio cholerae é uma bactéria autóctone do ambiente aquático e pode causar

Palavras-chave: Vibrio cholerae, sorogrupos O1 e O139, zooplâncton, DFA, Baixada

Santista, Atlântico Sudoeste

Keywords: Vibrio cholerae, serogroups O1 and O139, zooplankton, DFA, Santos

lowland, South-eastern Atlantic.

1.1) Víbrios no ambiente marinho: interações com fatores bióticos e

Bactérias da família Vibrionaceae são naturais de ambientes aquáticos, algumas

A predileção de Vibrio cholerae em fixar-se em substratos quitinosos pode ser

Embora a maioria das bactérias torna-se inviável em altas temperaturas (25 a 37

resultar em valores muito baixos de salinidade (menos de 0,10). O trabalho ainda

do mar contrabalanceou o crescimento das bactérias em experimentos de microcosmos.

1.2) Estados metabólicos bacterianos: viabilidade, dormência e cultivo

As bactérias se adaptam de maneira dinâmica às mudanças ambientais como

Figura 1: Síntese de variáveis que atuam no estado metabólico de

Sabe-se também que a quitina estimula a transformação natural (ou competência

1.3) Vibrio cholerae: identificação e genômica.

O reconhecimento de Vibrio cholerae é baseado no antígeno somático LPS O

O terceiro agrupamento, o RTX, contém apenas quatro genes e codifica

Tabela 1: Variedade de fatores descritos que conferem virulência para

Além dos grupos O1 e O139, outros podem provocar casos esporádicos e

eminente do surgimento de bactérias patogênicas (Waldor & Mekalanos, 1996 e

1.4) A Cólera e sua epidemiologia no mundo e no Brasil.

A infecção intestinal por Vibrio cholerae resulta na perda de grande quantidade

Segundo a IMO (International Maritime Organization), bioinvasões são

similares às cepas de origem clínica de V. cholerae O1 toxigênicas confirmam que

1.5) Finalidade da pesquisa de Vibrio cholerae associada ao zooplâncton

A caracterização da associação de Vibrio cholerae com o zooplâncton é

coletadas na região portuária de Santos, ressaltando a importância de monitorar a