Seminar Hasil Penelitian

Januari 2021

EFEK RENDAMAN AIR CO2 KADAR TINGGI PADA TIKUS GALUR WISTAR
(Rattus Norvegicus) JANTAN YANG DIBUAT ACUTE LIMB ISCHEMIC TERHADAP
PERUBAHAN KADAR SGOT, LDH, DAN PEMERIKSAAN HISTOPATOLOGI

THE EFFECT OF CO2 ENRICHED WATER IMMERSION ON ACUTE LIMB

ISCHEMIC MALE WISTAR RATS (Rattus Norvegicus) IN SERUM LEVEL OF
SGOT, LDH, AND HISTOPATHOLOGY EXAMINATION CHANGES

Oleh:

Adelaide Adiwana

Pembimbing :

Dr.dr. Muzakkir Amir, SpJP(K)

Prof. dr. Peter Kabo, PhD., SpFK., SpJP(K)
Dr. dr. Irfan Idris, MKes
dr. M. Husni Cangara, PhD, SpPA, DFM
Dr. dr. Andi Alfian Zainuddin, MKM

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS-1 (Sp-1)

PROGRAM STUDI ILMU PENYAKIT JANTUNG DAN PEMBULUH DARAH
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2021
 DAFTAR SINGKATAN

6P : Pain, Pallor, Pulselessness, Paresthesia, Paralysis, Poikilothermia

AF : Arteri Femoralis

ALI : Acute Limb Ischaemia

ANG : Angiopoetins

AS : Arteri Saphena

ASO : Arteriosclerosis Obliterans

AST : Aspartate Aminotransferase

Ca2+ : Ion Kalsium

CD31 : Cluster of Differentiation 31

CK : Creatine Kinase

CLTI : Chronic Limb-Threatening Ischaemia

CO2 : Karbon dioksida

CTA : Computed Thromography Angiography

DAB : Diaminobenzidine

DF : Degrees of freedom

DNA : Deoxyribonucleic Acid

DSA : Digital Subtraction Ultrasound

DUS : Duplex Ultrasound

EVAR : Endovascular Aortic Repair

FGF : Fibroblast Growth Factor

FMD : Flow Mediated Dilatation

H+ : Ion Hidrogen

H2CO3 : Asam Karbonat

ii
Hb : Hemoglobin

HCl : Hydro Chloride

HCO3- : Bikarbonat

HE : Hematoxylin dan Eosin

HIF : Hypoxia Inducible Factor

HIV : Human Immunodeficiency Viruses

HLI : Hind Limb Ischaemia

IMA : Infark Miokard Akut

IP : Intra-Peritoneal

IQR : Interquartil Range

IU/l : International Unit/Litre

KEPK : Komisi Etik Penelitian Kesehatan

LDH : Lactat Dehidrogenase

Min : Minimal

Max : Maximal

Na+/K+ ATPase : Natrium-Kalium Adenosine Triphosfat-ase

NO : Nitrit Oxide

O2 : Oksigen
o
C : Derajat Celcius

PA : Patologi Anatomi

PAD : Peripheral Artery Disease

PCO2 : Tekanan Karbon Dioksida

PDGF : Platelet-Derived Growth Factor

pH : Keasaman

PLA2 : Phospholipase 2

iii
ppm : Part per million

RBC : Red Blood Cell

SD : Standar Deviasi

SGOT : Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase

SkBF : Skin Blood Flow

SPSS : Statistical Package For Social Science

VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor

VF : Vena Femoralis

iv
 DAFTAR ISI

DAFTAR SINGKATAN.............................................................................................. ii

DAFTAR ISI................................................................................................................ v

DAFTAR GAMBAR.................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL........................................................................................................ xi

BAB I. PENDAHULUAN............................................................................................ 1

1.1 Latar Belakang Masalah.......................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah.................................................................................................... 4

1.3 Tujuan Penelitian..................................................................................................... 4

1.4 Hipotesis Penelitian................................................................................................. 5

1.5 Manfaat Penelitian................................................................................................... 5

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA................................................................................ 6

2.1 Pengertian Acute Limb Ischemia (ALI)................................................................... 7

2.2 Etiologi ALI............................................................................................................. 7

2.3 Patofisiologi ALI..................................................................................................... 9

2.4 Presentasi Klinis ALI............................................................................................... 10

2.5 Klasifikasi ALI dan Manfaatnya dalam Menentukan Terapi Serta Prognosis........... 12

2.6 Karbon Dioksida (CO2)........................................................................................... 14

2.7 Sifat Kimia dan Fisika dari CO2.............................................................................. 15

2.8 Transpor CO2 dalam Darah....................................................................................... 17

2.8.1 Senyawa Karbamino............................................................................................. 17

2.8.2 Ion Bikarbonat (HCO3-)......................................................................................... 18

2.8.3 Senyawa Terlarut dalam Plasma............................................................................ 19

v
2.9 Efek Fisiologis CO2 pada Pembuluh Darah Perifer................................................. 20

2.10 Peran CO2 pada Penyakit Pembuluh Darah Perifer................................................. 23

2.11 Difusi CO2 Melalui Kulit....................................................................................... 24

2.12 Penggunaan CO2 daam Praktik Klinis................................................................... 25

2.13 Rendaman Air Kaya CO2 (Imersi)......................................................................... 26

2.13.1 Pengaruh Konsentrasi CO2................................................................................. 29

2.13.2 Pengaruh Suhu.................................................................................................... 30

2.13.3 Pengaruh Waktu (Durasi dan Frekuensi)............................................................ 32

2.14 Indikasi dan Kontra Indikasi Terapi CO2.............................................................. 33

2.15 Hewan Coba Tikus Wistar (Rattus norvegicus).................................................... 33

2.15.1 Anatomi Pembuluh Darah Tungkai Tikus Wistar.............................................. 35

2.15.2 Metode Hind Limb Ischaemia (HLI).................................................................. 36

2.16 Parameter Penilaian Derajat Iskemik yang Diinduksi Metode HLI...................... 36

2.16.1 Functional Scoring............................................................................................. 37

2.16.2 Kadar SGOT dan LDH....................................................................................... 37

2.16.3 Pemeriksaan Histopatologi................................................................................. 38

BAB III. KERANGKA TEORI DAN KERANGKA KONSEP.............................. 40

3.1 Kerangka Teori........................................................................................................ 40

3.2 Kerangka Konsep..................................................................................................... 40

BAB IV. METODE PENELITIAN............................................................................ 41

4.1 Desain Penelitian..................................................................................................... 41

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian................................................................................... 41

4.3 Populasi Penelitian................................................................................................... 41

4.4 Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel................................................................. 41

4.5 Kriteria Inklusi dan Kriteria Ekslusi......................................................................... 42

vi
4.5.1 Kriteria Inklusi...................................................................................................... 42

4.5.2 Kriteria Eksklusi................................................................................................... 42

4.6 Izin Penelitian dan Kelayakan Etik.......................................................................... 43

4.7 Alur Penelitian......................................................................................................... 44

4.8 Material Penelitian................................................................................................... 44

4.8.1 Alat........................................................................................................................ 44

4.8.2 Bahan.................................................................................................................... 44

4.8.3 Hewan Coba.......................................................................................................... 45

4.9 Prosedur Penelitian.................................................................................................. 45

4.9.1 Penyiapan Hewan dan Pemberian Perlakuan Pra-Penelitian................................. 45

4.9.2 Cara Membuat Rendaman Air CO2 Kadar Tinggi ................................................. 46

4.9.3 Cara Ligasi Arteri Femoralis Tikus....................................................................... 47

4.9.4 Cara Perlakuan...................................................................................................... 49

4.9.5 Pengukuran Kadar SGOT dan LDH...................................................................... 53

4.9.6 Pemeriksaan Histopatologi/PA............................................................................. 53

4.9.6.1 Penilaian Kerusakan Jaringan dengan Pewarnaan HE........................................ 53

4.9.6.2 Perhitungan Jumlah Vaskular............................................................................. 54

4.10. Definisi Operasional dan Kriteria Objektif............................................................ 56

4.11. Pengolahan Data dan Analisis Data....................................................................... 60

BAB V. HASIL PENELITIAN.................................................................................... 61

5.1 Gambaran Perubahan Kadar SGOT, LDH, dan Histopatologi Tikus yang Tidak

Diligasi (Kelompok 1 dan 2) pada Rendaman Air Biasa dan Air CO 2 Kadar Tinggi 61

5.2 Gambaran Perubahan Kadar SGOT, LDH, dan Histopatologi Tikus yang Diligasi

(Kelompok 3 dan 4) pada Rendaman Air Biasa dan Air CO2 Kadar Tinggi.............. 62

vii
5.3 Analisis Pengaruh Air Biasa Versus Air CO2 Kadar Tinggi pada Tikus yang Tidak

Diligasi (Kelompok 1 dan 2).................................................................................... 63

5.4 Analisis Pengaruh Air Biasa Versus Air CO2 Kadar Tinggi pada Tikus yang

Diligasi (Kelompok 3 dan 4).................................................................................... 65

BAB VI. PEMBAHASAN............................................................................................ 68

BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN.................................................................... 72

7.1 Kesimpulan.............................................................................................................. 72

7.2 Saran......................................................................................................................... 72

DAFTAR PUSTAKA................................................................................................... 73

LAMPIRAN................................................................................................................. 81

Lampiran 1. Persetujuan Etik......................................................................................... 81

Lampiran 2. Dokumentasi.............................................................................................. 82

viii
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Etiologi ALI.................................................................................................... 9

Gambar 2. Patofisiologi ALI............................................................................................ 10

Gambar 3. Bagan tata laksana ALI................................................................................... 13

Gambar 4. Kurva perbandingan kelarutan oksigen dengan CO2 yang dipengaruhi oleh

suhu................................................................................................................. 16

Gambar 5. Reaksi pembentukan bikarbonat dalam tubuh................................................ 16

Gambar 6. Transpor CO2 dalam darah.............................................................................. 19

Gambar 7. Mekanisme perbaikan vaskular paska iskemik dan faktor pertumbuhan

yang terlibat.................................................................................................... 21

Gambar 8. Gelembung CO2 pada lengan yang direndam dalam air CO2......................... 28

Gambar 9. Penggabungan air dan CO2 dalam Bicarbonated CREA................................ 30

Gambar 10. Efek CO2 pada aliran darah kutaneus pada suhu perendaman yang

berbeda.......................................................................................................... 31

Gambar 11. Hubungan antara FMD (Flow Mediated Dilatation) dan SkBF (Skin

Blood Flow).................................................................................................. 31

Gambar 12. Perbandingan laju aliran darah pada air biasa dengan air CO2..................... 32

Gambar 13. Contoh kasus efek perendaman terhadap pasien Arteriosclerosis

Obliterans..................................................................................................... 33

Gambar 14. Tikus Wistar jantan....................................................................................... 34

Gambar 15. Anatomi pembuluh darah ekstremitas inferior pada tikus............................ 35

Gambar 16. Berbagai metode hind limb ischaemia yang dapat dilakukan....................... 36

Gambar 17. Alat dan bahan penelitian.............................................................................. 45

Gambar 18. Aklimatisasi dan pembagian kelompok tikus pra-penelitian........................ 46

ix
Gambar 19. CREA, sumber air (wastafel), tabung CO2, dan pemanas air (water

heater)........................................................................................................... 47

Gambar 20. Injeksi IP dengan Ketamin HCl.................................................................... 47

Gambar 21. Arteri femoralis setelah dipisahkan dari vena dan nervus............................ 48

Gambar 22. Ligasi arteri femoralis proksimal dan distal dengan benang silk 3.0............ 48

Gambar 23. Pemberian salep antibiotik pada luka bekas jahitan..................................... 49

Gambar 24. Skor Tarlov = 3, Skor Iskemik = 2............................................................... 49

Gambar 25. Pengukuran suhu dan pH menggunakan termometer air raksa dan

pHmeter........................................................................................................ 50

Gambar 26. Perendaman tikus dalam air biasa dan air CO2 kadar tinggi......................... 50

Gambar 27. Pengambilan sampel darah melalui vena lateralis pada ekor tikus............... 51

Gambar 28. Tungkai tikus yang telah dipotong setinggi lutut.......................................... 51

Gambar 29. Tungkai bawah tikus setelah dipotong kemudian direndam dalam

formalin 10%................................................................................................ 52

Gambar 30. Preparat PA yang telah diwarnai dengan pewarnaan HE dan CD31............ 52

Gambar 31. Alat sentrifuge dan pengukur kadar SGOT dan LDH.................................. 53

Gambar 32. Pewarnaan imunohistokimia dengan antibodi CD31 untuk menghitung

jumlah vaskularisasi tikus yang tidak diligasi pada rendaman air biasa

(gambar kolom kiri) dan air CO2 (gambar kolom kanan)............................. 64

Gambar 33. Pewarnaan imunohistokimia dengan antibodi CD31 untuk menghitung

jumlah vaskularisasi tikus yang diligasi pada rendaman air biasa (gambar

kolom kiri) dan air CO2 (gambar kolom kanan)........................................... 66

Gambar 34. Pewarnaan HE untuk menilai derajat kerusakan otot menggunakan skor

histologi pada tikus yang diligasi dalam rendaman air biasa (gambar

kolom kiri) dan air CO2 (gambar kolom kanan)........................................... 67

x
 DAFTAR TABEL

Tabel 1. Etiologi ALI.................................................................................................. 8

Tabel 2. Klasifikasi Klinis ALI.................................................................................. 12

Tabel 3. Functional Scoring....................................................................................... 37, 56

Tabel 4. Kriteria skoring pada pemeriksaan histologi................................................ 39, 59

Tabel 5. Gambaran Perubahan Kadar SGOT, LDH, dan Histopatologi Tikus yang

Tidak Diligasi (Kelompok 1 dan 2) pada Rendaman Air Biasa dan Air CO 2

Kadar Tinggi................................................................................................. 61

Tabel 6. Gambaran Perubahan Kadar SGOT, LDH, dan Histopatologi Tikus yang

Diligasi (Kelompok 3 dan 4) pada Rendaman Air Biasa dan Air CO2 Kadar

Tinggi............................................................................................................ 62

Tabel 7. Analisis Pengaruh Air Biasa Versus Air CO2 Kadar Tinggi pada Tikus yang

Tidak Diligasi (Kelompok 1 dan 2)............................................................... 63

Tabel 8. Analisis Pengaruh Air Biasa Versus Air CO2 Kadar Tinggi pada Tikus yang

Diligasi (Kelompok 3 dan 4)......................................................................... 65

xi
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Acute limb ischemia (ALI) merupakan kondisi dimana terjadi penurunan perfusi secara

tiba-tiba dan mengancam viabilitas ekstremitas yang terjadi dalam waktu kurang dari 14 hari

setelah onset gejala (Creager et al., 2012). Kondisi ini tidak saja mengancam ekstremitas yang

terkena, namun juga dapat meningkatkan risiko kematian bagi pasien-pasien yang terkena.

Hipoperfusi pada ekstremitas terutama bila tidak diterapi akan menyebabkan abnormalitas

elektrolit dan gangguan asam basa pada seluruh tubuh yang berakibat pada terganggunya

fungsi ginjal dan kardiopulmonal. Maka dari itu, tatalaksana reperfusi harus segera diberikan

demi menyelamatkan ekstremitas yang terkena dan mencegah pasien jatuh dalam kondisi yang

lebih buruk (Ram dan George, 2017).

Insidensi ALI diperkirakan sebanyak 1,5 kasus dari 10.000 orang per tahun (Norgren

et al., 2007). Angka kejadian ALI semakin banyak ditemukan pada populasi usia tua dengan

berbagai penyakit komorbid, terutama gagal jantung kongestif dan atrial fibrilasi. ALI juga

banyak ditemukan pada pasien dengan peripheral artery disease (PAD) yang telah menjalani

terapi reperfusi, baik endovaskular maupun operasi. Kejadian ALI pada ekstremitas atas jarang

ditemukan, hanya sekitar 17% dari seluruh insidensi ALI. Hal ini terjadi karena vaskularisasi

pada ekstremitas atas lebih baik dengan banyaknya kolateral serta proses atherosklerosis lebih

jarang terjadi (Sobieszczyk, 2013).

Proses patologis dan faktor risiko yang menyebabkan kerusakan pembuluh darah

ekstremitas memiliki banyak kesamaan dengan pembuluh darah jantung sehingga sebagian

besar kasus yang terjadi merupakan kombinasi keduanya. Seperti halnya pada kondisi infark

1
miokard akut (IMA), reperfusi segera harus diterapkan dengan prinsip yang sama pada ALI

(Ram dan George, 2017).

Komplikasi ALI tergolong tinggi meskipun telah dilakukan upaya revaskularisasi dini,

dimana amputasi terjadi pada 10-15% kasus dengan angka mortalitas mencapai 15-20%. Di

samping itu, terjadinya komplikasi mayor kardiovaskular seperti IMA, eksaserbasi gagal

jantung kongestif, kerusakan fungsi ginjal, dan komplikasi pernafasan selama pasien ALI

dirawat di rumah sakit juga sangat tinggi. Dengan demikian, selain menyelamatkan ekstremitas

yang terkena, managemen ALI juga harus meliputi terapi sistemik yang adekuat (Olinic et al.,

2019).

Berdasarkan uraian di atas, maka sebagian besar penyebab serta komplikasi ALI erat

hubungannya dengan penyakit kardiovaskular, sehingga upaya pencegahannya adalah dengan

mengendalikan berbagai faktor risiko yang berhubungan dengan penyakit kardiovaskular,

seperti hipertensi, diabetes mellitus, merokok, dan dislipidemia, baik dengan terapi

farmakologis maupun non-farmakologis (Khot UN et al., 2003).

Salah satu terapi non-farmakologis yang dipercaya dapat membantu penyembuhan

penyakit oklusi vaskular perifer sejak abad pertengahan adalah balneoterapi (natural bath

spring) dalam air berkarbonasi. Terapi karbon dioksida (CO2) pertama kali diperkenalkan

berupa spa pada tahun 1932. Metode terapeutik dengan menggunakan CO 2 yang diberikan

secara transkutan ini ditujukan bagi pasien-pasien dengan gangguan vaskular perifer. Sejak

saat itu, sejumlah penelitian berkembang, dimana sebagian besar berupa studi observasional,

yang menjelaskan efek CO2 sebagai terapi dan bagaimana patofisiologinya. Banyak studi klinis

telah menunjukkan keefektifan terapi CO2 terhadap mikrosirkulasi tanpa ditemukan adanya

toksisitas serta efek samping yang bermakna (Toriyama T et al, 2002; Hartmann et al., 1997).

Teori Jordan mengatakan CO2 dapat berdifusi ke dalam jaringan subkutan, mempengaruhi

mikrosirkulasi dan menyebabkan vasodilatasi dengan cara menurunkan pH seluler sehingga

2
kontraktilitas sel otot polos pembuluh darah menurun. PCO2 dapat ditingkatkan dengan

pemberian air yang mengandung kadar tinggi CO2 pada kulit (Ito et al., 1989).

Beberapa penelitian mengatakan bahwa pada suhu air 34 oC, CO2 meningkatkan aliran

darah kutaneus dua kali lebih cepat dibandingkan pada suhu 23oC. Sebaliknya, pada suhu 41oC

efek CO2 terhadap laju aliran darah kutaneus justru menurun (Nishimura et al., 2002; Hartmann

et al., 1997; Ito et al., 1989). Peningkatan aliran darah kutaneus merupakan kunci stimulus

fisiologis untuk meningkatkan vasodilatasi mikrosirkulasi karena dapat meningkatkan shear

stress pada dinding pembuluh darah serta meningkatkan fungsi endothelial sebagai vasodilator

(Naylor et al., 2011). Maka dari itu, CO2 dapat digunakan sebagai terapi pada kasus-kasus

penyakit pembuluh darah perifer, membantu penyembuhan luka, serta membantu regenerasi

kulit. Terapi CO2 ini sebagian besar diberikan secara transkutan/topikal dalam bentuk air

rendaman yang mengandung CO2 konsentrasi tinggi (imersi). Didukung dengan banyaknya

penelitian yang telah membuktikan manfaat imersi air yang mengandung CO2 kadar tinggi

khususnya bagi penderita penyakit pembuluh darah perifer, maka suatu perusahaan dari Jepang

telah berhasil membuat alat yang dapat menghasilkan air CO 2 kadar tinggi dengan suhu tertentu

yang mudah digunakan untuk terapi sehari-hari. Alat tersebut bernama Bicarbonated CREA

(JesC, 2013) yang telah digunakan pula di Indonesia, khususnya di Makassar.

Dengan adanya Bicarbonated CREA yang mempermudah pembuatan imersi air CO2

kadar tinggi, maka peneliti tertarik untuk meneliti pengaruh rendaman air CO2 kadar tinggi

pada pembuluh darah perifer normal (sebagai terapi preventif) maupun pada kondisi ALI

(sebagai terapi kuratif) dengan menggunakan hewan coba tikus galur Wistar jantan (Rattus

Norvegicus) yang dinilai dengan menggunakan parameter kadar lactat dehidrogenase (LDH),

serum glutamic oxaloacetic transaminase (SGOT), dan pemeriksaan histopatologi. Adapun

kondisi ALI dibuat dengan metode hind limb ischemic (HLI), yaitu dengan melakukan ligasi

pada arteri femoralis tikus (Xu et al., 2017).

3
1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah di atas, dapat dirumuskan pertanyaan penelitian

sebagai berikut: Apakah terdapat pengaruh perendaman kaki tikus galur Wistar jantan (Rattus

Norvegicus) dalam air CO2 kadar tinggi, baik yang tidak dibuat ALI maupun yang dibuat ALI

(dengan ligasi arteri femoralis), yang dinilai dengan menggunakan parameter kadar LDH,

SGOT, dan pemeriksaan histopatologi.

1.3 Tujuan Penelitian

1. Tujuan Umum

Mengetahui pengaruh perendaman CO2 pada kaki tikus galur Wistar jantan (Rattus

Norvegicus), baik yang dibuat ALI maupun tidak

2. Tujuan Khusus

 Mengetahui perubahan kadar SGOT pada tikus galur Wistar jantan (Rattus

Norvegicus), baik yang dibuat ALI maupun tidak, antara sebelum dan setelah

direndam dengan air biasa

 Mengetahui perubahan kadar LDH pada tikus galur Wistar jantan (Rattus

Norvegicus), baik yang dibuat ALI maupun tidak, antara sebelum dan setelah

direndam dengan air biasa

 Mengetahui perubahan gambaran histopatologi pada tikus galur Wistar jantan

(Rattus Norvegicus), baik yang dibuat ALI maupun tidak setelah direndam dengan

air biasa

 Mengetahui perubahan kadar SGOT pada tikus galur Wistar jantan (Rattus

Norvegicus), baik yang dibuat ALI maupun tidak, antara sebelum dan setelah

direndam dalam air CO2 kadar tinggi

4
  Mengetahui perubahan kadar LDH pada tikus galur Wistar jantan (Rattus

Norvegicus), baik yang dibuat ALI maupun tidak, antara sebelum dan setelah

direndam dalam air CO2 kadar tinggi

 Mengetahui perubahan gambaran histopatologi pada tikus galur Wistar jantan

(Rattus Norvegicus), baik yang dibuat ALI maupun tidak setelah direndam dalam

air CO2 kadar tinggi

1.4 Hipotesis Penelitian

1. H0 diterima apabila tidak terdapat pengaruh perendaman kaki tikus galur Wistar jantan

(Rattus Norvegicus), baik yang tidak dibuat ALI maupun dibuat ALI dalam campuran

air CO2 kadar tinggi yang dinilai dengan parameter kadar LDH, SGOT, dan

pemeriksaan histopatologi.

2. Ha diterima apabila terdapat pengaruh perendaman kaki tikus galur Wistar jantan

(Rattus Norvegicus), baik yang tidak dibuat ALI maupun dibuat ALI dalam campuran

air CO2 kadar tinggi yang dinilai dengan parameter kadar LDH, SGOT, dan

pemeriksaan histopatologi.

1.5 Manfaat Penelitian

1. Manfaat Pengembangan Ilmu

 Penelitian ini diharapkan dapat menambah khasanah ilmu pengetahuan dan menjadi

bahan bacaan tentang peranan perendaman kaki dalam air CO2 kadar tinggi, baik

sebagai pencegahan (preventif), maupun dalam membantu proses penyembuhan

penyakit vaskular perifer (kuratif), khususnya ALI.

5
  Menjadi referensi tambahan untuk penelitian-penelitian lebih lanjut terkait manfaat

perendaman kaki dalam air CO2 kadar tinggi terhadap mikrosirkulasi permbuluh

darah perifer, baik sebagai terapi preventif maupun kuratif.

2. Manfaat Aplikatif

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat aplikatif sebagai bahan intervensi

yang berguna dalam meningkatkan dan memperbaiki mikrosirkulasi pembuluh darah

perifer, baik sebagai terapi preventif maupun kuratif, khususnya dalam kondisi ALI.

6
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Acute Limb Ischemia (ALI)

ALI merupakan suatu kondisi dimana terjadi penurunan perfusi pada ekstremitas secara

tiba-tiba yang dapat mengancam viabilitas ekstremitas yang terkena sehingga dibutuhkan

penanganan segera. Kondisi ini dikatakan akut bila terjadi dalam waktu kurang dari 14 hari

dari onset munculnya gejala (Creager et al., 2012). Perburukan gejala dapat terjadi dalam

hitungan jam hingga hari, mulai dari episode klaudikasio intermiten hingga rasa nyeri pada

ekstremitas yang terkena saat istirahat (resting pain), parestesia, kelemahan otot, kelumpuhan

pada ekstremitas yang terkena, bahkan gangren. Pada pemeriksaan fisik didapatkan tidak

adanya pulsasi di daerah distal dari oklusi, kulit teraba dingin dan pucat, penurunan fungsi

sensoris, dan penurunan kekuatan otot (Ram dan George, 2017).

Berbeda dengan chronic limb-threatening ischemia (CLTI) dimana telah terbentuk

pembuluh darah kolateral, pada ALI belum terbentuk kolateral sebagai kompensasi dari

hilangnya perfusi karena waktu terjadinya sangat singkat, sehingga viabilitas ekstremitas yang

terkena menjadi terancam. Keadaan iskemik mendadak ini mempengaruhi seluruh jaringan

yang secara aktif bermetabolisme, seperti kulit, otot, dan saraf. Maka dari itu, diagnosis dan

tata laksana segera sangat diperlukan untuk menyelamatkan ekstremitas yang terkena serta

menghindari komplikasi sistemik yang dapat mengganggu fungsi organ lain sehingga risiko

kematian dapat menurun (Olinic et al., 2019).

2.2 Etiologi ALI

Penyebab ALI dapat diklasifikasikan menjadi 3 kategori, yaitu kausa emboli (40%),

thrombosis (50%), dan lain-lain (10%) seperti dapat dilihat pada Tabel 1 berikut ini:

Tabel 1. Etiologi ALI (Purushottam et al., 2014)

7
 EMBOLI (40%) THROMBOTIK (50%) PENYEBAB LAIN (10%)
Sumber dari jantung (80%) Berhubungan dengan PAD Trauma arteri
Atrial fibrilasi Ruptur plak de novo (30%) Diseksi aorta
Thrombus ventrikel kiri Thrombosis stent/graft (70%) Arteriopati HIV
Myxoma atrium kiri Thrombus pada aneurisma Sindrom kompartemen
Penyakit katup jantung Tidak berhubungan dengan PAD Phlegmasia cerulea dolens
- Infektif endokarditis Arteritis dengan thrombosis Kompresi eksternal
- Thrombosis katup prostetik - Giant cell arteritis
- Penyakit katup rematik - Thrombangitis obliterans
Paradoksikal emboli Hipercoagubilitas
Sumber dari vaskular - Sindrom antifosfolipid
Aneurisma - Keganasan
Plak atherosklerosis Ergotisme
Terkait prosedur Vasospasme
Coronary artery bypass Kokain
Prosedur endovaskular Vasopresor
Lain-lain
Udara
Air ketuban
Injeksi intra-arteri

Oklusi yang ditimbulkan karena thrombosis biasanya terjadi pada pembuluh darah

dengan lesi stenosis kronik akibat atherosklerosis sehingga sering disertai gejala PAD

sebelumnya dan ditemukan adanya kolateral. Sekitar 15-20% pasien dengan PAD dapat

berkembang menjadi ALI. Obstruksi akut terjadi akibat ruptur plak, kegagalan sirkulasi, atau

pada kondisi hiperkoagubilitas (Obara H et al., 2018). Thrombosis juga dapat disebabkan oleh

oklusi pada stent dan bypass graft yang menjadi penyebab tersering saat ini mengingat semakin

meningkatnya intervensi vaskular (Goldstein dan Mishkel, 2011).

Sebanyak 90% emboli berasal dari kardiak yang biasanya disebabkan oleh atrial

fibrilasi dan thrombus ventrikel kiri akibat infark miokard akut (IMA). Penyebab lain antara

lain penyakit katup jantung seperti pada post-valve replacement, tumor kardiak/aorta, dan

emboli paradoks (Obara H et al., 2018). Emboli cenderung menempel pada percabangan arteri

seperti aortoiliaka, femoralis dan arteri poplitea distal (Ascher E, 2014). Bila emboli terjebak

pada lesi stenotik akibat atherosklerosis, maka sulit dibedakan antara emboli dengan

thrombosis. Penderita ALI kausa emboli memiliki pembuluh darah yang relatif sehat dan tidak

8
ditemukan adanya kolateral, sehingga saat terjadi ALI, gejala yang muncul lebih mendadak

dan berat (Goldstein dan Mishkel, 2011).

Gambar 1. Etiologi ALI (Ram dan George, 2017)

2.3 Patofisiologi ALI

ALI memicu serangkaian kejadian yang mengakibatkan kerusakan otot yang bersifat

ireversibel dalam waktu sekitar 6 jam pada pasien yang tidak memiliki kolateral yang baik

maupun kondisi patologis vaskular sebelumnya. ALI menyebabkan kapasitas untuk

menghasilkan ATP dan cadangan ATP menjadi hilang sehingga terjadi akumulasi laktat.

Kerusakan pompa natrium-kalium (Na+/K+) ATP-ase mengakibatkan kebocoran kalsium

intraseluler. Peningkatan kadar kalsium yang persisten memicu sejumlah besar enzim yang

diaktivasi oleh kalsium yang pada akhirnya menyebabkan nekrosis. Dengan hilangnya

integritas membran sel dan mitokondria, maka terjadi proses kematian sel yang ireversibel

(Purushottam et al., 2014).

9
 Gambar 2. Patofisiologi ALI. (1) berkurangnya ATP menghambat fungsi pompa Na+/K+
ATPase sehingga kadar Na intraselular meningkat. (2) 2Na+/Ca2+ exchanger meningkatkan
kadar kalsium intraselular. (3) Ca2+ ATPase tidak dapat memompa kalsium intraselular keluar
karena kekurangan energi. (4) Kalsium intraselular mengaktifkan enzim protease seperti
phospholipase 2 (PLA2) yang merusak komponen struktural dari membran sel, membuat
kalsium yang masuk semakin bertambah. (5) Kadar kalsium yang berlebihan merusak
mitokondria dan merangsang apoptosis yang pada akhirnya membuat sel menjadi nekrosis
(Chavez et al., 2016)

2.4 Presentasi Klinis ALI

Secara umum, pasien ALI memiliki gejala klasik yang dapat disingkat menjadi “6P”,

yaitu Pain, Pallor, Paralysis, Pulse deficit, Paresthesia, dan Poikilothermia (Olinic et al.,

2019). Kejadian neurologik akut merupakan diagnosis banding tersering dari ALI karena

keduanya dapat menyebabkan nyeri (pain), paralisis, dan parestesia. Tidak jarang ditemukan

manifestasi klinis lanjut berupa kerusakan jaringan yang ireversibel akibat iskemik yang

semula salah didiagnosis sebagai kejadian neurologik akut. Kekeliruan diagnosis ini

mengakibatkan semakin buruknya prognosis karena waktu yang diperlukan untuk mencapai

keberhasilan revaskularisasi akibat emboli akut sangat terbatas. Maka dari itu, pemeriksaan

klinis yang teliti harus dilakukan untuk mencegah kejadian yang dapat berakibat fatal tersebut

(Ram dan George, 2017).

10
 Pada ALI kausa thrombosis biasanya didahului adanya keluhan claudicatio intermitten

atau riwayat revaskularisasi sebelumnya pada ekstremitas yang terkena. Selain itu, ditemukan

pula komorbid kardiovaskular yang signifikan, seperti penyakit jantung koroner, riwayat

stroke, diabetes, merokok, hipertensi, dislipidemia, riwayat keluarga, dan gagal ginjal kronik

(Fukuda et al., 2015). Komplikasi thrombosis akibat plak atherosklerosis akan membuat onset

serta gejala menjadi tidak jelas. Progresivitas dari atherosklerosis sering diikuti dengan

pembentukan pembuluh darah kolateral ke arah distal, sehingga ketika terjadi oklusi akut tidak

menimbulkan gejala iskemik yang menonjol. Akan tetapi, penyebaran thrombus dapat

menimbulkan iskemik yang luas (Olinic et al., 2019).

Oklusi akut akibat emboli patut dicurigai bila onset terjadinya tiba-tiba dengan derajat

nyeri yang hebat karena belum terbentuk pembuluh darah kolateral, riwayat emboli

sebelumnya, aritmia terutama atrial fibrilasi, diketahui terdapat sumber emboli (jantung,

aneurisma) dan tidak terdapat riwayat claudicatio intermitten (Creager et al., 2012). Oklusi

akut pada arteri akan menyebabkan spasme pembuluh darah dan membuat ekstremitas yang

terkena tampak berwarna keputihan seperti marmer. Beberapa jam kemudian, pembuluh darah

relaksasi, kulit terisi darah miskin oksigen (deoksigenasi) yang mengakibatkan bintik-bintik

yang memucat ketika ditekan (Acar et al., 2013).

Dengan pemeriksaan vaskular secara sistematik dan teliti, penyebab ALI dapat

ditemukan dalam waktu singkat. Palpasi pulsasi arteri bilateral pada daerah femur, lutut, dan

pergelangan kaki dapat menentukan lokasi oklusi serta kelainan irama, seperti atrial fibrilasi.

Pulsus defisit unilateral dengan pulsasi normal kontralateral sugestif suatu emboli. Pulsus

defisit bilateral sugestif komplikasi dari atherosklerosis. Pemeriksaan vaskular sebaiknya

meliputi palpasi pada arteri brakialis, radialis, dan ulnaris untuk menyingkirkan kemungkinan

emboli multipel. Bila ragu terhadap status pulsasi, maka sebaiknya dilakukan pemeriksaan

Doppler untuk mencari signal arteri (Olinic et al., 2019).

11
 Fungsi sensorik dan motorik dievaluasi pada saat pertama kali pasien masuk dan

dievaluasi kembali secara berkala. Gangguan sensorik dini dapat ditemukan pada pemeriksaan

neurologis seperti sentuhan ringan, diskriminasi sentuhan 2 titik, proprioseptif, dan persepsi

getaran. Paralisis yang menonjol dengan kehilangan sensasi total menandakan iskemik yang

ireversibel, sehingga amputasi merupakan terapi terbaik. Nyeri otot ketika digerakkan baik

secara pasif maupun aktif disertai pengerasan otot menandakan adanya sindrom kompartemen

dan merupakan indikator untuk dilakukan terapi segera (Ram dan George, 2017).

2.5 Klasifikasi ALI dan Manfaatnya dalam Menentukan Terapi Serta Prognosis

Klasifikasi ALI yang paling sering digunakan adalah klasifikasi berdasarkan

Rutherford (Tabel 2). Klasifikasi Rutherford ini terdiri dari pemerikaan klinis yang meliputi

warna kulit, pengisian vena, fungsi sensorik dan motorik, serta ada tidaknya signal pada arteri

dan vena ekstremitas yang terlibat yang didapatkan saat pemeriksaan Doppler vaskular

(Rutherford et al., 2001). Ketika diagnosis ALI ditegakkan, maka heparin intravena harus

segera diberikan untuk meminimalisir pembentukan thrombus dan menyelamatkan

mikrosirkulasi. Analgetik juga dapat diberikan untuk meredakan nyeri (Norgren et al., 2007).

Tabel 2. Klasifikasi Klinis ALI (Rutherford et al., 2001)

Temuan Klinis Signal Doppler

Derajat Deskripsi Gangguan Gangguan
Arteri Vena
sensoris motorik
Viable, tidak segera
I Tidak ada Tidak ada Terdengar Terdengar
mengancam
Sering
IIa Terancam, bisa diselamatkan Minimal (jempol) Tidak ada tidak Terdengar
jika cepat diterapi terdengar
Sangat terancam, bisa Lebih dari
Tidak
IIb diselamatkan jika jempol, nyeri Ringan-sedang Terdengar
terdengar
revaskularisasi segera saat istirahat
Ireversibel, sebagian besar
Tidak Tidak
III jaringan mati, kerusakan Mati rasa Paralisis
terdengar terdengar
saraf permanen

12
 Derajat kegawatdaruratan dan strategi pemilihan terapi pada penderita ALI sangat

tergantung pada presentasi klinis, terutama adanya defisit neurologis. Bila ditemukan adanya

defisit neurologis, maka harus dilakukan tindakan revaskularisasi segera, dimana pemeriksaan

imaging tidak membuat penundaan intervensi. Pemeriksaan imaging yang relatif cepat dapat

dilakukan pada kondisi ini antara lain duplex ultrasound (DUS) dan digital subtraction

ultrasound (DSA) (Aboyans et al., 2017).

Berbagai modalitas revaskularisasi yang dapat dilakukan antara lain percutaneous

catheter–directed thrombolytic therapy, percutaneous mechanical thrombus extraction atau

thrombo-aspirasi (dengan atau tanpa terapi thrombolitik) dan pembedahan (thrombektomi,

bypass dan/atau arterial repair). Pemilihan strategi terapi tergantung pada ada tidaknya defisit

neurologis, lamanya iskemik, lokasi, komorbid, tipe konduit (arteri atau graft), serta risiko dari

tindakan itu sendiri (Aboyans et al., 2017). Tata laksana ALI dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Bagan tata laksana ALI (Aboyans et al., 2017)

13
 Prognosis pasien setelah mengalami ALI adalah buruk. Frekuensi terjadinya

komplikasi mayor kejadian kardiovaskular seperti infark miokard, stroke iskemik, dan

amputasi meningkat 1,4 kali, kematian meningkat 3,3 kali, dan risiko amputasi mayor

meningkat 14,2 kali bila dibandingkan pasien tanpa ALI. Terapi revaskularisasi turut

memperburuk prognosis ALI, di samping kondisi pasien dengan atrial fibrilasi, penyakit arteri

perifer, usia tua, dan tidak adekuatnya terapi statin. Komplikasi paska revaskularisasi yang

sering terjadi antara lain surgical graft thrombosis dan stent thrombosis (Hess et al., 2019).

Berdasarkan permasalahan tersebut, maka dicarilah terapi alternatif yang dapat membantu

mencegah kerusakan jaringan maupun membantu proses penyembuhan pada pasien dengan

penyakit pembuluh darah perifer, khususnya ALI. Salah satu terapi alternatif yang dapat

membantu penyembuhan penyakit pembuluh darah perifer dan dipercaya sejak dahulu kala

adalah CO2.

2.6 Karbon Dioksida (CO2)

Karbon dioksida (CO2) selain merupakan produk akhir dari metabolisme semua

makhluk yang menggunakan oksigen (O2) sebagai sumber energi dan bahan dasar fotosintesis,

telah digunakan sebagai terapi dengan spektrum aplikasi yang luas (Hartmann et al. 2009).

Sejak abad pertengahan, air asam dan gas yang memancar dari dalam tanah diakui

secara efektif dapat menyembuhkan penyakit St. Anthony`s Fire yang disebabkan oleh

keracunan ergot dan sering terjadi pada waktu itu (Hartmann et al. 2009). Di seluruh Eropa,

mata air berkarbonasi telah digunakan sebagai balneoterapi (natural bath spring) bagi pasien-

pasien yang menderita hipertensi atau penyakit oklusi vaskular perifer. Beberapa literatur juga

menyebutkan manfaat CO2 sebagai terapi paliatif pada nyeri muskuloskeletal, intervensi

terapeutik dan rehabilitasi penyakit rematik, serta dapat membantu penyembuhan pada

dermatopati infeksius. Pada tahun 1834-1856, Piderit dan Beneke adalah orang yang pertama

14
kali menggambarkan efek utama yang langsung didapatkan dari balneoterapi dengan

menggunakan CO2 pada bagian tubuh yang direndam, yaitu dapat memberikan sensasi

kehangatan dan membuat kulit menjadi kemerahan atau flushing (erythematosus/hyperemic

reaction) (Schmidt, 2009).

Terapi CO2 pertama kali diperkenalkan berupa spa pada tahun 1932. Metode terapeutik

dengan menggunakan CO2 yang diberikan secara transkutan ini ditujukan bagi pasien-pasien

dengan gangguan vaskular. Sejak saat itu, sejumlah penelitian berkembang, di mana sebagian

besar berupa studi observasional, untuk menjelaskan efek CO2 sebagai terapi dan bagaimana

patofisiologinya. Banyak studi klinis telah menunjukkan keefektifan terapi CO2 terhadap

mikrosirkulasi tanpa ditemukan adanya toksisitas serta efek samping yang bermakna

(Toriyama T et al, 2002; Hartmann et al., 1997).

2.7 Sifat Kimia dan Fisika dari CO2

CO2 merupakan atom karbon tunggal yang terikat pada dua atom oksigen oleh ikatan

kovalen ganda sehingga membentuk molekul nonpolar. CO2 memiliki sifat tidak berwarna dan

tidak berbau sehingga secara visual tidak dapat dibedakan dengan udara. CO 2 juga memiliki

sifat 20 kali lebih mudah larut dibandingkan dengan oksigen. Kelarutan sebagian besar gas

dipengaruhi oleh suhu. Ketika suhu menurun, lebih banyak CO2 yang larut dalam air. Hal ini

dapat terlihat pada minuman berkarbonasi yang mengeluarkan gas saat dipanaskan (Cherniack

et al., 1970).

15
 Gambar 4. Kurva perbandingan kelarutan oksigen dengan CO2 yang dipengaruhi oleh suhu

(Cherniack et al., 1970)

CO2 mempunyai peran penting dalam darah. Kadar CO2 dalam darah diatur melalui

transpor CO2 ke paru-paru untuk kemudian dikeluarkan saat ekspirasi sehingga pH darah dapat

terjaga.

Gambar 5. Reaksi pembentukan bikarbonat dalam tubuh (Loerting et al., 2010)

Gambar 5 memperlihatkan bagaimana CO2 larut dalam darah. CO2 yang larut dalam

darah bereaksi dengan air membentuk asam karbonat (H2CO3). Reaksi ini dikatalisis oleh

enzim karbonik anhidrase sehingga terjadi sangat cepat (Forster dan N. Itada, 1980). Asam

karbonat pada gilirannya dapat melepaskan ion hidrogen menjadi bikarbonat (HCO3-).

Sebagian besar karbon dioksida dalam darah ditemukan dalam bentuk bikarbonat. Perubahan

asam karbonat (H2CO3) menjadi ion hidrogen dan bikarbonat (H+ + HCO3-) hampir terjadi

secara spontan. Bila konsentrasi CO2 meningkat, maka pH darah akan sedikit menurun atau

menjadi sedikit lebih asam. Sejumlah kecil CO2 terlarut menghasilkan sedikit kenaikan ion

hidrogen yang mampu mengubah pH darah. Rasio antara CO2 dan HCO3– kira-kira 1:20. Setiap

kenaikan 1 CO2 membutuhkan 20 HCO3– untuk mencegah perubahan pH darah dan melindungi

16
tubuh dari peningkatan keasaman. Seperti yang dijelaskan dalam reaksi di atas, hanya 1 HCO3–

yang dihasilkan dari setiap CO2 sehingga pH darah akan menjadi lebih asam karena kelebihan

ion hidrogen. Oleh karena itu, harus ada metode transportasi alternatif untuk mencegah asidosis

berat setiap kali kita bernafas dan menghasilkan CO2 (Loerting et al., 2010).

2.8 Transpor CO2 dalam Darah

CO2 merupakan produk sisa utama dari respirasi aerobik. Jumlah CO2 yang terlalu

banyak atau terlalu sedikit dalam darah dapat menyebabkan konsekuensi yang serius. Maka

dari itu, diperlukan transportasi CO2 dalam darah yang berfungsi menjaga pH darah. CO2 dalam

darah diangkut melalui 3 cara, yaitu berikatan dengan hemoglobin membentuk senyawa

karbamino, sebagai ion bikarbonat (HCO3-), dan sebagai CO2 terlarut (Geers et al., 2000).

2.8.1 Senyawa Karbamino

Sekitar 30% dari semua CO2 diangkut sebagai senyawa karbamino. Pada konsentrasi

tinggi, CO2 berikatan langsung dengan asam amino dan gugus amina hemoglobin (Hb) untuk

membentuk senyawa karbaminohemoglobin. Pembentukan karbamino paling efektif terjadi di

jaringan perifer, di mana produksi CO2 tinggi karena respirasi sel (Hsia CC, 1998).

Efek Haldane juga berkontribusi pada pembentukan senyawa karbamino, yaitu bila

konsentrasi O2 lebih rendah (seperti pada jaringan perifer aktif di mana O2 dikonsumsi), maka

kapasitas pengangkutan CO2 dari darah meningkat. Hal ini terjadi karena pelepasan O2 dari Hb

meningkatkan afinitas CO2 (Hsia CC, 1998; Geers et al., 2000).

Pembentukan senyawa karbamino memiliki 2 tujuan, yaitu:

1. Stabilisasi pH: CO2 tidak dapat meninggalkan sel darah untuk berkontribusi terhadap

perubahan pH

17
2. Efek Bohr: membantu pelepasan O2 dari subunit lain hemoglobin ke dalam jaringan yang

aktif, di mana respirasi paling banyak terjadi dan menghasilkan paling banyak CO2 (Jensen

FB, 2004).

Ketika sel darah mencapai daerah konsentrasi tinggi O 2 lagi (seperti paru-paru), maka

O2 akan terikat lagi. Hal ini menyebabkan pelepasan CO2 (efek Haldane) yang memungkinkan

lebih banyak O2 untuk diambil dan diangkut dalam darah (Jensen FB, 2004).

Efek Haldane mencerminkan perbedaan kandungan CO2 antara hemoglobin

teroksigenasi dengan tereduksi pada PCO2 yang sama. Efek ini sebagian disebabkan oleh

kemampuan hemoglobin untuk membuffer ion hidrogen dan sebagian disebabkan oleh daya

ikat hemoglobin tereduksi dengan karbon dioksida yang 3,5 kali lebih efektif daripada

oksihemoglobin (Geers et al., 2000).

2.8.2 Ion Bikarbonat (HCO3-)

Sekitar 60% dari semua CO2 diangkut melalui produksi ion HCO3- dalam sel darah

merah. CO2 berdifusi ke dalam sel darah merah dan dikonversi menjadi H+ dan HCO3– oleh

enzim karbonik anhidrase. HCO3– kemudian diangkut kembali ke dalam darah melalui penukar

ion klorida-bikarbonat (chloride shift). Maka HCO3– dapat bertindak sebagai buffer terhadap

hidrogen dalam plasma darah (Berend K et al., 2015). Rangkaian reaksi ini dapat dilihat pada

Gambar 5.

Ion H+ yang dihasilkan dari reaksi karbonik anhidrase dalam sel darah merah berikatan

dengan hemoglobin menghasilkan deoksihemoglobin. Hal ini berkontribusi pada efek Bohr,

yaitu pelepasan O2 dari hemoglobin terjadi pada jaringan yang aktif, di mana konsentrasi H+

lebih tinggi. Hal ini juga mencegah hidrogen memasuki darah yang dapat menurunkan pH,

sehingga kestabilan pH dapat terjaga (Berend K et al., 2015).

18
 Gambar 6. Transpor CO2 dalam darah (Berend K et al., 2015)

Ketika sel-sel darah merah mencapai paru-paru, oksigen berikatan dengan hemoglobin

dan terjadi pelepasan ion H+. Ion hidrogen ini menjadi bebas bereaksi dengan ion bikarbonat

untuk menghasilkan CO2 dan H2O, di mana CO2 dihembuskan. Dengan demikian, konsentrasi

O2 yang tinggi mengurangi kapasitas darah dalam mengangkut CO2. Hal ini sesuai dengan efek

Haldane (Hsia CC, 1998; Geers et al., 2000).

2.8.3 Senyawa Terlarut dalam Plasma

Sekitar 10% dari semua CO2 diangkut sebagai senyawa terlarut dalam plasma. Jumlah

gas terlarut dalam cairan tergantung dari kelarutan dan tekanan parsial gas tersebut. CO2 sangat

larut dalam air (20 kali lebih larut daripada O2) dan tekanan parsial CO2 inspirasi adalah sekitar

40 mmHg. Meskipun kelarutannya tinggi, namun hanya sebagian kecil dari total CO2 dalam

darah yang benar-benar diangkut sebagai senyawa terlarut dalam plasma (Geers et al., 2000;

Forster R. E dan N. Itada, 1980).

Tekanan parsial lebih tinggi di jaringan perifer, di mana CO2 diproduksi, dan lebih

rendah di alveoli tempat CO2 dilepaskan. Hal ini menyebabkan lebih banyak CO2 yang terlarut

di jaringan perifer dan dilepaskan dalam bentuk gas di alveoli di mana tekanan parsial lebih

rendah (Geers et al., 2000; Forster R. E dan N. Itada, 1980).

19
2.9 Efek Fisiologis CO2 pada Pembuluh Darah Perifer

CO2 merupakan hasil akhir dari metabolisme aerobik. Bila metabolisme meningkat,

maka jumlah CO2 yang dihasilkan juga akan meningkat. Metabolisme yang berlangsung aktif

dan terus-menerus memerlukan kecukupan supply oksigen dalam darah. Kecepatan aliran

darah bergantung pada kebutuhan metabolisme. Kadar CO2 yang tinggi menandakan

ketidakcukupan supply darah pada jaringan. Bila keadaan ini berlangsung terus menerus, maka

akan merangsang pembentukan pembuluh darah baru untuk memenuhi kecukupan aliran darah

pada jaringan. Sebagai contoh spesifik, stimulasi aktivitas metabolisme aerobik pada otot

skelet akan membentuk pembuluh darah baru. Beberapa penelitian mengatakan, peningkatan

kadar CO2 pada otot akan meningkatkan faktor-faktor biologis yang dapat merangsang

pembentukan sel otot dan pembuluh darah baru, sehingga pelepasan CO 2 pada metabolisme

menjadi sangat penting untuk pembentukan pembuluh darah dan jaringan baru yang sangat

diperlukan pada proses penyembuhan luka (Tune JD et al., 2002). Perlu dicatat bahwa

mekanisme pembentukan pembuluh darah baru karena kebutuhan metabolisme berbeda

dengan mekanisme pembentukan pembuluh darah yang terjadi akibat kondisi iskemik (O 2

rendah) di mana metabolisme berlangsung secara anaerobik dan terbentuk pula asam laktat.

Dalam kondisi iskemik, pembuluh darah baru yang terbentuk dalam kondisi anaerobik

berkompetisi dengan mekanisme yang berhubungan dengan kematian sel/apoptosis dan

berbagai mediator inflamasi yang pada akhirnya menyebabkan fibrosis dan terbentuk jaringan

parut. Hal ini sangat berbeda dengan pembentukan pembuluh darah baru pada metabolisme

aerobik (pembentukan CO2) yang menstimulasi terbentuknya jaringan baru yang sehat

(Hudlicka O et al., 1984).

20
 Gambar 7. Mekanisme perbaikan vaskular paska iskemik dan faktor pertumbuhan yang

terlibat (Dragneva et al., 2013)

Setengah bagian atas dari Gambar 7 menunjukkan mekanisme perbaikan pembuluh

darah (angiogenik) yang dapat terjadi setelah iskemik (oklusi arteri), yang tampak pada

setengah bagian bawah Gambar 7. Oklusi arteri akan menyebabkan terjadinya arteriogenesis

(pembentukan kolateral) yang diinduksi oleh perubahan arah aliran darah, peningkatan shear

stress dan produksi sitokin oleh sel endotelium pembuluh darah, yaitu vascular endothelial

growth factor (VEGF) dan nitrit oxide (NO) yang menyebabkan vasodilatasi dan pembentukan

kolateral. Platelet-derived growth factor (PDGF) dan fibroblast growth factor (FGF) akan

menstabilkan dinding pembuluh darah yang baru dengan bantuan pericytes. Bagian distal dari

oklusi akan mengalami hipoksia (bagian bawah Gambar 7) kemudian mengeluarkan hypoxia

inducible factor (HIF) yang akan merangsang produksi protein angiogenik, seperti VEGF dan

angiopoetins (ANG) yang pada akhirnya akan memodulasi pembuluh darah distal agar

berikatan dengan kolateral (angiogenesis). Angiogenesis terbentuk melalui pertumbuhan

pembuluh darah baru (sprouting), intususepsi, dan pembesaran diameter kapiler.

Vaskulogenesis juga berkontribusi dalam perbaikan vaskular paska-iskemik, yaitu dengan

21
bantuan sel-sel progenitor endotelial yang bersirkulasi untuk memperbaiki struktur pembuluh

darah (Dragneva et al., 2013, Simon et al., 2018).

Selain dapat menstimulasi pembentukan pembuluh darah baru, CO 2 juga dapat

meningkatkan konsentrasi O2 dalam jaringan dan secara langsung dapat meningkatkan

kecepatan aliran darah melalui vasodilatasi kapiler (Ito et al., 1989). CO2 yang dilepaskan

jaringan sebagai produk akhir metabolisme yang akan memasuki aliran darah dan diabsorbsi

oleh sel darah merah. Di dalam sel darah merah, sebagian akan berubah menjadi asam karbonat

dan berikatan dengan hemoglobin yang pada akhirnya akan menyebabkan pelepasan O 2 dari

hemoglobin. Dilepaskannya O2 karena CO2 dikenal sebagai efek Bohr (Sakai Y et al., 2011).

Kondisi lingkungan yang menguntungkan untuk pelepasan O2 adalah suhu tinggi, konsentrasi

CO2 yang tinggi, dan pH rendah atau lingkungan asam. Semua kondisi ini menyebabkan kurva

disosiasi O2, yang menunjukkan kemampuan pelepasan O2, bergeser ke kanan. Artinya,

hemoglobin melepaskan O2 lebih mudah dari biasanya, sehingga lebih banyak O2 yang masuk

ke dalam sel. Bila kadar O2 tinggi dalam sel, maka metabolisme sel diaktifkan sehingga

kemampuan regenerasi sel menjadi lebih tinggi. CO2 dapat dengan mudah mencapai pembuluh

darah melalui penyerapan kulit dan mudah larut dalam darah, sehingga hemoglobin

melepaskan lebih banyak O2. Semakin tinggi konsentrasi CO2, maka semakin kuat efeknya (Oe

K et al., 2011).

Beberapa studi juga menunjukkan bahwa CO2 dapat menstimulasi sel endotel

pembuluh darah untuk melepaskan NO yang dapat merelaksasi otot polos pembuluh darah

sehingga terjadi vasodilatasi dan meningkatkan aliran darah pada jaringan (Carr P et al., 1993).

CO2 juga merupakan messenger pertama sel otot polos. CO2 membuat asidosis ekstraseluler

sehingga kanal kalium terbuka dan terjadi hiperpolarisasi. Keadaan ini juga mengaktivasi kanal

kalsium dan membuat kadar kalsium intrasel berkurang sehingga terjadi vasodilatasi (Hasyar

et al., 2020).

22
2.10 Peran CO2 pada Penyakit Pembuluh Darah Perifer

Penyakit arteri perifer menyebabkan aliran darah berkurang sehingga terjadi hipoksia

jaringan. Rendahnya kadar O2 akan meningkatkan HIF yang menyebabkan translasi dari

protein yang berfungsi melindungi sel selama hipoksia, sehingga pada akhirnya terjadi

apoptosis (Gao L et al., 2012). Proses ini juga menyebabkan inflamasi (nyeri dan bengkak).

CO2 yang diberikan secara transkutan dapat meningkatkan aliran darah dan oksigenasi

jaringan, menurunkan konsentrasi HIF1alfa (Selfridge AC et al., 2016), dan secara langsung

menurunkan senyawa biologis utama yang mengontrol inflamasi, yaitu NFkB. Mekanisme

kerja ini serupa dengan obat anti-inflamasi, misalnya aspirin (Keogh CE et al., 2017).

Inflamasi merupakan suatu proses metabolik aktif di mana dihasilkan banyak sel

radang, enzim-enzim serta sitokin oleh jaringan yang meradang. Hal ini akan meningkatkan

kebutuhan O2. Hipoksia yang terjadi karena meningkatnya kebutuhan O2 akibat peradangan

akan diperburuk dengan adanya gangguan transpor O2. Keadaan ini terjadi terutama pada

peradangan kronis, di mana kombinasi antara inflamasi yang berkepanjangan akan membentuk

jaringan fibrosis dan trombosis yang pada akhirnya menurunkan aliran darah dan suplai O 2.

Oleh karena itu, peningkatan konsumsi O2 dan infiltrasi sel-sel imun pada daerah peradangan

disertai dengan disfungsi pembuluh darah yang mengganggu suplai O 2 akan merusak jaringan

selama terjadi inflamasi kronis (Flück K dan Fandrey J, 2016).

CO2 merupakan molekul yang sangat kecil yang dapat berdifusi secara cepat sesuai

dengan gradien konsentrasi. CO2 dapat melewati kulit, jaringan lemak, dan otot untuk

mencapai mikrosirkulasi di mana ia dapat memberikan efek terapeutiknya. CO 2 sangat larut

dalam air (20 kali lebih larut dibandingkan O2). Bahkan kelarutan CO2 dalam jaringan lemak

dan otot dikatakan lebih tinggi lagi (Sutton I, 2015; Jakobsen M dan Bertelsen G, 2006).

23
 Telah banyak bukti ilmiah yang mengatakan bahwa CO2 akan berdifusi melewati kulit

berdasarkan gradien konsentrasi. Setelah mencapai jaringan dan masuk mikrosirkulasi, secara

langsung CO2 menyebabkan vasodilatasi, membentuk pembuluh darah baru, dan membuat

darah melepaskan O2 untuk menyembuhkan jaringan yang rusak (Oe K et al., 2011).

2.11 Difusi CO2 Melalui Kulit

Jaringan target untuk terapi CO2 adalah kulit, jaringan lunak, atau bahkan sendi. Gas

CO2 harus dapat menembus kulit dan berdifusi lebih jauh ke dalam jaringan yang diinginkan.

Difusi CO2 dalam otot adalah 14 kali lebih cepat daripada melalui kulit. Meskipun demikian,

difusi melalui kulit cukup adekuat untuk mendapatkan respons terapeutik pada jaringan yang

lebih dalam. CO2 sangat larut dalam jaringan lunak dan bergerak menuju konsentrasi yang

lebih rendah bersama dengan aliran darah yang mengalir dalam jaringan (Shaw et al., 1992).

Terdapat empat variabel yang mempengaruhi kedalaman penetrasi CO2 ke dalam

jaringan, yaitu:

1. massa jaringan yang akan menyerap gas

2. transpor gas oleh darah

3. konsentrasi CO2 pada kulit (koefisien difusi CO2 dalam kulit)

4. waktu/lamanya difusi

Variabel-variabel ini sangat dipengaruhi oleh lingkungan, anatomi, serta jenis dan derajat

keparahan penyakit, sehingga perhitungan konsentrasi yang tepat dalam jaringan hampir tidak

mungkin dilakukan. Yang dapat diketahui adalah CO2 dapat menembus kulit, kecepatan difusi

meningkat 2-4 kali lipat dalam kondisi basah (mendekati difusi dalam air), dan CO2 sangat

larut dalam jaringan lunak (Bedu M et al., 1989).

2.12 Penggunaan CO2 dalam Praktik Klinis

24
 CO2 telah lama digunakan untuk pengobatan dalam spektrum aplikasi yang luas. Sejak

abad pertengahan, air asam dan gas yang memancar dari dalam tanah diakui secara efektif dapat

menyembuhkan penyakit St. Anthony`s Fire yang disebabkan oleh keracunan ergot dan sering

terjadi pada waktu itu (Hartmann et al. 2009). Di seluruh Eropa, mata air berkarbonasi telah

digunakan sebagai balneoterapi (natural bath spring) bagi pasien-pasien yang menderita

hipertensi atau penyakit oklusif perifer. Beberapa literatur juga menyebutkan manfaat CO2

sebagai terapi paliatif pada nyeri muskuloskeletal, intervensi terapeutik dan rehabilitasi

penyakit rematik, serta dapat membantu penyembuhan pada dermatopati infeksius. Pada tahun

1834-1856, Piderit dan Beneke adalah orang yang pertama kali menggambarkan efek utama

yang langsung didapatkan dari balneoterapi dengan menggunakan CO2 pada bagian tubuh yang

direndam, yaitu dapat memberikan sensasi kehangatan dan membuat kulit menjadi kemerahan

atau flushing (erythematosus/hyperemic reaction) (Schmidt, 2009). Sejak saat itu, sejumlah

penelitian berkembang, di mana sebagian besar berupa studi observasional, untuk menjelaskan

efek CO2 sebagai terapi dan bagaimana patofisiologinya.

Sekitar tahun 1950-1960an, setelah melalui berbagai tahap uji klinis dan keamanan, gas

CO2 digunakan sebagai kontras pada sirkulasi vena untuk memberikan gambaran jantung

kanan dan mengevaluasi ada tidaknya efusi perikardial (Boyd-Kranis R et al., 1999). Pada

tahun 1970an, gas CO2 digunakan sebagai kontras intra-arterial. Dengan ditemukannya Digital

Subtraction Angiography (DSA) pada tahun 1980an, angiografi menggunakan kontras CO2

menjadi alat diagnosis yang sangat berguna, terutama bagi pasien yang hipersensitif terhadap

kontras Iodine dan memiliki gangguan fungsi ginjal (Hawkins IF, 1082). Selain digunakan

untuk pencitraan baik vena maupun arteri, CO2 juga digunakan pada intervensi vaskular,

seperti angioplasti dan pemasangan stent, embolisasi transkateter, dan endovascular aortic

repair (EVAR) pada aneurisma aorta abdominalis. Penggunaan kontras CO 2 intra-arterial

25
sebaiknya dihindari pada arteri di atas diafragma karena dapat menyebabkan emboli gas pada

spinal, koroner, dan arteri serebral (Kyung J Cho et al, 2007; Taylor FC et al., 1998).

Savin, dkk melaporkan bahwa transfer CO2 melalui kulit memiliki efek vasomotor lokal

yang bermanfaat (Savin E et al., 1995). Hartmann, dkk mengatakan bahwa peningkatan kadar

O2 jaringan disebabkan oleh efek Bohr selain efek vasodilatasi oleh CO2 dan penurunan kadar

katekolamin plasma (Hartmann et al., 1997). Toriyama, dkk juga melaporkan bahwa efek air

yang diperkaya CO2 pada mikrosirkulasi subkutan menyebabkan vasodilatasi perifer yang

dihasilkan dari peningkatan aktivitas saraf parasimpatis dan penurunan saraf simpatis

(Toriyama T et al., 2002). Sedangkan penemuan pada sirkulasi koroner dan aorta menyebutkan

bahwa vasodilatasi yang terjadi sebagai respons terhadap CO2 dimediasi sebagian oleh NO

(Fukuda S et al., 1990).

Berdasarkan hasil studi-studi yang telah dilakukan, CO2 sebagai terapi dapat digunakan

pada kasus-kasus penyakit pembuluh darah perifer, membantu penyembuhan luka, dan

regenerasi kulit. Terapi CO2 sebagian besar diberikan secara transkutan/topikal dalam bentuk

air rendaman yang mengandung CO2 konsentrasi tinggi (imersi). Selain itu, CO2 dapat pula

diberikan dalam bentuk hydrogel (Sakai Y et al., 2011). CO2 dalam bentuk gas sangat jarang

digunakan karena sulitnya mengontrol kadar gas yang diperlukan. Pemberian terapi gas CO 2

dalam bentuk inhalasi hanya untuk kepentingan penegakkan diagnosis dan penelitian semata

(Ito T, 1989).

2.13 Rendaman Air Kaya CO2 (Imersi)

Di Eropa, perendaman dengan air dan CO2 telah digunakan untuk mengobati hipertensi

dan penyakit oklusi arteri perifer (Nishimura et al., 2002). Bahkan, penggunaan CO2 dalam

dunia medis telah dibuktikan melalui teknik pencitraan pada hewan coba dan telah dibuktikan

26
bahwa CO2 aman dan dapat ditoleransi dengan baik oleh tubuh. Namun, teknik dan pemahaman

sifat CO2 harus dikuasai dengan baik (Cho, 2015).

Telah banyak penelitian yang dilakukan untuk mengetahui manfaat pemberian CO 2

secara transkutan, dan secara signifikan diperoleh hasil bahwa CO 2 dapat meningkatkan aliran

darah, merangsang neovaskularisasi, dan meningkatkan oksigenasi jaringan, bahkan lebih baik

daripada oksigen itu sendiri. Perlu diketahui pula bahwa CO 2 memiliki sifat bakteriostatik

sehingga bakteri tidak akan bermultiplikasi pada lingkungan yang mengandung CO2. Hal ini

memungkinkan terapi CO2 dapat digunakan untuk mengobati penyakit yang disebabkan oleh

sirkulasi darah yang buruk (Xu Y et al., 2017), seperti pada penderita peripheral artery disease

(PAD), kaki diabetik dengan ulkus atau gangren disertai hilangnya jari-jari dan ekstremitas,

bahkan juga dapat mengurangi gejala yang disebabkan oleh penyakit Raynaud (Toriyama T et

al., 2002). Sebagian besar penelitian pada manusia menggunakan air yang mengandung CO 2

konsentrasi tinggi yang diberikan secara berkala dengan merendam bagian tubuh (ekstremitas

bawah dan atas) yang mengalami gangguan pada pembuluh darah perifer.

Terdapat 2 efek yang diperhatikan dan meninggalkan kesan bagi pasien yang direndam,

yaitu gelembung air yang tak terhitung jumlahnya di permukaan kulit dan warna kulit yang

memerah (bisa jelas dibedakan dari bagian tubuh yang tidak direndam dalam bak CO2).

Gelembung air tersebut adalah gelembung air berkarbonasi yang menempel pada kulit seperti

bulu halus, kadang disebut sebagai "sikat gas." Efek kedua adalah kemerahan pada kulit yang

dapat dilihat pada imersi air CO2 dengan konsentrasi 300-400 ppm. Hal ini dipengaruhi oleh

suhu air perendaman. Fenomena ini disebabkan oleh dilatasi arteriol prekapiler dan kapiler.

Selain itu, CO2 dapat menghambat reseptor dingin di kulit dan menstimulasi reseptor hangat.

Dengan kata lain, air tawar terasa dingin pada suhu 33°C, sedangkan dalam rendaman CO2

tidak terasa dingin pada suhu yang sama. Efek langsung dari rendaman CO2 juga dapat

menurunkan laju jantung dan pernapasan (Schmidt KL, 2009).

27
Gambar 8. Gelembung CO2 pada lengan yang direndam dalam air CO2 (Schmidt KL, 2009)

Efek primer dari rendaman air CO2 terhadap kulit antara lain (Schmidt KL, 2009):

1. Gelembung CO2 pada permukaan kulit

2. Difusi CO2 melalui kulit (bukan dari gelembung gas).

Faktor yang mempengaruhi:

 Tekanan gradien parsial

 Aliran darah

 Keadaan kulit

3. Absorpsi CO2 (10-80 ml CO2/menit; rata-rata 30 ml/menit/m2 luas permukaan tubuh,

setara dengan 1,8-4,5 liter/jam) (=10% dari jumlah CO2 yang dihasilkan tubuh pada

waktu yang sama)

4. Transpor yang cepat untuk mengabsorpsi CO2

Efek sekunder dari rendaman air CO2 antara lain (Schmidt KL, 2009):

1. Kulit menjadi kemerahan, tampak batas yang jelas dengan daerah iskemik (≥ 300-500

mg CO2/liter)

2. Dilatasi arteriol prekapiler dan meningkatnya jumlah kapiler

3. Meningkatkan aliran darah kapiler

4. Meningkatkan amplitudo dari fluktuasi aliran darah spontan (vasomotion)

28
 5. Menghambat reseptor dingin dan stimulasi reseptor hangat

6. Penurunan suhu inti tubuh sebanyak 0,5-1,0oC bila berendam pada suhu 32-33oC

7. Perubahan sirkulasi:

 Menurunnya resistensi kapiler

 Menurunnya tekanan darah

 Bradikardia

Terdapat beberapa faktor yang perlu diperhatikan saat terapi imersi dengan

menggunakan air rendaman kaya CO2 ini karena dapat mempengaruhi hasil akhir. Faktor-

faktor tersebut antara lain: konsentrasi CO2, suhu, dan waktu (durasi dan frekuensi

perendaman) (Ito T, 1989).

2.13.1 Pengaruh Konsentrasi CO2

Efek dari aplikasi CO2 sangat dipengaruhi oleh konsentrasinya. Kadar terendah CO2

untuk dapat menimbulkan efek terapeutik adalah 400 mg CO 2/kg air (= 400 ppm). Efek akan

meningkat secara linier hingga 1.400 mg CO2/kg air (= 1.400 ppm). Bila kadarnya lebih tinggi

dari itu, maka tidak akan menimbulkan efek (Bauer C, 1980).

Didukung dengan banyaknya penelitian yang telah membuktikan manfaat imersi air

dengan kandungan CO2 konsentrasi tinggi, khususnya bagi penderita penyakit pembuluh darah

perifer, maka banyak perusahaan terutama di negara Jepang dan Eropa berlomba-lomba untuk

membuat suatu alat yang dapat menghasilkan campuran air dengan CO 2 kadar tinggi yang

mudah digunakan untuk terapi sehari-hari. Saat ini, telah ditemukan alat yang dapat

menghasilkan air dengan kandungan CO2 kadar tinggi hingga 1.300 ppm, di mana sumber air

dengan konsentrasi lebih dari 1.000 ppm diklasifikasikan sebagai sumber air berkarbonasi

tinggi. Alat tersebut dibuat oleh salah satu perusahaan dari Jepang, dan telah digunakan pula

di Indonesia, khususnya di Makassar. Alat tersebut bernama Bicarbonated CREA (JesC, 2013).

29
 Bicarbonated CREA diciptakan untuk mencampurkan dua senyawa yang berbeda

fisiknya, yaitu air dan gas. Alat ini memiliki membran komposit tiga lapis dengan serat

berongga. Membran tersebut terdiri dari film ultra tipis non-berpori dengan permeabilitas

selektif terhadap gas yang terletak di antara 2 lapisan. Lapisan tengah membran memungkinkan

gas seperti oksigen, nitrogen, dan karbon dioksida dapat melewatinya, namun tidak dapat

dilalui oleh air. Di dalam alat tersebut, pada saluran yang terpisah dialirkan air dengan suhu

tertentu. Saluran air tersebut dikelilingi oleh membran yang ketika menerima karbon dioksida

bertekanan tinggi, maka gas CO2 akan berdifusi melalui struktur molekul film tipis dari

membran tersebut dan larut ke dalam air menuju tekanan lebih rendah sehingga mengeluarkan

air yang kaya akan CO2 (Aratel Group, 2012).

Gambar 9. Penggabungan air dan CO2 dalam Bicarbonated CREA (JesC, 2013)

2.13.2 Pengaruh Suhu

Aktivitas CO2 juga menunjukkan respon terhadap efek termal (Nishimura et al., 2002).

Berdasarkan kesimpulan dari beberapa hasil studi mengatakan bahwa aplikasi imersi campuran

air dan CO2 pada suhu tertentu dapat meningkatkan aliran darah dan tekanan oksigen (PO2)

(Hartmann et al., 1997). Pada suhu 34oC didapatkan peningkatan absolut laju aliran darah

kutaneus 2 kali lipat lebih baik dibandingkan pada suhu 23oC. Sebaliknya, pada suhu 41oC efek

CO2 terhadap laju aliran darah kutaneus sangat kurang. Sehingga dapat disimpulkan bahwa ada

suhu tertentu dimana CO2 dapat memberikan efek yang besar pada laju aliran darah kutaneus.

30
Penyebab CO2 memberikan dampak yang besar pada suhu 34oC karena suhu tersebut sangat

dekat dengan suhu netral yang dapat membantu menyembuhkan luka dan ulkus kronik (Ito T

dan Moore JI, 1989).

Gambar 10. Efek CO2 pada aliran darah kutaneus pada suhu perendaman yang berbeda (Ito

T dan Moore JI, 1989)

Peningkatan aliran darah kutaneus sangat penting karena merupakan kunci stimulus

fisiologis untuk meningkatkan fungsi vasodilator mikrosirkulasi. Termoregulasi pada

vasodilatasi kutaneus memicu peningkatan shear stress di conduit artery dan meningkatkan

fungsi endothelial sebagai vasodilator (Ogoh et al., 2016). Hal ini tergambar pada grafik berikut

yang menjelaskan hubungan antara FMD (Flow Mediated Dilatation) dan SkBF (Skin Blood

Flow) dengan membandingkan antara imersi air biasa dan air CO2 serta sebelum dan selama

imersi (Ogoh et al.,2016).

Gambar 11. Hubungan antara FMD (Flow Mediated Dilatation) dan SkBF (Skin Blood

Flow) (Ogoh et al., 2016)

31
2.13.3 Pengaruh Waktu (Durasi dan Frekuensi)

Terapi dengan merendam ekstremitas yang mengalami gangguan pembuluh darah

perifer (PAD, kaki diabetik, ulkus, gangen) pada air yang mengandung kadar tinggi CO 2

kurang dirasakan manfaatnya bila hanya diberikan satu kali perendaman. Efek permanen yang

diharapkan akan dicapai bila perendaman dilakukan secara berulang karena dibutuhkan waktu

untuk pembentukan pembuluh darah baru sehingga dapat memperbaiki suplai oksigen ke

jaringan dan secara permanen menurunkan inflamasi (Toriyama T et al., 2002).

Perendaman air CO2 dapat meningkatkan aliran darah mencapai 200-250% dari nilai

pra imersi. Kecepatan peningkatan aliran darah kutaneus terlihat paling besar selama 10 menit

pertama, setelah itu mulai berkurang. Hal ini sangat kontras dengan perendaman dalam air

murni yang menunjukkan tidak adanya peningkatan aliran darah kutaneus yang signifikan

seperti yang tampak pada gambar di bawah ini (Nishimura et al., 2002).

Gambar 12. Perbandingan laju aliran darah pada air biasa dengan air CO2 (JesC, 2013)

Berdasarkan pemaparan di atas mengenai efek perendaman air CO2, berikut ini adalah

contoh kaki penderita Arteriosclerosis Obliterans yang secara berkala menjalani intervensi

perendaman kaki dalam campuran air CO2 dan hasilnya memberikan perbaikan jaringan yang

sangat signifikan dalam 1 tahun terapi (JesC, 2013).

32
 Gambar 13. Contoh kasus efek perendaman terhadap pasien Arteriosclerosis Obliterans

(JesC, 2013)

2.14 Indikasi Dan Kontra Indikasi Terapi CO2

Indikasi dari terapi CO2 antara lain: gangguan mikrosirkulasi kutaneus, hipertensi

arteriolar, insufisiensi vena, gagal jantung ringan-sedang (functional class I-II), nyeri

fibromuskular, dan pada keadaan dimana latihan otot tidak mungkin dilakukan atau tidak

adekuat (Xu Y et al., 2017).

Terapi CO2 menjadi kontraindikasi pada keadaan hiperkapnia, terutama bila dilakukan

perendaman pada seluruh tubuh, sedangkan hipotensi hingga saat ini masih diperdebatkan (Xu

Y et al., 2017).

2.15 Hewan Coba Tikus Wistar (Rattus norvegicus)

Hewan coba banyak digunakan dalam studi eksperimental berbagai cabang ilmu

pengetahuan, termasuk di bidang medis, dengan pertimbangan penelitian tidak dapat

diaplikasikan langsung pada manusia karena alasan praktis dan etis. Pemakaian hewan coba

untuk penelitian klinis pada manusia telah memberikan kontribusi yang besar terhadap

pemahaman berbagai proses fisiologis dan patologis yang terjadi pada manusia (Badan

Penelitian dan Pengembangan Pertanian, 2008).

33
 Tikus merupakan hewan rodensia yang banyak digunakan dalam penelitian. Tikus

sebagai “mouse model” sangat cocok digunakan untuk penelitian berbagai penyakit pada

manusia karena adanya kesamaan struktur DNA dan ekspresi gen, dimana 98% gen manusia

memiliki gen yang sebanding dengan gen tikus (Badan Penelitian dan Pengembangan

Pertanian, 2008).

Tikus Wistar (Rattus norvegicus) atau yang dikenal sebagai Norway rat adalah salah

satu hewan coba yang sering digunakan pada penelitian biomedis karena memiliki gen yang

telah terkarakteristik dengan baik, galur yang bervariasi, serta tersedia dalam jumlah banyak.

Rattus norvegicus yang digunakan pada penelitian ini merupakan jenis albino yang tidak

memiliki pigmen melanin. Sifat tersebut diturunkan pada anak-anaknya (Barnett, 2002).

Menurut Boolation dan Stikes (1991), taksonomi dari tikus Wistar adalah sebagai berikut:

Kingdom : Animalia

Divisi : Chordata

Kelas : Mammalia

Ordo : Rodentia

Famili : Muridae

Subfamili : Murinae

Genus : Rattus Gambar 14. Tikus Wistar jantan

Spesies : Rattus norvegicus

Model hewan coba yang digunakan untuk penelitian pre-klinis sangat diperlukan untuk

pengembangan terapi baru, penilaian intervensi medis, dan studi jalur molekuler yang terlibat

dalam perkembangan penyakit. Variasi desain penelitian dan perlakuan pada hewan coba dapat

meningkatkan keberhasilan aplikasi dari model hewan coba ke praktik klinis (Krishna et al.,

2016).

34
 Telah banyak penelitian yang dilakukan untuk memahami patofisiologi dan terapi

alternatif pada penyakit pembuluh darah perifer, baik pada hewan coba maupun manusia. Akan

tetapi, hingga saat karya tulis ini disusun, belum ada penelitian yang dilakukan pada kondisi

ALI. Seperti telah disebutkan di atas, prognosis ALI adalah buruk, baik yang telah

mendapatkan terapi (farmakologis dan/atau intervensi) maupun tidak diterapi, sehingga perlu

dilakukan pendekatan terapeutik baru bagi pasien ALI untuk memperbaiki prognosis. Salah

satu terapi alternatif yang sering digunakan dalam studi eksperimental baik pada hewan coba

maupun manusia adalah CO2. Bila menggunakan subjek hewan coba, kondisi pembuluh darah

perifer dibuat iskemik dengan meligasi arteri femoralis tikus, atau lazim disebut dengan istilah

hind limb ischaemia. Metode hind limb ischaemia (HLI) ini ternyata memiliki banyak versi,

tidak ada keseragaman antara satu penelitian dengan penelitian yang lain.

2.15.1 Anatomi Pembuluh Darah Tungkai Tikus Wistar

Sebelum menjelaskan berbagai metode HLI, terlebih dahulu perlu diketahui anatomi

pembuluh darah tungkai tikus Wistar yang dapat dilihat pada Gambar 15 berikut ini:

Gambar 15. Anatomi pembuluh darah tungkai tikus Wistar (Niiyama et al., 2009)

2.15.2 Metode Hind Limb Ischaemia (HLI)

35
 Dari berbagai kepustakaan dan studi-studi eksperimental dengan menggunakan metode

HLI, tidak ditemukan adanya keseragaman dalam penerapannya. Berikut beberapa contoh

metode hind limb ischaemia yang dapat dilakukan (Gambar 16):

Gambar 16. Berbagai metode hind limb ischaemia yang dapat dilakukan. (i) ligasi AF
proksimal dan distal dengan benang silk, (ii) ligasi AF proksimal dan distal diikuti eksisi
segmen di antaranya, (iii) ligasi dan eksisi seluruh AF dengan cabang-cabangnya, (iv) ligasi
AF proksimal dan AS distal diikuti eksisi segmen di antaranya, (v) ligasi dan eksisi AF dan
VF (AF = arteri femoralis, AS = arteri saphena, VF = vena femoralis) (Krishna et al., 2016)

Derajat iskemik yang dihasilkan oleh masing-masing metode HLI adalah tidak sama.

Metode HLI pada (i) menghasilkan derajat iskemik paling rendah, sehingga cocok digunakan

sebagai model gangguan pembuluh darah arteri perifer seperti pada intermitten claudicatio dan

chronic limb threatening ischaemia. Derajat iskemik semakin meningkat dari (ii) hingga terjadi

auto-amputasi pada (v). Metode (iv) dianggap sebagai metode yang paling sesuai dengan

kondisi ALI (oklusi arteri total yang terjadi akut), di mana bagian proksimal dan distal arteri

femoral diikat mati, dan segmen di antaranya dieksisi untuk memastikan tidak ada aliran darah

yang dapat lewat hingga ke distal (Krishna et al., 2016).

2.16 Parameter Penilaian Derajat Iskemik yang Diinduksi Metode HLI

Terdapat beberapa parameter yang dapat digunakan untuk menilai keberhasilan induksi

iskemik dengan metode HLI, yaitu dengan menggunakan sistem skoring (Functional Scoring),

darah (SGOT = Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase, LDH = Lactat Dehydrogenase),

36
dan pemeriksaan histopatologi (PA = Patologi Anatomi). Seluruh parameter tersebut juga dapat

digunakan untuk follow up keberhasilan terapi.

2.16.1 Functional Scoring

Sistem skoring yang paling sering digunakan untuk menilai derajat nekrosis pada

hewan coba setelah menjalani metode HLI adalah Functional Scoring yang meliputi Skor

Tarlov untuk menilai fungsi motorik dan Skor Iskemik yang digunakan untuk menilai luas serta

derajat iskemik (Brenes et al., 2012).

Tabel 3. Functional Scoring (Brenes et al., 2012)

Skor Tarlov Deskripsi

0 Tidak ada pergerakan
1 Gerakan hampir tidak terlihat, berat badan tidak ditumpu pada tungkai yang terluka
2 Gerakan sedikit, berat badan tidak ditumpu pada tungkai yang terluka
3 Tungkai yang terluka dapat menopang sebagian berat badan
4 Mampu berjalan dengan defisit ringan
5 Normal namun lambat saat berjalan
6 Normal dan dapat berjalan cepat

Skor Iskemik Deskripsi

0 Autoamputasi > setengah tungkai
1 Gangren > setengah tungkai
2 Gangren < setengah tungkai, terdapat nekrosis otot
3 Gangren < setengah tungkai tanpa ditemukan nekrosis otot
4 Tungkai pucat dan terdapat gangguan saat berjalan
5 Normal

2.16.2 Kadar SGOT dan LDH

SGOT atau AST (Aspartate Aminotransferase) merupakan enzim transaminase yang

terdapat pada seluruh jaringan tubuh, kecuali tulang, dimana kadar tertinggi ditemukan pada

organ hepar dan otot skelet sehingga kadarnya akan meningkat bila terdapat kerusakan pada

organ-organ tersebut (Washington dan Goosier, 2012). Waktu paruh SGOT pada tikus Wistar

(Rattus norvegicus) ± 47 jam dalam sirkulasi, 87 jam dalam mitokondria dengan nilai normal

4-688 IU/L (Charles River Laboratories, 2016). Tikus memiliki kadar SGOT yang tinggi,

terutama bila mengalami nekrosis hepatoselular. Akan tetapi, kadar SGOT pada tikus dapat

37
meningkat lebih dari 2 kali lipat tanpa ditemukannya lesi histologis, sehingga SGOT pada tikus

dianggap sebagai indikator kerusakan jaringan yang sensitif namun kurang spesifik. Kadar

SGOT ini tidak dipengaruhi oleh usia maupun jenis kelamin tikus. SGOT merupakan senyawa

yang stabil, tidak berubah bila dibekukan, akan tetapi kadarnya dapat meningkat bila terjadi

hemolisis karena enzim ini juga terdapat dalam eritrosit (Kusmeirczyk et al., 2020).

LDH merupakan enzim yang mengkatalisis perubahan piruvat menjadi laktat dalam

proses glikolisis pada kondisi hipoksia/iskemik (Washington dan Goosier, 2012). LDH

memiliki 5 isoenzim yang akan meningkat kadarnya bila terjadi kerusakan sel. Pada tikus, LDH

paling banyak ditemukan dalam otot rangka dan otot jantung, diikuti oleh hepar, ginjal, dan

usus. Kadar LDH lebih tinggi pada tikus jantan dan meningkat seiring pertambahan usia, baik

pada tikus jantan maupun betina (Kusmeirczyk et al., 2020; Loeb dan Quimby, 1999). Kadar

normal LDH pada tikus Wistar (Rattus norvegicus) adalah 575-725 IU/L, dan mencapai kadar

puncak dalam 48 jam post injury (Charles River Laboratories, 2016). Peningkatan kadar LDH

akibat injury pada otot skelet dan otot jantung akan diikuti pula dengan kenaikan kadar creatine

kinase (CK) dan SGOT. Kadar LDH akan meningkat bila terjadi hemolisis dan menurun bila

sampel darah dibekukan (Kusmeirczyk et al., 2020; Loeb dan Quimby, 1999).

2.16.3 Pemeriksaan Histopatologi

Studi-studi yang telah dilakukan sebelumnya dengan menggunakan imersi CO 2 sebagai

terapi alternatif pada penyakit pembuluh darah arteri perifer mengatakan bahwa CO 2 dapat

meningkatkan aliran darah kutaneus, menyebabkan vasodilatasi, dan merangsang terjadinya

angiogenesis sehingga dapat membantu proses penyembuhan. Untuk membuktikannya,

pemeriksaan imunohistokimia dengan menggunakan antibodi CD31 dapat membantu untuk

memvisualisasikan sel endotelial tikus dengan baik sehingga memungkinkan untuk dilakukan

38
penghitungan jumlah vaskular/pembuluh darah tikus, dimana angiogenesis akan meningkatkan

jumlah vaskular (Krishna et al., 2020).

Derajat nekrosis, edema jaringan, perdarahan, infiltrasi sel radang, dan struktur jaringan

dapat dinilai dengan sistem skoring melalui pemeriksaan histologi rutin dengan menggunakan

pewarnaan hematoxylin dan eosin (HE). Salah satu sistem skoring (kuantitatif) yang bisa

digunakan dapat dilihat pada Tabel 4 di bawah ini. Skor 0 menandakan otot yang sehat,

sedangkan skor 5 menandakan otot yang rusak (Bitto et al., 2008).

Tabel 4. Kriteria skoring pada pemeriksaan histologi (Bitto et al., 2008)

Skor Nekrosis Edema Perdarahan Inflitrasi Sel Struktur

Jaringan Radang Jaringan
0 Tidak ada kerusakan Tidak ada Tidak ada Tidak ada Terstruktur
1 Kerusakan lokal Sedikit Tidak ada Ada Sebagian besar
terstruktur
2 Nekrosis lebih luas, Ada Sedikit Ada Sebagian
melewati batas jaringan terstruktur
ikat, melibatkan sedikit
fasikulus otot
3 Nekrosis lebih luas, Ada Ada di antara serat Ada Sebagian kecil
melewati batas jaringan otot terstruktur
ikat, melibatkan banyak
fasikulus otot
4 Kerusakan otot hampir Ada Ada pada hampir Ada Tidak
memenuhi seluruh lapang seluruh lapang terstruktur
pandang pandang
5 Kerusakan otot pada Ada Ada pada hampir Ada Tidak
seluruh lapang pandang seluruh lapang terstruktur
pandang

39
 BAB III

KERANGKA TEORI DAN KERANGKA KONSEP

3.1 Kerangka Teori

3.2 Kerangka Konsep

Variabel bebas Variabel terikat

Perubahan kadar SGOT

Air CO2 kadar tinggi Perubahan kadar LDH
Gambaran histopatologi

40
 BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Desain Penelitian

Desain penelitian ini adalah dengan metode eksperimental.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Tempat melakukan ligasi kaki tikus dengan metode HLI, pengambilan dan pemeriksaan

spesimen darah (SGOT dan LDH) adalah di Laboratorium Biofarmasi Universitas Hasanuddin,

Makassar. Perendaman kaki tikus dilakukan di Laboratorium Entomologi Hewan Universitas

Hasanuddin, Makassar. Pemeriksaan histopatologi/PA dilakukan di Laboratorium Patologi

Anatomi Rumah Sakit Universitas Hasanuddin, Makassar.

Penelitian ini dilakukan pada pertengahan September - awal Desember 2020.

4.3 Populasi Penelitian

Populasi dalam penelitian ini adalah semua tikus putih galur Wistar (Rattus norvegicus)

jantan yang berusia sekitar 120 hari dengan rentang berat 180-250 gram, memiliki

karakterisitik fisik sehat yang terdapat di Laboratorium Biofarmasi Universitas Hasanuddin,

Makassar.

4.4 Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel menggunakan metode simple random sampling. Tikus dibagi

menjadi 4 kelompok perlakuan. Penentuan besar sampel pada masing-masing kelompok

perlakuan dengan menggunakan desain one-way Anova, dimana sample minimal menggunakan

DF = 10 dan sampel maksimal menggunakan DF = 20, sesuai rumus berikut ini (Arifin, 2017):

41
 Sample minimal: Sampel maksimal:

n = DF/k + 1 n = DF/k + 1

n = 10/4 + 1 n = 20/4 + 1

n = 2,5 + 1 n=5+1

n = 3,5 ≈ 4 n=6

Keterangan:

n : jumlah sampel tiap kelompok perlakuan

DF : degrees of freedom (derajat kebebasan)

k : jumlah kelompok perlakuan

Berdasarkan perhitungan di atas, diputuskan jumlah sampel pada masing-masing

kelompok perlakuan adalah 5, sehingga total tikus yang digunakan adalah 20 ekor.

4.5 Kriteria Inklusi dan Kriteria Ekslusi

4.5.1 Kriteria Inklusi

 Tikus galur Wistar jantan

 Berusia sekitar 120 hari

 Berat badan 180-250 gram

 Sehat dan secara makroskopis tidak tampak kelainan morfologi

4.5.2 Kriteria Eksklusi

 Tikus galur Wistar jantan yang sakit selama proses penelitian berlangsung (tampak

gerak terbatas)

 Tikus galur Wistar jantan yang mati saat proses penelitian

4.6 Izin Penelitian dan Kelayakan Etik

42
 Usulan penelitian ini telah mendapatkan persetujuan dari Komisi Etik Penelitian

Kesehatan (KEPK) Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin, Makassar.

Penelitian ini akan memperhatikan aspek-aspek yang berhubungan dengan prinsip

etika penelitian pada hewan coba, antara lain :

a. Replacement

Replacement adalah keperluan memanfaatkan hewan percobaan sudah diperhitungkan

secara seksama, baik dari pengalaman terdahulu maupun literatur untuk menjawab

pertanyaan penelitian dan tidak dapat digantikan oleh mahluk hidup lain seperti sel atau

biakan jaringan.

b. Reduction

Reduction diartikan sebagai pemanfaatan hewan dalam penelitian sesedikit mungkin,

tetapi tetap mendapatkan hasil yang optimal.

c. Refinement

Refinement adalah memperlakukan hewan coba secara manusiawi, memelihara hewan

dengan baik, serta meminimalisasi perlakuan yang menyakitkan sehingga menjamin

kesejahteraan hewan coba sampai akhir penelitian.

4.7 Alur Penelitian

43
 20 ekor tikus
Aklimatisasi 7 hari Wistar jantan

10 ekor 10 ekor
Rendam selama 7 hari
air biasa air CO2

5 ekor 5 ekor 5 ekor 5 ekor

Pembagian kelompok
tidak diligasi diligasi tidak diligasi diligasi

Ligasi a. Ligasi a.
Ambil darah pra Femoralis Femoralis

48 jam paska ligasi Ambil darah Ambil darah

Rendam kembali Ambil darah Ambil darah Ambil darah Ambil darah
selama 7 hari post + PA post + PA post + PA post + PA

4.8 Material Penelitian

4.8.1 Alat

Kandang hewan coba, tempat minum dan makan tikus, sekam, bisturi, hecting set, kaca

pembesar, timbangan digital, handscoon, masker, kassa steril, kaspas, underpad,

bicarbonated CREA (BC-2000), tabung berisi CO2, pemanas air (water heater), sumber

air mengalir (wastafel), stopwatch, baskom ukuran sedang, termometer air raksa, pH-

meter, handuk, kawat, tabung merah kecil, tabung vacutainer, spoit (1 cc, 3 cc),

pot/wadah sampel jaringan, sentrifuge EBA 21®, Humalyzer 3500®.

4.8.2 Bahan

Ketamin HCl, eter, alkohol 70%, NaCl 0.9%, formalin 10%, salep neomycin sulphate

dan bacitracin (Nebacetin®), salep perontok bulu (Veet®), benang silk 3.0.

44
 Gambar 17. Alat dan bahan penelitian

4.8.3 Hewan Coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah 20 ekor tikus putih jantan galur

Wistar (Rattus norvegicus) sehat berusia sekitar 120 hari dengan berat 180-250 gram.

4.9 Prosedur Penelitian

4.9.1 Penyiapan Hewan dan Pemberian Perlakuan Pra-Penelitian

1) Sebanyak 20 ekor tikus putih jantan galur Wistar (Rattus norvegicus) sehat yang

berusia sekitar 120 hari dengan berat 180-250 gram diaklimatisasi selama 7 hari di

Laboratorium Biofarmasi Universitas Hasanuddin, Makassar dengan pemberian pakan

dan minum normal serta pemberian sekam dan pembersihan kandang setiap hari

sebelum penelitian dimulai.

2) Secara acak, hewan coba dibagi menjadi 4 kelompok, dimana setiap kelompok terdiri

dari 5 ekor tikus putih

 Kelompok 1 (kontrol): tungkai tikus direndam dalam air biasa

 Kelompok 2: tungkai tikus direndam dalam air CO2 kadar tinggi

45
  Kelompok 3: tungkai tikus direndam dalam air biasa dan dilakukan ligasi pada arteri

femoralis tungkai kanan belakang dengan metode HLI

 Kelompok 4: tungkai tikus direndam dalam air CO 2 kadar tinggi dan dilakukan

ligasi pada arteri femoralis tungkai kanan belakang dengan metode HLI

Gambar 18. Aklimatisasi dan pembagian kelompok tikus pra-penelitian

4.9.2 Cara Membuat Rendaman Air CO2 Kadar Tinggi

Untuk membuat rendaman air dengan kadar CO2 yang dianggap cukup untuk bisa

membuat CO2 berdifusi ke dalam pembuluh darah tikus, diperlukan sebuah alat bicarbonated

CREA, 1 buah tabung berisi CO2, sumber air (wastafel) yang terhubung dengan pemanas air

(water heater). Pemanas air digunakan untuk membuat air yang keluar dari sumber air

memiliki suhu 38oC untuk kemudian dihubungkan ke alat CREA menggunakan sebuah selang.

Begitu pula gas CO2 dalam tabung CO2 dihubungkan dengan sebuah selang ke alat CREA. Di

dalam alat CREA, dibentuklah air berkarbonasi dengan kadar CO2 tinggi (mencapai 1300 ppm)

sehingga dapat berdifusi ke dalam pembuluh darah. Air dengan kadar tinggi CO2 bersuhu 38oC

yang keluar dari alat CREA tersebut kemudian ditampung dalam sebuah baskom yang

digunakan sebagai tempat untuk merendam kaki tikus, baik kaki tikus yang diligasi arteri

femoralisnya maupun yang tidak.

46
 Gambar 19. CREA, sumber air (wastafel), tabung CO2, dan pemanas air (water heater)

4.9.3 Cara Ligasi Arteri Femoralis Tikus

Prosedur ligasi arteri femoralis tikus dengan model HLI adalah sebagai berikut (Bitto

A et al., 2008; Krishna et al., 2016):

1. Tikus dianestesi menggunakan Ketamin HCl dosis 100 mg/kgBB melalui injeksi

intraperitoneal (IP).

Gambar 20. Injeksi IP dengan Ketamin HCl

2. Rambut di daerah inguinal dan tungkai belakang kanan tikus dibersihkan dengan krim

perontok rambut.

47
3. Aseptik dan antiseptik pada daerah arteri femoralis tungkai belakang kanan dengan alkohol

70% dan kassa steril.

4. Insisi kurang lebih 2 cm di bawah ligamentum inguinal kanan, lalu dibuka lapis demi lapis

hingga terlihat arteri femoralis.

5. Pisahkan arteri femoralis dari vena dan nervus femoralis secara hati-hati.

Gambar 21. Arteri femoralis setelahh dipisahkan dari vena dan nervus

6. Ligasi bagian proksimal dan distal arteri femoralis dengan benang silk 3.0 hingga terjadi

penyempitan total lumen pembuluh darah.

Gambar 22. Ligasi arteri femoralis proksimal dan distal dengan benang silk 3.0

7. Eksisi pembuluh darah di antara kedua ikatan tersebut agar tidak ada aliran darah ke distal

8. Luka insisi kemudian dijahit lapis demi lapis dan tikus kembali pulih.

9. Oleskan salep antibiotik pada bekas luka jahitan dan tutup dengan kassa steril.

48
 Gambar 23. Pemberian salep antibiotik pada luka bekas jahitan

10. Derajat nekrosis dinilai dengan functional scoring (Tabel 3). Skor Tarlov dan Skor

Iskemik yang diharapkan berkisar 2-4, dimana gangguan motorik dan jaringan nekrosis

tampak dalam 1-2 hari setelah ligasi.

G

Gambar 24. Skor Tarlov = 3, Skor Iskemik = 2

4.9.4 Cara Perlakuan

1. Setelah 20 ekor tikus galur Wistar jantan (Rattus Norvegicus) sehat yang berusia sekitar

120 hari dengan berat 180-250 gram diaklimatisasi selama 7 hari dan secara acak dibagi

menjadi 4 kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus, dilakukan

perendaman tungkai tikus dalam air biasa dengan suhu 38oC (kelompok 1 dan 3) dan air

CO2 kadar tinggi (kelompok 2 dan 4) dengan suhu 38oC dan pH 4.5-5.5 setiap hari selama

7 hari dengan durasi setiap perendaman masing-masing selama 10 menit.

49
 Gambar 25. Pengukuran suhu dan pH menggunakan termometer air raksa dan pHmeter

2. Tikus dimasukkan ke dalam kandang kawat berbentuk kotak dengan ukuran sedikit lebih

besar daripada ukuran badannya sehingga pergerakan tikus menjadi terbatas namun

keempat tungkainya dapat terjulur keluar di antara sela-sela kawat. Kemudian, tikus

direndam dalam air biasa atau air CO2 kadar tinggi setinggi perut sehingga seluruh

tungkainya terendam namun hidung serta kepala tikus tidak ikut terbenam.

Gambar 26. Perendaman tikus dalam air biasa dan air CO2 kadar tinggi

3. Setelah 7 hari perendaman, dilakukan pengambilan sampel darah melalui vena lateralis

pada ekor tikus untuk mengukur kadar LDH dan SGOT sebagai parameter awal.

50
 Gambar 27. Pengambilan sampel darah melalui vena lateralis pada ekor tikus

4. Tikus kelompok 1 kemudian direndam kembali dalam air biasa, dan tikus kelompok 2

direndam dalam air CO2 kadar tinggi selama 7 hari, sehingga total lamanya perendaman

adalah 14 hari. Pada hari ke-14, dilakukan kembali pengambilan sampel darah melalui vena

lateralis pada ekor tikus untuk mengukur kadar LDH dan SGOT sebagai parameter akhir.

Kemudian, tikus dieutanasia dan dilakukan pemotongan tungkai kanan belakang setinggi

lutut lalu dimasukkan dalam wadah berisi formalin 10%. Sisa bangkai tikus dikubur.

Gambar 28. Tungkai tikus yang telah dipotong setinggi lutut

5. Tikus kelompok 3 dan 4 diligasi arteri femoralis pada masing-masing tungkai kanan

belakangnya. Bekas luka jahitan diberi salep antibiotik dan ditutup dengan kassa steril.

Setelah 48 jam post ligasi, kembali dilakukan pengambilan sampel darah melalui vena

lateralis untuk mengukur kadar LDH dan SGOT. Kemudian dilakukan perendaman

kembali dalam air biasa (kelompok 3) dan air CO2 kadar tinggi selama 7 hari berikutnya.

Setelah 7 hari perendaman paska ligasi arteri femoralis, diambil kembali sampel darah
51
 untuk mengukur kadar SGOT dan LDH, lalu tikus dieutanasia dan dilakukan pemotongan

tungkai kanan belakang setinggi lutut. Tungkai yang telah dipotong tersebut dimasukkan

dalam wadah berisi formalin 10%. Sisa bangkai tikus kemudian dikubur.

Gambar 29. Tungkai bawah tikus setelah dipotong kemudian direndam dalam formalin 10%

6. Kedua puluh tungkai kanan belakang tikus dalam formalin dari kelompok 1-4 tersebut

kemudian diperiksakan histopatologi dengan mengambil jaringan pada otot gastrocnemius

dan diberi 2 macam pewarnaan, yaitu hematoxylin eosin (HE) untuk penilaian jaringan otot

dengan sistem scoring (Tabel 4) dan pewarnaan imunohistokimia dengan antibodi CD31

yang spesifik untuk visualisasi dan penghitungan jumlah pembuluh darah.

Gambar 30. Preparat PA yang telah diwarnai dengan pewarnaan HE dan CD31

4.9.5 Pengukuran Kadar SGOT dan LDH

52
 Sebanyak ± 3 cc darah tikus yang telah diambil melalui vena lateralis, dimasukan ke

dalam tabung merah. Kemudian darah di-sentrifuge dengan alat EBA 21® sehingga terpisah

antara sel darah di bagian bawah dan serum di bagian atas. Sebanyak 100 µl serum darah

diambil lalu dicampur dengan 1000 µl reagen GOT (ASAT) IFCC mod. liquiUV® untuk

memeriksa kadar SGOT, sedangkan untuk pemeriksaan kadar LDH dibutuhkan campuran 20

µl serum dengan 1000 µl reagen LDH SCE mod. liquiUV®. Keduanya diinkubasi selama 1

menit pada suhu 37oC kemudian diukur kadarnya menggunakan alat Humalyzer 3500®. Nilai

SGOT dan LDH dalam satuan IU/l (International Unit/Litre).

Gambar 31. Alat sentrifuge dan pengukur kadar SGOT dan LDH

4.9.6 Pemeriksaan Histopatologi / PA

4.9.6.1 Penilaian Kerusakan Jaringan dengan Pewarnaan HE

Setelah tungkai tikus dipotong, dilanjutkan dengan pembuatan preparat PA dengan

langkah-langkah berikut:

1. Deparafinisasi preparat yang telah kering dalam xylol sebanyak 2 kali (masing-masing

selama 5 menit).

2. Masukkan ke dalam alkohol 96% sebanyak 2 kali (masing-masing selama 5 menit). Lalu

cuci dengan air mengalir sampai alkohol hilang.

53
3. Masukkan ke dalam larutan hematoxylin selama 5-10 menit. Lalu cuci dengan air mengalir

selama 10 menit.

4. Celupkan ke dalam larutan HCl 0.4% sebanyak 3 kali celup untuk dekolorisasi. Lalu cuci

kembali dengan air mengalir selama 10 menit.

5. Masukkan ke dalam larutan lithium carbonat selama 30 detik lalu cuci dengan air mengalir

selama 10 menit.

6. Masukkan ke dalam larutan eosin selama 1-2 menit, lalu cuci dengan air mengalir selama

10 menit.

7. Masukkan ke dalam larutan ethanol selama 15 detik sebanyak 3 kali dan selama 1 menit

sebanyak 2 kali.

8. Rendam ke dalam larutan xylol selama 5 menit sebanyak 3 kali.

9. Tetesi dengan entelan dan tutup dengan deck glass.

10. Preparat dibaca di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali

11. Hitung skor histologi otot menggunakan Tabel 6.

4.9.6.2 Perhitungan Jumlah Vaskular

Untuk menghitung jumlah vaskular, pembuatan preparat PA mengikuti langkah-

langkah berikut ini:

1. Sediaan preparat dideparafinisasi dengan xylene sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5

menit dan direhidrasi masing-masing selama 5 menit berturut-turut dengan alkohol 96%,

alkohol 80% dan alkohol 70%.

2. Kemudian dicuci dengan air mengalir selama 5 menit.

3. Slide dimasukkan ke dalam larutan TRS, lalu dipanaskan dengan microwave selama 10

menit.

4. Setelah didinginkan, kemudian dicuci dengan PBS 2 kali, masing-masing selama 5 menit.

54
5. Lalu pinggir jaringan ditandai, selanjutnya dilakukan perokside block selama 15 menit.

6. Preparat dicuci kembali dengan PBS 2 kali, masing-masing selama 5 menit, kemudian

diberi protein block selama 5 menit, lalu dicuci lagi dengan PBS 2 kali, masing-masing

selama 5 menit.

7. Antibodi yang dipakai adalah antibodi CD31 dengan pengenceran 1/200 yang diinkubasi

pada suhu -20oC

8. Sediaan dicuci dengan PBS 2 kali, masing-masing selama 5 menit. Diberikan Ultratek anti-

polyvalent (ScyTek) selama 10 menit. Sediaan dicuci kembali dengan PBS 2 kali, masing-

masing selama 5 menit.

9. Kemudian diberi Ultratek HRP (ScyTek) selama 10 menit, lalu dicuci kembali dengan PBS

2 kali, masing-masing selama 5 menit.

10. Selanjutnya sediaan diinkubasi dengan chromogen diaminobenzidine (DAB) dan dicuci

dengan air mengalir selama 5 menit, lalu direndam dalam larutan hematoxylin selama 5

menit.

11. Sediaan dicuci kembali dengan air mengalir. Setelah itu dilakukan dehidrasi dengan

alkohol secara bertingkat (alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 96%) masing-masing selama

5 menit lalu dilakukan clearing ( xylol I, xylol II) masing-masing selama 5 menit.

12. Slide dikeringkan, kemudian diberi entelan, lalu ditutup dengan deck glass.

13. Dilakukan penghitungan jumlah vaskular di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 kali.

4.10 Definisi Operasional dan Kriteria Objektif

55
1. Tikus putih galur Wistar (Rattus norvegicus)

Definisi Operasional:

Tikus putih galur Wistar (Rattus norvegicus) atau Norway rat adalah hewan coba yang

sering digunakan pada penelitian biomedis karena memiliki gen yang telah terkarakteristik

dengan baik, galur yang bervariasi, serta tersedia dalam jumlah banyak.

Kriteria Objektif:

Tikus putih galur Wistar (Rattus norvegicus) jantan yang berusia sekitar 120 hari dengan

rentang berat 180-250 gram, baik yang tidak dibuat ALI maupun dibuat ALI dengan

metode HLI, yaitu dengan ligasi kuat pada bagian proksimal dan distal arteri femoralis

tungkai kanan belakang. Untuk membuat suplai aliran darah benar-benar tidak mencapai

bagian distal tungkai, maka pembuluh darah di antara kedua ikatan tersebut dipotong.

Derajat nekrosis dinilai dengan functional scoring yang meliputi Skor Tarlov dan Skor

Iskemik (Tabel 3). Nekrosis diharapkan timbul dalam waktu 1-2 hari setelah ligasi dengan

Skor Tarlov dan Skor Iskemik berkisar antara 2-4.

Tabel 3. Functional Scoring (Brenes et al., 2012)

Skor Tarlov Deskripsi

0 Tidak ada pergerakan
1 Gerakan hampir tidak terlihat, berat badan tidak ditumpu pada tungkai yang terluka
2 Gerakan sedikit, berat badan tidak ditumpu pada tungkai yang terluka
3 Tungkai yang terluka dapat menopang sebagian berat badan
4 Mampu berjalan dengan defisit ringan
5 Normal namun lambat saat berjalan
6 Normal dan dapat berjalan cepat

Skor Iskemik Deskripsi

0 Autoamputasi > setengah tungkai
1 Gangren > setengah tungkai
2 Gangren < setengah tungkai, terdapat nekrosis otot
3 Gangren < setengah tungkai tanpa ditemukan nekrosis otot
4 Tungkai pucat dan terdapat gangguan saat berjalan
5 Normal

2. Air Biasa

Definisi Operasional:
56
 Air yang keluar dari sumber air (keran) yang telah dihubungkan dengan pemanas air (water

heater).

Kriteria Objektif:

Air yang keluar dari sumber air (keran) dengan suhu 38oC yang diatur dengan

menggunakan pemanas air (water heater). Air biasa digunakan untuk merendam tikus

kelompok 1 (tidak diligasi) dan tikus kelompok 3 (diligasi) masing-masing selama 10 menit

setiap hari selama 2 minggu.

3. Air CO2

Definisi Operasional:

Air yang mengandung CO2 kadar tinggi yang dihasilkan oleh alat bicarbonated CREA.

Kriteria Objektif:

Air CO2 kadar tinggi yang dihasilkan oleh alat bicarbonated CREA dengan suhu air dari

sumber air adalah 38oC dan pH 4.5-5.5. Air CO2 digunakan untuk merendam tikus

kelompok 2 (tidak diligasi) dan tikus kelompok 4 (diligasi) masing-masing selama 10 menit

setiap hari selama 2 minggu.

4. SGOT

Definisi Operasional:

SGOT atau AST (Aspartate Aminotransferase) merupakan enzim transaminase yang

terdapat pada seluruh jaringan tubuh, kecuali tulang, dimana kadar tertinggi ditemukan

pada organ hepar dan otot skelet sehingga kadarnya akan meningkat bila terdapat kerusakan

pada organ-organ tersebut (Washington dan Goosier, 2012).

Kriteria Objektif:

57
 Kadar SGOT normal pada tikus Wistar (Rattus norvegicus) berkisar antara 4-688 IU/L

(Charles River Laboratories, 2016). Tikus kelompok 1 dan 2 yang tidak diligasi dilakukan

pengukuran kadar SGOT sebelum dan sesudah perendaman. Sedangkan pada kelompok 3

dan 4 yang diligasi, pengukuran kadar SGOT dilakukan 48 jam setelah ligasi dan 2 minggu

setelah perendaman.

5. LDH

Definisi Operasional:

LDH merupakan enzim yang mengkatalisis perubahan piruvat menjadi laktat dalam proses

glikolisis pada kondisi hipoksia/iskemik (Washington dan Goosier, 2012).

Kriteria Objektif:

Kadar normal LDH pada tikus Wistar (Rattus norvegicus) adalah 575-725 IU/L, dan

mencapai kadar puncak dalam 48 jam post injury (Charles River Laboratories, 2016). Tikus

kelompok 1 dan 2 yang tidak diligasi dilakukan pengukuran kadar LDH sebelum dan

sesudah perendaman. Sedangkan pada kelompok 3 dan 4 yang diligasi, pengukuran kadar

LDH dilakukan 48 jam setelah ligasi dan 2 minggu setelah perendaman.

6. Jumlah Vaskularisasi

Definisi Operasional:

Jumlah total pembuluh darah yang dihitung pada jaringan tungkai tikus yang diperiksa

melalui pemeriksaan histopatologi.

Kriteria Objektif:

Untuk menilai jumlah vaskularisasi, dilakukan pemeriksaan histopatologi yang dimulai

dengan pemotongan tungkai kanan belakang tikus pada hari terakhir perlakuan dengan

memotong tungkai 1 cm di atas lutut, dibuang kulitnya, lalu tungkai dimasukkan dalam

wadah berisi formalin. Jaringan yang akan diambil dan dibuat preparat adalah otot

gastrocnemius. Kemudian dilakukan pemotongan jaringan dan pewarnaan

58
 imunohistokimia dengan menggunakan antibodi CD31 yang spesifik untuk visualisasi dan

penghitungan jumlah vaskular yang dilakukan pada seluruh kelompok tikus.

7. Skor Histologi

Definisi Operasional:

Pemeriksaan histopatologi dengan menggunakan sistem skoring (kuantitatif) untuk menilai

derajat kerusakan jaringan.

Kriteria Objektif:

Untuk menilai skor histologi, dilakukan pemeriksaan histopatologi yang dimulai dengan

pemotongan tungkai kanan belakang tikus pada hari terakhir perlakuan dengan memotong

tungkai 1 cm di atas lutut, dibuang kulitnya, lalu tungkai dimasukkan dalam wadah berisi

formalin. Jaringan yang akan diambil dan dibuat preparat adalah otot gastrocnemius.

Kemudian dilakukan pemotongan jaringan dan pewarnaan dengan menggunakan

hematoxylin dan eosin (HE) untuk menilai struktur jaringan dengan sistem skoring

menggunakan beberapa parameter yang terdapat pada Tabel 4.

Tabel 4. Kriteria skoring pada pemeriksaan histologi (Bitto et al., 2008)

Skor Nekrosis Edema Perdarahan Inflitrasi Sel Struktur

Jaringan Radang Jaringan
0 Tidak ada kerusakan Tidak ada Tidak ada Tidak ada Terstruktur
1 Kerusakan lokal Sedikit Tidak ada Ada Sebagian besar
terstruktur
2 Nekrosis lebih luas, Ada Sedikit Ada Sebagian
melewati batas jaringan terstruktur
ikat, melibatkan sedikit
fasikulus otot
3 Nekrosis lebih luas, Ada Ada di antara serat Ada Sebagian kecil
melewati batas jaringan otot terstruktur
ikat, melibatkan banyak
fasikulus otot
4 Kerusakan otot hampir Ada Ada pada hampir Ada Tidak
memenuhi seluruh lapang seluruh lapang terstruktur
pandang pandang
5 Kerusakan otot pada Ada Ada pada hampir Ada Tidak
seluruh lapang pandang seluruh lapang terstruktur
pandang

4.11 Pengolahan Data dan Analisis Data

59
1. Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan software SPSS® (Statistical Package

For Social Science) versi 23. (Produksi IBM®)

2. Hasil pengolahan dan analisa data dasar variabel numerik berdistribusi normal akan

disajikan dalam bentuk pengukuran mean ± standar deviasi (SD), sedangkan yang

berdistribusi tidak normal akan disajikan dalam bentuk median ± interquartil range

(IQR)

3. Hasil pengolahan dan analisa data dasar variabel kategorik akan disajikan dalam bentuk

persentase

4. Perbandingan perubahan parameter numerik antara kelompok perlakuan dan kontrol

akan dilakukan dengan analisis independent t test/Mann-Whitney test

5. Korelasi antara parameter kategorik dan jenis perlakuan akan dilakukan dengan

Spearman`s correlation

60
 BAB V

HASIL PENELITIAN

5.1 Gambaran Perubahan Kadar SGOT, LDH, dan Histopatologi Tikus yang Tidak

Diligasi (Kelompok 1 dan 2) pada Rendaman Air Biasa dan Air CO2 Kadar Tinggi

Tabel 5. Gambaran Perubahan Kadar SGOT, LDH, dan Histopatologi Tikus yang Tidak
Diligasi (Kelompok 1 dan 2) pada Rendaman Air Biasa dan Air CO2 Kadar Tinggi
PARAMETER MEAN±SD MIN MAX
Kadar SGOT Sebelum Perendaman 178±84 81 340
Kadar SGOT Setelah Perendaman 122±92 6 167
Perubahan Kadar SGOT 57±56 2 149
Kadar LDH Sebelum Perendaman 877±411 414 1504
Kadar LDH Setelah Perendaman 653±345 321 1195
Perubahan Kadar LDH 224±192 18 640
Jumlah Vaskularisasi 118±51 51 200

Tabel 5 menunjukkan gambaran hasil laboratorium dan histopatologi tikus yang tidak

diligasi (kelompok 1 dan 2). Seluruh parameter yang dideskripsikan pada tikus yang tidak

diligasi berdistribusi normal, sehingga tendensi sentral dan variasi dinyatakan dalam mean ±

standar deviasi. Secara umum, terjadi penurunan kadar SGOT dan LDH setelah dilakukan

perendaman. Rerata kadar SGOT sebelum perendaman adalah 178±84 IU/l dan setelah

perendaman 122±92 IU/l dengan rerata perubahan kadar SGOT 57±56 IU/l. Rerata kadar LDH

sebelum perendaman adalah 877±411 IU/l dan setelah perendaman 653±345 IU/l dengan rerata

perubahan kadar LDH 224±192 IU/l. Rerata jumlah vaskularisasi setelah dilakukan

perendaman pada tikus yang tidak diligasi adalah 118±51.

61
5.2 Gambaran Perubahan Kadar SGOT, LDH, dan Histopatologi Tikus yang Diligasi

(Kelompok 3 dan 4) pada Rendaman Air Biasa dan Air CO2 Kadar Tinggi

Tabel 6. Gambaran Perubahan Kadar SGOT, LDH, dan Histopatologi Tikus yang Diligasi
(Kelompok 3 dan 4) pada Rendaman Air Biasa dan Air CO2 Kadar Tinggi
TENDENSI
PARAMETER SENTRAL MIN MAX
±VARIASI
Kadar SGOT Sebelum Perendaman 196±55 100 284
Kadar SGOT Setelah Perendaman 157±73 65 167
Perubahan Kadar SGOT 63±42 18 126
Kadar LDH Sebelum Perendaman 431±182 163 688
Kadar LDH Setelah Perendaman 359±148 156 657
Perubahan Kadar LDH 44±106 7 250
Jumlah Vaskularisasi 157±73 80 260
Skor Histologi 1.44±1.2 0 3

Tabel 6 menunjukkan deskripsi hasil laboratorium dan histopatologi tikus yang diligasi

(kelompok 3 dan 4). Dari uji normalitas, kadar SGOT sebelum perendaman, perubahan kadar

SGOT, kadar LDH sebelum perendaman, kadar LDH setelah perendaman, jumlah

vaskularisasi, dan skor histologi berdistribusi normal, sehingga tendensi sentral untuk

parameter tersebut dinyatakan dalam mean ± standar deviasi. Akan tetapi, uji normalitas pada

SGOT sesudah perendaman dan perubahan LDH berdistribusi tidak normal, sehingga tendensi

sentral dinyatakan dalam median ± interquartile range. Secara umum, terjadi penurunan kadar

SGOT dan LDH setelah perendaman pada kelompok tikus yang diligasi. Rerata jumlah

vaskularisasi pada kelompok tikus yang diligasi setelah dilakukan perendaman adalah 157±73

IU/l dengan rerata skor histologinya adalah 1.44±1.2.

62
5.3 Analisis Pengaruh Air Biasa Versus Air CO2 Kadar Tinggi pada Tikus yang Tidak

Diligasi (Kelompok 1 dan 2)

Tabel 7. Analisis Pengaruh Air Biasa Versus Air CO2 Kadar Tinggi pada Tikus yang Tidak
Diligasi (Kelompok 1 dan 2)
PARAMETER AIR BIASA AIR CO2 KADAR TINGGI NILAI P
Perubahan SGOT 25±23 89±63 0.76
Perubahan LDH 125±76 322±230 0.131
Jumlah Vaskularisasi 92±36 144±54 0.109

Tabel 7 menunjukkan uji analitik pada tikus yang tidak diligasi. Terdapat perbedaan

rerata perubahan SGOT antara tikus yang direndam air biasa dengan air CO2. Pada tikus yang

direndam air biasa, rerata perubahan kadar SGOT adalah 25±23 IU/l, sedangkan pada tikus

yang direndam air CO2 adalah 89±63 IU/l, tetapi perbedaan ini tidak bermakna secara statistik

(nilai p=0.76). Terdapat perbedaan rerata perubahan LDH pada tikus yang direndam air biasa

dengan air CO2. Pada tikus yang direndam air biasa, rerata perubahan kadar LDH adalah

125±76 IU/l, sedangkan pada tikus yang direndam air CO2 rerata perubahan LDH adalah

322±230 IU/l, tetapi perbedaan ini juga tidak bermakna secara statistik (nilai p=0.131).

Terdapat pula perbedaan jumlah vaskularisasi antara tikus yang direndam air biasa dengan air

CO2. Akan tetapi, setelah dilakukan analisis statistik didapatkan hasil tidak bermakna (nilai

p=0.109).

Sebagai kesimpulan, tidak terdapat perbedaan bermakna terhadap perubahan kadar

SGOT, LDH, dan jumlah vaskularisasi pada tikus yang tidak diligasi antara yang direndam air

biasa dengan yang direndam air CO2 kadar tinggi.

63
Gambar 32. Pewarnaan imunohistokimia dengan antibodi CD31 untuk menghitung jumlah
vaskularisasi tikus yang tidak diligasi pada rendaman air biasa (gambar kolom kiri) dan air
CO2 (gambar kolom kanan)

64
5.4 Analisis Pengaruh Air Biasa Versus Air CO2 Kadar Tinggi pada Tikus yang Diligasi

(Kelompok 3 dan 4)

Tabel 8. Analisis Pengaruh Air Biasa Versus Air CO2 Kadar Tinggi pada Tikus yang Diligasi
(Kelompok 3 dan 4)
PARAMETER AIR BIASA AIR CO2 KADAR TINGGI NILAI P
Perubahan SGOT 32±23 88±37 0.033
Perubahan LDH 26±13 110±102 0.142
Jumlah Vaskularisasi 97±22 205±62 0.013
Skor Histologi 2.5±0.6 0.6±0.9 0.022

Tabel 8 menunjukkan uji analitik pada tikus yang diligasi. Terdapat perbedaan

bermakna terhadap perubahan SGOT pada tikus yang diligasi antara yang direndam air biasa

dengan air CO2 (32±23 IU/l pada air biasa versus 88±37 IU/l pada air CO2, nilai p=0.033).

Pada tikus yang direndam air biasa, rerata jumlah vaskularisasi adalah 97±22, sedangkan pada

tikus yang direndam air CO2 adalah 205±62, dimana perbedaan ini bermakna secara statistik

(nilai p=0.013). Terdapat pula perbedaan bermakna pada skor histologi tikus yang diligasi

antara yang direndam dalam air biasa dengan air CO2 (2.5±0.6 pada air biasa versus 0.6±0.9

pada air CO2, dengan nilai p=0.022). Sedangkan perubahan kadar LDH pada tikus yang diligasi

antara yang direndam air biasa dengan yang direndam air CO 2 kadar tinggi tidak bermakna

secara statistik (26±13 IU/l versus 110±102 IU/l, nilai p 0.142).

Sebagai kesimpulan, terdapat perbedaan bermakna terhadap perubahan kadar SGOT,

jumlah vaskularisasi dan skor histologi pada tikus yang diligasi antara yang direndam air biasa

dengan yang direndam air CO2 kadar tinggi, namun tidak bermakna terhadap perubahan kadar

LDH. Analisis korelasi Spearman’s antara skor histologi dengan jenis air perendaman yang

digunakan menghasilkan nilai koefisien korelasi 0.810 yang menunjukkan bahwa terdapat

korelasi kuat antara jenis air dengan skor histologi, dengan nilai r 0.810.

65
Gambar 33. Pewarnaan imunohistokimia dengan antibodi CD31 untuk menghitung jumlah
vaskularisasi tikus yang diligasi pada rendaman air biasa (gambar kolom kiri) dan air CO 2
(gambar kolom kanan)

66
 Gambar 34. Pewarnaan HE untuk menilai derajat kerusakan otot menggunakan skor
histologi pada tikus yang diligasi dalam rendaman air biasa (gambar kolom kiri) dan air CO2
(gambar kolom kanan)

67
 BAB VI

PEMBAHASAN

ALI merupakan suatu kondisi kegawatdaruratan di bidang vaskular. Sebanyak 10-16%

penyakit vaskular di seluruh dunia disebabkan karena ALI (Purushottam et al., 2014).

Meskipun ALI memiliki prognosis yang buruk, akan tetapi hingga saat ini penelitian mengenai

ALI masih sangat sedikit, baik dengan menggunakan hewan coba maupun pada manusia.

Mayoritas penelitian yang dilakukan adalah pada PAD dan CLTI, sedangkan studi mengenai

ALI sendiri masih terpusat pada epidemiologi dengan data-data yang sangat terbatas, yaitu

berupa perkiraan insidensi berdasarkan registri rumah sakit, trial-trial intervensi, dan temuan

autopsi (Howard et al., 2015).

Meskipun telah banyak dicapai kemajuan dari segi pengobatan pada berbagai penyakit

vaskular, baik berupa intervensi bedah/non-bedah maupun medikamentosa, akan tetapi hingga

saat ini belum ada satupun terapi yang dianggap memuaskan (Dhalla dan Elimban, 2017).

Morbiditas dan mortalitas ALI masih tergolong tinggi bila dibandingkan dengan penyakit

vaskular lainnya. Oleh karena itu, sangat penting dikembangkan strategi baru untuk

mengurangi angka kematian serta meningkatkan kualitas hidup pasien yang menderita penyakit

arteri perifer, khususnya ALI (Xu et al., 2017).

Telah banyak penelitian klinis dan eksperimental yang menunjukkan manfaat terapi

CO2 pada penyakit arteri perifer, yaitu dapat meningkatkan aliran darah pada bagian tubuh

yang mengalami iskemik (Ito et al., 1989; Hartmann et al., 1997, 2009; Nisihimura et al., 2002;

Toriyama et al., 2002; Schmidt, 2009; Oe et al., 2011; Sakai et al., 2011; Ogoh et al., 2016;

Dhalla et al., 2017; Xu et al., 2017). Akan tetapi, seluruh penelitian tersebut dilakukan pada

kondisi penyakit arteri perifer kronis (PAD dan CLTI), baik pada hewan coba dengan

menggunakan metode HLI untuk induksi iskemik, maupun pada manusia. Akan tetapi, masih

68
diperlukan penelitian yang lebih ekstensif lagi untuk memahami mekanisme CO2 dalam

meningkatkan aliran darah pada otot skeletal yang mengalami iskemik.

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah peningkatan aliran darah pada

tungkai yang mengalami iskemik sebagai efek dari terapi CO2 ini berhubungan dengan proses

angiogenesis yang dapat pula membantu proses penyembuhan luka (manfaat kuratif).

Mengingat belum pernah ada penelitian terdahulu yang meneliti efek terapi CO 2 pada penyakit

arteri perifer akut (ALI), maka untuk pertama kalinya, pada penelitian ini digunakan hewan

coba tikus yang dibuat ALI dengan metode HLI. Di samping itu, penelitian ini juga ingin

mengetahui apakah ada manfaat dari terapi CO2 pada tungkai yang sehat (manfaat preventif).

Efek terapi CO2 tersebut diukur dengan menggunakan parameter perubahan kadar SGOT dan

LDH yang merupakan marker kerusakan otot dan jaringan, serta pemeriksaan histopatologi

untuk melihat proses angiogenesis yang dilihat dari jumlah vaskularisasi yang terbentuk dan

perubahan struktur jaringan secara mikroskopis yang dinilai dengan skor histologi setelah

dilakukan perendaman dengan air CO2 kadar tinggi. Air biasa digunakan sebagai kontrol pada

penelitian ini.

SGOT merupakan enzim transaminase yang banyak ditemukan dalam hepar dan otot

skelet, sehingga bila terjadi kerusakan pada organ-organ tersebut, kadarnya akan meningkat.

Pada keadaan normal, terjadi kesetimbangan antara proses kematian dengan regenerasi sel,

sehingga didapatkan rentang kadar SGOT normal (Washington dan Goosier, 2012). Sama

seperti SGOT, LDH juga dapat digunakan sebagai parameter kerusakan jaringan, terutama otot

skelet, dimana kadarnya akan meningkat bila terjadi kerusakan pada jaringan tersebut. LDH

merupakan senyawa protein yang normal ditemukan dalam jumlah kecil dalam tubuh. Pada

kelompok tikus yang tidak diligasi, setelah 2 minggu dilakukan perendaman dalam air biasa

(kelompok 1) dan dalam air CO2 kadar tinggi (kelompok 2), tidak didapatkan perbedaan yang

bermakna antara air biasa dengan CO2 terhadap perubahan kadar SGOT (p=0.76) dan LDH

69
(p=0.131). Hal ini dikarenakan tidak adanya kerusakan jaringan yang menyebabkan

peningkatan kadar SGOT dan LDH. Brancaccio, dkk mengatakan bahwa individu tanpa

kondisi patologis jarang didapatkan kadar SGOT yang meningkat (Brancaccio et al., 2010).

Pada kelompok tikus yang tidak diligasi, jumlah vaskularisasi didapatkan lebih banyak

pada tikus yang direndam dalam air CO2 kadar tinggi dibandingkan dengan yang direndam

dalam air biasa, akan tetapi perbedaan jumlah vaskularisasi tersebut tidak bermakna secara

statistik (p=0.109). Hal ini menunjukkan bahwa angiogenesis yang terbentuk akibat

peningkatan aliran darah sebagai efek perendaman dalam air CO2 kadar tinggi tidak memiliki

manfaat pada kondisi non-patologis untuk mencegah terjadinya penyakit arteri perifer (tidak

bermanfaat sebagai terapi preventif).

Pada kelompok tikus yang diligasi (kelompok 3 dan 4), terjadi kerusakan jaringan,

khususnya otot skelet dan pembuluh darah, sehingga ditemukan kadar SGOT dan LDH yang

meningkat. Waktu paruh yang dimiliki baik SGOT maupun LDH adalah ± 48 jam, sehingga

pengambilan sampel darah tikus dilakukan pada 48 jam paska ligasi. Kadar SGOT menurun

secara signifikan (p=0.033) pada kelompok tikus yang diligasi yang direndam dalam air CO2

kadar tinggi. Hal ini menandakan bahwa rendaman air CO 2 kadar tinggi membantu proses

penyembuhan/regenerasi jaringan yang mengalami kerusakan.

Perbedaan signifikan juga ditemukan pada jumlah vaskularisasi (p=0.013), dan skor

histologi (p=0.022) pada kelompok tikus yang diligasi, dimana kelompok tikus yang direndam

dalam air CO2 kadar tinggi memiliki jumlah vaskularisasi yang lebih banyak dan skor histologi

yang lebih baik bila dibandingkan dengan kelompok tikus yang direndam dalam air biasa. Hal

ini membuktikan bahwa air rendaman yang mengandung CO2 kadar tinggi dapat meningkatkan

angiogenesis dan membantu proses penyembuhan jaringan yang mengalami kerusakan. Hasil

serupa didapatkan pula oleh Xu, dkk pada tahun 2017. Xu, dkk melakukan penelitian yang

hampir mirip dengan penelitian ini. Yang membedakan adalah tikus diligasi hanya pada bagian

70
proksimal arteri femoralis. Dua minggu setelah ligasi (setting kronis), tikus kemudian

direndam dalam air biasa (kontrol) versus air CO2 dengan suhu 37oC selama 20 menit setiap

hari (5 hari dalam seminggu) selama 4 minggu. Pada temuan histologis dengan pewarnaan HE

didapatkan angiogenesis yang lebih banyak pada grup yang direndam CO2, sedangkan pada

grup kontrol, tidak ditemukan angiogenesis yang bermakna. Angiogenesis yang diinduksi oleh

CO2 ini menyebabkan aliran darah meningkat, terjadi vasodilatasi, dan mengurangi stress

oksidatif yang pada akhirnya akan membantu proses penyembuhan pada penyakit arteri perifer

(Xu et al., 2017). Irie dkk mengatakan angiogenesis yang terbentuk pada ekstremitas yang

mengalami iskemik disebabkan oleh peningkatan kadar NO oleh air rendaman CO2 kadar

tinggi yang diinduksi oleh HIF (Irie et al., 2005).

Senada dengan kelompok tikus yang tidak diligasi, perubahan kadar LDH pada

kelompok tikus yang diligasi juga didapatkan hasil yang tidak bermakna secara statistik

(p=0.142). Hal ini dapat terjadi karena kadar LDH sangat dipengaruhi oleh kondisi fisiologis,

psikologis, serta stress. Terdapat suatu penelitian yang dilakukan oleh Rahimiyan, dkk

mengenai efek kegaduhan terhadap kadar LDH pada tikus jantan. Dari hasil penelitian tersebut

didapatkan bahwa kegaduhan akan mengaktivasi sistem saraf simpatis dan endokrin,

memberikan efek negatif pada sekresi gaster, hipotalamus dan stimulasi kelenjar adrenal,

mensupresi respon imun dan sistem kardiovaskular, serta meningkatkan hormon stress

(katekolamin dan glukokortikoid) yang pada akhirnya menyebabkan peningkatan kadar LDH

(Rahimiyan et al., 2014). Pada penelitian ini, ligasi arteri femoralis yang berdampak pada

kerusakan jaringan serta rasa sakit yang ditimbulkan akibat perlakuan tersebut secara otomatis

akan mengganggu kondisi fisiologis, psikologis, serta menimbulkan stress pada tikus yang

diligasi, sehingga didapatkan hasil yang tidak signifikan terhadap penurunan kadar LDH antara

tikus yang direndam air biasa dengan yang direndam air CO2 kadar tinggi.

71
 BAB VII

KESIMPULAN DAN SARAN

7.1 Kesimpulan

 Rendaman air CO2 kadar tinggi dapat membantu proses penyembuhan pada kondisi ALI,

yaitu dengan merangsang proses angiogenesis dan membantu memperbaiki kerusakan

jaringan (bermanfaat sebagai kuratif).

 Rendaman air CO2 kadar tinggi tidak memiliki efek pada ekstremitas yang sehat sehingga

tidak bermanfaat untuk mencegah penyakit arteri perifer, khususnya ALI (tidak bermanfaat

sebagai preventif).

 Rendaman air CO2 kadar tinggi dapat dipertimbangkan sebagai terapi penyerta pada

kondisi ALI sehingga diharapkan kualitas hidup penderita ALI dapat ditingkatkan dan

mortalitas akibat ALI dapat diturunkan.

7.2 Saran

 Untuk membuktikan rendaman air CO2 kadar tinggi tidak memiliki manfaat preventif,

diperlukan waktu penelitian yang lebih lama dan jumlah sampel yang lebih banyak.

 Perlu dilakukan penelitian mengenai efek rendaman air CO2 kadar tinggi pada manusia

dalam kondisi ALI.

72
 DAFTAR PUSTAKA

1. Aboyans V, Ricco JB, Bartelink ML, et al. 2017 ESC Guidelines on the Diagnosis and

Treatment of Peripheral Arterial Diseases, in collaboration with the European Society for

Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 2017. 00:1–60 ESC GUIDELINES.

doi:10.1093/eurheartj/ehx095

2. Acar R.D., Sahin M., Kirma C. One of the most urgent vascular circumstances: Acute limb

ischemia. Sage Open Med. 2013, 1, 1–11.

3. Aratel Group. CARBOTHERA – ARATEL GROUP. Carbothera: 2012.

4. Arifin, W. and W. Z. 2017. Sample Size Calculation in Animal Studies Using Resource

Equation Approach. 24(5), 101–105.

5. Ascher E. Haimoviciʼs Vascular Surgery, 5th ed. 2014. Oxford: Blackwell.

6. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. (BPPK). Hewan Coba. 2008;Pp 1–81.

7. Barnett S.A. 2002. The Story of Rats: Their Impact on Us, and Our Impact on Them. Allen

& Unwin: St Leonards NSW, Australia

8. Bauer. C, G. Gros, H. Bartels. Biophysics and physiology of carbon dioxide. 1980.

Springer, Heidelberg-New York.

9. Bedu M, Cheynel J, Gascard J, et al. Transcutaneous CO2 diffusion comparison between

CO2 spa water and dry gas in Royal thermal spa. In: Advances n Vascular Pathology,

edited by Strano A, and Novo S. Elsevier Science Publishers B. V. (Biomedical Division);

1989:1109-1113.

10. Berend K, de Vries AP, Gans RO. Physiological approach to assessment of acid-base

disturbances. N. Engl. J. Med. 2015 Jan 08;372(2):195.

73
11. Bitto A, Polito F, Altavilla D, et al. 2008. Polydeoxyribonucleotide (PDRN) restores blood

flow in an experimental model of peripheral artery occlusive disease. Journal of Vascular

Surgery. P:1295.

12. Boyd-Kranis R, Sullivan KL, Eschelman DJ, et al. Accuracy and safety of carbon dioxide

inferior vena cavography. J Vasc Interv Radiol. Oct 1999. 10(9):1183-9.

13. Brancaccio P, Lippi G, Maffulli N. Biochemical markers of muscular damage. Clin Chem

Lab Med 2010; 48(6): 757–767. doi 10.1515/cclm.2010.179.

14. Brenes R.A, Jadlowiec C.C, Bear M, et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia

to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. December 2012. P:1677.

15. Carr P, Graves JE, Poston L. Carbon dioxide induced vasorelaxation in rat mesenteric

small arteries precontracted with noradrenaline is endothelium dependent and mediated

by nitric oxide. Pflügers Archiv : European journal of physiology. 1993. 423(3-4):343-345.

16. Charles River Laboratories: Baseline Hematology and Clinical Chemistry Values for

Charles River Fischer344 Rats‐CDF® (F344)CrIBR as a Function of Sex and Age. 1984.

http://www.criver.com/files/pdfs/rms/f344/rm_td_baselinehematologyf344ratw.asp

17. Chavez L. O., Leon M, Einav S., et al. Beyond muscle destruction: a systematic review of

rhabdomyolysis for clinical practice. Critical Care. 2016; 20:135. doi: 10.1186/s13054-

016-1314-5.

18. Cherniack, Neil S., and G. S. Longobardo. Oxygen and carbon dioxide gas stores of the

body. Physiol Rev 50.2. 1970: 196-243.

19. Cho, K. J. Carbon Dioxide Angiography : Scientific Principles and Practice. 2015;31(3).

20. Creager, M.A, Kaufman, J.A., Conte, M.S. Clinical practice. Acute Limb Ischemia. N. Engl.

J. Med. 2012:366, 2198–2206.

74
21. Dhalla, N.S. dan Elimban, V. CO2 water bath therapy promotes blood flow and

angiogenesis in diabetes with peripheral ischemia. In Program of the 9th International

Conference of the International Academy of Cardiovascular Sciences. Delhi. 2017:33.

doi: 10.1161/circulationaha.115.016424.

22. Dragneva G, Korpisalo P, Ylä-Herttuala S. Promoting blood vessel growth in ischemic

diseases: challenges in translating preclinical potential into clinical success. Disease

Models & Mechanisms 6. 2013: 312-322 doi:10.1242/dmm.010413

23. Flück K and Fandrey J. Oxygen sensing in intestinal mucosal inflammation. Pflugers Arch

European Journal Physiology 468: 77-84, 2016.

24. Forster, R. E., and N. Itada. Carbonic anhydrase activity in intact red cells as measured by

means of 18O exchange between CO2 and water. Biophysics and Physiology of Carbon

Dioxide. Springer Berlin Heidelberg, 1980. 177-183.

25. Fukuda I., Chiyoya M., Taniquchi, S., et al. Acute limb ischemia: Contemporary approach.

Gen. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2015, 63, 540–548.

26. Gao L, Chen Q, Zhou X, et al. The role of hypoxia-inducible factor 1 in atherosclerosis.

Journal of Clinical Pathology 65: 872, 2012.

27. Geers, Cornelia, and Gerolf Gros. Carbon dioxide transport and carbonic anhydrase in

blood and muscle. Physiological Reviews 80.2. 2000: 681-715.

28. Goldstein J. A., Mishkel G. Choosing the correct therapeutic option for acute limb

ischemia. Interv. Cardiol. 2011; 3(3), 381–389.

29. Hartmann B, Pittler M, Drews B. 2009. CO2 Balneotherapy for arterial occlusion diseases:

Physiology and Clinical Practise.

30. Hartmann BR, Bassenge E, Pittler M. Effect of carbon dioxide-enriched water and fresh

water on the cutaneous microcirculation and oxygen tension in the skin of the foot.

Angiology. 1997; 48:337–343.

75
31. Hasyar, ARB, Muchlis, NY, Dwitama Y, et al. Direct Effects of Carbon Dioxide-rich Water

Bathing on Peripheral Blood Flow. Mal J Med Health Sci 16(SUPP14): 23-28, Dec 2020.

32. Hawkins IF. Carbon dioxide digital subtraction arteriography. AJR Am J Roentgenol. Jul

1982. 139(1):19-24.

33. Hess C. N, Huang Z, Patel M. R, et al. Acute Limb Ischemia in Peripheral Artery Disease:

Insights From EUCLID. Circulation 2019; 140:556–565. doi:

10.1161/circulationaha.119.039773

34. Hidayah, R. 2008. Pengaruh lama pemberian ekstrak daun sambiloto.

35. Howard Dominic P.J, Banerjee A, Fairhead Jack F, et al. Population-Based Study of

Incidence, Risk Factors, Outcome, and Prognosis of Ischemic Peripheral Arterial Events

Implications for Prevention. Circulation. 2015;132:1805-1815.

36. Hsia CC. Respiratory function of hemoglobin. N. Engl. J. Med. 1998;338(4):239-47.

37. Hudlicka O, Wright AJ, Ziada AM. Angiogenesis in the heart and skeletal muscle. Can J

Cardiol. 1984. 2:120-123.

38. Irie H, Tatsumi T, Takamiya M, Zen K, et al. Carbon Dioxide-Rich Water Bathing

Enhances Collateral Blood Flow in Ischemic Hindlimb Via Mobilization of Endothelial

Progenitor Cells and Activation of NO-cGMP System. Circulation. 2005;111(12):1523–9.

39. Ito T, Moore JI, Koss MC. Topical application of CO2 increases skin blood flow. J Invest

Dermatol. 1989; 93:259–262.

40. Jakobsen M, Bertelsen G. Solubility of carbon dioxide in fat and muscle tissue. Journal of

Muscle Foods. 2006;17(1):9-19.

41. Jensen FB. Red blood cell pH, the Bohr effect, and other oxygenation-linked phenomena in

blood O2 and CO2 transport. Acta Physiol. Scand. 2004 Nov;182(3):215-27.

42. JesC. 2013. Bicarbonated.pdf.

76
43. Keogh CE, Scholz CC, Rodriguez J, et al. Carbon dioxide-dependent regulation of NF-

kappaB family members RelB and p100 gives molecular insight into CO2-dependent

immune regulation. The Journal of Biological Chemistry 292: 11561-11571, 2017.

44. Kihara, T. et al. 2002. Repeated Sauna Treatment Improves Vascular Endothelial and

Cardiac Function in Patients With Chronic Heart Failure. Journal of the American College

of Cardiology. Elsevier Masson SAS, 39(5), pp. 754–759. doi: 10.1016/S0735-

1097(01)01824-1.

45. Krishna S. M, Omer S. M, and Golledge J. 2016. Evaluation of the clinical relevance and

limitations of current pre-clinical models of peripheral artery disease. Department of

Vascular and Endovascular Surgery, The Townsville Hospital, Townsville, Queensland

4811, Australia.

46. Krishna S. M, omer S. M, Li J, et al. Development of a two-stage limb ischemia model to

better simulate human peripheral artery disease. Scientific Reports. 2020; 10:3449

https://doi.org/10.1038/s41598-020-60352-4

47. Kusmeirczyk J, Kling M, Kier A. B, et al. Rats and mice: Exotic Animal Laboratory

Diagnosis, First Edition. Ed. Heatley J dan Russell K. E. John Wiley & Sons, Inc: 2020.

48. Kyung J. Cho, Irvin F, Hawkins. Carbon dioxide angiography. Informa healthcare; 2007.

49. Loeb, W.F dan Quimby, F.W. The Clinical Chemistry of Laboratory Animals, 2e, 1–49.

Taylor & Francis: 1999.

50. Loerting, Thomas, and Juergen Bernard. Aqueous carbonic acid (H2CO3). ChemPhysChem

11.11. 2010: 2305-2309.

51. Naylor, L. H., H. Carter, M. G. FitzSimons, et al. 2011. Repeated increases in blood flow,

independent of exercise, enhance conduit artery vasodilator function in humans. Am. J.

Physiol. Heart Circ. Physiol. 300:H664–H669.

77
52. Niiyama H, Huang N. F, Rollins M. D, et al. Murine Model of Hindlimb Ischemia. Journal

of Visualized Experiments. 2009, 23, e1035.

53. Nishimura, N., J. Sugenoya, T. Matsumoto, et al. 2002. Effects of repeated carbon dioxide-

rich water bathing on core temperature, cutaneous blood flow and thermal sensation. Eur.

J. Appl. Physiol. 87:337–342.

54. Norgren, L, Hiatt, W.R, Dormandy, J.A, et al. Inter-society consensus for the management

of peripheral arterial disease (TASC II). J. Vasc. Surg. 2007, 45, S5–S67.

55. Obara H, Matsubara K, Kitagawa Y. Acute Limb Ischaemia. Ann Vasc Dis Vol. 11, No. 4;

2018; pp 443 –448. doi: 10.3400/avd.ra.18-00074.

56. Oe K, Ueha T, Sakai Y, et al. The effect of transcutaneous application of carbon dioxide

(CO2) on skeletal muscle. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2011.

407(1):148-152.

57. Ogoh, S. et al. 2016. Acute vascular effects of carbonated warm water lower leg immersion

in healthy young adults, 4, pp. 1–11. doi: 10.14814/phy2.13046.

58. Olinic DM, Stanek A, Tataru DA, et al. Acute Limb Ischemia: An Update on Diagnosis and

Management. J. Clin. Med. 2019. 8, 1215. doi:10.3390/jcm8081215.

59. Purushottam B, Gujja K, Zalewski A, et al. Acute limb ischemia. Intervent Cardiol Clin 3

2014; 557–572. doi: 10.1016/j.iccl.2014.07.004.

60. Rahimiyan E, Ahmadi R, dan Gohari A. The Effects of Traffic Noise on Serum Levels of

LDH in Male Rats. International Conference on Earth, Environment and Life sciences

(EELS-2014). Dubai (UEA): 2014;13-17. http://dx.doi.org/10.15242/IICBE.C1214108

61. Ram BL, George RK. Nontraumatic Acute Limb Ischemia – Presentation, Evaluation, and

Management. Indian Journal of Vascular and Endovascular Surgery. Volume 4. Issue 4.

October-December 2017.

62. Rittner D, Bailey RA. 2005. Encyclopedia of Chemistry. Facts on File: AS.

78
63. Rutherford RB, Baker JD, Ernst C, et al. Recommended standards for reports dealing with

lower extremity ischemia: revised version. J Vasc Surg 1997;26:517-38. Erratum, J Vasc

Surg 2001;33:805.

64. Sakai Y, Miwa M, Oe K, et al. A novel system for transcutaneous application of carbon

dioxide causing an "artificial bohr effect" in the human body. PloS one. 2011. 6(9):e24137.

65. Savin E, Balliart O, Bonnin P, et al. Vasomotor effects of transcutaneous CO2 in stage II

peripheral occlusive arterial disease. Angiology. 1995;46:785–791.

66. Schmidt KL. Carbon dioxide bath (Carbon dioxide spring). Center for Clinical Research

in Rheumatology, Physical Medicine and Balneotherapy; Bad Nauheim, 2009: Germany.

67. Selfridge AC, Cavadas MAS, Scholz CC, et al. Hypercapnia Suppresses the HIF-

dependent Adaptive Response to Hypoxia. The Journal of Biological Chemistry 291:

11800-11808, 2016.

68. Shaw LA, Messer AC, Weiss S. Cutaneous respiration in manned : I. factors affecting the

rate of carbon dioxide elimination and oxygen absorption. American Journal of Physiology

Legacy Content. 1992;90(1):107-118.

69. Simon F, Oberhuber A, Floros N, et al. Acute Limb Ischemia—Much More Than Just a

Lack of Oxygen. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 374. doi:10.3390/ijms19020374

70. Sobieszczyk PS. Acute arterial occlusion. In: Creager MA, Beckman JA, Loscalzo J,

editors. Vascular medicine: A companion to Braunwald’s heart disease. 2nd edition.

Philadelphia: Elsevier Saunders; 2013. p. 557–71.

71. Sutton I. Solubility of O2, N2, H2 and CO2 in water. In: Process risk and reliability

management. 2nd Edition ed. Elsevier; 2015:209-239.

72. Taylor FC, Smith DC, Watkins GE, et al. Cardiovasc and Intervent Radiol. 1998. 22:150-

151.

79
73. Toriyama T, Kumada Y, Matsubara T, et al. Effect of artificial carbon dioxide foot bathing

on critical limb ischemia (Fontaine IV) in peripheral arterial disease patients. International

angiology : a journal of the International Union of Angiology. 2002.21: 367.

74. Tune JD, Richmond KN, Gorman MW, et al. Control of coronary blood flow during

exercise. Exp Biol Med. Maywood. 2002. 227(4):238-250.

75. Wang, H. et al. 2016. Stable solid and aqueous H2CO3 from CO2 and H2O at high pressure

and high temperature. Nature Publishing Group. January. pp. 2–9. doi: 10.1038/srep19902.

76. Washington I. M dan Goosier G. Clinical Biochemistry and Hematology. Dalam: The

Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents. Elsevier. 2012. P:63.

77. Xu Y, Elimban V dan Dhalla NS. Carbon Dioxide Water-bath Treatment Augments

Peripheral Blood Flow through the Development of Angiogenesis. Can J Physiol

Pharmacol. 2017.

80
 LAMPIRAN

Lampiran 1. Persetujuan Etik

81
Lampiran 2. Dokumentasi

82