UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

unesp INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

(ÁREA: MICROBIOLOGIA APLICADA)

ANA MARIA LIMA CORREIA

DIVERSIDADE E PROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE

BEGONIA spp. ENCONTRADAS NA MATA ATLÂNTICA

Dissertação apresentada ao
Instituto de Biociências, do Câmpus
de Rio Claro, Universidade
Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências Biológicas
(Área: Microbiologia Aplicada).

Abril - 2016
 ANA MARIA LIMA CORREIA

DIVERSIDADE E PROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE

BEGONIA spp. ENCONTRADAS NA MATA ATLÂNTICA

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, do

Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista,
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas (Área: Microbiologia
Aplicada).

Orientador: Prof. Dr. André Rodrigues

Co-orientadora: Profª. Drª. Simone Possedente de Lira

Abril - 2016
589.2 Correia, Ana Maria Lima
C824d Diversidade e prospecção de fungos endofíticos de
Begonia spp. encontradas na Mata Atlântica / Ana Maria
Lima Correia. - Rio Claro, 2016
59 f. : il., figs., gráfs., fots.

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,

Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Andre Rodrigues
Coorientadora: Simone Possedente de Lira

1. Fungos. 2. Comunidades. 3. Fitopatógenos. 4.

Bioensaio. I. Título.

Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP

Campus de Rio Claro/SP
Dedico este trabalho aos meus pais, por todo
apoio, carinho e compreensão.
 AGRADECIMENTOS

À CAPES e, principalmente, à FAPESP pela bolsa concedida durante todo o meu

mestrado, a qual foi muito importante para minha estadia em Rio Claro e desenvolvimento da
minha pesquisa.
Ao meu orientador, Prof. Dr. André Rodrigues, pela oportunidade de desenvolver meu
projeto de mestrado sob sua orientação. Pelas horas de dedicação ao meu trabalho, por estar
sempre presente, acompanhando desde as coletas, até a avaliação e discussão dos resultados.
Agradeço pelas discussões científicas, tenho certeza de que aprendi muito durantes esses dois
anos e minha visão como cientista teve muita influência sua.
À minha co-orientadora Profª. Drª. Simone Possedente de Lira (ESALQ/USP,
Piracicaba), pelas sugestões nesse trabalho e pela oportunidade de trabalhar em seu
laboratório no desenvolvimento dessa pesquisa.
Ao Prof. Dr. Marco Antônio Assis (UNESP, Rio Claro) pelas identificações das
begonias pela dedicação e bom humor durante as coletas.
À Profª. Drª. Eliane Jacques pela identificação das begonias.
Ao Prof. Dr. Roberto Gomes de Souza Berlinck (USP, São Carlos), coordenador do
projeto temático o qual este trabalho está vinculado.
Aos demais professores que participaram do meu Mestrado e demais funcionários
envolvidos no programa de Microbiologia Aplicada e na UNESP como um todo.
Ao programa de pós-graduação em Microbiologia Aplicada da UNESP de Rio Claro.
Ao Laboratório de Ecologia e Sistemática de Fungos (LESF), onde desenvolvi a maior
parte da minha pesquisa.
Aos Laboratórios de Evolução Molecular e ao Laboratório de Micologia Ambiental e
Industrial.
Ao Departamento de Bioquímica e Microbiologia como um todo e seus funcionários,
pela oportunidade de formação acadêmica oferecida.
Ao doutorando Sergio Kakazu pela ajuda com as amostras colocadas no sequenciador.
Ao pessoal do laboratório de Química de Produtos Naturais da USP (Sérgio, Luciana,
Gislâine e Flávio) por terem me ajudado com as coletas. Em especial, a Diana que
acompanhou e ensinou os procedimentos da parte química deste trabalho.
Ao pessoal do LESF, alguns deles já não estão mais lá, mas com certeza deixaram
suas marcas, pelo apoio, pelas discussões científicas e de vida (Rafael, Jaqueline, Sadala,
Bárbara, Lucas, Mariana, Danilo, Bruna, Júlio, Daniel, Irina). Em especial ao meu grande
amigo Quimi, por toda sua paciência comigo, apoio e amizade, por ter me ensinado a fazer as
melhores lâminas que eu jamais conseguiria sozinha; por fazer-me rir e ver o copo meio
cheio, ao invés do contrário. E ao meu grande amigo Tássio, por ter me ajudado muito com a
estatística desse trabalho, por me apoiar, pelo prazer da convivência ao seu lado, por ser uma
das pessoas mais inteligentes que conheço e dividir esse conhecimento comigo, aprendi muito
com você.
À minha família, em especial os meus pais, Francisco e Odete, por sempre me
incentivarem com os estudos, e me apoiarem incondicionalmente em minhas escolhas. Aos
meus irmãos, que fizeram muitas viagens por minha causa nos anos em que morei fora, e
pelas esporádicas recepções maravilhosas que faziam quando eu voltava. Muito obrigada.
“A tarefa não é tanto ver o que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou
sobre aquilo que todo mundo vê”.
Arthur Schopenhauer
 RESUMO

Fungos endofíticos vivem no interior dos tecidos das plantas sem causar dano aparente aos
seus hospedeiros. É sabido que esses fungos podem estimular as defesas da planta frente a
fitopatógenos, através da produção de compostos químicos; sendo uma promissora fonte para
a descoberta de novos compostos bioativos. Utilizando método dependente de cultivo, o
presente estudo avaliou a diversidade de fungos endofíticos associados à Begonia fischeri,
Begonia olsoniae e Begonia venosa encontradas na Mata Atlântica. Adicionalmente, foram
realizados bioensaios in vitro com frações acetato dos fungos endofíticos frente aos
fitopatógenos Phomopsis sojae e Colletotrichum gloeosporiodes, com o intuito de verificar a
produção de compostos bioativos. Das 20 folhas analisadas de cada espécie de planta, um
total de 426 fungos endofíticos foi obtido, sendo que 120 foram isolados de B. fischeri, 151 de
B. olsoniae e 155 de B. venosa. Após a triagem dos isolados e sequenciamento da região ITS,
as sequências foram agrupadas em Unidades Taxonômicas Operacionais (UTOs) e as métricas
ecológicas aplicadas a 97% de similaridade. Utilizando tal abordagem, 46 taxa foram
identificados, sendo Colletotrichum (51,6% do total de 426 isolados) e Diaporthe (22,5%) os
gêneros mais abundantes, seguido por Phyllosticta (3,5%), Neopestalotiopsis (1,8%),
Stagonospora (1,8%) e Nigrospora (1,6%) entre os gêneros com menor abundância. A
riqueza e a diversidade de fungos foi maior em B. fischeri, quando comparada a B. olsoniae e
B. venosa. Além disso, a análise de correspondência sugere que o tipo de hospedeiro pode
explicar 24% das diferenças observadas entre as comunidades de endófitos, demonstrando
que outras variáveis ecológicas (por exemplo, o local de coleta) também podem explicar a
estrutura dessas comunidades. Dos 88 endófitos utilizados nos ensaios, as frações acetato de
26% deles (n= 23) inibiram pelo menos um fitopatógeno. Tais resultados são promissores e
indicam que os fungos endofíticos dessas plantas são uma fonte ainda não explorada para a
prospecção de compostos antifúngicos.

Palavras-chave: Endófitos. Comunidades. Fitopatógenos. Bioensaio.

 ABSTRACT

Endophytic fungi live within plant tissues without causing any apparent disease symptoms.
Fungal endophytes may stimulate host defenses towards pathogens through the production of
chemical compounds; thus they are a promising source for the discovery of new bioactive
compounds. Using culture dependent methods coupled with a polyphasic approach for fungal
identification, we evaluated the diversity of endophytic fungi associated with Begonia
fischeri, Begonia olsoniae and Begonia venosa found in the Atlantic Rain Forest. In addition,
we carried out in vitro bioassays from acetate fractions of the endophytic fungi towards the
plant pathogens Phomopsis sojae and Colletotrichum gloeosporiodes, to verify the putative
production of bioactive compounds. From 20 leaves analyzed of each species, a total of 426
endophytic fungi were obtained, comprehending 120 from B. fischeri, 151 from B. olsoniae
and 155 from B. venosa. After screening the isolates and sequencing the ITS region, the
sequences were clustered into Operational Taxonomic Units (OTUs) and ecological metrics
applied at 97% similarity. Using this approach, we identified 46 taxa and the prevalent genera
were Colletotrichum (51.6% of the total of 426 isolates) and Diaporthe (22.5%), followed by
Phyllosticta (3.5%), Neopestalotiopsis (1, 8%), Stagonospora (1.8%) and Nigrospora (1.6%)
among the genera found in minor abundance. Richness and diversity of fungi were higher in
B. fischeri in comparison to B. olsoniae e B. venosa. Furthermore, correspondence analysis
demonstrated that the host plant explains 24% of the observed differences among the
endophytic community, suggesting that other environmental variables (e.g., sampling sites)
may explain the community structure. From the 88 endophytes evaluated in the inhibition
assays, 26% (n = 23) of the acetate fractions showed activity against at least one
phytopathogen. These results are promising and indicate that endophytic fungi these plants are
an untapped source for prospecting antifungal compounds.

Keywords: Endophytes. Communities. Pathogens. Bioassay.

 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 10
2 CAPÍTULO 1 - COMUNIDADES ENDOFÍTICAS ENCONTRADAS EM BEGONIA
spp. DA MATA ATLÂNTICA .............................................................................................. 12
2.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 13
2.2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 15
2.2.1 Área de estudo ......................................................................................................... 15
2.2.2 Coleta das amostras ................................................................................................ 15
2.2.3 Isolamento dos fungos endofíticos........................................................................... 17
2.2.4 Triagem, extração de DNA, sequenciamento e análise filogenética ....................... 18
2.2.5 Análise das comunidades de endófitos .................................................................... 20
2.3 RESULTADOS ............................................................................................................. 20
2.3.1 Diversidade e ecologia dos fungos endófitos .......................................................... 20
2.3.2 Estrutura das comunidades de endófitos encontrados em begônias ....................... 25
2.4 DISCUSSÃO ................................................................................................................. 27
2.5 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 31
2.6 ANEXOS ....................................................................................................................... 35
3 CAPÍTULO 2 - PROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ENCONTRADOS EM
TRÊS ESPÉCIES DE BEGONIA.......................................................................................... 46
3.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 47
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 49
3.2.1 Origem das linhagens .............................................................................................. 49
3.2.2 Obtenção da fração acetato e bioensaios in vitro ................................................... 49
3.3 RESULTADOS ............................................................................................................. 51
3.4 DISCUSSÃO ................................................................................................................. 55
3.5 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 57
4 CONSIDERAÇÕES .............................................................................................................. 59
5 PERSPECTIVAS .................................................................................................................. 59
 10

1 INTRODUÇÃO

Micro-organismos endofíticos vivem no interior dos tecidos das plantas sem causar
danos aparentes ao hospedeiro. Muitos desses micro-organismos podem auxiliar o
desenvolvimento das plantas e promover a resistência frente a patógenos, devido à produção
de compostos bioativos. Embora haja um grande interesse nos metabólitos secundários
produzidos pelos fungos endofíticos, muitas questões relacionadas à biologia e ecologia
desses organismos ainda não são compreendidas.
Devido à ampla diversidade taxonômica, os fungos endofíticos constituem uma fonte
promissora de biocompostos, porém pouco explorada. Pesquisas apontam que esses micro-
organismos são bons produtores de enzimas e metabólitos secundários, o que possibilita sua
aplicação em diversas áreas como a indústria farmacêutica, agronômica e química. Nesse
contexto, os fungos endofíticos se destacam no controle de fitopatógenos, pois compartilham
o mesmo nicho ecológico, portanto, úteis no combate dessas pragas que assolam diversas
lavouras.
É sabido que a Mata Atlântica abriga uma grande diversidade biológica de plantas,
animais e micro-organismos, devido às condições ambientais únicas. Considerado um
hotspot, tal bioma apresenta grande relevância em estudos de diversidade e bioprospecção,
pois é um refúgio de espécies ainda desconhecidas pela ciência e com amplo potencial
biotecnológico. Tal bioma possui uma variedade de espécies de plantas endêmicas e não
endêmicas. Dentre as endêmicas, destacamos Begonia venosa e Begonia olsoniae e a espécie
não endêmica Begonia fischeri, as quais não foram estudadas do ponto de vista da diversidade
e prospecção de fungos endofíticos.
Nesse contexto, ambientes diferenciados como as ilhas também são de grande
relevância em estudos de diversidade, como é o caso do Arquipélago de Alcatrazes.
Localizado a 43 km da costa de São Sebastião (SP), o arquipélago é constituído por cinco
ilhas: Ilha da Sapata, do Paredão, do Porto, do Sul, e a principal, Ilha de Alcatrazes. Por fazer
parte da Mata Atlântica, o arquipélago apresenta espécies de Begonia, incluindo B. venosa, a
qual é considerada endêmica da ilha.
De ocorrência pantropical, o gênero Begonia é reconhecido como um dos maiores do
grupo das angiospermas, quanto ao número de espécies descritas (cerca de 1.500). A maioria
dos estudos enfatizou a taxonomia, a genética de populações e as propriedades do genoma
desse gênero. Por outro lado, existem trabalhos que relataram o uso de espécies do gênero
 11

Begonia para fins biotecnológicos. No entanto, até o momento não há estudos sobre a
diversidade e prospecção de fungos endofíticos associados às espécies desse gênero.
Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a diversidade das
comunidades de fungos endofíticos presentes em B. fischeri, B. olsoniae e B. venosa
encontradas em diferentes locais da Mata Atlântica (continente e ilha) e, posteriormente,
avaliar o potencial desses micro-organismos na inibição do crescimento de fitopatógenos. Os
resultados desse estudo estão divididos em dois capítulos, apresentados em formato de
manuscritos, a saber:

Capítulo 1: Com um enfoque ecológico, avaliamos as comunidades endofíticas presentes nas

espécies B. fischeri, B. olsoniae e B. venosa, uma vez que, segundo nossos conhecimentos,
não há estudos sobre endófitos presentes nessas plantas. Portanto, neste capítulo tentamos
responder como estão estruturadas as comunidades de fungos endofíticos de Begonia e se
essas comunidades são semelhantes. Nossos resultados sugerem que cada espécie de planta
abriga uma comunidade de endófitos específica. Embora demonstramos que o tipo de planta
hospedeira seja um fator que module essas comunidades, discutimos que outros fatores, como
as distâncias entre os locais de coleta, também contribuem para essa diferenciação.

Capítulo 2: Com base em frações acetato obtidas dos cultivos dos endófitos das três espécies
de begônia, realizamos uma triagem para avaliar se tais fungos produzem metabólitos
secundários capazes de inibir o crescimento de fitopatógenos. Nesse contexto, avaliamos a
inibição do crescimento micelial de Colletotrichum gloeosporioides e Phomopsis sojae frente
a frações de 88 fungos endofíticos. A pergunta deste capítulo é se os fungos endofíticos
associados à Begonia produzem compostos ativos frente à fitopatógenos. Os resultados
obtidos são promissores, pois 26% das frações foram capazes de inibir pelo menos um dos
fitopatógenos. Os resultados sugerem que os endófitos presentes nessas plantas são uma fonte
para prospecção de compostos antifúngicos.
 12

2 CAPÍTULO 1 - COMUNIDADES ENDOFÍTICAS ENCONTRADAS EM BEGONIA

spp. DA MATA ATLÂNTICA

Ana M. L. Correia1, Simone P. Lira2, Marco A. Assis3, Andre Rodrigues1*

1
UNESP – Univ Estadual Paulista, Departamento de Bioquímica e Microbiologia, Rio Claro,
SP, Brasil.
2
USP – Univ de São Paulo, Departamento de Produtos Naturais, Piracicaba, SP, Brasil.
3
UNESP – Univ Estadual Paulista, Departamento de Botânica, Rio Claro, SP, Brasil.

Palavras-chaves: Diversidade. Riqueza. Endófitos. Begoniaceae. Mata Atlântica

* Correspondência para:
Andre Rodrigues (andrer@rc.unesp.br)
Universidade Estadual Paulista, UNESP, Câmpus de Rio Claro
Avenida 24-A, n. 1515, Bela Vista, Rio Claro, São Paulo, Brazil, CEP: 13.506-900
Tel.: +55 19 3526-4364; Fax: +55 19 3526-4176
 13

RESUMO
Fungos endofíticos representam um grupo intrigante de micro-organismos. Os fatores que
determinam a diversidade e a distribuição em seus hospedeiros ainda não são bem
compreendidos. Neste trabalho, avaliamos as comunidades de fungos endofíticos associadas à
Begonia fischeri, Begonia olsoniae e Begonia venosa encontradas em diferentes locais da
Mata Atlântica. A primeira não é endêmica, já as duas últimas são endêmicas desse bioma.
Dentre as 20 folhas analisadas de cada espécie, um total de 426 endófitos foi isolado. Após
identificação polifásica dos fungos, um total de 19 gêneros foi identificado, sendo os mais
abundantes Colletotrichum (51,6%) e Diaporthe (22,5%), seguido por, Phyllosticta (3,5%)
Neopestalotiopsis (1,8%), Stagonospora (1,8%) e Nigrospora (1,6%). A diversidade e
composição de espécies foram diferentes para cada planta hospedeira avaliada. Além disso, B.
fischeri apresentou maior diversidade e riqueza de endófitos, quando comparado a B. olsoniae
e B. venosa. De acordo com a análise de correspondência, 24% da estrutura observada das
comunidades endófiticas pode ser atribuída aos hospedeiros. Tais diferenças entre as
comunidades de fungos podem estar relacionadas às características intrínsecas de cada espécie
de planta. No entanto, a maior parte da variação observada na estrutura das comunidades é
devida a outros fatores, como o local de coleta que também pode atuar como fator
determinante das comunidades endofíticas do gênero Begonia.

2.1 INTRODUÇÃO

Begonia é um dos maiores gêneros de plantas vasculares, pois compreende mais de

1.500 espécies descritas (HUGHES; HOLLINGSWORTH, 2008) de ocorrência pantropical,
exceto na Austrália (GOODALL-COPESTAKE et al., 2010). Das 213 espécies que ocorrem
no Brasil, 186 são encontradas apenas na Mata Atlântica (JACQUES, 2005). Dentre essas, a
espécie Begonia venosa é usualmente encontrada em ilhas do litoral norte de São Paulo, e
Begonia olsoniae apresenta registros apenas na região continental do sudeste brasileiro. Já,
Begonia fischeri é encontrada em todos os biomas brasileiros, além disso, sua distribuição
compreende das Antilhas até a Argentina e não é endêmica do Brasil (JACQUES, 2015).
As espécies de plantas avaliadas nesse estudo apresentam diferentes tipos de habitats
sendo que, B. venosa ocorre em lugares de baixa declividade e maior acúmulo de matéria
orgânica, tais como topo de morros e fendas de rochas. Ao passo que B. olsoniae é rupícola e
preferencialmente ocorre em locais sombreados, já, B. fischeri apresenta habitat terrestre e
ocorre principalmente em locais com incidência de luz e solos úmidos, geralmente
relacionados a áreas alteradas ou em regeneração (WANDERLEY et al., 2012).
 14

Os estudos realizados com Begonia sp. incluem aqueles com enfoque taxonômico
como um indicador de variação biogeográfica, estudos de genética de populações de espécies
endêmicas, hibridação e genômica, entre outros (DEWITTE et al., 2009; 2011). Alguns
trabalhos apontam o potencial biotecnológico de Begonia malabarica no tratamento de
diabetes (PANDIKUMAR et al., 2009). Além disso, extratos foliares dessa mesma espécie
apresentaram atividade antimicrobiana frente a Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus e Klebsiella pneumoniae (RAMESH et al., 2002). No entanto, nada se sabe sobre os
micro-organismos endofíticos associados às plantas do gênero Begonia.
Micro-organismos endofíticos compreendem fungos e bactérias que estão presentes
nos tecidos das plantas, durante parte do ciclo de vida, sem causar sintomas visíveis
(WILSON, 1995; ARAÚJO et al., 2010). Tais micro-organismos podem contribuir com a
nutrição, crescimento e até resistência do hospedeiro frente a patógenos (ARNOLD, 2005).
Considerados um grupo hiperdiverso, os micro-organismos endofíticos representam uma
importante fonte de novos metabólitos secundários bioativos com aplicações em diversos
setores da sociedade, como saúde, indústria, agricultura, entre outros (STROBEL; DAISY,
2003; WANI et al., 2015).
Esses micro-organismos estão amplamente distribuídos entre as plantas terrestres.
Estima-se que cada espécie de planta abriga ao menos uma espécie de fungo endofítico,
entretanto esse número pode variar de dezenas a centenas, dependo do hospedeiro (ARNOLD,
2005). Muitos estudos abrangendo a distribuição biogeográfica dos hospedeiros e seus micro-
organismos endofíticos foram realizados (ARNOLD; LUTZONI, 2007; DAVIS; SHAW,
2008; U’REN et al., 2012; ZHANG et al., 2013). Contudo, compreender o funcionamento
dessas associações é uma tarefa desafiadora, pois às diversas interações que ocorrem entre o
endófito e a planta, e também as interações que acontecem entre os endófitos, fazem dessas
associações uma rede de interações (SANCHEZ-AZOFEIFA et al., 2012).
É sabido que vários fatores bióticos e abióticos influenciam a estrutura das
comunidades endofíticas. Por exemplo, hospedeiros não relacionados filogeneticamente (i.e.
plantas de gêneros diferentes) e o tipo de órgão da planta foram os fatores mais determinantes
nas diferenças entre as comunidades endofíticas estudadas por Peršoh (2013). Além disso,
diferenças no local de coleta também influenciam na estrutura, pois hospedeiros mais
próximos tendem a ter comunidades mais similares, do que aquelas encontradas em
hospedeiros distantes (HIGGINS et al., 2014). Embora, estudando diferentes hospedeiros, tais
resultados demonstram a complexidade das interações fungo, planta e ambiente.
 15

Muitos trabalhos discutem sobre os endófitos presentes em diferentes famílias de

plantas (ARNOLD; HERRE, 2003; HIGGINS et al., 2011; ZHANG et al., 2013; MELLO et
al., 2014). Porém, nada se sabe sobre os endófitos presentes em Begonia sp., o qual é um dos
dez maiores gêneros em número de espécies e também amplamente conhecido por sua
importância ornamental. Assim, é de grande relevância o estudo desses micro-organismos em
plantas pouco avaliadas, como as begônias, uma vez que o interior dos tecidos dessas plantas
constitui em um ambiente para encontrar novas espécies de fungos e que apresentem novos
metabólitos bioativos (CANTRELL et al., 2011).
Levando em consideração que B. fischeri, B. olsoniae e B. venosa são encontradas no
mesmo bioma, porém em locais distintos (ilha e continente), neste trabalho avaliamos as
comunidades de fungos endofíticos associadas a essas plantas, a fim de compreender como
estão estruturadas essas comunidades e se apresentam semelhanças entre si. Este é o primeiro
estudo a avaliar comunidades de fungos endofíticos em espécies de begônias.

2.2 MATERIAL E MÉTODOS

2.2.1 Área de estudo

O bioma Mata Atlântica é reconhecido como um hotspot mundial de diversidade,
devido à riqueza de espécies e variedade de fitofisionomias (MYERS et al., 2000). Muitas
espécies encontradas na Mata Atlântica são endêmicas, o que revela as características únicas
desse ambiente (MYERS et al., 2000). O presente estudo foi realizado em dois locais do
bioma Mata Atlântica. A região de Ubatuba localizada no litoral norte de São Paulo e a Ilha
de Alcatrazes que localiza-se próximo ao município de São Sebastião, a 43 km dos pontos
mais próximos do litoral centro-norte de São Paulo. A Ilha de Alcatrazes compõe juntamente
com outras quatro ilhas, o Arquipélago de Alcatrazes, o qual pertencente à Estação Ecológica
Tupinambás, a gestão, proteção e conservação do arquipélago é de responsabilidade do
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio, 2015).

2.2.2 Coleta das amostras

As coletas de amostras foram organizadas em duas expedições. A primeira coleta foi
realizada no continente em junho de 2014, nas proximidades do Núcleo Picinguaba, Parque
Estadual da Serra do Mar, Ubatuba-SP, Brasil, sob a autorização de coleta (SISBio) número
21774 (emitida para André Rodrigues). Um total de 10 plantas foi coletado e georreferenciado
(Tabela 1), sendo cinco indivíduos de B. fischeri e cinco de B. olsoniae (Figura 1). As plantas
 16

foram acondicionadas em sacos plásticos e mantidas sob refrigeração até o processamento,

este realizado no mesmo dia da coleta.

Tabela 1. Dados referentes às coletas de espécies de Begonia na região de Ubatuba-SP e

Ilha de Alcatrazes.
Código Espécie Data da coleta Coordenadas geográficas
B1a Begonia fischeri 24/06/2014 S23°28’27.1” W45°10’21.0”
B1b Begonia fischeri 24/06/2014 S23°28’27.3” W45°10’21.1”
B1c Begonia fischeri 24/06/2014 S23°28’28.1” W45°10’22.0”
B1d Begonia fischeri 24/06/2014 S23°28’27.9” W45°10’22.2”
B1e Begonia fischeri 24/06/2014 S23°28’28.6” W45°10’22.6”
B2a Begonia olsoniae 24/06/2014 S23°28’18.2” W45°10’20.4”
B2b Begonia olsoniae 24/06/2014 S23°28’18.2” W45°10’20.4”
B2c Begonia olsoniae 24/06/2014 S23°28’18.2” W45°10’20.4”
B2d Begonia olsoniae 24/06/2014 S23°28’18.2” W45°10’20.4”
B2e Begonia olsoniae 24/06/2014 S23°28’18.11” W45°10’20.49”
B3a Begonia venosa 09/02/2015 S24°05.926’ W45°41.511’
B3b Begonia venosa 09/02/2015 S24°05.926’ W45°41.511’
B3c Begonia venosa 09/02/2015 S24°05.929’ W45°41.516’
B3d Begonia venosa 09/02/2015 S24°05.902’ W45°41.540’
B3e Begonia venosa 09/02/2015 S24°05.898” W45°41.533’
B1: Begonia fischeri; B2: Begonia olsoniae; B3 Begonia venosa. As letras em minúsculo referem-se aos diferentes
indivíduos coletados.

Figura 1. Espécies de Begonia avaliadas neste estudo.

Begonia fischeri Begonia olsoniae Begonia venosa

 17

A segunda coleta foi realizada em fevereiro de 2015 na Ilha de Alcatrazes, sob a

autorização de coleta (SISBio) número 37256-1 (emitida para Simone Possedente de Lira).
Cinco indivíduos de B. venosa foram localizados, coletados e transportados da mesma forma
que as plantas da primeira coleta (Figura 1).
As duas espécies de Begonia coletadas no continente estavam localizadas em dois
pontos distintos da área estudada. As populações de B. fischeri foram encontradas em local
aberto com alta incidência de luz, ao passo que B. olsoniae foi encontrada na borda da mata
no sub-bosque sombreado. Os espécimes de B. venosa coletadas na ilha estavam localizados
sobre rochas e expostas à alta incidência de luz.
Ramos, folhas e flores foram coletados e constituíram os vouchers para identificação
das plantas e também material de partida para o isolamento dos fungos. Os exemplares de
Begonia foram identificados pelo Prof. Dr. Marco Antônio de Assis (Departamento de
Botânica, UNESP – Rio Claro) e pela Profª. Dra. Eliane Jacques (Departamento de Botânica,
UFRJ- Rio de Janeiro). Os vouchers estão depositados no Herbário Rioclarence (HRCB) da
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Rio Claro, SP, número de tombo
HRCB 64226 (B. fischeri) HRCB; 64227 (B. venosa) e HRCB 64229 (B. olsoniae).

2.2.3 Isolamento dos fungos endofíticos

Quatro folhas aparentemente sadias foram selecionadas de cada indivíduo, totalizando
60 folhas, considerando os 15 indivíduos das três espécies de Begonia. As folhas foram
lavadas em água corrente para remoção de partículas de solo e/ou outros detritos.
Posteriormente, as folhas foram submetidas ao processo de desinfecção superficial, o qual
consistiu na imersão durante 1 minuto em água destilada esterilizada, 1 minuto em etanol
70%, 2 minutos em NaOCl (2,5%), 1 segundo em etanol 70% e 2 minutos em água destilada
esterilizada (PETRINI, 1991 com modificações). A fim de comprovar a eficiência do
processo de desinfecção, 100 µL da última água de lavagem foi semeada em ágar malte 2%
(MA2%) e as placas incubadas em B.O.D à 25 °C, para verificar a ausência de fungos
epifíticos.
Após o processo de desinfecção, cada folha foi cortada em fragmentos de 0,8-1,0 cm
com auxílio de estilete esterilizado. Cinco fragmentos de cada folha foram inoculados em
meio batata-dextrose ágar (BDA – Acumedia, meio rico em nutrientes). Portanto, para o meio
BDA foram analisados 20 fragmentos de folhas para cada um dos 15 indivíduos de begônia.
O restante das folhas foi cortado em vários fragmentos menores e incorporados em ágar malte
2% fundido (MA2% – Acumedia, meio intermediário em nutrientes). Semelhante à técnica de
 18

placa derramada, este método foi realizado no doutorado de Sérgio Birello Sartori, o qual
recuperou um maior número de fungos endofíticos comparado aos demais meios utilizados
(dados não publicados).
Os meios utilizados neste estudo são comumente empregados para o isolamento de
fungos endofíticos (ARNOLD; HERRE, 2003). No entanto, diferente da maioria dos estudos,
optamos por utilizar duas técnicas de isolamento a fim de recuperar uma maior diversidade de
endófitos. Os meios de cultivo foram suplementados com os antibióticos tetraciclina (100 mg
L-1) e sulfato de estreptomicina (20 mg L-1) para evitar o crescimento de bactérias.
As placas de isolamento foram incubadas em B.O.D à 25 °C, durante 10 dias, no
escuro, e observadas diariamente. Uma vez detectado o crescimento de hifas, estas foram
transferidas para placas adicionais contendo MA2% e incubadas nas mesmas condições. Após
incubação, para os fungos que apresentaram esporulação foram preparadas culturas
monospóricas para garantir a pureza da cultura. Para aqueles fungos que não apresentaram
esporulação, a pureza da cultura foi checada através de transferências sucessivas em MA2%.
Após a purificação dos isolados, estes foram submetidos em dois métodos de preservação: (a)
em tubos de ensaio contendo MA2% inclinado e mantidos à 10 °C e (b) criopreservação à -80
°C, em glicerol 10%. Os isolados estão mantidos no acervo de pesquisa da Central de
Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP).

2.2.4 Triagem, extração de DNA, sequenciamento e análise filogenética

Neste estudo, foram realizadas duas triagens: morfológica e molecular, a última
baseada em Unidades Taxonômicas Operacionais (UTOs), posteriormente, os dados foram
refinados com análises filogenéticas. Primeiramente os isolados obtidos foram agrupados em
morfoespécies e caracterizados com base em observações macroscópicas (aspectos gerais da
colônia) e microscópicas (estruturas reprodutivas). As observações microscópicas foram
realizadas a partir de preparações de lâminas a fresco utilizando água ou azul de algodão
como líquido de montagem. As estruturas observadas foram comparadas com as encontradas
em chaves taxonômicas (ELLIS, 1971; 1976; WATANABE, 2002). O DNA genômico de
todas as morfoespécies foi extraído e sequenciado em proporção à sua abundância.
Para classificar os fungos foi utilizado o marcador molecular ITS (internal
transcribed spacer, SCHOCH et al., 2012). No entanto, para fungos dos gêneros Aspergillus e
Penicillium, amplificamos o gene que codifica para a ß-tubulina (primers ßT2a e ßT2b). Para
o gênero Trichoderma o gene que codifica para o fator alfa de elongação – tef1 (primers tef1r
e 728f) foi escolhido. Esses marcadores apresentam uma melhor resolução intraespecífica
 19

para esses gêneros, quando comparados com ITS. As reações de amplificação consistiram em:
0,2 mM de cada dNTP, tampão KCl 5x, MgCl2 1,5 mM, 0,5 μM de cada primer e 1U da
enzima Taq polimerase em volume final de 25 μL; as condições de amplificação foram
aquelas descritas em Montoya et al. (2016).
Os produtos da amplificação foram visualizados em gel de agarose 1% corado com
GelRed® (Biotium). A purificação dos amplicons foi realizada com Wizard® Genomic DNA
Purification Kit (Promega) e quantificado em NanoDrop (Thermo Scientific). Uma
quantidade de 20 ng de DNA molde foi utilizada na reação de sequenciamento empregando
BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit v. 3.1 (Life Technologies), seguindo o protocolo
do fabricante e aplicados em sequenciador ABI 3500 (Life Technologies).
Após sequenciamento, os contigs foram montados utilizando o software BioEdit v.
7.0.5.3 (HALL, 1999). Os contigs foram comparados com sequências homólogas presentes no
NCBI-GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov), utilizando a ferramenta MEGA BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). As sequências pertencentes aos fungos do gênero
Trichoderma foram comparadas com outras depositadas no banco de dados do International
Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy (ISTH), utilizando o aplicativo
TrichOKEY (DRUZHININA et al., 2005).
As sequências foram agrupadas em (UTOs) no software MOTHUR, considerando um
ponto de corte de 97% de similaridade. Para auxiliar na afiliação taxonômica de alguns grupos
de fungos (a saber, Aspergillus, Colletotrichum, Diaporthe, Epicoccum, Mucor, Penicillium,
Stemphylium e Trichoderma), foram realizadas análises filogenéticas a partir das UTO’s
obtidas pelo software MOTHUR. Desse modo, para cada UTO foram geradas árvores para
determinar os taxa mais relacionados com os examinados.
Análises preliminares foram realizadas para com sequências obtidas do NCBI-
GenBank (baseado nos hits obtidos) e também sequências obtidas de outros estudos (WANG
et al., 2014; CANNON et al., 2012; WALTHER et al., 2013; UDAYANGA et al, 2012;
FÁVARO et al., 2011; INDERBITZIN et al., 2009; DODD et al., 2003). As sequências foram
alinhadas com a ferramenta MAFFT (KATOH; STANDLEY, 2013), seguido de refinamento
manual. As filogenias foram inferidas utilizando o método de neighbor-joining, calculando a
distância evolutiva com o modelo Kimura 2-parâmetros (KIMURA, 1980). O suporte dos
clados foi calculado com 1.000 pseudorepetições de bootstrap e as árvores inferidas
utilizando MEGA v. 6.0 (TAMURA et al., 2013).
 20

2.2.5 Análise das comunidades de endófitos

Diferentes métricas ecológicas foram utilizadas para avaliar a riqueza e diversidade de
fungos nas comunidades examinadas. A riqueza estimada de espécies foi calculada utilizando
Chao1 (MAGURRAN, 2004). Curvas de rarefação foram geradas para comparar a riqueza de
espécies de fungos encontradas em cada espécie de begônia. Além disso, com relação à
diversidade alfa foram calculados os índices de Simpson (inverso= 1/D) e Shannon. Para
determinar o compartilhamento das espécies (diversidade beta) foram utilizados os índices de
Jaccard, Sorensen e Bray-Curtis (MAGURRAN, 2004).
As curvas de rarefação e todos os índices foram calculados no software EstimateS v.
9.1.0 (COLWELL, 2013). Para verificar diferenças significativas entre os índices de
diversidade e compartilhamento entre as comunidades avaliadas foi utilizado o teste não-
paramétrico de Kruskal-Wallis, empregado no software R v. 3.0.1. Além dessas métricas, o
número de taxa obtidos de cada comunidade foi utilizado para a construção de um diagrama
de Venn, com o intuito de visualizar o compartilhamento dos taxa entre as comunidades
estudadas. Tal análise também foi realizada no software R v. 3.0.1.
A fim de investigar possíveis relações entre as comunidades foi realizada uma análise
de correspondência (AC) no software Past v. 2.17c (HAMMER et al., 2001). Essa análise
representa os dados em dois planos a partir de uma matriz de distância (coeficiente de
similaridade de Bray-Curtis) utilizando dados de abundância para cada amostra, no caso, para
cada planta. Nessa análise, o índice de similaridade é calculado a partir de cada par de
amostras para se mapear a inter-relação destas (PODANI; MIKLOS, 2002). A análise de
similaridade ANOSIM também foi gerada no software Past v. 2.17c, utilizando a mesma
matriz de dados calculada para AC, para avaliar as diferenças estatísticas entre as
comunidades presentes nas três espécies de plantas estudadas (CLARKE; GORLEY, 2001).
A Porcentagem de Similaridade (SIMPER) foi gerada no software Past v. 2.17c. Tal
análise verifica quais taxa são os principais responsáveis pela diferença observada entre as
amostras, considerando principalmente o índice de Bray-Curtis (CLARKE, 1993).

2.3 RESULTADOS

2.3.1 Diversidade e ecologia dos fungos endófitos

Nesse estudo foram avaliadas 60 folhas (20 de cada uma das três espécies de planta),
sendo que todas apresentaram crescimento de endófitos. Não foi observado crescimento de
fungos nas placas inoculadas com a água de lavagem das folhas, demonstrando que o
 21

processo de desinfecção foi efetivo para eliminar os micro-organismos epifíticos. Das 60

folhas analisadas, foi obtido um total de 426 isolados, sendo 120 de B. fischeri e 151 de B.
olsoniae e 155 de B. venosa, considerando os dois meios de cultivo utilizados.
Baseado em caracteres morfológicos, os 426 isolados foram agrupados em 71
morfoespécies (Figura A1) e os isolados representativos de cada morfoespécie foram
sequenciados (total de 302 isolados). As sequências geradas foram agrupadas em 46 UTOs, as
quais compreendem os filos Ascomycota (93,5% do total de 426 isolados), Basidiomycota
(4,3%) e “Mucoromycota” (2,2%). Dos representantes do filo Ascomycota foram encontradas
nove ordens: Botryosphaeriales, Capnodiales, Diaporthales, Eurotiales, Hypocreales,
Pleosporales, Sordariales, Trichosphaeriales e Xylariales. O filo Basidiomycota foi
representado com apenas dois isolados, sendo um da ordem Cantharellales e o outro um
basidiomycota não identificado. O filo Mucoromycota apresentou apenas um isolado, o qual
pertence à ordem Mucorales (Tabela 2).
Dentre as 46 UTOs foi possível identificar 19 gêneros, sendo os mais abundantes:
Colletotrichum (51,6% do total de 426 isolados) e Diaporthe (22,5%, Tabela 2). As
sequências que apresentaram baixa similaridade (< 97%) com aquelas disponíveis nos bancos
de dados, cujos isolados não puderam ser identificados pelas estruturas de reprodução, estão
aqui representadas como Ascomycota não identificado.
Para auxiliar na afiliação taxonômica das UTOs obtidas pelo software MOTHUR,
foram realizadas análises filogenéticas para alguns gêneros (Figuras A2-A9). Os resultados
mostraram que o software MOTHUR (a 97% de similaridade na região ITS) foi eficiente na
distinção de todas as sequências analisadas.
Com relação à riqueza observada de taxa, foi possível notar que nenhuma das curvas
de rarefação atingiu uma assíntota, considerando um intervalo de confiança de 95%, o que
sugere que a riqueza de taxa continuaria a aumentar conforme o esforço amostral (Figura 2).
Esse resultado indica a importância de estudar essas plantas, uma vez que abrigam um grande
número de endófitos diferentes. Segundo o índice de Simpson, as comunidades de endófitos
presentes em B. fischeri, B. olsoniae e B. venosa diferem significativamente entre si. Com
relação ao índice de Shannon, as comunidades de B. fischeri e B. olsoniae, coletadas no
continente, apresentaram diferenças significativas (Kruskal-Wallis, P > 0,1, Figura 3). Já o
índice Chao1 não foi significativo entre as espécies de plantas (Kruskal-Wallis, P > 0,1,
Figura 3), o que indica que espera-se encontrar mais espécies raras em proporções
semelhantes nas três espécies e plantas.
 22

Neste estudo, as comunidades endofíticas presentes em B. fischeri apresentaram a

maior diversidade para ambos os índices avaliados. O índice de Shannon também mostrou
que a diversidade de endófitos variou segundo os hospedeiros, uma vez que, B. fischeri e B.
olsoniae, coletadas no continente apresentaram diferenças significativas entre si em relação a
esse índice. Ao passo que, B. venosa coletada na ilha de Alcatrazes não apresentou diferenças
significativas em relação às plantas do continente.

Figura 2. Riqueza de espécies de fungos endofíticos associados à Begonia fischeri (A),

Begonia olsoniae (B) e Begonia venosa (C). Riqueza estimada em um intervalo de confiança
de 95% (linhas tracejadas).
 23

Figura 3. Riqueza estimada (Chao1) e diversidade (índices de Simpson e Shannon) de fungos

endofíticos encontrados em Begonia fischeri, Begonia olsoniae e Begonia venosa.

A média e o desvio padrão para cada espécie de planta estão indicados acima dos boxplots. Letras iguais
demonstram diferenças não significativas (Kruskal-Wallis, p > 0,1). Círculos indicam valores outliers. A: Chao1,
B: Simpson, C: Shannon.
 24

Tabela 2. Classificação e distribuição das 46 UTOS de fungos endofíticos obtidas de Begonia

fischeri, Begonia olsoniae e Begonia venosa.
Taxa Begonia fischeri Begonia olsoniae Begonia venosa Total
Ascomycota não identificado 1 10 10
Ascomycota não identificado 2 1 1
Ascomycota não identificado 3 1 1
Ascomycota não identificado 4 1 1
Aspergillus niger 3 3
Aspergillus sp. 1 1
Bartalinia sp. 1 1
Basidiomycota não identificado 1 1
Cantharellales 1 1
Cladosporium sp. 3 3
Colletotrichum sp. 1 13 81 2 96
Colletotrichum sp. 2 12 6 53 71
Colletotrichum sp. 3 24 7 14 45
Colletotrichum sp. 4 7 7
Colletotrichum sp. 5 1 1
Curvularia sp. 1 3 3
Curvularia sp. 2 1 1
Diaporthe sp. 4 5 5
Diaporthe sp. 1 14 19 21 54
Diaporthe sp. 2 11 11
Diaporthe sp. 3 22 22
Diaporthe sp. 5 1 1
Diaporthe sp. 6 1 1
Diaporthe sp. 7 1 1
Diaporthe sp. 8 1 1
Endomelanconiopsis sp. 3 3
Epicoccum nigrum 2 1 3
Mucor bainieri 1 1
Neofusicoccum sp. 5 5
Neopestalotiopsis sp. 8 8
Neurospora sp. 2 2
Nigrospora sp. 6 1 7
Penicillium thomii var. flavescens 4 4
Phoma sp. 2 2
Phyllosticta sp. 15 15
Pleosporales 6 2 8
Stagonospora sp. 8 8
Stemphylium sp. 1 1
Trichoderma atroviride 2 2
Trichoderma sp. 1 1
Xylariales 1 1 1 2 4
Xylariales 2 2 1 3
 25

Xylariales 3 2 2
Xylariales 4 1 1 2
Xylariales 5 1 1
Xylariales 6 1 1
Total 120 151 155 426

2.3.2 Estrutura das comunidades de endófitos encontrados em begônias

A frequência dos gêneros e UTOs dominantes variaram entre as espécies de plantas.
No entanto, todas as begônias apresentaram como gêneros dominantes Colletotrichum e
Diaporthe. Begonia fischeri apresentou as UTOs, Colletotrichum sp. 3 (20%) e Diaporthe sp.
1 (11,6 %) como as mais abundantes. Begonia olsoniae apresentou Colletotrichum sp.1
(53,6%) e Diaporthe sp. 1 (12,5%); já Begonia venosa apresentou Colletotrichum sp. 2 (34%)
e Diaporthe sp. 3 (14%), sendo esta última encontrada apenas nesta espécie de planta.
O compartilhamento dos taxa entre as espécies de plantas foi baixo, uma vez que os
valores dos índices estavam abaixo de 0,5 (Tabela 3). Esses resultados corroboram com
aqueles obtidos pela análise de SIMPER. Esta última demonstrou que as comunidades de
endófitos encontradas nas três espécies de Begonia diferem entre si em 77,16 % em relação
aos taxa encontrados. Desse total de dissimilaridade, a UTO (Colletotrichum sp. 1) é a
responsável por 24,58 % da diferença, o que demonstra a importância desse taxa para todas as
comunidades.
A análise par a par gerada pela SIMPER mostrou que B. fischeri e B. venosa
apresentam dissimilaridade de 74 %, sendo que desse total as UTOs Colletotrichum sp. 2 e
Diaporthe sp. 3 colaboram com 15 % e 8 %, respectivamente. Ainda, B. olsoniae e B. venosa
diferem em 83,6% dos quais Colletotrichum sp. 1 (25,9%), Colletotrichum sp. 2 (15%). Já B.
fischeri e B. olsoniae diferem em 73,8 %, Colletotrichum sp. 1 (26,8) e Colletotrichum sp. 3
(6,9%). Isso demonstra a importância desses gêneros para todas as comunidades endofíticas
de begônias avaliadas no presente estudo.
Um total de cinco taxa (Colletotrichum sp. 1, Colletotrichum sp. 2, Colletotrichum sp.
3, Diaporthe sp. 1 e Xylariales 1) foram compartilhados entre as três espécies de Begonia, os
quais representam 270 isolados do total de 426 obtidos no estudo. Já B. fischeri e B. olsoniae
compartilharam quatro taxa, os quais não foram compartilhados com B. venosa (Epicoccum
nigrum, Nigrospora sp., Pleosporales e Xylariales 2; n = 21 isolados). No entanto, apenas um
taxa (Xylariales 4; n = 2 isolados) foi compartilhado entre B. fischeri e B. venosa, o qual não
foi compartilhado com B. olsoniae. Nenhum taxa foi compartilhado entre B. venosa e B.
olsoniae. Dentre as UTOs encontradas em B. fischeri, oito delas são singletons, já B. olsoniae
 26

e B. venosa apresentaram cinco e seis singletons, respectivamente, demonstrando que os

endófitos exclusivos de cada planta hospedeira compreendem taxa raros (Figura 4).
As comunidades de fungos endofíticos presentes nas espécies de begônias avaliadas
compreendem, em sua maioria, taxa raros (Figura 4). Além disso, pelo menos um indivíduo
de cada espécie de planta apresentou ao menos um isolado o qual não foi possível à
identificação, tais isolados apresentaram baixa similaridade com as sequências encontradas na
base de dados, além de não apresentarem esporulação. Esses resultados sugerem que begônias
podem abrigar espécies novas para a ciência.

Figura 4. Diagrama de Venn representando o número de Unidades Taxonômicas Operacionais

compartilhadas entre Begonia fischeri, Begonia olsoniae e Begonia venosa.

A AC apresenta-se em dois planos, onde cada eixo (horizontal e vertical) considera

uma variável. A julgar pelo eixo 1 (Figura 4), a análise sugere que as comunidades de B.
venosa (Ilha - endêmica) e B. olsoniae (continente - endêmica) são claramente divergentes.
Além disso, o eixo 2 separou as comunidades de fungos de B. fischeri (continente – não-
endêmica) das outras duas espécies. Os eixos 1 e 2 correspondem a 24% e 17 % da variação
observada nessas comunidades, respectivamente, o que sugere que outros fatores, como
características ambientais, também podem explicar os outros 59%. Contudo, o valor de R
calculado pela ANOSIM, o qual mede o quão separados estão os grupos em uma escala de 0
(não há diferença) a 1 (diferença máxima), confirmou as diferenças significativas entre as três
comunidades de begônia (R= 0,937; P= 0,001).
 27

Tabela 3. Compartilhamento de fungos endofíticos entre as espécies de plantas.

Plantas Jaccard Sorensen Bray-Curtis
Begonia fischeri Begonia olsoniae 0,257 0,409 0,339
Begonia fischeri Begonia venosa 0,167 0,286 0,32
Begonia olsoniae Begonia venosa 0,161 0,278 0,229

Figura 4. Distribuição das comunidades de fungos endofíticos de Begonia olsoniae (B2 -

vermelho), Begonia fischeri (B1 - preto) e Begonia venosa (B3 - azul). Os códigos
correspondem aos indivíduos de cada planta (segundo Tabela 1).

Porcentagem dos valores de inertia das axis 1: 24% e axis 2: 17%

2.4 DISCUSSÃO

Neste estudo foram analisados os endófitos presentes em três espécies de Begonia, a

saber: B. fischeri, B. olsoniae e B. venosa, encontradas em diferentes locais de Mata Atlântica,
continente e Ilha de Alcatrazes. Utilizando método dependente de cultivo, foi possível
comparar a diversidade, composição e estrutura das comunidades dos endófitos presentes
nessas plantas.
 28

O ciclo de vida do endófito é crucial para o conhecimento de quando e como esses

fungos realizam a fase de esporulação e são transmitidos para outros hospedeiros, bem como
compreender o real papel que desempenham na planta (MÁRQUEZ et al., 2012). Contudo, o
ciclo de vida dos fungos não é estável, mas dinâmico, sendo influenciado por características
específicas dos fungos, dos hospedeiros, bem como pelas mudanças no ambiente, já que
alguns endofíticos também são encontrados fora da planta (KUO et al., 2014). Portanto,
compreender o ciclo de um endófito é uma tarefa ardilosa. O estágio endofítico em particular,
representa um equilíbrio entre hospedeiro e fungo, quando esse equilíbrio é afetado os
endófitos podem vir a se tornar patógenos ou sapróbios (KUO et al., 2014; SCHULZ;
BOYLE, 2005).
Nesse contexto, os gêneros Colletotrichum e Diaporthe são frequentemente reportados
como endófitos e patógenos de diversas plantas, sendo de grande importância econômica
(EUGÉNIO et al., 2010; CANNON et al., 2012, MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014).
Além disso, gêneros tais como Cladosporium e Penicillium, também encontrados nesse
estudo, são considerados cosmopolitas habitantes do solo, mas também constantemente
isolados como endófitos. Essas disparidades revelam a intrigante e ainda desconhecida
biologia dos fungos endofíticos (MARQUEZ et al., 2012).
Os gêneros Colletotrichum e Diaporthe foram os dominantes para todas as plantas
avaliadas. Entretanto, as UTOs dominantes para cada planta foram diferentes, com exceção de
Diaporthe sp 1., o qual foi dominante em B. fischeri e B. olsoniae. Embora, as folhas
coletadas para o isolamento dos fungos endofíticos não apresentavam sintomas aparente de
doenças, é sabido que esses gêneros podem ocorrer como endófitos de folhas e patógenos
latentes (CANNON et al., 2012, HATA et al., 2002). No entanto, estudos anteriores
realizados pelo nosso grupo de pesquisa encontraram com prevalência esses dois gêneros em
B. venosa da ilha de Alcatrazes (dados não publicados), o que pode sugerir que esses fungos
podem ser naturalmente prevalentes em espécies de Begonia.
Algumas espécies do gênero Fusarium são conhecidas por causarem doenças em
begônias. Por exemplo, a espécie Fusarium foetens responsável pela murcha em begônias
cultivadas em casa de vegetação (SCHROERS et al., 2004). Curiosamente, nenhuma das
begônias avaliadas neste estudo apresentou espécies de Fusarium, o qual também é
comumente isolado como endófito em diversas plantas (ARNOLD; HERRE, 2003). Pesquisas
futuras poderão avaliar se os endófitos encontrados nessas plantas protegem-nas do ataque de
Fusarium, ou se hospedeiros em seu habitat natural são resistentes a esse fungo.
 29

Em relação aos taxa Xylaria, Nigrospora, Epicoccum, Curvularia, entre outros

encontrados em baixas proporções neste estudo, já foram reportados como endófitos em
outras plantas (DAVIS; SHAW, 2008; BOTELLA; DIEZ, 2011; U’REN et al., 2012).
Igualmente, Colletotrichum e Diaporthe foram os gêneros prevalentes no estudo de Ferreira et
al. (2015), o qual avaliou a comunidade endofítica de Carapa guianensis (popularmente
conhecida como Andiroba), o que sugere que esses gêneros de fungos são comuns como
endófitos.
Dentre os gêneros encontrados somente em B. venosa, destacamos Phyllostica (9,6%
do total de 155 isolados). Espécies desse gênero são reconhecidas por serem patógenos de
uma ampla gama de hospedeiros, entretanto, também são encontradas como endófitos
generalistas. Trabalhos demonstraram que este gênero foi encontrado em 70 famílias de
plantas (WIKEE et al., 2013; MOTOHASHI et al., 2009). No entanto, essa parece ser a
primeira vez que este gênero é encontrado na família Bignoniaceae.
Neste estudo alguns taxa não puderam ser identificados e estão aqui representados
como Ascomycota e Basidiomycota não identificados. Além desses, um taxa da ordem
Pleosporales, um da ordem Cantharellales e seis taxa diferentes pertencentes à ordem
Xylariales foram distinguidos, entretanto, para um melhor refinamento da identificação desses
isolados, é necessário avaliar outros marcadores moleculares para saber se tais isolados se
tratam de espécies novas. Desse modo, estudos realizados com hospedeiros pouco explorados
como Begonia são de grande importância, uma vez que a descoberta de espécies novas de
fungos corrobora com o conhecimento sobre a diversidade de fungos e também do ponto de
vista biotecnológico no sentido de que esses são uma nova maquinaria metabólica a ser
explorada.
Embora poucas UTOs tenham sido compartilhadas entre as três espécies de planta, as
begônias coletadas no continente apresentaram maior compartilhamento de UTOs, quando
comparado à begônia da ilha. Isso pode sugerir que as comunidades variaram de acordo com
o local de coleta, uma vez que, embora encontradas na mesma área, B. fischeri e B. olsoniae
estavam aproximadamente 270 m distantes entre si. Entretanto, as coletas do continente
aconteceram oito meses antes da coleta realizada na ilha de Alcatrazes, além da primeira
coleta ter ocorrido no inverno e a segunda no verão, tal fato pode explicar o porquê do maior
compartilhamento de espécies entre as begônias do continente. Contudo, o agrupamento
gerado pela análise de correspondência (Figura 4) foi significativamente diferente (ANOSIM,
R 0,937, p< 0,01), demonstrando que as comunidades endofíticas variaram entre os
 30

hospedeiros de ambientes próximos, o que mostra que cada uma das três espécies de planta
possui uma comunidade singular de endófitos.
Muitos trabalhos sugerem que a comunidade de endófitos difere segundo o tipo de
hospedeiro (U’REN et al., 2012; LAU et al., 2013; ZHANG et al., 2013; PERŠOH, 2013).
Contudo, a maioria dos hospedeiros avaliados nesses trabalhos não era relacionada, ou seja,
eram plantas de grupos filogeneticamente distintos. Embora, no presente estudo as três
espécies de plantas pertençam ao mesmo gênero, nossos resultados mostraram diferenças
significativas entre as comunidades de cada hospedeiro. As espécies B. olsoniae e B. venosa
pertencem ao mesmo clado filogenético (MOONLIGHT et al., 2015). No entanto, essas
apresentaram o maior valor de dissimilaridade entre suas comunidades (83,6%). Ou seja,
relações filogenéticas e genotípicas dos hospedeiros parecem não ter uma correlação com a
composição das comunidades endofíticas, podendo ser diferente entre hospedeiros da mesma
espécie, porém semelhantes entre outros gêneros ou até mesmo hospedeiros de outras famílias
(PERŠOH, 2015).
A diferença na diversidade entre as comunidades de fungos de B. fischeri, B. olsoniae
e B. venosa pode estar relacionada às características intrínsecas de cada hospedeiro, como a
espessura da folha e quantidade de tricomas, os quais podem interferir na entrada de
endófitos. Por exemplo, B. olsoniae e B. venosa apresentam folhas mais grossas e com mais
tricomas que B. fischeri, porém não encontramos na literatura estudos sobre endófitos dessas
plantas ou tais características associadas. Além disso, metabólitos secundários presentes nas
folhas de cada planta pode também apresentar o papel de selecionar a comunidade endofítica,
de modo que, alguns fungos consigam resistir às condições desse ambiente e outros não.
No estudo sobre endófitos de Taxus chinensis var. mairei, Wu e colaboradores (2013)
sugeriram que as características ambientais de cada local influenciaram na estrutura das
comunidades de endófitos, uma vez no interior da planta estes podem ser selecionados por
diferentes tipos de tecidos. De modo semelhante, as comunidades de fungos estudadas neste
trabalho podem variar conforme o local, porém serem “selecionadas” pelo hospedeiro, de
modo que alguns endófitos consigam se alojar dentro do tecido vegetal, no caso as folhas, e
outros não.
Nesse trabalho, observamos que cada uma das espécies avaliadas apresenta uma
comunidade distinta de endófitos independente da área de coleta. No entanto, o fato de B.
fischeri e B. olsoniae compartilharem um número considerado de espécies, comparado a B.
venosa sugerimos que, embora o hospedeiro seja um dos principais fatores para as diferenças
observadas na composição de espécies, o local de coleta também pode atuar como fator
 31

determinante nas comunidades endofíticas de Begonia. Compreender a estrutura das

comunidades endofíticas exigi um olhar dinâmico, portanto, estudos futuros visando o
conhecimento do microbioma endofítico em Begonia poderiam ser realizados, a fim de obter
um conhecimento mais profundo sobre os fungos endotíticos dessas plantas.

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 35

2.6 ANEXOS
Tabela A1. Endófitos isolados de Begonia fischeri, Begonia olsoniae, Begonia venosa encontradas na
Mata Atlântica.
ID Total de
Identificação Resultado da busca no NCBI-GenBank N. de acesso
(%) isolados
Ascomycota

Ascomycota não identificado 1 94 Mycoleptodiscus terrestres JN711860 10

Ascomycota não identificado 2 98 Mycoleptodiscus indicus KJ471483 1

Ascomycota não identificado 3 98 Sporormiella isomera CBS 166.73 AY943053 1

99 Preussia africana JQ031265

Ascomycota não identificado 4 98 Microsphaeropsis olivacea CBS 303.68 JX681101 1

98 Ascochyta viciae-pannonicae EU167559

Aspergillus niger 100 Aspergillus niger CBS 12049 AY585535 3

99 Aspergillus lacticoffeatus CBS 101884 AY819999

Aspergillus sp. 100 Aspergillus niger CBS 12049 AY585535 1

Bartalinia sp. 97 Bartalinia sp. UFMGCB 6427 KJ471560 1

Bartalinia pondoensis JQ425386
Cladosporium sp. 100 Cladosporium perangustum CBS 126364 HM148122 3
99 Cladosporium colombiae CBS 274.80B
NR_119729
Colletotrichum sp. 1 99 Colletotrichum brevisporum NR_111637 96
99 Glomerella magna HM163188

Colletotrichum sp. 2 99 Colletotrichum boninense JX258728 71

99 Colletotrichum nicotianae HG798903

Colletotrichum sp. 3 100 Colletotrichum NR_120133 45

99 aeschynomenes CBS 130418 NR_119731
Colletotrichum asianum

Colletotrichum sp. 4 100 Colletotrichum thailandicum JN050242 7

99 Colletotrichum gloeosporioides JQ936128

Colletotrichum sp. 5 99 Colletotrichum magnisporum CBS 398.84 NR_132056 1

98 Colletotrichum arxii CBS 132511 NR_132055

Curvularia sp. 1 99 Curvularia trifolii KM246257 3

96 Curvularia luneta KJ418360

Curvularia sp. 2 99 Curvularia geniculate CBS187_50 KJ909781 1

Diaporthe sp. 1 98 Diaporthe terebinthifolii CBS 133180 NR_111862 54

98 Diaporthe endophytica CBS 133811 NR_111847

Diaporthe sp. 2 99 Diaporthe arengae CBS 114979 NR_111843 11

98 Diaporthe musigena CBS 129519 NR_111853
Diaporthe sp. 3 99 Diaporthe ceratozamiae CBS 131306 JQ044420 22
98 Diaporthe arecae CBS 161.64 KC343032

Diaporthe sp. 4 99 Diaporthe mayteni CBS 133185 NR_111852 5

Diaporthe sp. 5 96 Diaporthe phaseolorum CBS 113425 KC343174 1
95 Diaporthe endophytica CBS 133811 NR_111847

Diaporthe sp. 6 96 Diaporthe sclerotioides CBS 296.67 KC343193 1

 36

Diaporthe sp. 7 96 Diaporthe phaseolorum CBS 113425 KC343174 1

Diaporthe sp. 8 99 Diaporthe anacardii CBS 720.97 NR_111841 1

98 Diaporthe foeniculacea CBS 111554 KC343102
Endomelanconiopsis sp. 99 Endomelanconiopsis endophytica CBS 120397 KF766164 3
99 Endomelanconiopsis microspora CBS 353.97 KF766165

Epicoccum nigrum 99 Epicoccum nigrum KP132016 3

Phoma sp. 100 Phoma sp. KM507776 2

Neofusicoccum sp. 98 Neofusicoccum ribis CBS 115475 KF766205 5
Neopestalotiopsis sp. 100 Neopestalotiopsis cubana CBS 600.96 KM199347 8
99 Neopestalotiopsis ellipsospora CBS 115113 KM19934

Neurospora sp. 99 Neurospora tetraspora CBS 178.33 NR_077163 2

99 Neurospora africana CBS 571.69 GQ922531

Nigrospora sp. 1 99 Nigrospora oryzae CBS 113884 DQ219433 7

Penicillium thomii var. flavescens 99 Penicillium flavescens KF769402 4

99 Penicillium thomii CBS n 347.59 GQ367510

Phyllosticta sp. 100 Phyllosticta capitalensis CBS 123373 JQ743587 15

Pleosporales 97 Leptosphaerulina chartarum CBS 329.86 KJ79640 8
99 Boeremia exigua var. exigua CBS 118.94 EU167567

Stagonospora sp. 99 Stagonospora trichophoricola CBS 136764 KJ869110 8

Stemphylium sp. 100 Stemphylium lycopersici KR911818 1
Trichoderma sp. 97 Trichoderma ovalisporum FJ463280 1
97 Trichoderma koningiopsis FJ463288

Trichoderma atroviride 99 Trichoderma atroviride UTHSC:10-2682 HG931223 2

Xylariales 1 98 Xylaria sp. AB743839 4
Xylariales 2 95 Xylaria sp. EU747724 3

Xylariales 3 98 Xylaria berteri UFMG 5268 JQ327861 2

Xylariales 4 97 Muscodor vitigenus KC771503 2

100 Muscodor yucatanensis FJ917287

Xylariales 5 99 Xylaria arbuscula JN601145 1

99 Xylaria venosula AB462754
Xylariales 6 99 Xylaria apiculata KP133329 1
Basidiomycota
Cantharellales 95 Ceratobasidium sp. HQ630980 1
95 Rhizoctonia sp. AJ318421
Basidiomycota não identificado 90 Basidiomycota sp. KP814442 1
Mucormycotina
Mucor bainieri 100 Mucor bainieri CBS 293.63 NR_103628 1

TOTAL 426
 37

Figura A1. Aspecto geral das colônias de algumas UTOs representativas obtidas no presente
estudo. Para maiores detalhes sobre a origem (espécie de planta), consulte a tabela 2.

A: Epicoccum nigrum, B: Penicillium thomii var. flavescens, C: Cladosporium sp., D: Diaporthe sp.1, E:
Neopestalotiopsis sp., F: Colletotrichum sp.1, G: fungo não identificado, H: Nigrospora sp.1, I: Mucor bainieri,
J: Aspergillus niger, K: Xylaria sp. 1, L: Trichoderma sp. M: Cantharellales, N: Curvularia sp.1, O:
Endomelanconiopsis sp, P: Diaporthe sp. 2, Q: Diaporthe sp. 2, R: Epicoccum soghi, S: Trichoderma atroviride,
T: Diaporthe sp. 2, U: Neopestalotiopsis sp., V: Neofusicoccum sp., X: Colletotrichum sp. 1, W: Diaporthe sp. 6,
Y: Ascomycota não identificado 2
 38

Figura A2. Árvore filogenética de sequências de Aspergillus spp. inferida com o gene que codifica
para a proteína beta tubulina. A árvore foi baseada no algoritmo de Neighbor-Joining, inferida com o
modelo de Kimura 2 parâmetros. O suporte dos clados foi calculado com 1000 pseudoréplicas de
bootstrap. Em negrito estão os isolados analisados no presente estudo.
 39

Figura A3. Árvore filogenética de sequências de Colletotrichum spp. inferida com o marcador ITS. A
árvore foi baseada no algoritmo de Neighbor-Joining e inferida com o modelo de Kimura 2
parâmetros. O suporte dos clados foi calculado com 1000 pseudoréplicas de bootstrap. Em negrito
estão os isolados analisados no presente estudo
 40

Figura A4. Árvore filogenética de sequências de Diaporthe spp. inferida com o marcador ITS. A
árvore foi baseada no algoritmo de Neighbor-Joining e inferida com o modelo de Kimura 2
parâmetros. O suporte dos clados foi calculado com 1000 pseudoréplicas de bootstrap. Em negrito
estão os isolados analisados no presente estudo.
 41

Figura A5. Árvore filogenética de sequências de Epicocum spp. inferida com o marcador ITS. A
árvore foi baseada no algoritmo de Neighbor-Joining e inferida com o modelo de Kimura 2
parâmetros. O suporte dos clados foi calculado com 1000 pseudoréplicas de bootstrap. Em estão os
isolados analisados no presente estudo.
 42

Figura A6. Árvore filogenética de sequências de Mucor spp. inferida com o marcador ITS. A árvore
foi baseada no algoritmo de Neighbor-Joining e inferida com o modelo de Kimura 2 parâmetros. O
suporte dos clados foi calculado com 1000 pseudoréplicas de bootstrap. Em negrito estão os isolados
analisados no presente estudo. Grupo externo Rhizomucor.
 43

Figura A7. Árvore filogenética de sequências de Penicillium spp. inferida com o gene que codifica
para a proteína Beta tubulina. A árvore foi baseada no algoritmo de Neighbor-Joining e inferida com o
modelo de Kimura 2 parâmetros. O suporte dos clados foi calculado com 1000 pseudoréplicas de
bootstrap. Em negrito estão os isolados analisados no presente estudo.
 44

Figura A8. Árvore filogenética de sequências de Stemphylium spp. inferida com o marcador ITS. A
árvore foi baseada no algoritmo de Neighbor-Joining e inferida com o modelo de Kimura 2
parâmetros. O suporte dos clados foi calculado com 1000 pseudoréplicas de bootstrap. Em negrito
estão os isolados analisados no presente estudo
 45

Figura A9. Árvore filogenética de sequências de Trichoderma spp. inferida com o gene que codifica
para a proteína fator alfa. A árvore foi baseada no algoritmo de Neighbor-Joining, inferida com o
modelo de Kimura 2 parâmetros. O suporte dos clados foi calculado com 1000 pseudoréplicas de
bootstrap. Em negrito estão os isolados analisados no presente estudo.
 46

3 CAPÍTULO 2 - PROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ENCONTRADOS EM

TRÊS ESPÉCIES DE BEGONIA

Ana M. L. Correia1, Simone P. Lira2, Diana Fortkamp2, Andre Rodrigues1*

1
UNESP – Univ Estadual Paulista, Departamento de Bioquímica e Microbiologia, Rio Claro,
SP, Brasil.
2
USP – Univ de São Paulo, Departamento de Produtos Naturais, Piracicaba, SP, Brasil.

Palavras-chaves: Bioensaio. Fitopatógenos. Bioprospecção. Fração acetato.

* Correspondência para:
Andre Rodrigues (andrer@rc.unesp.br)
Universidade Estadual Paulista, UNESP, Câmpus de Rio Claro
Avenida 24-A, n. 1515, Bela Vista, Rio Claro, São Paulo, Brazil, CEP: 13.506-900
Tel.: +55 19 3526-4364; Fax: +55 19 3526-4176
 47

RESUMO
Fungos endofíticos vivem dentro do tecido das plantas sem causar sintomas aparente de
doença. Tais fungos são conhecidos por serem excelentes produtores de metabólitos
secundários capazes de combater micro-organismos patogênicos, além de constituírem uma
fonte pouco explorada em relação aos compostos bioativos que produzem. Nesse contexto, o
presente trabalho avaliou frações acetato obtidas de fungos endofíticos isolados de Begonia
fischeri, Begonia olsoniae e Begonia venosa, plantas encontradas em diferentes áreas da Mata
Atlântica. As frações foram obtidas de cultivos em meio líquido e submetidas a teste de
antagonismo em placa frente aos fitopatógenos Phomopsis sojae e Colletotrichum
gloeosporioides. Das 88 frações acetato avaliadas, 26% apresentaram atividade inibitória
significativa em relação ao controle, dessas 14,7% inibiram C. gloeosporioides e 11,3 %
inibiram P. sojae. Neste trabalho destacamos a importância de estudos com hospedeiros não
usuais como fonte de endófitos não explorados. Aqui, demonstramos que esses endófitos são
capazes de produzir compostos que podem eventualmente serem empregados no controle
desses fitopatógenos.

3.1 INTRODUÇÃO

Micro-organismos endofíticos são principalmente fungos e bactérias que habitam, pelo

menos em um período de seu ciclo de vida, o interior das plantas sem causar sintomas de
doenças (ARAÚJO et al., 2010). Recentemente, o interesse nos fungos endofíticos deve-se ao
seu potencial uso como biocatalizadores para transformação química de produtos naturais,
uma vez que produzem enzimas com atividade de modificação esteroespecífica de compostos
químicos (ALY et al., 2011). Além disso, vários estudos levaram à descoberta de centenas de
produtos naturais incluindo alcaloides, terpenoides, flavonoides e esteroides oriundos de
fungos endofíticos (NAIR, PADMAVATHY, 2014; JOSEPH, MINI PRIYA, 2011). Muitos
desses compostos são também reconhecidos por suas funções antibiótica, imunossupressora,
anticancerígena e de repelência de insetos pragas (BARTHOLDY et al., 2001).
Endófitos podem sintetizar metabólitos bioativos frente a diferentes doenças do
hospedeiro, possibilitando o controle biológico através de fatores de indução da resistência
sistêmica e resistência adquirida, o que pode culminar na redução dos patógenos na planta
(STEPNIEWSKA; KUŹNIAR, 2013). No entanto, a produção de biocompostos pode variar
entre linhagens fúngicas isoladas de habitats diferentes, como relatado por Higginbotham e
colaboradores (2013). Esses autores observaram que endófitos de florestas úmidas
 48

apresentaram maior antagonismo a Plasmodium falciparum e Leishmania donovani, quando

comparados a isolados obtidos das mesmas ordens de hospedeiros encontradas em florestas de
planícies.
Estudos demonstram que endófitos isolados de Theobroma cacao possuem atividade
antagonista frente à fitopatógenos, como Moniliophthora perniciosa, causador da vassoura-
de-bruxa, uma doença muito comum em cacaueiros (ARNOLD; HERRE, 2003; HANADA et
al., 2010). Desse modo, os endófitos são relevantes para o controle de fitopatógenos, pois
colonizam um nicho ecológico semelhante ao ocupado pelos mesmos (ARAÚJO et al., 2010).
Devido ao potencial dos endófitos em auxiliar seus hospedeiros na proteção de
fitopatógenos, faz-se necessário uma busca sistemática por fungos que produzem substâncias
bioativas. Tendo em vista o estudo de Higginbotham et al. (2013), avaliar o potencial
antifúngico de endófitos isolados de diferentes locais, é de grande interesse para a prospecção
de bioativos.
Dentre os diversos fitopatógenos que ocasionam prejuízos para o setor agroeconômico
brasileiro, Phomopsis sojae e Colletotrichum gloeosporioides são os que acarretam o maior
descarte de lotes de sementes (EMBRAPA, 2004). O fungo Phomopsis sojae é um
fitopatógeno que ocasiona a seca da haste e da vagem da soja, influenciando na qualidade das
sementes e ocasionando importantes perdas econômicas em nosso país (EMBRAPA, 2004). O
fungo C. gloeosporioides é o agente responsável pela antracnose, uma doença que ataca
diversas culturas, como abacate, morango, berinjela, café, caju, citros, etc; podendo afetar o
hospedeiro na fase de seu desenvolvimento no campo, como também na pós-colheita
(FREEMAN et al., 1998). Devido aos prejuízos causados por tais fitopatógenos, a busca por
biocompostos ativos que possam combatê-los é importante, uma vez que, podem corroborar
com alternativas de biocontrole, diminuindo o impacto causado por agrotóxicos.
Nesse sentido, o presente estudo avaliou o potencial dos fungos endofíticos isolados
de Begonia fischeri, Begonia olsoniae e Begonia venosa coletadas em duas regiões diferentes
de Mata Atlântica, a fim de saber se os fungos endofíticos associados a Begonia produzem
compostos ativos frente a fitopatógenos. Embora alguns estudos tenham evidenciado o uso
biotecnológico de algumas espécies de begônias (PANDIKUMAR et al., 2009; SURESH;
NAGARAJAN, 2009; RAMESH et al., 2002), além de várias patentes que fazem uso de
espécies como Begonia fimbristipula, nada se sabe sobre os micro-organismos endofíticos
associados a essas plantas.
O estudo de endófitos em hospedeiros pouco explorados pode levar à descoberta de
novos compostos bioativos, portanto, o presente trabalho avaliou a ação antagonista de
 49

frações acetato obtidas de fungos endofíticos frente aos fitopatógenos P. sojae e C.

gloeosporioides.

3.2 MATERIAL E MÉTODOS

3.2.1 Origem das linhagens

Um total de 88 endófitos provenientes do acervo de pesquisa da CRM-UNESP foi
utilizado para os bioensaios de antagonismo frente aos fitopatógenos P. sojae e C.
gloeosporioides. Dentre esses, 36 endófitos foram selecionados de B. fischeri, 24 de B.
olsoniae e 28 de B. venosa. O número de endófitos selecionados de cada planta foi designado
de acordo com a diversidade de endófitos recuperados dessas plantas no estudo apresentado
no capítulo 1. Portanto, quanto mais diversas foram comunidades, maior o número de isolados
selecionados para o teste de bioensaio. Os fitopatógenos utilizados nesse estudo foram
gentilmente cedidos pelo Laboratório de Genética de Micro-organismos e Laboratório de
Fitopatologia da ESALQ- USP. Além disso, ambos foram isolados de hospedeiros que
apresentavam sintomas de podridão da haste e antracnose, ocasionados pelos respectivos
fitopatógenos.

3.2.2 Obtenção da fração acetato e bioensaios in vitro

Os fungos endofíticos utilizados neste estudo estão preservados pela técnica de
Castellani (CASTELLANI, 1939). Primeiramente, os isolados foram inoculados em MA2% e
incubados a 25 °C, no escuro, durante sete dias. Uma vez que estes apresentaram-se viáveis,
(crescimento uniforme e livre de contaminações) um disco de ágar com micélio fúngico (5
mm de diâmetro) foi transferido para novas placas de Petri contendo MA2% e incubadas nas
mesmas condições..
Em seguida, três discos (5 mm de diâmetro) de ágar com micélio dos fungos foram
transferidos para 150 mL de meio Caldo Extrato de Malte 2%, pH 6,0 e cultivados a 28 °C,
em agitação (150 rpm), durante sete dias. Após esse período, os caldos de cultivo foram
filtrados e submetidos à partição entre água e acetato de etila. Para cada 150 mL de filtrado
foram adicionados 100 mL de acetato de etila em funil de separação. Esse procedimento foi
repetido três vezes para a extração máxima e ao final a fase aquosa foi descartada. Por fim, a
fração acetato foi seca em rotoevaporador e pesada.
A triagem de atividade biológica foi realizada em placas de Petri contendo MA2%. No
centro da placa foi inserido um disco de ágar contendo o fitopatógeno alvo, já com sete dias
 50

de crescimento. Entre o fitopatógeno e a borda da placa foi inserido um disco de papel filtro
esterilizado, onde foi depositado 2 mg da fração acetato obtida de cada isolado. Também
foram realizados controles dos fitopatógenos (somente o fitopatógeno) e do acetato de etila
(fitopatógeno mais disco com o solvente). As placas de Petri foram incubadas em B.O.D. a 28
°C, durante sete dias, no escuro.
Para avaliar o crescimento dos fitopatógenos na presença das frações foram
determinados escores qualitativos de inibição, os quais foram baseados no tamanho do halo de
inibição formado e se o crescimento micelial do fitopatógeno alcançou o disco de papel ou
não (Figura 1). Optou-se por esse tipo de avaliação, uma vez que é sabido que os resultados
obtidos através de bioensaios variam segundo a capacidade de difusão do composto no meio
de cultivo e quantidade do composto ativo formado. A fim de verificar a reprodutibilidade do
ensaio, as frações que foram capazes de inibir o crescimento dos fitopatógenos foram
submetidas a um novo bioensaio. Esse foi realizado do mesmo modo que o anterior, porém
para cada fração foram realizadas três réplicas.

Figura 1. Escores de inibição dos fitopatógenos Colletotrichum gloeosporioides de Phomopsis

sojae por frações acetato obtidas de cultivos de fungos endofíticos
Escores de Descrição Foto
inibição
+ Fitopatógeno chegou até o disco. Halo de inibição
muito pequeno

++ Fitopatógeno não chegou até o disco de papel.

Pequeno halo de inibição

+++ Fitopatógeno não chegou até o disco de papel.

Grande inibição
 51

O crescimento dos fitopatógenos foi registrado digitalizando-se as placas com sete

dias de crescimento (momento em que o controle atingiu a borda da placa), utilizando scanner
HP Deskjet F2050. Após a digitalização, as imagens das colônias foram analisadas no
software ImageJ v. 1.38 (SCHNEIDER et al., 2012), onde foi realizado a medição da área de
crescimento (em mm2). As médias da área de crescimento dos fitopatógenos frente aos
diferentes extratos foram avaliadas utilizando-se ANOVA dois fatores. As comparações
múltiplas entre as médias foram realizadas pelo teste de Tukey HSD. As análises estatísticas
foram realizadas no programa Past v. 2.17c (HAMMER et al., 2001). Para representar os
dados foram gerados boxplots no programa R.

3.3 RESULTADOS

Dentre os 88 endófitos, 24 frações acetato apresentaram atividade antagonista frente a

pelo menos um dos fitopatógenos. Dessas frações, seis demonstraram atividade para ambos os
fitopátogenos, porém apresentaram diferentes escores de inibição (Tabela 1); exceto o isolado
am80 (Xylaria sp. 2) que apresentou inibição média (++) tanto para P. sojae, quanto para C.
gloeosporioides (Tabela 1). Resultado interessante foi o fato de que os endófitos que
apresentaram maiores escores de inibição (+++) não foram os mesmos para cada fitopatógeno
(Tabela 1).
Em relação à origem dos isolados, dos 36 endófitos selecionados de B. fischeri, as
frações acetato de 10 deles inibiram o crescimento de pelo menos um dos fitopatógenos
estudados. Dos 24 endófitos de B. olsoniae, as frações acetato de 12 deles foram capazes de
inibir o crescimento dos fitopatógenos. Para B. venosa das 28 frações avaliadas, apenas duas
foram capazes de inibir somente P. sojae.
Todas as frações que apresentaram inibição (n= 24) foram submetidas a um novo
bioensaio, dessa vez em triplicata. Como demonstrado nas Figuras 2 e 3, a maior parte das
frações continuaram ativas mesmo após quatro a cincos meses de armazenamento em freezer,
quando o teste foi reavaliado. Isso sugere que os metabólitos extraídos são estáveis e não
degradam facilmente. No entanto, em relação ao fitopatógeno C. gloeosporioides o ensaio
com a fração am222 (Colletotrichum sp. 1) não apresentou atividade no segundo bioensaio. Já
para P. sojae os tratamentos am078, am95, am120, am122, am173 e am273, não apresentaram
diferenças significativas em relação ao controle. Desse modo, das 88 frações avaliadas 13
(14,7%) apresentaram atividade inibitória significativa em relação ao controle contra C.
gloeosporioides e 10 (11,3 %) contra P. sojae.
 52

Tabela 1. Atividade inibitória de 24 fungos endofíticos isolados de Begonia fischeri, Begonia

olsoniae e Begonia venosa frente aos fitopatógenos Phomopsis sojae e Colletotrichum
gloeosporioides. Em negrito, isolados que inibiram ambos os fitopatógenos.
Isolado Fungo Hospedeiro Phomopsis sojae Colletotrichum gloeosporioides
am 11 Colletotrichum sp. 1 B. olsoniae - +
am 222 Colletotrichum sp. 1 B. olsoniae - +
am 229 Colletotrichum sp. 1 B. olsoniae - +
am 37 Colletotrichum sp. 1 B. olsoniae - ++
am 273 Curvularia sp. 1 B. fischeri +++ -
am 193 Curvularia sp. 2 B. fischeri +++ -
am 02 Diaporthe sp. 1 B. fischeri ++ -
am 114 Diaporthe sp. 1 B. olsoniae - ++
am 117 Diaporthe sp. 1 B. fischeri ++ +++
am 122 Diaporthe sp. 1 B. olsoniae + +
am 111 Diaporthe sp. 2 B. olsoniae ++ -
am 120 Diaporthe sp. 3 B. olsoniae ++ -
am 82 Diaporthe sp. 5 B. olsoniae +++ -
am 173 Epicoccum nigrum B. fischeri + +++
am 78 Mucor bainieri B. olsoniae + +
am 110 Neopestalotiopsis sp. B. fischeri - ++
am 29 Neopestalotiopsis sp. B. fischeri +++ -
am 95 Neopestalotiopsis sp. B. fischeri ++ -
am 58 Trichoderma sp. B. olsoniae ++ +
am 166 Xylarialles B. olsoniae - +
am 80 Xylaria sp. 2 B. fischeri ++ ++
am 145 Xylarialles B. fischeri - ++
Ascomycota não -
b145 B. venosa +++
identificado
b147 Colletotrichum sp. 1 B. venosa ++ -
 53

Figura 2. Área de crescimento micelial do fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides

exposto às frações acetato dos endófitos encontrados em Begonia fischeri e Begonia olsonie.

Os (*) sobre os boxplots indicam diferença não significativa em relação ao controle (Anova, p > 0,05).
O tratamento am222 apresentou resultado no primeiro bioensaio, no entanto, não apresentou atividade
quando submetido ao novo bioensaio em triplicata.

Figura 3. Área de crescimento do fitopatógeno Phomopsis sojae exposto às frações acetato

dos endófitos encontrados em Begonia fischeri, Begonia olsonie e Begonia venosa.

Os (*) sobre os boxplots indicam diferença não significativa em relação ao controle (Anova, p > 0,05).
 54

Figura 4. Crescimento micelial de Colletotrichum gloeosporiodes na presença de frações acetato

obtidas de cultivos de fungos endofíticos de Begonia fischeri, Begonia olsoniae e Begonia venosa

A: am011, B: am037, C: am058, D: am078, E: am080, F: am110, G: am114, H: am117, I: am122, J:

am145, K: am166, L: am173, M: am222, N: am229, O: Controle

Figura 5. Crescimento micelial de Phomopsis sojae na presença de frações acetato obtidas de cultivos
de fungos endofíticos de Begonia fischeri, Begonia olsoniae e Begonia venosa

A: am02, B: am29, C: am58, D: am78, E: am80, F: am82, G: am95, H: m111, I: am117, J: am120, K:
am122, L: am173, M: am193, N: am 273, O: b 145, P: b147, Q: Controle
 55

3.4 DISCUSSÃO

No presente estudo foram avaliadas as frações acetato obtidas de fungos endofíticos

depositados no acervo de pesquisa da CRM-UNESP. Os fungos foram isolados de espécies de
plantas do gênero Begonia, a saber: B. fischeri, B. olsoniae e B. venosa. Os bioensaios de
antagonismo foram realizados frente aos fitopatógenos P. sojae e C. gloeosporioides. Os
resultados obtidos mostraram que alguns desses endófitos produzem metabólitos capazes de
inibir o crescimento de fitopatógenos de interesse agroeconômico.
No primeiro bioensaio 24 frações apresentaram atividade, no entanto, quando
submetida ao segundo teste de antagonismo, a fração am222 não apresentou atividade. Isso
sugere que o composto responsável pela inibição inicial degradou com o decorrer do tempo,
uma vez, que o segundo teste foi realizado quatro a cinco meses depois do primeiro. Logo,
dentre as frações avaliadas, 26% delas (23 de um total de 88) foram ativas para pelo menos
um fitopatógeno. Além disso, algumas dessas frações formaram halos de inibição maiores que
outros, o que sugere que diferentes metabólitos secundários ativos sejam produzidos por cada
uma das linhagens de fungos, conforme observado por Higginbotham et al. (2013) também
em experimentos in vitro.
Em relação ao bioensaio realizado frente a C. gloeosporiodes, podemos observar que
os tratamentos utilizados formaram poucos halos bem definidos (em comparação os
tratamentos am173 e am117 para o mesmo fitopatógeno, por exemplo, Figura 4). No entanto,
para os tratamentos am11 e am078, o crescimento micelial do fitopatógeno apresenta-se
diferente do controle, além de não atingir a borda da placa. Essa observação sugere que os
compostos presentes nessas frações atuem como retardadores de crescimento (fungistáticos).
Já para P. sojae, de modo geral, os halos de inibição formados foram definidos (Figura 5).
Embora os tratamentos am173 e am120 não tenham apresentado diferenças significativas em
relação ao controle, pode-se observar halos bem definidos, indicando provavelmente que o
composto responsável pela inibição é produzido em pouca quantidade ou não se difunde em
meio de cultivo. Em ambos os casos, para afirmações mais consistentes é necessário uma
busca pelos compostos responsáveis pela inibição.
Os bioensaios de antagonismo realizados frente a P. sojae demonstraram que as
frações acetato obtidas dos endófitos Cuvularia sp. 1, Curvularia sp. 2, Diaporthe sp. 5 e
Neopestalotiopsis sp. inibiram fortemente esse fitopatógeno. Ao passo que Diaporthe sp. 1 e
Epicoccum nigrum apresentaram maior inibição para o fitopatógeno C. gloeosporioides.
Nesse contexto, os endófitos apresentaram certa especificidade inibitória, uma vez que, os
 56

melhores inibidores para P. sojae não foram os mesmos para C. gloeosporioides, o que do
ponto de vista do controle biológico é interessante. Baseado nesses resultados é provável que
os compostos ativos desses endófitos sejam diferentes, o que mostra um potencial
biotecnológico a ser explorado.
Em relação ao gênero Neopestalotiopsis, embora a similaridade das sequências obtidas
no presente estudo aponte para espécies desse gênero, é necessário que outras regiões do
genoma sejam avaliadas para confirmar a identificação, visto que muitas espécies de
Pestalotiopsis foram transferidas para Neopestalotiopsis, seguido da descrição de 11 espécies
novas (MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014). Espécies do gênero Pestalotiopsis são
consideradas excelentes produtores de metabólitos secundários, pois cerca de 160 metabólitos
secundários com atividade antitumoral, antifúngica e antimicrobiana foram descobertos entre
os anos de 2010 e 2013 provenientes desse gênero (XU et al., 2014).
O gênero Diaporthe é encontrado comumente como endófito em várias plantas
(GOMES et al., 2013). Muitos trabalhos reportaram a atividade antagonista de espécies desse
gênero frente a vários micro-organismos patogênicos. Dettrakul et al. (2003) isolaram o
composto Diaporthein B, o qual inibiu o crescimento de Mycobacterium tuberculosis, o
agente etiológico da tuberculose. Desse modo, devido Diaporthe ser um dos gêneros que
apresenta um grande número de espécies endofíticas, esse é um grupo promissor na busca de
novos compostos bioativos. Portanto, trabalhos futuros poderão explorar esse potencial nos
isolados obtidos de begônias.
Neste estudo, observamos que linhagens de Cuvularia e Epicoccum apresentaram
atividades antagonistas ao fitopatógeno P. sojae. Semelhante a Curvularia pallescens, isolado
como endófito de Calotropis procera, destacou-se pela inibição das bactérias Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes e o fungo fitopatogênico Colletotrichum dematium
(NASCIMENTO et al., 2015). Já, E. nigrum foi capaz de inibir o crescimento de vários
fitopatógenos da cana-de-açúcar, além de ocasionar o aumento de biomassa da raiz
(FÁVARO et al., 2012). Isso sugere que tais gêneros também são promissores na busca por
compostos bioativos.
O gênero Xylaria é comumente encontrado como sapróbio, entretanto, algumas
espécies são encontradas com endófitos ou patógenos (CHEN et al., 2014). Além disso,
representantes desse gênero são reconhecidos por apresentarem compostos bioativos, como o
antifúngico xyloide isolado do endófito Xylaria feejeensis, encontrado em plantas da
Amazônia (BARABAN et al., 2013). No presente trabalho, também observamos a atividade
antagonista de Xylaria sp. frente aos fitopatógenos estudados, o que demonstra que esses
 57

fungos endofíticos são uma fonte a ser explorada na busca de compostos para fungos
fitopatogênicos.
Nesse contexto, embora várias espécies de fungos sejam conhecidas pela produção de
metabólitos secundários, pouco se sabe sobre a interação desses compostos na associação
fungo-planta e de que modo tais fungos podem atuar como agentes de defesa naturais para as
plantas (FÁVARO et al., 2012). Desse modo, é de grande relevância estudos
interdisciplinares, associando tanto os aspectos ecológicos evolvendo fungo-planta, quanto
metabólicos para melhor compreensão, desse diverso e intrigante grupo de fungos.
Embora houve um aumento no número de estudos sobre os fungos endófiticos nos
últimos anos, este grupo ainda permanece pouco explorado (CORRÊA et al., 2014). Neste
trabalho destacamos a importância de estudos com hospedeiros não usuais como fonte de
endófitos não explorados. Aqui, demonstramos que esses endófitos são capazes de produzir
compostos que podem eventualmente atuar no controle de C. gloeosporiodes e P. sojae. No
entanto, é necessário exaurir os potencias de tais endófitos, não somente avaliando quais são
os compostos que estes produzem, como também, avaliar os efeitos em outros micro-
organismos de interesse médico ou biotecnológico.

3.5 REFERÊNCIAS
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 58

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 59

4 CONSIDERAÇÕES

 As espécies Begonia fischeri, Begonia olsoniae e Begonia venosa apresentaram

fungos endofíticos de ocorrência comum em outras plantas. Porém, cada hospedeiro
também apresenta uma comunidade singular de fungos endofíticos, os quais são
representados por taxa raros.

 Esses hospedeiros são uma fonte pouco explorada do ponto de vista dos fungos
endofíticos, visto que, não foi possível identificar alguns dos fungos obtidos no
presente estudo, além disso, a maioria do isolados foi identificada até gênero o que
sugere que esses hospedeiros podem abrigar espécies ainda desconhecidas para a
ciência. Estudos posteriores com os fungos depositados no acervo da CRM-UNESP
poderão revelar se esses isolados são taxa ainda não descritos.

 As diferenças na riqueza, composição e diversidade das comunidades endofíticas

presentes nas espécies de plantas avaliadas, parecem estar relacionadas com o tipo de
hospedeiro. No entanto, fatores abióticos como localidade geográfica e o período de
coleta também podem explicar as diferenças observadas.

 Os endófitos das plantas estudadas são agentes promissores no controle de

crescimento de fitopatógenos como Phomopsis sojae e Colletotrichum
gloeosporioides.

5 PERSPECTIVAS

O presente trabalho contribuiu com a criação de uma coleção de micro-organismos

isolados de hospedeiros pouco estudados. Esse importante patrimônio genético está em
avaliação por discentes que compõem o projeto temático FAPESP – Processo n. 13/50228-8
(Componentes da biodiversidade, e seus caracteres metabólicos, de ilhas do Brasil - uma
abordagem integrada), o qual está inserido o presente trabalho. Resultados preliminares
revelaram que um total de dez linhagens apresentou atividade anti-leishmania e cinco isolados
estão sendo quimicamente avaliados. Estudos futuros poderão continuar a explorar o
potencial dessa coleção de micro-organismos. Além disso, muitos dos endófitos recuperados
das begônias incluem isolados que não foram totalmente caracterizados, portanto, estudos
futuros de taxonomia e sistemática poderão revelar espécies novas contidas nessa coleção.