L’Accréditation en

Immuno-Hématologie

Nouvelles exigences réglementaires

et expérience du CNRHP

Dr Agnès Mailloux,
Responsable médical - UF de biologie du CNRHP
Centre National de Référence en Hémobiologie Périnatale
Pôle de Biologie-Imagerie
Hôpital Saint-Antoine – AP-HP - Paris
 3 TEXTES CLES
Aujourd’hui

L'ordonnance du 13 janvier 2010 relative à la biologie

médicale (application partielle)
Arrêté de 2002 fixant les conditions de réalisation
des examens de biologie médicale d’Immuno-
hématologie érythrocytaire

GBEA v3
 4 TEXTES CLES
Dès 2011
L'ordonnance du 13 janvier 2010 relative à la biologie
médicale

Projet d’arrêté fixant les conditions de réalisation des

examens de biologie médicale d’Immuno-
hématologie érythrocytaire

NABM : Projet de révision du sous-chapitre 5-03 Immuno-

hématologie

La norme NF EN ISO 15189

 ARRETE du ……….
fixant les conditions de réalisation
des examens de biologie médicale d’immuno-hématologie érythrocytaire

Le phénotypage érythrocytaire comporte une détermination réalisée sur un

échantillon biologique unique.
Le phénotypage érythrocytaire standard comprend le phénotypage ABO-RH1 et RH-
KEL1.
Le phénotypage érythrocytaire réduit comprend le phénotypage ABO-RH1.
Questionnements concernant la sécurité de l’identité du patient

« les résultats sont indiqués en nomenclature internationale par les dispositifs

médicaux de diagnostic in vitro et sur les compte-rendus d’examens de biologie médicale.
Sur ces derniers, ils sont accompagnés d’une éventuelle correspondance en nomenclature
usuelle entre parenthèses.
Exemple RH:1,2,3,4,5 = DCEce

Concernant les anticorps anti-érythrocytaires, une reprise des antécédents connus du

laboratoire est effectuée sur tous les comptes-rendus de résultats. »
« Pour la réalisation des examens de biologie médicale d’immuno-hématologie
érythrocytaire, les laboratoires de biologie médicale se conforment aux exigences
techniques de l’annexe I »

ANNEXE I

Cet arrêté concerne les examens de biologie médicale d’immuno-hématologie

érythrocytaire. Les examens sont :
- le phénotypage ABO-RH1 (D) et RH-KEL1 (Rh-K) ;
- le phénotypage érythrocytaire autre que ABO-RH1 et RH- KEL1 ;
- le dépistage et l’identification d'anticorps anti-érythrocytaires (RAI) ;
- l'épreuve de compatibilité au laboratoire ;
- le titrage d'anticorps anti-érythrocytaires ;
- le test direct à l’antiglobuline.

Même plan suivi pour chaque examen

a) Définition
b) Modalités de mise en œuvre
Principe
Techniques
Contrôles internes de qualité (CIQ)
Validation et interprétation des résultats
 (1) MISE EN EVIDENCE DE L’ANTIGENE RH1

« Le phénotypage RH1 comporte obligatoirement l'utilisation d'un réactif anti-RH1

d'origine monoclonale, et du réactif témoin dépourvu de toute activité anticorps mais
dont la capacité d'agglutination d'hématies sensibilisées est strictement identique à celle
du réactif anti-RH1. Ce réactif ne doit pas reconnaître l’antigène partiel DVI. Il n’y a
pas lieu de rechercher la présence d’un phénotype RH:1 faible (D faible) chez les
sujets RH:-1 (D-). »

Techniques (par ordre croissant de sensibilité) Reconnaissance des RH1 positifs

Plaque - 95 %
Tube + 98 %
Techniques directes 99 %
microplaque ++
Gel avec réactif inclus +++ 99,8 %
Test à anti-globuline (tube ou gel) ++++ 99.9 %
Test de fixation-élution +++++ 100 %

Le recours au test à l’anti-globuline pour la recherche de RH1

faible est devenu moins pertinente
 (2) MODIFICATION DU SEUIL DE SENSIBILITE DES
TECHNIQUES DE DEPISTAGE ET D’IDENTIFICATION
DES AGGLUTININES IRREGULIERES

« Pour les étapes de dépistage et d’identification, la technique repose

sur la mise en œuvre d'un test indirect à l'antiglobuline polyspécifique
ou anti-IgG, permettant de détecter, sur support type colonne-filtration
ou d'autres techniques de sensibilité au moins égale, un anti-RH1
humain de concentration égale à 10 ng/ml. »
SEUIL DE SENSIBILITE DES DIFFERENTES TECHNIQUES

½ VIE 3 SEMAINES DIMINUTION DE MOITIE TOUTES LES 3 SEMAINES

350
45 ng/ml Seuil de
300 sensibilité exigé Seuil de sensibilité de la
par GBEA 2002 technique gel
250 Coombs indirect, Seuil de
hématies non traitées sensibilité de la
200 technique gel,
22 ng/ml
Coombs indirect
150 Seuil de sensibilité avec hématies
11 ng/ml de la technique traitées par
100 immunocapture protéases
6 ng/ml
50 3 ng/ml
NOUVEAU SEUIL
1,5 ng/ml
0
28 30 32 34 36 38 40 42

Terme SA Concentration en anti-RH1 détecté

 (3) LE TITRAGE DES ANTICORPS

2.3- Titrage d’anticorps anti-érythrocytaires autres que ABO

La technique de référence est le test indirect à l’antiglobuline en tube, en utilisant
des hématies natives en solution saline 0.15M. Toute autre technique équivalente
peut être utilisée moyennant une validation documentée par le laboratoire de
biologie médicale.

Validation et interprétation des résultats

La validation repose sur les résultats du CIQ, les résultats comparatifs entre les
échantillons n et n-1 du patient et les résultats de l’antériorité. Le titre et la
spécificité des anticorps anti-érythrocytaires identifiés peuvent justifier la
réalisation d’un dosage pondéral ou d’un microtitrage contre un standard
approprié pour distinguer un anti-RH1 d’allo-immunisation d’un anti-RH1
passif lors d’un suivi périnatal.

D’un point de vue technique disparition de la constitution d’un pool

de 3 hématies
 EXEMPLE

Mme X RH1 négatif, 3ème grossesse

Une grossesse 14 ans auparavant, et une
fausse couche
• 7 SA: RAI négatives mais métrorragies ⇒ injection Rhophylac®
200

• 11 SA: métrorragies
– ⇒ RAI +injection N°2 de Rhophylac® 200
– ⇒ RAI positives ⇒ CNRHP: identification anti-RH1 et
microtitrage :6-12ng/ml; µtitrage compatible avec l’injection à
7 SA

• 13 SA et 18 SA: RAI positives ⇒ EFS X: anti-RH1 « résiduel »

• 25 SA: RAI positives ⇒ Laboratoire centralisateur: anti-RH1

identifié de titre <1 : « anti-RH1 passif résiduel »
• 32 SA: Consultation à la maternité pour
« Cholestase gravidique »
– Anomalies du RCF sur J1
– Anasarque sur J1 avec accélération des
vitesses cérébrales
⇒ Extraction en urgence

• Deux jumelles anémiques et ictèriques

avec mauvaise adaptation et détresse
respiratoire
– J1→ Hb:2,9g/dl et bili:100µmoles/l ⇒
TNN+EST
– J2 → Hb:7,9g/dl et bili:120 µmoles/l ⇒
EST
 ECHEC DE LA PRISE EN CHARGE D’UNE FEMME
ENCEINTE IMMUNISEE

Obstétricien n’avait aucun moyen de mettre en doute le résultat

donné par le laboratoire, pas de connaissance sur :
techniques à réaliser
sensibilité des techniques
transmission des examens à laboratoire de référence
ROLE DU BIOLOGISTE EST ESSENTIEL

RAI positive dans un contexte d’injection d’IgRHD

Erreur d’interprétation : anti-RH1 faussement étiqueté comme
passif résiduel
Seul le dosage des anti-RH1 permet de se prononcer
INTERET DU MICROTITRAGE
 TECHNIQUE DE MICROTITRAGE
Technique simple d’hémagglutination en support gel

6 ng/ml 3 1.5 0.75 Pur 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

STANDARD PATIENT
Concentration approchée = 8 x 1.5= 12 ng/ml

Concentration de la
Inverse de la dernière
dilution du
Concentration en anti-RH1 = dilution réactive de X
standard avec la
l’échantillon
même intensité de
réaction
 INTERPRETATION DU MICROTITRAGE

Concentration en anti-RH1 comparée à la concentration théorique

½ VIE 3 SEMAINES DIMINUTION DE MOITIE TOUTES LES 3 SEMAINES

350
45 ng/ml
300

250 ANTI-RH1 TROUVE DANS LE SERUM

PASSIF et/ou ALLO-IMMUNISATION ?
200
22 ng/ml
150

100 11 ng/ml

50
6 ng/ml

3 ng/ml
0
28 30 32 34 36 38 40 42

Terme SA
(4) AUTORISATION DU SANG DE CORDON
POUR LA PREVENTION RH

« 3- Cas particulier du nouveau-né

Le phénotypage érythrocytaire chez un nouveau-né nécessite un prélèvement de sang
effectué chez l’enfant pour la réalisation d’examens à visée transfusionnelle. La
détermination du phénotype ABO fait appel uniquement à l’épreuve globulaire.
Les résultats du phénotype érythrocytaire ne sont valides que jusqu'à l'âge de six
mois. Ils doivent mentionner une date de validité correspondant à la date de
naissance + 6 mois.
Dans le cadre de la prophylaxie de l’allo-immunisation anti-RH1 chez la femme
accouchée RH :-1, la détermination du phénotype érythrocytaire du nouveau-né
peut être réalisée à partir d'un prélèvement de sang chez l’enfant ou effectué au
cordon. Afin de détecter un antigène de faible réactivité, le phénotypage RH1
doit être réalisé en technique colonne-filtration ou par une technique de
sensibilité au moins égale.
L’origine de l’échantillon biologique ayant servi à l’analyse figure systématiquement
sur le compte rendu de résultats. »
 Prélèvement de sang de cordon pour la prévention
Rhésus à l’accouchement

1- Avantage : évite de piquer l’enfant

2- Exclut phénotypage érythrocytaire en vue d’une transfusion

(prélèvement n’étant pas effectué chez le véritable receveur,
problème d’identification du prélèvement)

3- Conditions strictes de prélèvement doivent être

parfaitement définies :
-A l’aiguille
-Prélèvement directement au niveau de la veine ombilicale
-Avant expulsion du placenta

Si le prélèvement est réalisé dans des conditions

strictes : pas de risque de contamination
 (5) SIGNALEMENTS

« 4 Cas particulier de la sécurite transfusionnelle pour la femme enceinte

Afin d’anticiper les besoins transfusionnels et d’assurer la sécurité des transfusions en
contexte obstétrical, les résultats de la dernière RAI du suivi de grossesse (8ème ou 9ème
mois) doivent être adressés au site présumé de délivrance des produits sanguins
labiles. Leurs modalités de transmission sont définies conformément à l’organisation
transfusionnelle mise en place dans la maternité où la patiente est susceptible
d’accoucher. »

- Importance de mettre un commentaire avec le résultat

- d’informer la patiente surtout lorsqu’un anticorps différent du système Rh ou Kell est
identifié

Exemple de commentaire :
« POUR FACILITER LA SELECTION DU SANG EN CAS D'URGENCE
TRANSFUSIONNELLE, Merci de transmettre ce résultat au
Site EFS correspondant de la Maternité, avec la date prévisible d'accouchement »
 (6) INTERPRETATIONS, CONSEILS ET SIGNALEMENTS

« L’interprétation est réalisée grâce aux informations cliniques pertinentes

transmises par le prescripteur, relatives notamment aux antécédents
transfusionnels datant de moins de quatre mois »

« 5. conduite à tenir vis-a-vis d'une allo-immunisation anti-érythrocytaire,

d'un phenotype rare
5-1 Validation, interprétation et conseil
Afin de pouvoir répondre aux besoins des prescripteurs, le laboratoire de biologie
médicale définit des résultats « critiques » (notamment une allo-immunisation en
cours de grossesse, une allo-immunisation complexe, un phénotype rare…) qui
nécessitent un conseil adapté, une alerte rapide du clinicien et une information
systématique et sans délai du site de délivrance des produits sanguins.

5-2 Transmission des résultats de phénotype rare

Tout phénotype érythrocytaire rare (fréquence inférieure à 4/1000 dans la
population générale) fait l'objet d'une validation par le Centre National de
Référence pour les Groupes Sanguins (Institut National de la Transfusion
Sanguine - Paris) afin de le faire figurer dans le fichier national des sujets
présentant un phénotype érythrocytaire rare. »
 LES PHENOTYPES RARES :
BESOIN D’UN SIGNALEMENT
« En cas de besoin transfusionnel, les résultats de phénotypes rares RH:-1,2,-3,-4,5, RH:-
1,-2,3,4,-5, RH:1,2,3,-4,-5, RH:-1,2,3,-4,-5, RH:-1,2,3,-4,5, RH:-1,2,3,4,-5 et ceux
comportant l’absence d’antigènes antithétiques, sont transmis sans délai au site de
délivrance des produits sanguins labiles. »

Absence d’expression de plusieurs antigènes de prévalence équilibrée

(1-99%) dans un même système de groupe sanguin

RH:-1,2,-3,-4,5 D-C+E-c-e+ dCCee 4/10 000

RH:-1,-2,3,4,-5 D-C-E+c+e- dccEE 1/10 000

RH:1,2,3,-4,-5 D+C+E+c-e- DCCEE < 1/10 000

RH:-1,2,3,-4,-5 D-C+E+c-e- dCCEE < 1/10 000

RH:-1,2,3,-4,5 D-C+E+c-e+ dCCEe < 1/10 000

RH:-1,2,3,4,-5 D-C+E+c+e- dCcEE < 1/10 000

INTERPRETATIONS CONSEILS ET SIGNALEMENTS

1- Recueil des éléments cliniques pertinents,

Chez une femme enceinte :
- Date de grossesse
- Nombre de grossesse
- Injection d’IgRh avec la date et dose
- transfusion antérieure
- lieu de la maternité d’accouchement

2- Définir des valeurs critiques

- Les allo-anticorps devant être signalés au clinicien

3- Examens biologiques complémentaires à réaliser

-Titrage
- Dosage pondéral ou microtitrage
- Recours à un laboratoire expert
 ANTI-KELL
Dans anémie fœtale sévère

• Est toujours identifiable au 1er trimestre

• Piège : l’agglutination est parfois faible
• Faire d’emblée un titrage
• Son titre est d’emblée très élevé > ou = au
1/32
 Dépistage et surveillance
des incompatibilités foetomaternelles
au cours de la grossesse

RAI positive

Identification

Anti-D, anti-c, anti-E, Anti-Kell Anti-Fya, Fy-b, Anti-Jka, Anti-Lea, Anti-Leb,

Anti-Jkb, Anti-S, Anti-s, Anti-P1, Anti-H,
Anti-M, Anti-C Anti-HI, auto-
anticorps froid,
auto-papaïne
Risque d’anémie fœtale Risque de maladie
Pas de risque de
sévère in utéro hémolytique postnatale
maladie
hémolytique
1- Phénotyper procréateur 1- Phénotyper procréateur
Si phéno-incompatible : Si phéno-incompatible :
2- Génotypage fœtal 2- Titrage et dosage
3- Titrage et dosage pondéral pondéral à 3 et 8 mois Pas d’examen
toutes les 2 à 3 semaines complémentaire
 (7) TRANSFERT DES DONNEES IH

« 6. Sécurisation du transfert des résultats

Transmission des résultats aux services de délivrance des produits sanguins.
Afin d’éviter la saisie manuelle des résultats à partir de supports matérialisés,
les données immunohématologiques du receveur, doivent être transférées en
totalité et informatiquement, après validation, vers le site de délivrance de
l’Etablissement Français du Sang ou le dépôt de délivrance autorisé des
Etablissements de Santé. »

- Besoin d’une connexion bidirectionnelle (différente d’ERA)

- Besoin d’une base commune Nationale des données IH

 Projet d’arrêté fixant les conditions de réalisation des
examens de biologie médicale d’immuno-hématologie
érythrocytaire
Conclusions
DIFFERENCES AVEC L’ARRETE DU 26/04/2002
Disparition des champs d’application
Les indications se retrouvent dans la révision du sous-chapitre
5-03 Immuno-hématologie

Simplification de certains chapitres techniques

Prenant en compte l’évolution de la sensibilité des techniques

Met l’accent sur l’interprétation et le conseil

Conformément aux exigences de l’ordonnance du 13 janvier
2010
 CONCLUSIONS

• Actualisation réglementation
• Applicable dès la parution de l’arrêté
• Vérifié rarement par l’inspection
• Vérifié dans la plupart des cas par l’évaluateur
technique du COFRAC lors de la visite
d’accréditation du LBM
• Avis CNRHP :
– renforcement du lien clinico-biologique,
– prise en compte du statut spécifique «femme
enceinte »