INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL E RECURSOS NATURAIS Código de barras de DNA em espécies de Proechimys (Rodentia: Echimyidae) da Amazônia MARCO ANTÔNIO ALVES SCHETINO Manaus, Amazonas Maio, 2008 MARCO ANTÔNIO ALVES SCHETINO Código de barras de DNA em espécies de Proechimys (Rodentia: Echimyidae) da Amazônia ORIENTADOR: Jorge Ivan Rebelo Porto, Dr. CO-ORIENTADORA: Maria Nazareth Ferreira da Silva, Dra. Dissertação apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do convênio INPA/UFAM, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. Manaus, Amazonas Maio, 2008 Schetino, Marco Antônio Alves Código de barras de DNA em espécies de Proechimys (Rodentia: Echimyidae) da Amazônia / Marco Antônio Alves Schetino. --- Manaus: [s.n.]. 2008. xi, 81 f. : il. Dissertação (Mestrado) --- INPA/UFAM, Manaus, 2008 Orientador: Jorge Ivan Rebelo Porto Co-orientador: Maria Nazareth Ferreira da Silva Área de concentração Genética, Conservação e Biologia Evolutiva Sinopse: Com o intuito de auxiliar na taxonomia e sistemática dos roedores do gênero Proechimys, foram utilizados marcadores moleculares das regiões mitocondriais dos genes citocormo b e citocromo oxidase I em indivíduos provenientes de diversos pontos da amazônia. Os marcadores foram eficazes na identificação das espécies e as topologias de árvores filogenéticas geradas por máxima parcimônia e máxima verossimilhança foram analisadas. Palavras-chave: Amazônia; Roedores; Proechimys; taxonomia; Sistemática; coI; cit b. i Dedico esta dissertação aos meus pais Mário e Lilia e a meus familiares que tornaram esta jornada possível. ii “I look at the world and I notice it's turning. While my guitar gently weeps With every mistake we must surely be learning. Still my guitar gently weeps”. The Beatles iii Agradecimentos Ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e Universidade Federal do Amazonas (UFAM), curso de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. Ao Laboratório Temático de Biologia Molecular (LTBM) do INPA, Coordenação de Pesquisas (COPE), onde a maior parte deste trabalho foi desenvolvido. Aos projetos financiadores: Caracterização genética (cromossomos, proteínas e DNA) de peixes e pequenos mamíferos da Amazônia (INPA/PPI PRJ 05.73); Sistemática, Genética e Ecologia de pequenos mamíferos do vale do rio Jari, Pará e Amapá (CNPq 480908/04). Ao Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior (CAPES) que concedeu a bolsa de estudo durante a realização deste trabalho. Agradeço a todas as pessoas, colegas e amigos que, direta ou indiretamente, possibilitaram a realização deste trabalho. Ao Dr. Jorge Ivan Rebelo Porto, que me direcionou, compreendeu, brigou e ajudou na hora certa tornando válida minha experiência científica e também um exemplo a tentar ser seguido. À Dra Maria Nazareth Ferreira da Silva que me iniciou nos estudos com pequenos mamíferos, que tolerou meus momentos rebeldes e me ensinou a querer buscar sempre mais do que parecia ser o limite. À Dra. Eliana Feldberg, que cansou de escutar minhas lamúrias, me mostrou que o mundo profissional não é um “mar-de-rosas” e que esteve a meu lado com seus conselhos (“mãe substituta”) nas horas em que eu mais precisava. Aos amigos do LTBM (Jacqueline, Kyara, Naiara, Tatiana, Fabíola, Giselle, Rosa, Luci, Andréa, Iamilli, Gilson, Fredson, Giulliano e companhia) pelo auxílio no laboratório e pelos momentos de descontração. À Alexandra que sempre com um sorriso se mostrou disponível para me dedicar sua atenção no laboratório. À Renata pela minha iniciação na difícil tarefa de usar o PAUP. À Maria Cláudia, Leandra e Leila pelas risadas, críticas, joguinhos de PC e companheirismo nestes dois anos. Ao Carlos, que sem ele seria muito mais difícil qualquer coisa dentro do laboratório e análises de dados. Ao Eduardo que foi essencial nos meus primeiros passos e sem ele talvez nem teria chegado ao INPA. iv Aos “Coiotes” Rafolia, KK, Rodrigo, Angrizani, Bárbara e Everton que vão ficar sempre em meu coração e nunca vou esquecer dos momentos inestimáveis de amizade, farras e felicidades que a gente passou junto. À Maria e Aline por todo apoio e carinho incondicional oferecido nos meus momentos mais difíceis. À Camila Domingues que me fez lembrar que loucura é ponto de vista e que ciganos e astronautas são bem mais parecidos do que se pode imaginar. À Camila Campos por ser meu porto seguro nos mais diversos momentos, pelo companheirismo e carinho, por ser minha segunda consciência nos meus momentos mais perdidos. Sem você eu não teria chegado aqui. Ao bar do porão onde eu descansei minha cabeça e ao Carlão pelos descarregos de fins de disciplinas. A todos meus amigos que mesmo distantes me fizeram rir e me sentir querido, principalmente ao José Henrique que mais que ninguém entende como foi difícil fazer cada dia um dia. À minha família que dispensa descrições em separado pois é um bloco único, força interminável e exemplo de raça para os momentos mais difíceis. Obrigado por deixarem eu ser o que sou hoje mesmo que seja difícil. Amo vocês. Aos animais que não morreram em vão. À Deus em todas suas manifestações. Enfim, a todos que colaboraram direta ou indiretamente na minha jornada que aqui não foram mencionados. À vocês todo meu carinho... v RESUMO Os roedores do gênero Proechimys, também conhecidos como ratos-de-espinho, distribuem-se de Honduras, na América Central, até o Paraguai, na América do Sul. Como várias de suas espécies ocorrem em simpatria e a sistemática do gênero é problemática, dado a grande variabilidade dos caracteres morfológicos e a compreensão relativamente restrita da natureza intra e/ou interespecífica dessa variação, a taxonomia molecular (DNA Barcode) pode ser de grande valia. No presente trabalho foram obtidas 65 seqüências parciais (638 pares de bases) do gene mitocondrial citocromo b (cit b) e 20 seqüências parciais (600 pares de bases) do gene mitocondrial citocromo oxidase I (coI) de espécies identificadas preliminarmente como: Proechimys cf. brevicauda (grupo longicaudatus) P. cuvieri (grupo cuvieri), P. echinothrix, P. gardneri, P. cf. guyannensis (grupo guyannensis), P. simonsi (grupo simonsi) P. steerei (grupo goeldii) e Proechimys sp. (indivíduos sem identificação taxonômica) procedentes de coletas efetuadas em cinco Estados da bacia amazônica (Acre, Amapá, Amazonas, Rondônia e Pará). Adicionalmente, as seqüências obtidas foram alinhadas e comparadas com outras disponibilizadas por colaboradores do Museum of Vertebrate Zoology, Universidade da Califórnia, Berkeley e outras disponibilizadas no GenBank. O gene cit b apresentou grau de divergência genética interspecífica (10,5% a 18,13%) similar ao gene coI (9,4% a 19,4%). Após as análises moleculares e as comparações com as seqüências adicionais, os 65 indivíduos foram classificados molecularmente em: P. goeldi, P. cf. guyannensis, P. gardneri, P. simonsi, P. roberti, Proechimys sp. (grupo goeldii) e Proechimys sp. “Madeira” (provavelmente uma espécie nova do rio Madeira pertencente ao grupo longicaudatus). As análises de máxima parsimônia (MP) e máxima verossimilhança (MV) de ambos os genes indicaram que há elevados valores de suporte para os clados monofiléticos terminais dos táxons analisados, sendo a maioria congruentes com as identificações morfológicas preliminares. Porém, as árvores de MP falharam em demonstrar relações evolutivas particularmente nos nós mais basais e vários clados internos corresponderam a regiões geográficas distintas. A exemplo do gene cit b, o gene coI utilizado no projeto DNA Barcode (Código de Barras de DNA) foi eficaz para taxonomia molecular dos Proechimys. Estes resultados serão adicionados ao banco de dados da Coleção de Mamíferos do INPA e contribuirão para que a identificação dos Proechimys da Amazônia seja feita com mais segurança. vi ABSTRACT: The rodent genus Proechimys, known as spiny rats, are found throughout Central and South America with a documented range extending from Honduras to Paraguay. Systematics of the genus remains problematic for a number of reasons: multiple species are often found together in sympatry, diagnostic morphological characters can be highly variable, and the nature of inter- and intra-specific variation in these traits is poorly understood. For these reasons, molecular taxonomy (“DNA barcoding”) could prove to be a useful technique. This study presents results obtained from 65 partial sequences consisting of 638 base pairs of the Cytochrome b (cyt b) mitochondrial gene and 20 partial sequences consisting of 600 base pairs of the Cytochrome Oxidase I (coI) mitochondrial gene. These sequences were obtained from individuals from INPA’s Mammals Collections collected in five different states of the Brazilian Amazon (Acre, Amapá, Amazonas, Rondônia and Pará) identified initially as: Proechimys cf. brevicauda (longicaudatus group), P. cuvieri (cuvieri group), P. echinothrix, P. gardneri, P. cf. guyannensis (guyannensis group), P. simonsi (simonsi group), P. steerei (goeldii group) as well as unidentified specimens assigned to Proechimys sp. These sequences were aligned and compared with other sequences provided by collaborators at the Museum of Vertebrate Zoology at University of California, Berkeley, or on GenBank. The Cyt b sequences showed a degree of interspecific genetic divergence (10.5%-18.1%) similar to that found for coI (9.4%-19.4%). The 65 individuals were classified by molecular taxonomy as: P. goeldi, P. cf. guyannensis, P. gardneri, P. simonsi, P. roberti, Proechimys sp. (goeldii group) and Proechimys sp. “Madeira” (probably represents a new species from the longicaudatus group of the Madeira River). Moreover, it seems likely that cryptic species are present within the longicaudatus group, requiring further analysis to distinguish among them. Maximum Parsimony (MP) and Maximum Likelihood (ML) analyses of both genes indicate high bootstrap values for monophyletic terminal clades of the taxa analyzed, most of which were congruent with the morphological identifications. However, the MP phylogenetic trees failed to demonstrate evolutionary relationships at the basal nodes, while various internal clades corresponded to distinctive geographical regions. Cyt b, like the coI gene used by the DNA Barcode, proved to be efficient for molecular taxonomy of Proechimys. These results will be added to the Mammals Collections at INPA and will contribute to better identification of Proechimys species throughout Amazonia. vii SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1 2. REVISÃO BIBLIOGRAFICA .............................................................................................. 2 2.1 Amazônia ................................................................................................................. 2 2.2 Proechimys (Rodentia: Echimyidae) .................................................................... 3 2.3 DNA mitocondrial, DNA barcode e sistemática molecular ................................ 8 3. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 9 3.1 Objetivo Geral: ....................................................................................................... 9 3.2 Objetivos específicos: ............................................................................................. 9 4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 10 4.1 Técnicas de coleta ................................................................................................. 10 4.2 Extração de DNA .................................................................................................. 16 4.3 Amplificação e purificação dos fragmentos ....................................................... 17 4.4 Seqüenciamento .................................................................................................... 19 4.5 Edição e alinhamento das seqüências. ................................................................ 19 4.6 Sistemática molecular e análises filogenéticas .................................................. 19 5. RESULTADOS .................................................................................................................... 22 5.1 Análise das seqüências de citocromo b (cit b) .................................................... 22 5.2 Identificação molecular pelo citocromo b (cit b) ............................................... 23 5.3 Identificação molecular pela citocromo oxidase I (coI) .................................... 50 6. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 55 6.1 Taxonomia molecular em Proechimys................................................................ 55 6.2 Sistemática molecular em Proechimys ............................................................... 59 7. CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 63 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 64 9. ANEXOS .............................................................................................................................. 74 viii LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Proechimys steerei. Foto: MNF da Silva. ................................................................. 6 Figura 2 - Mapa das regiões de coleta dos indivíduos do gênero Proechimys. Os números correspondem aos locais de coleta listados na tabela 1. ................................................... 12 Figura 3 – Gráfico de transição/transversão vs. distância genética (HKY85). Ts= transição; Tv = transversão. .................................................................................................................... 22 Figura 4 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de 15 espécies do gênero Proechimys. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística. .......................... 27 Figura 5 –Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de 15 espécies do gênero Proechimys. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. .......................................................... 28 Figura 6 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys gardneri e Proechimys pattoni. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. .............................................................................................................. 30 Figura 7 –Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys gardneri e Proechimys pattoni. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. ...................................... 31 Figura 8 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys roberti. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. ....................... 33 Figura 9 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys roberti. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. ............................................................. 34 Figura 10 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys echinothrix. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. .......................................................................................................................................... 36 Figura 11 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys echinothrix. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. ............................................................. 36 Figura 12 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys simonsi. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. .......................................................................................................................................... 37 Figura 13 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys simonsi. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a ix distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. ............................................................. 38 Figura 14 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys quadruplicatus, P. steerei e P. goeldii e Proechimys sp (grupo goeldii). Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. ...................................... 40 Figura 15 – Árvore de Máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys quadruplicatus, P. steerei e P. goeldii e Proechimys sp (grupo goeldii). Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. .................................................................................. 41 Figura 16 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys cf. guyannensis. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. .......................................................................................................................................... 42 Figura 17 –Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys cf. guyannensis. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. ............................................................. 43 Figura 18 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys cuvieri. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. .......................................................................................................................................... 45 Figura 19 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys cuvieri. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. ............................................................. 46 Figura 20 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys sp., Proechimys brevicauda e P. longicaudatus. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. O clado identificado como Proechimys sp. provavelmente é uma espécie nova do rio Madeira. ........................................................ 48 Figura 21 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys sp., Proechimys brevicauda e P. longicaudatus. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. O clado identificado como Proechimys sp. provavelmente é uma espécies nova do rio Madeira. ............................................................................................................................ 49 Figura 22 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial coI de 12 espécies do gênero Proechimys. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística............................................. 53 x Figura 23 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial coI de 12 espécies do gênero Proechimys. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado................................................................................... 54 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Listagem dos espécimes testemunhos seqüenciados para identificação taxonômica molecular. Espécimes e respectivos tecidos fazem parte da Coleção de Mamíferos do INPA. ................................................................................................................................ 13 Tabela 2 – Identificações molecular e morfológica a posteriori dos indivíduos do gênero Proechimys seqüenciados neste estudo. ........................................................................... 24 Tabela 3 – Distância genética entre as espécies do gênero Proechimys utilizando o gene mitocondrial coI e o parametro de distância GTR. ........................................................... 51 xi 1. INTRODUÇÃO A manutenção da diversidade biológica tornou-se, nos anos recentes, um dos objetivos mais importantes da conservação. A biodiversidade é definida pela Convenção sobre Diversidade Biológica - CDB, no seu Art. 2º, como "a variabilidade de organismos vivos de todas as origens, compreendendo, dentre outros, os ecossistemas terrestres, marinhos e outros ecossistemas aquáticos e os complexos ecológicos de que fazem parte; compreendendo ainda a diversidade dentro de espécies, entre espécies e de ecossistemas". A biodiversidade amazônica está sendo cada vez mais ameaçada devido ao desflorestamento constante da região. Mesmo com a redução do desmatamento de 27.379 Km2 em 2004 para 11.224 Km2 em 2007 (INPE, 2008) ainda persiste grande dúvida sobre o quanto de riqueza faunística perde-se anualmente em decorrência dessas e outras atividades antrópicas, que se somam à falta de inventários faunísticos e conhecimento ainda limitado sobre a distribuição geográfica das espécies. Voss & Emmons (1996) destacam que inventários faunísticos representam grande auxílio para o planejamento de ações visando a conservação de espécies tendo em vista a grande possibilidade de extinção face a perda de seus habitats. Porém, as lacunas no conhecimento sobre a fauna de mamíferos amazônicos ainda são enormes. Em parte isso se deve ao fato de que apenas alguns grupos de mamíferos foram amostrados nas áreas inventariadas e o esforço de amostragem não conseguiu saturar as curvas cumulativas das espécies. Nas matas neotropicais Voss & Emmons em 1996 listaram 10 sítios onde os inventários de mastofauna foram considerados completos por abrangerem as várias ordens de mamíferos, mas apenas dois destes localizaram-se na Amazônia brasileira. Na Amazônia brasileira foram levantadas cerca de 311 espécies de mamíferos, dentre eles cerca de 72 foram roedores, podendo haver um acréscimo nestes números à medida que novas áreas forem amostradas e revisões taxonômicas forem realizadas (da Silva et al., 2001; Costa et al., 2005). O aumento de áreas inventariadas e devidamente estudadas da Amazônia é considerado primordial para que haja um melhor entendimento de padrões de distribuição das espécies na região como o gradiente decrescente de diversidade no sentido oeste-leste aparentemente existente para a mastofauna deste grande bioma (Emmons, 1984; Voss & Emmons, 1996). Neste estudo, utilizando seqüências do DNA mitocondrial dos genes citocromo b e citocromo oxidase I como marcadores moleculares, pretendemos contribuir para o melhor conhecimento taxonômico e dos padrões evolutivos das espécies do gênero Proechimys (Echimyidae, Rodentia) de vários pontos da Amazônia. 1 2. REVISÃO BIBLIOGRAFICA 2.1 Amazônia A Amazônia é a maior floresta tropical do mundo, possuindo uma vegetação heterogênea constituída de florestas de terra firme, campinas, savanas, várzeas e áreas abertas pedregosas. Associado a essas formações vegetais, a Amazônia possui um grande número de corpos d’água, além de rios, igapós, lagos, igarapés e poças de água que definem uma grande variedade de habitats, isolando populações e possibilitando a formação de novas espécies (Patton & da Silva, 1998; Vogt, 2001). Abrigando nove países sul-americanos, a Amazônia estende-se de leste a oeste no continente Sul Americano, das encostas do Atlântico Sul até cerca de 600 metros de altitude na Cordilheira dos Andes (Ab’Saber, 1977). No Brasil, estende-se por nove estados da região Norte (Acre, Amapá, Amazonas, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins), Centro-Oeste (Mato Grosso e Mato Grosso do Sul ) e Nordeste (Maranhão) o que corresponde à cerca de 5 milhões de quilômetros quadrados do território brasileiro (INPE, 2008). Vários estudos vêm sendo feitos tentando explicar processos de especiação na Amazônia, podendo estes ter ocorrido tanto no Terciário, no período de grandes mudanças em sua estrutura geológica (Zamudio, 1997; Glor et al., 2001; Nores, 2004; Steiner & Catzeflis, 2004; Kronauer et al., 2005), quanto no Quaternário (Silva & Patton, 1993; Bonaccorso et al., 2004; Noonan & Gaucher, 2005; Wüster et al., 2005; Rull, 2006). Cinco formações principais compõem a divisão geológica da Amazônia Legal: os escudos pré-cambrianos das Guianas e do Brasil; os depósitos marinhos paleozóicos destes escudos; sedimentos Terciários que ocupam grande parte do alto Amazonas/Solimões, seus afluentes e também as margens da calha do rio Amazonas; sedimentos do Cretáceo (noroeste do Mato Grosso e sudoeste do Amazonas e Rondônia); e sedimentos do Quaternário compondo as atuais várzeas (Bigarella & Ferreira, 1985). Alterações geomorfológicas ocorridas no decorrer das eras levando a modificações constantes no sistema de drenagem e fluxo dos rios foi de grande importância para a elevada biodiversidade que compõe este bioma, havendo nítidas associações entre biodiversidade e os diferentes tipos de solo e mosaico de habitats (Sioli, 1990; Voss & Emmons, 1996, Rossetti et al., 2005). 2 No decorrer das eras até o fim do Terciário, eventos como o desmembramento do continente Africano do continente Sul Americano, o soerguimento dos Andes e sucessivas incursões marinhas no continente causaram diversas alterações no relevo e hidrografia amazônicos como, por exemplo, a inversão do sentido de alguns rios que passaram a deslocar sentido oeste-leste e a desembocar no Atlântico. No fim do Terciário e início do Quaternário houve também várias mudanças em sua estrutura devido aos depósitos sedimentares sentido oeste-leste com a sedimentação constante dos rios que vinham dos Andes (Sioli, 1990; Rosseti et al., 2005). Adicionalmente mudanças climáticas ocorridas no fim do Terciário e início do Quaternário fragmentaram a floresta, podendo ter criado refúgios que isolaram os mais diversos tipos de populações, acreditava-se favorecendo a especiação alopátrica e, por conseqüência, o aumento da biodiversidade (Vanzolini & Willians, 1970; Haffer, 1992; Haffer & Prance, 2002). 2.2 Proechimys (Rodentia: Echimyidae) A ordem Rodentia é a maior e mais diversificada dentre os mamíferos compondo 40% desta classe com mais de 2.000 espécies. Sua distribuição ocorre em todas as partes do mundo, com exceção da Antártica, sendo que na Nova Zelândia e algumas ilhas oceânicas a população de roedores foi introduzida pelo homem (Eisenberg & Redford, 1999; Myers, 2000). Os roedores podem pesar de 5 gramas (camundongo-pigmeu Africano) a até 70 quilos (capivaras, encontradas nas Américas Central e do Sul). Uma característica comum a todos desta ordem é a presença de um par de proeminentes incisivos nos maxilares inferior e superior, seguido de um diastema e ausência de caninos. Esta adaptação dentária está diretamente ligada a alimentação (onívora, insetívora, herbívora, seminívora ou combinação destas), e é um dos principais fatores do sucesso e sobrevivência desta ordem (Emmons & Feer, 1990; Eisenberg & Redford, 1999; Myers, 2000; Silva, 2005). Seus indivíduos têm modo de vida noturno, porém algumas espécies podem ser avistadas durante o dia como as do gênero Sciurus (esquilos) e Dasiprocta (cutias) (Voss & Emmons, 1996). Ocupam uma enorme variedade de nichos e habitats, o que pode refletir de maneira marcante nas características morfológicas das espécies, por exemplo, patas adaptadas para subir em árvores, nadar ou escavar (Emmons & Feer, 1990; Eisenberg & Redford, 1999). Sua distribuição no continente Sul-Americano é derivada de duas grandes colonizações, a subordem Hystricomorpha é bem representada desde o Eoceno tardio até o 3 presente, enquanto os sigmodontíneos colonizaram a América do Sul com uma série de invasões posteriores, possivelmente no Mioceno tardio até o Plioceno (Eisenberg & Redford, 1999). Mesmo não sendo considerados os mamíferos mais ameaçados, existem amplas evidências da vulnerabilidade à extinção de diversas de suas linhagens. Um dos principais motivos é a destruição ambiental associada à falta de dados taxonômicos e de informações detalhadas sobre o status de suas populações. Considerando a possibilidade de haver espécies crípticas, o nível de ameaça de várias espécies pode estar sendo subestimado. Além do mais, espécies de roedores consideradas fora de risco de extinção em nível mundial estão ameaçadas regionalmente podendo desaparecer numa dada região (Amori &.Gippoliti, 2003; Costa et al., 2005). Dentre os roedores da subordem Hystricomorpha, a família Echimyidae, comumente conhecida como ratos-de-espinho, pode ser considerada uma das mais diversas, possuindo 21 gêneros e somando um total de 90 espécies (Wilson & Reeder, 2005), além de uma grande diversidade de características morfológicas e ecológicas (Voss & Emmons, 1996). A denominação ratos-de-espinho foi dada em função de um grande número de espécies nessa família portar uma pelagem dorsal única,com pêlos achatados e de rigidez considerável (pêlos aristiformes) ou pêlos bastante ásperos especialmente visíveis nas costas e ancas. A coloração de sua pelagem pode variar consideravelmente entre espécies, que apresentam coloração dorsal cinza ou com diferentes tons de marrom, e ventre normalmente amarelado ou branco. Várias espécies também apresentam marcas faciais, como listras claras ou escuras. O comprimento cabeça-corpo varia de 80 mm a 500 mm sendo relativamente menor quando comparado com outros histricomorfos da América do Sul. Os representantes dessa família vivem numa variedade de ambientes, apresentando formas variadas adaptadas a seu modo de vida; os olhos e orelhas são de tamanho médio e a cauda pode variar de 0.5 a 42 cm aproximadamente (Emmons & Feer, 1990; Nowak, 1991; Eisenberg & Redford, 1999; Wilson & Reeder, 2005). A distribuição geográfica da família Echimyidae se estende da América Central até a Argentina (Eisenberg & Redford, 1999), e seus membros ocupam uma vasta variedade de nichos, podendo ser, terrestres, fossoriais e arborícolas. Estes últimos são considerados menos abundantes na natureza que as formas terrestres, devido à sua raridade ou dificuldade de coleta (Emmons & Feer, 1990; Nowak, 1991; Patton et al., 2000). A alimentação varia de insetos a frutas e folhagens (Malcolm, 1991). A maioria dos indivíduos vive de modo solitário, com exceção de certas espécies, como as do gênero Clyomis que podem viver em 4 colônias (Eisenberg & Redford, 1999; Burda et al., 2000). A família Echimyidae está entre as mais antigas dos roedores. Seus fósseis mais antigos foram encontrados na Bolívia e são datados do oligoceno tardio a 25 milhões de anos atrás, representando um dos registros mais antigos de histricognatos do novo mundo (Patterson & Wood, 1982; Macfadden, 1985). O monofiletismo da família Echimyidae é relativamente bem suportado por dados morfológicos e moleculares, apesar da discordância entre autores quanto a inclusão ou não de três pequenas famílias ou subfamílias (Myocastoridae, Capromyidae e Chaetomyidae) em Echymyidae (Emmons 2005). Porém, no âmbito supra-específico, ainda existem politomias a serem resolvidas, talvez pela ausência de dados ou, possivelmente, pela rápida e simultânea divergência dos táxons no Mioceno. Estudos moleculares baseados em seqüências do DNA mitocondrial apoiam a hipótese desta rápida divergência no Mioceno (Lara et al., 1996; Leite & Patton, 2002; Galewski et al., 2005). O gênero Proechimys (subfamília: Eumysopinae) é o que apresenta maior diversidade e abundância nos Neotrópicos dentre os gêneros da família Echimyidae, com um total de 25 espécies reconhecidas e com distribuição geográfica desde Honduras até o Paraguai (Emmons & Feer, 1990; Wilson & Reeder, 2005). Todas as espécies do gênero Proechimys (Figura 1) são terrestres. Sua pelagem dorsal, como a de outros equimídeos, apresenta pêlos aristiformes de coloração amarronzada e seu ventre normalmente possui a coloração branca. Suas orelhas são maiores do que as de seus similares arborícolas, suas patas traseiras são alongadas e finas e sua cauda tem comprimento similar ou mais curto que o comprimento cabeça-corpo (Emmons & Feer, 1990; Nowak, 1991; Eisenberg & Redford, 1999; Patton et al., 2000). A alimentação desses animais provem de um lento forrageamento de pequenas sementes e frutas no solo florestal, seus hábitos são noturnos e vivem normalmente em tocas e troncos caídos. Têm uma grande importância na dispersão de esporos de fungos micorrízicos por também forragearem próximo a raízes de troncos nas árvores (Emmons & Feer, 1990; Janos et al., 1995; Eisenberg & Redford, 1999; Mangan & Adler, 1999 e 2002). Algumas espécies são morfologicamente semelhantes e sua distinção é muito difícil mesmo que por meio de caracteres morfológicos e/ou dados morfométricos em adultos (Emmons & Feer, 1990; Eisenberg & Redford, 1999). Alguns caracteres morfológicos são diagnósticos na separação de grupos de espécies, mas há variações de acordo com a distribuição geográfica, o que torna a sistemática de Proechimys ainda não bem resolvida. (Gardner & Emmons, 1984; Patton 1987; Patton et al., 2000, Voss et al., 2001). 5 Caracteres morfológicos como morfologia de pêlos, bula timpânica, crânio, báculo peniano e dentição têm sido utilizados para o diagnóstico das espécies em Proechimys. Gardner & Emmons (1984) analisando diferenças em bulas timpânicas reconheceram quatro grupos de espécies de Proechimys: guairae, brevicaudata, semispinosus e Trinomys (então considerado subgênero de Proechimys). Posteriormente, Patton (1987) analisando o crânio e o báculo peniano, agrupou 59 dos 67 epítetos específicos existentes para o gênero, em nove grupos sendo seis politípicos (goeldii, guyannensis, longicaudatus, semispinosus, simonsi e trinitatus) e três monotípicos (canicollis, cuvieri e decumanus). Figura 1 – Proechimys steerei. Foto: MNF da Silva. Estudos moleculares apresentaram-se como ferramenta eficaz no auxílio à determinação do status taxonômico de algumas espécies relacionadas ao gênero, tanto como a compreensão de seus padrões geográficos. Lara et al. (1996), baseando-se em seqüências de DNA mitocondrial (mtDNA) do gene citocromo b (cit b), além de proporem a diversificação simultânea da família Echimyidae, elevaram Trinomys, outrora pertencente a Proechimys, à categoria de gênero. Também utilizando seqüências do gene mitocondrial citocromo b, dados morfológicos e cariológicos, da Silva (1998) descreveu quatro novas espécies de Proechimys (P. echinothrix, P. gardneri, P. kulinae e P. pattoni) da bacia do rio Juruá. Neste trabalho, a autora também 6 apresentou uma filogenia molecular de 12 espécies de Proechimys (P. amphicoricus, P. brevicauda, P. cayennensis (= P. guyannensis), P. cuvieri, P. echinothrix, P. gardneri, P. kulinae, P. pattoni, P. sp. (Rio Madeira), P. quadruplicatus, P. simonsi e P. steerei) mostrando que apesar da filogenia apresentada ter pouco suporte de relacionamento entre as espécies sua topologia condizia com a identificação das espécies. da Silva & Patton (1998) apresentaram uma filogenia molecular de Proechimys spp. pertencentes ao grupo goeldii, e concluíram que dos quatro clados encontrados três deles podiam ser tratados como espécies distintas, sendo elas P. amphichoricus, P. goeldii e P. steerei, que divergiram em mais de 11%. P. steerei, por sua vez, dividiu-se em dois clados, com uma média de 6,5% de divergência. Matocq et al (2000) compararam os padrões de diversidade genética e estrutura populacional de P. steerei e P. simonsi do rio Juruá, com base no uso do gene cit b. Ambas espécies apresentaram aproximadamente o mesmo número de haplótipos mitocondriais porém P. steerei apresentou uma diversidade genética média menor (7,09%) que P. simonsi (11.76%). P. steerei apresentou 14 haplótipos distribuidos em ambas margens do rio Juruá enquanto P. simonsi apresentou apenas dois haplótipos. Patton et al. (2000) descreveram detalhadamente aspectos relativos ao uso de habitat, história natural, distribuição geográfica, e diferenciacão geográfica baseada em dados ecológicos e caracteres morfológicos, cromossômicos e moleculares de espécies de marsupiais e de roedores murídeos e equimídeos da calha do rio Juruá. Os autores descreveram a existência de padrões filogeográficos singulares, como a existência de conjuntos de haplótipos mitocondriais correspondentes às regiões do alto e baixo Juruá, cuja área de contato se dá na porção média desse rio, área essa marcada pela presença do arco estrutural de Iquitos. A concordância geral entre a localização desse arco e das áreas de “quebras” filogeográficas para diversas espécies de roedores e marsupiais, indica que esses autores evidenciaram uma possível ligação entre eventos geotectônicos na Amazônia e padrões de diversificação de seus organismos. Neste mesmo trabalho é apresentado uma abordagem molecular sobre as oito espécies de Proechimys do rio Juruá (P. brevicauda, P. cuvieri, P. echinothrix, P. gardneri, P. kulinae, P. pattoni, P. simonsi e P. steerei) comparando-as com seqüências das mesmas espécies mas de outras localidades da bacia amazônica. Steiner et al. (2000) e Van Vuuren (2004) analisaram na Guiana Francesa duas espécies simpátricas, P. cuvieri e P. cayennensis, atráves de variações do mtDNA. Os autores observaram o monofiletismo dos clados em cada uma das espécies, confirmando a sintopia de 7 suas populações e verificando um grau de divergência em torno de 12% entre essas duas espécies. Weksler et al. (2001) com o auxílio de dados morfológicos, cromossômicos e moleculares evidenciaram que P. roberti é uma espécies válida do grupo guyannensis que ocorre na Amazônia Oriental, e que P. oris, provavelmente é sinônima de P. roberti. Galewski et al. (2004) propuseram uma filogenia para os equimídeos usando o exon 28 do gene nuclear Fator von Willebrand Factor (vWF) combinado com genes mitocondriais (cit b, 12S and 16S rRNAs) tendo sido evidenciado um clado formado por Myocastor, Thrichomys, e Proechimys + Hoplomys. Neste trabalho, foi evidenciado que Hoplomys é grupo irmão das seis espécies de Proechimys analisadas (P. cuvieri, P. guyannensis, P. simonsi, P. longicaudatus, P. quadruplicatus e P. roberti). Além disso, os autores estimaram que as espécies de Proechimys divergiram no fim do Plioceno. 2.3 DNA mitocondrial, DNA barcode e sistemática molecular A mitocôndria é uma das principais organelas celulares devido a sua função energética. É encontrada em todos organismos eucariotos e possui genoma próprio. Há anos o DNA mitocondrial vêm sendo usado como uma ferramenta acessória nos estudos de espécies proximamente relacionadas e na reconstrução de histórias filogenéticas recentes (Avise, 1987; Avise, 1994; Simon et al., 1994). Dentre as principais características que favorecem o genoma mitocondrial como uma boa fonte de dados para taxonomia molecular pode-se citar: a diferença de seqüências entre espécies próximas é de 5 a 10 vezes maior nos genes mitocondriais do que nos genes nucleares devido a sua elevada taxa de mutação; a ausência de íntrons; o número maior de cópias dentro de uma única célula; menos diferenças nas seqüências dentro de uma única espécie devido ao genoma mitocondrial não ser recombinante e ser na grande maioria das vezes de origem materna (Brown et al., 1979; Wilson et al. 1985; Moritz et al. 1987; Avise, 1987; Avise, 1994). Análises filogenéticas utilizando-se genes mitocondriais têm se mostrado eficiente na elucidação de relações de parentesco entre pequenos mamíferos. Um dos principais genes utilizados, o cit b, codifica uma das mais importantes e bem conservadas proteínas mitocondriais relacionadas à respiração celular e é um dos mais bem conhecidos dentre os 13 genes codificantes de proteínas no genoma mitocondrial (Hatefi, 1985; Mustrangi & Patton, 1997; Smith & Patton, 1999; Harris et al. 2000; Costa, 2003; Leite, 2003; Gonçalves & Oliveira, 2004; Reeder et al., 2006). No estudo do gênero Proechimys este gene têm se 8 mostrado mais eficiente para resolver relações de parentesco nos ramos mais terminais que basais, pois têm agrupado melhor os indivíduos da mesma espécie do que demonstrado relações evolutivas entre as espécies, porém destaca-se a necessidade de introduzir mais indivíduos de localidades e espécies diferentes nas análises (da Silva, 1998). Contudo, para analisar relações evolutivas entre as espécies, talvez o mais critico seja a análise de múltiplos genes. Com o advento do projeto DNA Barcode (Código de Barras de DNA) o gene mitocondrial citocromo c oxidase I (coI, coxI) vêm cada vez mais sendo utilizado como ferramenta auxiliar (não substituta de estudos mais amplos envolvendo além dos dados moleculares, dados morfológicos, cariotípicos e até mesmo ecológicos) na identificação de espécies. O Barcode é um ambicioso projeto com objetivo de, através de marcadores moleculares, auxiliar na rápida identificação e catalogar todas as espécies existentes (Blaxter, 2003; Hebert et al. 2003; Blaxter, 2004; Oliveira 2007). Com pequenos fragmentos deste gene é possível identificar e validar espécies por meio da análise do DNA de espécimes testemunhos depositados em museus, os quais geralmente possuem o DNA bastante fragmentado (Hajibabaei, 2006a). Além disto, auxilia também: na identificação de espécies novas, cripticas ou apenas polimórficas dentro de uma única espécie (Hebert et al., 2004a; Hebert et al., 2004b; Schander & Willanssen, 2005; Ward et al., 2005; Smith et al. 2006; Hajibabaei, 2006b; Clare et al., 2007 Kerr et al., 2007), na identificação de espécies invasoras como, por exemplo, pragas de insetos em plantações (Armstrong & Ball, 2005); serve como complemento em análises filogenéticas e populacionais (Scarpassa & Conn, 2006; Hajibabaei et al., 2007). 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral: O estudo tem como objetivo geral contribuir para a taxonômia e conhecimento da história evolutiva de pequenos mamíferos amazônicos, especificamente, roedores do gênero Proechimys, por meio do uso de marcadores moleculares. 3.2 Objetivos específicos: 1. Testar o valor dos genes mitocondriais cit b e coI como marcadores moleculares taxonômicos para o gênero. 2. Inferir as relações evolutivas entre as espécies de Proechimys da Amazônia. 9 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Técnicas de coleta Grande parte das amostras de tecidos utilizadas no presente estudo foram coletadas anteriormente por outros colegas e representam amostragens feitas em diferentes localidades na Amazônia (Figura 2, Tabela 1). Adicionalmente, realizamos coletas na Reserva Biológica do rio Uatumã (Vila de Balbina-AM), Parque Estadual do Rio Negro Setor Sul (ManausAM/rio Cuieiras) e Refinaria de Manaus (REMAN) utilizando armadilhas sherman (8x8x23 cm) e tomahawk (14x14x40 cm) que permitem a captura do animal vivo. As coordenadas geográficas dos locais de coleta são descritas abaixo. A) Estado do Amapá: Pedra Branca do Amapari, ca. 15 km W da Vila de Serra do Navio (0º53’10,8” N, 51º52’48,3” W). B) Estado do Pará: Capoeira 56, Monte Dourado (0º42’42,6” S, 52º40’0,8” W); Capoeira 86, Monte Dourado (0º36’14,72” S, 52º39’9,44” W); Eucalipto 14, Monte Dourado (0º49’58,65”S, 52º39’29,69” W); Quaruba, Monte Dourado (1º1’32,45” S, 52º54’17,27”W); Bituba, Monte Dourado (1º11’ 28,3” S, 2º38’51,8” W); Alter do Chão, MC 67 – Caratinga (2º31'48.6" S, 54º57'17.5" W); Alter do Chão, MC 70 – Murajuba (2º32'56.7" S, 54º53'58.7" W); Marajuba, ca. 8 km E de Alter do Chão (2º32’56,7” S, 54º53’58,7” W). C) Estado do Amazonas: UHE de Balbina, Ilha do Rato (1º47’32”S, 59º21’ 12”W); UHE de Balbina, Ilha da Serrinha (1º52’24” S, 59º25’6” W); UHE de Balbina, Terra firme 2, Floresta Contínua Reservatório da Hidrelétrica de Balbina/ReBio do Uatumã (1º79’80”S, 59º27’45”W); UHE de Balbina, Ilha do Palhal 1, Reservatório da Hidrelétrica de Balbina/ReBio do Uatumã (1º80’69”S, 59º36’18”W); UHE de Balbina, Ilha da Neto, Reservatório da Hidrelétrica de Balbina/ReBio do Uatumã (1º83’83”S, 59º35’63”W); UHE de Balbina, Ilha da Serrinha, Reservatório da 10 Hidrelétrica de Balbina/ReBio do Uatumã (1º87’40”S, 59º41’77”W); Comunidade Boa Esperança, margem direita rio Cuieiras (2°43'27'' S, 60°24' 22'' W); Manaus, mata da REMAN (3º 8 18,5 S, 59º 57 25,4 W); Margem esquerda do rio Madeira, comunidade Bela Vista (5º 14 46 S, 60º 42 50 W); Cachoeirinha, margem esquerda do rio Madeira (5°29’26.6” S 60°49’28.5”W); Lago Açaí, margem esquerda do rio Aripuanã (6º 0 52,7 S, 60º 12 32,4 W); Boca do Juma, margem direita do rio Aripuanã (6º 1 16,6 S, 60º 10 19,5 W); Margem esquerda do rio Aripuanã, igarapé Arauazinho (6º 17 44 S, 60º 23 33 W); Margem direita do rio Aripuanã (6º 19 33 S, 60º 20 47 W); RESEX Baixo Juruá, Comunidade Cumaru (03°45´ 20``S/ 66°05`26`` W); RESEX Baixo Juruá, Comunidade Botafogo, marg. direita rio Juruá (03°11´24´´S/ 65°55´14´´ W) e RESEX Baixo Juruá, Comunidade Forte das Graças II (03º40´40´´S/ 65º05´48`` W). D) Estado de Rondônia: Teotônio, margem esquerda do rio Madeira, 19 Km SW Porto Velho (8º 50 16 S, 64º 1 37 W); Teotônio, margem direita do rio Madeira, 25 Km SW Porto Velho (8º 52 27 S, 64º 0 28 W); Morrinhos, margem direita do rio Madeira, Rondônia (9º 1 10 S, 69º 12 59 W); Morrinhos, margem esquerda do rio Madeira, Rondônia (9º 2 06.8 S, 64º 12 05.2 W); Jirau, margem direita do rio Madeira, 40 Km SE Jaci-Paraná, Porto Velho (9º 20 4 S, 64º 43 38 W); Jirau, margem esquerda do rio Madeira, 40 Km SE Jaci-Paraná, Porto Velho (9º 20 60 S, 64º 44 20 W); Abunã, margem direita do rio Madeira, Rondônia (9º32’19.1” S, 65º 20 08.5 W); Abunã, margem esquerda do rio Madeira, Rondônia (9º 32 05.8 S, 65º 20 37.8 W); Terra Indígena Uru-Eu Wau Wau (10º 41 54,5 S, 63º 27 21 W). Os espécimes testemunhos de todas as amostras coletadas e analisadas no âmbito deste estudo se encontram depositadas na Coleção de Mamíferos do INPA e sua morfologia e citogenética estão sendo estudadas por outros pesquisadores do INPA e colaboradores. 11 Figura 2 - Mapa das regiões de coleta dos indivíduos do gênero Proechimys. Os números correspondem aos locais de coleta listados na tabela 1. 12 Tabela 1: Listagem dos espécimes testemunhos seqüenciados para identificação taxonômica molecular. Espécimes e respectivos tecidos fazem parte da Coleção de Mamíferos do INPA. ESPÉCIE REGISTRO Iniciais COLETOR* No CAMPO UF LOCALIDADE MAPA Proechimys cf. brevicauda INPA 4780 CGB 35 Amazonas Boca do Juma, margem direita do rio Aripuanã 16 Proechimys cf. brevicauda INPA 4789 CGB 44 Amazonas Boca do Juma, margem direita do rio Aripuanã 16 Proechimys cf. brevicauda INPA 5410 MCA 37 Amazonas Margem direita do rio Aripuanã 16 Proechimys cf. brevicauda INPA 5419 MCA 46 Amazonas Margem esquerda do rio Aripuanã, igarapé Arauazinho 17 Proechimys cf. brevicauda INPA 4768 CGB 23 Amazonas Lago Açaí, margem esquerda do rio Aripuanã 18 Proechimys cf. brevicauda INPA 4558 BAC 64 Rondônia Teotônio, margem direita do rio Madeira, 25 Km SW Porto Velho 22 Proechimys cf. cuvieri AM 173 Amapá Pedra Branca do Amapari, ca. 15 km W da Vila de Serra do Navio 1 Proechimys cf. cuvieri EE 238 Amazonas Manaus, mata da REMAN 14 MCA 5 Amazonas Margem esquerda do rio Madeira, comunidade Bela Vista 20 EE 147 Amazonas RESEX Baixo Juruá, Comunidade Cumaru 29 Proechimys cf. echinothix INPA 5379 Proechimys cf. echinothix Proechimys cf. gardneri INPA 4573 BAC 76 Rondônia Teotônio, margem esquerda do rio Madeira, 19 Km SW Porto Velho 21 Proechimys cf. gardneri INPA 4576 BAC 79 Rondônia Teotônio, margem esquerda do rio Madeira, 19 Km SW Porto Velho 21 Proechimys cf. gardneri INPA 4591 BAC 94 Rondônia Jirau, margem esquerda do rio Madeira, 40 Km SE JaciParaná, Porto Velho 26 Proechimys cf. guyannensis AM 124 Amapá Pedra Branca do Amapari, ca. 15 km W da Vila de Serra do Navio 1 Proechimys cf. guyannensis AM 126 Amapá Pedra Branca do Amapari, ca. 15 km W da Vila de Serra do Navio 1 Proechimys cf. guyannensis AM 128 Amapá Pedra Branca do Amapari, ca. 15 km W da Vila de Serra do Navio 1 Proechimys cf. guyannensis INPA 5455 MLOB 15 Amazonas UHE de Balbina, Ilha da Neto, ReBio do Uatumã 10 Proechimys cf. guyannensis INPA 5450 MLOB 10 Amazonas UHE de Balbina, Ilha da Serrinha, ReBio do Uatumã 11 Proechimys cf. guyannensis INPA 5482 MLOB 42 Amazonas Ilha da Serrinha, Reservatório da Hidrelátrica de Balbina/ReBio do Uatumã 11 Proechimys cf. guyannensis INPA 5044 RNL 28 Pará Capoeira 56, Monte Dourado 3 Proechimys cf. guyannensis INPA 5019 RNL 3 Pará Capoeira 86, Monte Dourado 3 Proechimys cf. guyannensis INPA 5021 RNL 5 Pará Capoeira 86, Monte Dourado 3 Proechimys cf. guyannensis INPA 5024 RNL 8 Pará Capoeira 86, Monte Dourado 3 13 Proechimys cf. guyannensis INPA 5028 RNL 12 Pará Capoeira 86, Monte Dourado 3 Proechimys cf. guyannensis INPA 5052 RNL 36 Pará Eucalipto 14, Monte Dourado 4 Proechimys cf. guyannensis INPA 5053 RNL 37 Pará Eucalipto 14, Monte Dourado 4 Proechimys cf. guyannensis INPA 5054 RNL 38 Pará Eucalipto 14, Monte Dourado 4 Proechimys cf. guyannensis INPA 5055 RNL 39 Pará Eucalipto 14, Monte Dourado 4 Proechimys cf. guyannensis INPA 5033 RNL 17 Pará Quaruba, Monte Dourado 5 Proechimys cf. simonsi EE 137 Amazonas RESEX Baixo Juruá, Comunidade Forte das Graças II 30 Proechimys cuvieri AM 196 Amapá Pedra Branca do Amapari, ca. 15 km W da Vila de Serra do Navio 1 Proechimys cuvieri INPA 5535 MLOB 95 Amazonas UHE de Balbina, Ilha do Palhal 1, ReBio do Uatumã 12 Proechimys cuvieri INPA 5539 MLOB 99 Amazonas UHE de Balbina, Ilha do Palhal 1, ReBio do Uatumã 12 Proechimys cuvieri EE 217 Amazonas Comunidade Boa Esperança, margem direita rio Cuieiras 15 Proechimys cuvieri EE 218 Amazonas Comunidade Boa Esperança, margem direita rio Cuieiras 15 Proechimys cuvieri INPA 5050 RNL 34 Pará Bituba, Monte Dourado 2 Proechimys cuvieri INPA 5514 MLOB 74 Amazonas UHE de Balbina, Floresta Contínua, ReBio do Uatumã 9 Proechimys gardneri INPA 5376 MCA 2 Amazonas Margem esquerda do rio Madeira, comunidade Bela Vista 20 Proechimys gardneri INPA 5390 MCA 17 Amazonas Margem esquerda do rio Madeira, comunidade Bela Vista 20 Proechimys gardneri INPA 5391 MCA 18 Amazonas Margem esquerda do rio Madeira, comunidade Bela Vista 20 Proechimys gardneri INPA 4704 MSF 666 Rondônia Morrinhos, margem direita do rio Madeira, Rondônia 23 Proechimys gardneri INPA 4705 MSF 667 Rondônia Morrinhos, margem direita do rio Madeira, Rondônia 23 Proechimys gardneri INPA 4579 BAC 82 Rondônia Jirau, margem direita do rio Madeira, 40 Km SE JaciParaná, Porto Velho 25 Proechimys gardneri INPA 4583 BAC 86 Rondônia Jirau, margem esquerda do rio Madeira, 40 Km SE JaciParaná, Porto Velho 26 Proechimys gardneri INPA 4631 MSF 591 Rondônia Abunã, margem esquerda do rio Madeira, Rondônia 28 Proechimys gardneri INPA 4633 MSF 593 Rondônia Abunã, margem esquerda do rio Madeira, Rondônia 28 Proechimys simonsi EE 141 Amazonas RESEX Baixo Juruá, Comunidade Forte das Graças II 30 Proechimys sp. CEF 10 Amazonas UHE de Balbina, Ilha da Serrinha 11 Proechimys sp. CEF 12 Amazonas UHE de Balbina, Ilha da Serrinha 11 Proechimys sp. CEF 14 Amazonas UHE de Balbina, Ilha da Serrinha 11 Proechimys sp. CEF 1 Amazonas UHE de Balbina, Ilha do Rato 13 CGB 9 Amazonas Lago Açaí, margem 18 Proechimys sp. INPA 4754 14 esquerda do rio Aripuanã Proechimys sp. CGB 63 Amazonas Cachoeirinha, margem esquerda do rio Madeira 19 Proechimys sp. INPA 4707 MSF 669 Rondônia Morrinhos, margem direita do rio Madeira, Rondônia 23 Proechimys sp. INPA 4717 MSF 679 Rondônia Morrinhos, margem esquerda do rio Madeira, Rondônia 24 Proechimys sp. MNFS 2172 Rondônia Terra Indígena Uru-Eu Wau Wau 27 Proechimys sp. MNFS 2173 Rondônia Terra Indígena Uru-Eu Wau Wau 27 Proechimys sp. MNFS 2174 Rondônia Terra Indígena Uru-Eu Wau Wau 27 MSF 583 Rondônia Abunã, margem esquerda do rio Madeira, Rondônia 28 Proechimys sp. CMS 51 Pará Alter do Chão, MC 67 Caratinga 6 Proechimys sp. MNFS 2168 Pará Alter do Chão, MC 70 Murajuba 7 Proechimys sp. MNFS 2154 Pará Marajuba, ca. 8 km E de Alter do Chão 8 Proechimys sp. MNFS 2156 Pará Marajuba, ca. 8 km E de Alter do Chão 8 Proechimys sp. MNFS 2157 Pará Marajuba, ca. 8 km E de Alter do Chão 8 Proechimys steerei EE 116 Amazonas RESEX Baixo Juruá, Comunidade Botafogo, marg. direita rio Juruá 31 Proechimys sp. INPA 4623 *As inicias CEF, CMS, MLOB e RNL correspondem a espécimes coletados por Carlos Eduardo Faresin, Cristiano Martins de Souza, Manoela Lima de Oliveira Borges e Rafael do Nascimento Leite, respectivamente (dissertações de mestrado do programa de pós-graduação do INPA); BAC e MSF, correspondem às iniciais de campo de Bárbara Maria de Andrade Costa e Manoel dos Santos Filho (consultoria INPA/FDB/Furnas Centrais Elétricas); CGB e MCA correspondem às iniciais de campo de Carla Gomes Bantel e Maria Clara Arteaga (projeto PROBIO-Madeira); EE corresponde à inicial de Eduardo Eler, (Projeto Piatam no rio Juruá e Instituto de Pesquisas Ecológicas - IPÊ - no rio Cuieiras) e MNFS corresponde a coletas realizados por Maria Nazareth F. da Silva em diferentes consultorias. Nos locais de amostragem, em cada margem do rio, as armadilhas foram distribuídas em transectos e dispostas em estações espaçadas a cada 20 metros. Os transectos iniciaram a uma distância de 50 metros da borda e em cada estação as armadilhas foram distribuídas duas de cada tipo em cada lado do transecto próximo a troncos e supostas tocas. Tanto fatias de banana como amendoim torrado e moído foram utilizados como iscas sendo repostas todos os dias. Os espécimes coletados tiveram seus dados de idade, medidas, sexo, condições reprodutivas, ambiente e condições climáticas anotados em um caderno de campo 15 padronizado pela curadoria da Coleção de Mamíferos do INPA. De cada indivíduo foi coletado os tecidos do fígado e do músculo femural que foram armazenados em tubos criogênicos com álcool etílico hidratado a aproximadamente 95% e mantidos em um freezer a –20o C. Os indivíduos analisados foram previamente classificados por um especialista. Como mencionado, todos os indivíduos coletados e suas respectivas partes (pele, carcaça, fluido, crânio, tecidos e/ou outros) foram depositados na Coleção de Mamíferos do INPA. 4.2 Extração de DNA As amostras de DNA dos indivíduos foram extraídas de acordo com protocolo descrito por Sambrook et al. (1989) com o tampão de lise ( Tris HCl 50 mM pH, 8.0; EDTA 20 mM, pH 8.0; SDS 1%; NaCl 200 mM e β-mercapto etanol 1%) de acordo com os seguintes procedimentos: Pesar não mais que 20 mg de tecido sendo este esfacelado e colocado em um tubo para microcentrífuga. Lavar rapidamente o tecido três vezes com 1 ml de tampão STE frio. Adicionar 550 µl de tampão de lise e imediatamente 11 µl de proteinase K no microtubo, utilizar o vortex e incubar a amostra a 55o C até que o tecido esteja totalmente degradado. Uma hora antes do fim da incubação adicionar 5,5 µl de RNAse A. Após a incubação, centrifugar a amostra a 13.000 RPM durante 10 minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Adicionar 350 µl de NaCl 5M (concentração final de 2M), utilizar o vortex por 15 segundos e centrifugar a 13.000 RPM durante 30 minutos. 16 Transferir 450 µl do sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga, adicionar 900 µl de etanol absoluto frio, homogeinizar a mistura e incubar a amostra a -20o C durante 2 horas ou ao longo da noite a 4o C. Centrifugar por 30 minutos (13.000 RPM) a amostra e descartar o sobrenadante deixando no tubo somente o pellet resultante da centrifugação. Lavar duas vezes o pellet com 1 ml de Etanol 70% (6.000 RPM por 5 minutos) sempre removendo o sobrenadante. Incubar o tubo com o pellet a 37o C até que este esteja seco. Ressuspender o pellet de DNA em tampão TE 1X a 55o C por cerca de 2 horas e armazenar o DNA em um freezer a uma temperatura de –20o C. A quantidade de DNA extraído foi calculada via espectofotometria ou comparação visual em gel de agarose 0,8%. 4.3 Amplificação e purificação dos fragmentos A amplificação do gene mitocondrial citocromo b foi realizada a partir do DNA total (Nuclear + Mitocondrial) previamente extraído e isolado através da técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction. Saiki et al., 1988) no termociclador Ependorff - Mastercycler Gradient ®. A obtenção do produto PCR foi através de uma reação com volume total de 25 μl contendo: 100 ng de DNA total, Tampão PCR 1X, 0,5 unidades de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP, 2 mM de Cloreto de Magnésio, 0,2 mM dos iniciadores (primers) para amplificação do fragmento de cit b. Os primers utilizados para a amplificação do cit b foram MVZ 05 (CCTCCGTAGCCCACA[T/C][A/T]TG[C/T]CG) e MVZ 16 (AAATAGGAA[A/G]TATCA[T/C]TCTGGTTT[A/G]AT, para coI foram os primers CoI F3 (TCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC) e CoI R3 (ACTTCYGGGTGRCCRAAR AATCA) (Ward et al,. 2005 com modificações) e água ultrapura para completar o volume. Os primers foram retirados do banco de dados do Museum of Vertebrates Zoology, University of 17 California, Berkeley, tendo sido utilizados anteriormente (Silva & Patton (1993), da Silva 1995). O termociclador foi programado para a amplificação de cit b utilizando passos de desnaturação a 92o C por 2 minutos, seguido de anelamento dos Primers a 45o C por 1.5 minutos e 2 minutos de extensão a 72o C em um total de 34 ciclos (da Silva e Patton, 1993). Para coI foi programado utilizando os passos: de desnaturação a 94o C por 30 segundos, seguido de anelamento dos Primers a 50o C por 40 segundos e 1 minutos de extensão a 72o C em um total de 35 ciclos. Depois de amplificados, os fragmentos PCR foram verificados e quantificados em gel de agarose 1,0% corado com EtBr (0,5 g/ml) tendo como referência o marcador Low Mass DNA Ladder ® (Invitrogen). A purificação dos fragmentos PCR resultantes da amplificação foi feita utilizando-se o Kit de purificação CONCERT RapidPCR Purification System ® (GIBCO) seguindo o protocolo e recomendações do fabricante. 18 4.4 Seqüenciamento O seqüenciamento foi realizado de acordo com a técnica de terminação em cadeia por dideoxiribonucleotídeos (ddNTPs) descrita por Sanger et al. (1977), utilizando-se terminadores marcados com fluorescência. Para isso foi utilizado o Kit de seqüenciamento DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing ® (GE HealthCare) seguindo o protocolo e recomendações do fabricante. As reações foram feitas em placas de 96 poços utilizando: cerca de 150 ng e 300 ng do produto PCR já purificado; 5pMol de cada primer em reações separadas; 4 μl do premix (Kit) e água ultrapura completando o volume total para 10 μl. Os ciclos desta amplificação foram um total de 30 tendo cada um deles um passo de desnaturação a 95o C por 20 segundos, anelamento a 50o C por 15 segundos e extensão a 72o C durante 1,5 minutos. Os fragmentos resultantes foram submetidos a uma precipitação eliminando assim as impurezas resultantes do processo; logo após, foram seqüenciados no seqüenciador automático MegaBACE 1000 ® (GE HealthCare) utilizando os parâmetros de 300 minutos de tempo de corrida a 6 kV e 100 segundos de injeção a 2kV. 4.5 Edição e alinhamento das seqüências. Os dados resultantes do seqüenciamento foram salvos na extensão .abd e o alinhamento das seqüências foi feito utilizando-se o programa de alinhamento múltiplo Clustal W (Thompson et al., 1994) incluso no software Bioedit 7.0.9 (Hall, 1999). Após o alinhamento automático foi feita uma revisão manual dos dados alinhados e a edição foi feita utilizando-se o mesmo software. 4.6 Sistemática molecular e análises filogenéticas Para melhor compreensão taxonômica e filogenética, foram incluídas 155 seqüências parciais do gene cit b de indivíduos devidamente identificados cedidas gentilmente por James 19 Patton e Maria Nazareth Ferreira da Silva seqüências essas obtidas ao longo das duas últimas décadas no laboratório do Museum of Vertebrate Zoology, Universidade da Califórnia, Berkeley, por Patton e vários de seus (ex) alunos (Anexo 1). Para o gene coI foram utilizadas as seqüências disponíveis no Genbank, utilizadas no trabalho de Borisenko e colaboradores (2007) com mamíferos da Guiana Francesa (Anexo 2). Para se verificar o nível de saturação das substituições foram plotadas em um gráfico o número de transições e transversões versus divergência através do programa Dambe v. 4.2.13 (Xia & Xie, 2001). Para se estimar as relações de parentesco e confirmar a posição de indivíduos da mesma espécie ou grupo de Proechimys dentro de um único clado foram utilizados os métodos filogenéticos baseados em Distância, Máxima Verossimilhança “MV” (Felsenstein, 1981) e Máxima Parcimônia “MP” (Hennig, 1966); os resultados obtidos pelos três métodos foram comparados. Todas as análises dos modelos foram feitas pelo programa PAUP 4.0 (Swofford, 1999). Para encontrar o modelo adequado para as análises da árvore baseada em Distância fenética e por máxima verossimilhança (10.000 replicatas) foi utilizado o programa Modeltest 3.7 (Posada & Crandall, 1998). Na árvore de máxima parcimônia foi estimado seu comprimento em número de passos (L), o índice de consistência (CI), o índice de retenção (RI), o índice de consistência reescalonado (RCI) e o índice de homoplasia (IH). Como várias árvores foram igualmente parcimoniosas, foi realizado o consenso estrito entre todas elas. A validade de cada nó interno foi avaliada através da análise de bootstrap, realizada com 1.000 replicatas. Em adição foi feita busca heurística (TBR - Tree bissection and reconection) com 25 replicatas visando aumentar a versatilidade da análise. Para o enraizamento das árvores encontradas, foram utilizados como grupos externos outros gêneros de roedores equimídeos como Trinomys 20 (gi|23394314|gb|AF422924.1|) e Isothrix (gi|995846|gb|L23355.1|) para cit b e o morcego do gênero Lasiurus (gi|156078929|gb|EU096756.1|) para coI. 21 5. RESULTADOS 5.1 Análise das seqüências de citocromo b (cit b) As amplificações do gene cit b resultaram em banda única no gel de agarose. O tamanho estimado do amplicon foi de 700 pares de bases (pb). As seqüências obtidas foram comparadas às do GenBank para checar se de fato correspondiam ao gene mitocondrial cit b, tendo sido assegurado a ortologia ao gene mediante o uso do programa Blast. A composição de bases média de cit b dos Proechimys analisados foi: A=29,2%; C=24%; G=14,3% e T=32,4%. Esses valores estão bem próximos das porcentagens encontradas o cit b de outros Proechimys. Após a edição automática e manual das seqüências foi efetuado o alinhamento nucleotídico múltiplo das seqüências. O alinhamento de 638 sítios indicou a existência de 257 sítios variáveis sendo 221 informativos para parcimônia. Dentre os xx modelos evolutivos testados pelo programa Modeltest, o modelo evolutivo escolhido foi HKY+I+G, o qual foi utilizado para as análises de máxima verossimilhança e de distância genética corrigida . Plotando-se a distância genética versus a quantidade de mutações (transversões e transições) observou-se que não houve saturação nucleotídica, exceto quando inseridas a seqüência do grupo externo (Trynomys) cujas transições saturam ao redor de 20% de distância genética (figura 3). Como observado em outros organismos, a maioria das mutações ocorreram na terceira posição do códon, sendo a maioria silenciosas. Apesar disso, a obtenção das árvores de máxima parcimônia e máxima verossimilhança foram feitas com a utilização dos três códons. Figura 3 – Gráfico de transição/transversão vs. distância genética (HKY85). Ts= transição; Tv = transversão. 22 Nos Proechimys analisados a distância genética entre espécies variou de 10,5% a 18,13%. Já, a distância detectada entre os indivíduos da mesma espécie nominal ficou abaixo de 10% sendo que na média foi de 3,5%. 5.2 Identificação molecular pelo citocromo b (cit b) As seqüências do cit b dos 65 indivíduos analisados neste trabalho foram agrupadas as 155 seqüências gentilmente cedidas por James Patton e M. N. F. da Silva. Com o uso de chaves de identificação dicotômica, os 65 indivíduos foram tentativamente identificados até o nível de espécie. Tomando como base a distância genética e o posicionamento dentro de cada clado monofilético obtido por máxima parcimônia e máxima verossimilhança procedeu-se a taxonomia molecular dos 65 Proechimys analisados. Destes, 36 indivíduos tiveram sua identificação molecular congruente com a identificação morfológica provisória realizada a priori; 20 indivíduos identificados morfologicamente a priori não tiveram sua identificação molecular confirmada mas após uma re-análise morfológica as identificações taxonômicas foram congruentes; 6 indivíduos sem identificação a priori ao nível de espécie foram agrupados dentro de espécies de acordo com sua distância genética e localização no clado monofilético; dois indivíduos afins, sem identificação a priori ao nível de espécie, não se agruparam em nenhuma espécie, tanto molecularmente como morfologicamente, indicando tratar-se de uma nova espécie; um índividuo identificado morfologicamente a priori e a posteriori como P. gardneri foi identificado molecularmente como longicaudatus, sendo a única situação de discordância que se manteve a posteriori (Tabela 2). Um conjunto de espécies identificadas a priori como pertencentes ao grupo longicaudatus formaram um único grupo na árvore de distância genética sendo que posteriormente foram identificados como P. brevicauda. Porém, este grupo não se agrupou geneticamente com os P. brevicauda analisados por Patton e colaboradores (2000). 23 Tabela 2 – Identificações molecular e morfológica a posteriori dos indivíduos do gênero Proechimys seqüenciados neste estudo. ID molecular* ID morfológica** P. cuvieri REGISTRO Iniciais COL No CAMPO P. cf. cuvieri AM 173 P. cuvieri P. cuvieri AM 196 P. cuvieri P. cuvieri EE 217 P. cuvieri P. cuvieri EE 218 P. cuvieri P. cf. cuvieri EE 238 P. cuvieri P. cuvieri INPA 5514 MLOB 74 P. cuvieri P. cuvieri INPA 5535 MLOB 95 P. cuvieri P. cuvieri INPA 5539 MLOB 99 P. cuvieri P. cuvieri INPA 5050 RNL 34 P. echinothrix P. cf. echinothix EE 147 P. echinothrix P. cf. echinothix INPA 5379 MCA 5 P. gardneri P. c.. gardneri INPA 4573 BAC 76 P. gardneri P. cf. gardneri INPA 4576 BAC 79 P. gardneri P. gardneri INPA 4583 BAC 86 P. gardneri P. cf. gardneri INPA 4591 BAC 94 P. gardneri P. gardneri INPA 5376 MCA 2 P. gardneri P. gardneri INPA 5390 MCA 17 P. gardneri P. gardneri INPA 5391 MCA 18 P. gardneri P. sp INPA 4623 MSF 583 P. gardneri P. gardneri INPA 4631 MSF 591 P. gardneri P. gardneri INPA 4633 MSF 593 P. gardneri P. gardneri INPA 4704 MSF 666 P. gardneri P. gardneri INPA 4705 MSF 667 P. goeldii P. sp MNFS 2156 P. goeldii P. sp MNFS 2168 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis AM 124 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis AM 126 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis AM 128 P. cf. guyannensis P. sp CEF 1 P. cf. guyannensis P. sp CEF 10 P. cf. guyannensis P. sp CEF 12 P. cf. guyannensis P. sp CEF 14 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5450 MLOB 10 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5455 MLOB 15 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5482 MLOB 42 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5019 RNL 3 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5021 RNL 5 24 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5024 RNL 8 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5028 RNL 12 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5033 RNL 17 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5044 RNL 28 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5052 RNL 36 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5053 RNL 37 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5054 RNL 38 P. cf. guyannensis P. gr. guyannensis INPA 5055 RNL 39 P. roberti P. sp CMS 51 P. roberti P. sp MNFS 2154 P. roberti P. sp MNFS 2157 P. roberti P. sp MNFS 2174 P. simonsi P. cf. simonsi EE 137 P. simonsi P. simonsi EE 141 P. simonsi P. sp MSF 669 P. sp. (grupo goeldii) P. sp CGB 63 P. sp. (grupo goeldii) P. sp INPA 4717 MSF 679 P. sp. (grupo longicaudatus)*** P. cf. brevicauda INPA 4558 BAC 64 P. sp. (grupo longicaudatus)*** P. gardneri INPA 4579 BAC 82 P. sp. (grupo longicaudatus)*** P. sp INPA 4754 CGB 9 P. sp. (grupo longicaudatus)*** P. cf. brevicauda INPA 4768 CGB 23 P. sp. (grupo longicaudatus)*** P. cf. brevicauda INPA 4780 CGB 35 P. sp. (grupo longicaudatus)*** P. cf. brevicauda INPA 4789 CGB 44 P. sp. (grupo longicaudatus)*** P. cf. brevicauda INPA 5410 MCA 37 P. sp. (grupo longicaudatus)*** P. cf. brevicauda INPA 5419 MCA 46 P. sp. (grupo longicaudatus)*** P. sp MNFS 2172 P. sp. (grupo longicaudatus)*** P. sp.*** MNFS 2173 P. steerei P. steerei EE 116 INPA 4707 (*) identificações moleculares tiveram como referência as seqüências em GenBank e, principalmente, as seqüências obtidas no laboratório do Dr. James L. Patton (MVZ / UC, Berkeley), em colaboração com seus (ex) alunos de doutorado (M. N. F. da Silva, M. Lara, Y. Leite e L. P. Costa) e vários outros colaboradores; (**) Identificação provisória pois estudos morfológicos, morfométricos e citogenéticos em andamento estão sendo realizados pela Dra. MNF da Silva e colaboradores. Identificações preliminares aqui apresentadas tiveram por base o exame qualitativo de estruturas cranianas, conforme Patton (1987) e da Silva (1996), a morfologia externa dos animais e eventualmente citogenéticos; (***) presumivelmente o mesmo táxon que em da Silva (1998; Fig. 13) foi denominado Proechimys sp, rio Madeira, do grupo longicaudatus. Espécimes em negrito ainda não foram examinados morfológica e/ou morfometricamente. 25 A análise de máxima parcimônia não resultou em uma árvore que demonstrasse relações de parentesco entre os táxons, porém cada um foi claramente agrupado em clados monofiléticos com altos valores de bootstrap (Figura 4). P. cuvieri apresentou dois clados distintos, decorrentes provavelmente da natureza composta desse táxon. Os indivíduos CGB 63 e INPA 4717 também se agruparam em um único clado chamado Proechimys sp. Um único indivíduo de P. kulinae se posicionou fora do clado monofilético de sua espécie e como o indivíduo mais basal do gênero. Considerando a falta de resolução nos nós mais basais da árvore, a monofilia de vários grupos de espécies (sensu Patton 1987) não foi confirmada, como é o caso dos grupos guyannensis (que nessa análise não reune P. cf. roberti aos demais representantes do grupo), goeldii (que apesar de associar P. steerei e P. quadruplicatus com valores baixos de boostrap não se associa a P. goeldii), cuvieri (que nessa análise se subdivide em dois clados monofiléticos independentes) e longicaudatus (que não associa P. longicaudatus e P. brevicauda). Os valores dos índices obtidos pela análise foram de: IC=0.298; IR=0,750; CR=0,224 e IH=0,702. O tamanho mínimo das árvores obtidas foi de 340 passos e o máximo de 3544. Assim como na análise de máxima parcimônia, o indivíduo INPA 3515, identificado como P. kulinae, está na posição basal para o gênero na análise de MV, e os clados mais terminais que agrupam os vários indivíduos em grupos monofiléticos de Proechimys obtiveram altos valores de consistência. Alguns valores de verossimilhança nos nós que indicam a relação de parentesco entre as espécies foram baixos (Figura 5). Porém, a topologia da árvore demonstra relações de parentesco mais consistentes com as estabelecidas por Patton (1987), ao associar os representantes do grupo goeldii (P. quadruplicatus, P. steerei e P. goeldii), do grupo simonsi e do grupo cuvieri, embora este último esteja inserido no grupo longicaudatus; outra exceção é o grupo guyannensis, com a falta de associação entre representantes desse grupo e o clado de P. cf. roberti. Os indivíduos (INPA 4117 e CGB 83) denominados Proechimys sp. se agruparam em um único clado monofilético que se associa aos representantes do grupo goeldii (P. goeldii, P. steerei e P. quadruplicatus). As árvores de máxima parcimônia foram geradas em separado para cada clado, e as topologias apresentadas foram comparadas e tiveram por base as topologias apresentadas por Patton et al. (2000) e, para P. roberti e P. oris, por Weksler et al. (2001). As topologias de máxima verossimilhança para cada grupo foram extraídas de uma árvore obtida previamente a partir de análise realizada com todos os indivíduos representados neste estudo. Quando possível, as localidades foram resumidas às suas bacias hidrográficas para melhor compreensão das árvores. 26 Figura 4 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de 15 espécies do gênero Proechimys. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística. 27 Figura 5 –Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de 15 espécies do gênero Proechimys. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. 28 A seguir são apresentados, por espécie ou grupo de espécies de Proechimys, as filogenias obtidas com o citocromo b utilizando a máxima parcimônia e a máxima verossimilhança. P. gardneri e P. pattoni Nas análises de máxima parcimônia, 124 dos 638 sítios foram variáveis e destes 85 foram parcimoniosamente informativos. Os valores dos índices obtidos foram: IC = 0,815; IR = 0,914; CR=0,745 e IH = 0,185. O tamanho mínimo das árvores foi de 132 passos e o máximo de 431. As duas espécies se separaram em clados monofiléticos distintos, suportadas por altos valores de boostrap de 94.03 e 100% nas análises de máxima verossimilhança e máxima parcimônia, respectivamente, e são divergentes entre si por uma média de 11,6% (Figs. 6 e 7). Todos os indivíduos de P. pattoni para os quais temos seqüências são procedentes do rio Juruá, e se agruparam em um único clado monofilético, com níveis de divergência de 2,1%. Para P. gardneri, sua monofilia também é suportada por altos valores de boostrap em ambas as análises (máxima verossimilhança e máxima parcimônia, respectivamente com valores de 98,15 e 100%). Representantes dos rios Juruá e Urucú formam um clado suportado por altos valores de bootstrap em ambas as análises (94,17 e 83% para máxima verossimilhança e máxima parcimônia, respectivamente), e divergem entre si por uma média de 2,5%. Já os representantes do rio Madeira formam uma politomia não resolvida na análise de máxima parcimônia, mas se associam com suporte moderado de valor 60,42 nas análises de MV, e apresentam um distância genética média de 0,7% entre si. Entretanto, um indivíduo (INPA 4623) se posiciona basalmente como grupo-irmão de todos os indivíduos de P. gardneri aqui analisados. A divergência média entre os haplótipos do rio Madeira e os do clado Juruá/Urucu é de 2,5%. Considerando o importante papel biogeográfico atribuído ao rio Madeira, é interessante notar que os haplótipos (INPA 4704 e 4705) de indivíduos provenientes da margem direita, não indicam a ocorrência de monofilia recíproca em relação aos haplótipos da margem esquerda, o que seria esperado caso o rio Madeira atuasse como divisor zoogeográfico. 29 Figura 6 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys gardneri e Proechimys pattoni. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 30 Figura 7 –Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys gardneri e Proechimys pattoni. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 31 Proechimys roberti As análises de máxima parcimônia demonstraram que 126 dos 638 sítios foram variáveis e destes 79 foram parcimoniosamente informativos. Os valores dos índices obtidos foram: IC = 0,847; IR = 0,900; CR=0,762 e IH = 0,153. O tamanho mínimo das árvores foi de 133 passos e o máximo de 373. Tanto a análise de máxima parcimônia como a de máxima verossimilhança demonstram que P. roberti não pertence ao grupo guyannensis. P. roberti divide-se em dois grupos monofiléticos distintos, suportados por valores de bootstrap de moderado a muito alto (Figs. 8 e 9). O clado mais a leste é composto por indivíduos das regiões de Paraupebas e Marabá no Pará, Chapada dos Veadeiros/Fazenda Fiandeiras em Goiás e rio Santa Teresa no Estado do Tocantins. O segundo clado, mais a oeste, também é formado por indivíduos representantes de localidade situada no centro-leste da Amazônia, como a região próxima a foz do rio Tapajós, que se associa a localidade do alto rio Jamari, afluente do rio Madeira; ambas tem a localidade do rio Cristalino próxima a Alta Floresta, Mato Grosso como grupo irmão. A distância genética entre os dois clados do leste e oeste é de 6,7%; apesar de considerável, para roedores do gênero Proechimys, esses níveis de divergência são normalmente encontrados entre unidades geográficas (supostamente) intraespecífcas. Apesar disso, e embora os espécimes provenientes de Alta Floresta (LPC 522 e 540) tenham sido identificados pela própria Leonora Pires Costa (LPC) e por James L. Patton (JLP) como P. roberti, considerando a congruência geográfica e o nível de divergência separando esses dois clados, um estudo mais detalhado à luz das novas amostras provenientes das bacias dos rios Madeira e Tapajós é recomendado. 32 Figura 8 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys roberti. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 33 Figura 9 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys roberti. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 34 P. echinothrix Nas análises de máxima parcimônia, 144 dos 638 sítios foram variáveis e destes 85 foram parcimoniosamente informativos. Os valores dos índices obtidos foram: IC = 0,767; IR = 0,882; CR=0,677 e IH = 0,233. O tamanho mínimo das árvores foi de 155 passos e o máximo de 553. Ambas as análises demonstraram congruência entre os clados monofiléticos e as localidades analisadas (Figs. 10 e 11). Em ambas topologias, três grupos foram evidentes os quais apresentaram na base alto índice de consistência dos ramos. A divergência entre estes grupos foi de 9,4%. Um grupo corresponde as populações da bacia do rio Negro (Jaú e Tiquié), outro grupo representando os indivíduos das regiões dos rios Juruá e Urucu e um outro ramo correspondendo a um indivíduo proveniente da margem esquerda do rio Madeira (INPA5379). Dentro do grupo Juruá/Urucu ocorreu uma nítida divisão entre populações correspondentes a margem direita e a margem esquerda do rio Juruá. O indivíduo INPA5379 que na análise de máxima parcimônia não se associou aos outros dois grupos, na análise de máxima verossimilhança posicionou-se como grupo irmão do grupo do clado representativo das regiões do rio Juruá e Urucu. A distância genética entre o haplótipos do rio Tiquié e os do Jaú foi de 0,9%. A distância entre os indivíduos das diferentes margens do rio Juruá foi de 3,8 %. A distância do indivíduo do rio Madeira para o grupo Jaú/Tiquié foi de 9% e para o grupo Juruá/Urucu foi de 7%. 35 Figura 10 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys echinothrix. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. Figura 11 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys echinothrix. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 36 P. simonsi As análises de máxima parcimônia demonstraram que 145 sítios dos 638 foram variáveis e destes 70 foram parcimoniosamente informativos. Os scores obtidos foram: IC = 0,650; IR = 0,722; CR=0,469 e IH = 0,350. O tamanho mínimo das árvores obtidas foi de 156 passos e o máximo de 458. Das espécies estudas esta foi a que apresentou menores valores de consistência das topologias geradas no entanto todos os clados estão comgruentes com suas localidades com exceção de um clado composto por indivíduos das regiões dos rios Madeira, Alto Madre de Dios e Juruá (Figs. 12 e 13). A distância genética entre os indivíduos deste clado varia de 0,9% a 1,7%. A variação da distância dentro da espécie é de a 4,3% Figura 12 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys simonsi. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 37 Figura 13 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys simonsi. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 38 Grupo goeldii Para as análises de máxima parcimônia, 188 dos 638 sítios foram variáveis e destes 160 foram parcimoniosamente informativos. Os valores dos índices obtidos foram: IC = 0,598; IR = 0,890; CR=0,533 e IH = 0,402. O tamanho mínimo das árvores foi de 216 passos e o máximo de 1537. As quatro espécies integrantes do grupo goeldii, P. quadruplicatus, P. goeldii, P. steerei e P. sp., analisadas por máxima parcimônia e máxima verossimilhança se separaram em clados monofiléticos distintos (Figs. 14 e 15). Os indivíduos da região do rio Madeira (P. sp), divergente em 11% na média, se apresentou como grupo irmão das demais espécies do grupo goeldii. Análises morfológicas em andamento possivelmente contribuirão para definir sobre a inclusão de P. sp. no grupo de espécies goeldii (sensu Patton 1987). Em P. quadruplicatus, na análise de MV, três clados foram formados, sub-dividindo em unidades geográficas os indivíduos da região do rio Negro (Brasil), de San Carlos do Río Negro (Venezuela) e da região do rio Tahuayo e rio Santiago (Peru). A distância genética média entre os indivíduos de P. quadruplicatus variou de 4,5% a 5%. Representantes da espécie P. steerei foram agrupados em dois clados distintos, um formado por amostras da região dos rios Urucu/Juruá e outro pelos indivíduos da região do Rio Jaú. Representantes do rio Xingu e do rio Tapajós de P. goeldii se associaram por alto suporte com valores 100% para ambas as análises; a distância genética média entre os haplótipos de ambas as drenagens é de 5%. Para todas as três espécies, o nível de divergência intra-específica dos haplótipos representantes das diversas drenagens (que também correspondem aos clados mais terminais), variou de 4,5% a 6%, indicando níveis consideráveis de diferenciação interpopulacional para as espécies do grupo goeldii aqui representadas. A distância genética entre as espécies foi consideravelmente maior: P. goeldii e P. steerei divergem em 12%, P. goeldii e P. quadruplicatus 13%, P. steerei e P. quadruplicatus 10% e, por fim, a distância de P. sp. de P. goeldii, P. quadruplicatus e P. steerei foi de 11%, 11,4% e 11,3%, respectivamente. 39 Figura 14 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys quadruplicatus, P. steerei e P. goeldii e Proechimys sp (grupo goeldii). Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 40 Figura 15 – Árvore de Máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys quadruplicatus, P. steerei e P. goeldii e Proechimys sp (grupo goeldii). Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 41 Proechimys cf. guyannensis Nas análises de máxima parcimônia, 148 dos 638 sítios foram variáveis e destes 82 foram parcimoniosamente informativos. Os valores dos índices obtidos foram: IC = 0,713; IR = 0,839; CR=0,598 e IH = 0,287. O tamanho mínimo das árvores foi de 164 passos e o máximo de 573. Dentro do grupo quatro clados foram distintos: o primeiro formado por indivíduos da região do Pico da Neblina; o segundo por um único indivíduo de El Pauji na Venezuela; o terceiro por indivíduos da região de Pedra Branca do Amapari – AP e do rio Jarí; e por último por indivíduos das regiões do rio Uatumã (UHE – Balbina), alto Jatapú e fragmento do PDBFF (próximo de Manaus) (Figs. 16 e 17). A distância genética entre os clados mais próximos é de 9,5%, com exceção entre o terceiro e quarto clado que mantiveram uma distancia de 4,5 %. Figura 16 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys cf. guyannensis. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 42 Figura 17 –Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys cf. guyannensis. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 43 Proechimys cuvieri (grupo cuvieri) Para as análises de máxima parcimônia, 159 dos 638 sítios foram variáveis e destes 103 foram parcimoniosamente informativos. Os valores dos índices obtidos foram: IC = 0,673; IR = 0,866; CR=0,583 e IH = 0,327. O tamanho mínimo das árvores obtidas foi de 179 passos e o máximo de 830. Apesar das topologias apresentarem em alguns ramos valores de bootstrap e verossimilhança baixos (Fig. 18 e 19), ambas as análises demonstraram congruência entre os clados monofiléticos e suas respectivas localidades. Dois grandes grupos, divergentes aproximadamente em 8%, foram formados na base de ambas topologias com alto índice de consistência dos ramos, um representando os indivíduos amostrados no rio Juruá (Amazonas, Brasil) e rio Blanco (Loreto, Perú) e o outro representando os indivíduos amostrados das regiões dos rios Cuyuni (Bolívar, Venezuela), Santiago (Amazonas, Peru), Tiquié, Negro, Cuieiras e Uatumã no Estado do Amazonas, Jarí no limite dos Estados do Pará e Amapá, Pedra Branca do Amapari no Amapá e Guiana Francesa. 44 Figura 18 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys cuvieri. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 45 Figura 19 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys cuvieri. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. 46 Grupo longicaudatus Para as análises de máxima parcimônia, 170 dos 638 sítios foram variáveis e destes 130 foram parcimoniosamente informativos. Os valores dos índices obtidos foram: IC = 0,652; IR = 0,895; CR=0,584 e IH = 0,348. O tamanho mínimo das árvores foi de 184 passos e o máximo de 1120. A análise de máxima verossimilhança indica que o grupo longicaudatus (sensu Patton 1987) é parafilético, pois agrupa P. cuvieri (grupo cuvieri) como grupo irmão do clado P. longicaudatus + P. sp, enquanto P. brevicauda ficou como grupo irmão dessas três espécies. Vale notar que a análise de máxima parcimônia apresente uma politomia entre as espécies. Três clados diferenciados são evidenciados e suportados por altos valores de bootstrap em ambas as análises (Figs. 20 e 21), correspondendo a no mínimo três espécies de Proechimys: P. sp. do rio Madeira (possivelmente o mesmo táxon que em da Silva, 1998) que foi subdividido em três sub-clados geograficamente estruturados suportados por altos valores de bootstrap, P. longicaudatus com representantes do rio Paragua, Bolívia e P. brevicauda, com representantes do norte e sul do Peru e da região do alto rio Juruá, Brasil. A distancia genética entre os representantes de Proechimys sp. do rio Madeira e os representantes de P. longicaudatus e de P. brevicauda é de 10,7% e 11%, respectivamente. Similarmente, a distancia genética entre os representantes de P. brevicauda e de P. longicaudatus é 11%. É importante salientar a sub-divisão do clado do rio Madeira, que apresenta três subclados bem estruturados geograficamente e suportados por altos valores de bootstrap em ambas as análises: no primeiro deles, utilizamos o indivíduo IM3575 como referência em função de análises moleculares anteriores (da Silva, 1998) revelarem a distinção desse indivíduo em relação a outras espécies de Proechimys (veja também Patton et al, 2000). Esse sub-clado reúne representantes das regiões de Porto Velho, UHE de Samuel e do alto Jamari, Rondônia; os outros dois sub-clados reúnem representantes do rio Aripuanã, um afluente da margem direita do curso médio do rio Madeira. Os indivíduos analisados das margens direita e esquerda do rio Aripuanã se segregaram em sub-clados distintos, reciprocamente monofiléticos na análise de máxima parcimônia, mas na análise de máxima verossimilhança o sub-clado da margem esquerda do Aripuanã é grupo irmão dos outros dois, que se associam com suporte moderado. O nível de divergência entre os sub-clados das margens direita e esquerda do rio Aripuanã é de 4%, e entre esses e o sub-clado Porto Velho/Jamari é de 5,8%. 47 Figura 20 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys sp., Proechimys brevicauda e P. longicaudatus. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística e os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. O clado identificado como Proechimys sp. provavelmente é uma espécie nova do rio Madeira. 48 Figura 21 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial citocromo b de Proechimys sp., Proechimys brevicauda e P. longicaudatus. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. Os indivíduos marcados com asterisco correspondem aos roedores seqüenciados no presente trabalho. O clado identificado como Proechimys sp. provavelmente é uma espécies nova do rio Madeira. 49 5.3 Identificação molecular pela citocromo oxidase I (coI) Para avaliar o potencial do gene citocromo oxidase I (coI) discriminar as espécies de Proechimys, bem como avaliar a capacidade do gene reconstruir a filogenia do gênero foi realizado uma análise com indivíduos representativos dos grupos monofiléticos detectados com o gene cit b. Assim, dois indivíduos de cada unidade taxoxômica (P. goeldii, P. sp (grupo goeldii), P. steerei, P. sp. (grupo longicaudatus), P. roberti, P. simonsi, P. cuvieri, P. gardneri, P. echinothrix e P. cf. guyannensis) foram amplificados com primers do coI. Como resultado das amplicações foi obtido uma única banda no gel de agarose com tamanho estimado de 600 pares de bases (pb). Após o seqüenciamento, as seqüências foram comparadas às do Genbank para checar sua correspondência com o gene mitocondrial coI, tendo sido assegurado a ortologia ao gene mediante o uso do programa Blast. Adicionalmente 14 sequencias de Proechimys (Tabela 2) provenientes do Genbank foram integradas às análises de MV, máxima parcimônia e na composição da matriz de distância perfazendo um total de 34 indivíduos de 12 espécies. A composição de bases do COI dos Proechimys analisados foi: A=28.7; C=22.7; G=14.9 e T=33,6. Esses valores estão bem próximos das porcentagens encontradas na mesma região amplificada em outros Proechimys. O alinhamento múltiplo nucleotídico seguido do manual de 507 sítios indicou a existência de 176 sítios variáveis sendo 158 informativos para parcimônia. Dentre os 56 modelos evolutivos testados pelo programa Modeltest, o modelo evolutivo escolhido foi GTR+I+G, o qual foi utilizado para as análises de máxima verossimilhança e na composição da matriz de distância. Plotando-se a distância genética versus a quantidade de mutações (transversões e transições), observou-se que a maioria das mutações ocorreram na terceira posição do códon, sendo todas silenciosas. Nos Proechimys analisados a distância genética detectada entre os indivíduos da mesma espécie variou de 0% a 4,6%. Já, a distância entre as espécies foi de 9,4% a 19,4% (tabela 3). A variação de distancia genética das espécies em relação ao grupo externo variou de 19,9% a 26,4%. 50 Tabela 3 – Distância genética entre as espécies do gênero Proechimys utilizando o gene mitocondrial coI e o parametro de distância GTR. P. goeldii P. sp P. steerei P. gr. longicaudatus P. roberti P. simonsi P. cuvieri P. goeldii P. sp 0.112 P. steerei 0.136 0.136 P. gr. longicaudatus 0.130 0.120 0.136 P. roberti 0.129 0.116 0.138 0.115 P. simonsi 0.156 0.153 0.161 0.135 0.146 P. cuvieri 0.144 0.117 0.144 0.094 0.110 0.140 P. gardneri 0.150 0.154 0.143 0.131 0.127 0.143 0.141 P. echinothrix 0.145 0.139 0.143 0.116 0.126 0.141 0.106 P. cf. guyannensis 0.157 0.146 0.156 0.143 0.121 0.132 0.115 P. hoplomyoides 0.194 0.157 0.167 0.154 0.151 0.181 0.157 P. gularis 0.135 0.118 0.138 0.111 0.116 0.122 0.075 Grupo_externo 0.261 0.246 0.240 0.243 0.217 0.240 0.226 P. gardneri echinothrix P. guiannensis P. hoplomyoides P. gularis P. P. goeldii P. sp P. steerei P. gr. longicaudatus P. roberti P. simonsi P. cuvieri P. gardneri P. echinothrix 0.122 P. cf. guyannensis 0.141 0.097 P. hoplomyoides 0.166 0.164 0.154 P. gularis 0.136 0.105 0.117 0.161 Grupo_externo 0.264 0.222 0.219 0.251 0.199 Todos os indivíduos analisados se agruparam em clados monofileticos tanto nas árvores de máxima verossimilhança como máxima parcimônia A espécie identificada molecularmente com o gene cit b como Proechimys sp. (grupo goeldii) manteve seu dois indivíduos (CGB63 e INPA 4717) monofiléticos e próximos a P. goeldii. As seqüências do genbank de espécies nominalmente iguais áquelas sequenciadas neste trabalho (P. cuvieri, P. cf. guyannensis, P. steerei e P. simonsi) também formaram clados monofiléticos. P. 51 hoplomyoides se apresentou monofilético em ambas as árvores ao contrário de P. gularis que nas análises de máxima verossimilhança se dividiu em ramos parafiléticos (Figuras 22 e 23). A exemplo do observado com o gene cit b, a análise de máxima parcimônia do coI não resultou em uma árvore que demonstrasse relações de parentesco entre os táxons. Os valores dos índices obtidos pela análise foram de: IC=0.397; IR=0,653; CR=0,259 e IH=0,603. O tamanho mínimo das árvores obtidas foi de 242 passos e o máximo de 1304. Messmo com baixo valor de consistência (59 de bootstrap) foi demonstrado o monofiletismo das espécies do grupo goeldii. Os valores de verossimilhança obtidos foram altos na definição dos clados de espécies porem baixos quando relacionados ao parentesco entre elas. A topologia apresentada foi totalmente diferente da obtida por cit b com exceção do monofiletismo do grupo goeldii. P. hoplomyoides do grupo trinitatus foi o grupo mais basal do gênero e P. goeldii a mais distante, congruente com a matriz de distância obtida entre as espécies. P. gularis (grupo longicaudatus) além do parafiletismo apresentado foi o que apresentou maior distancia entre indivíduos da mesma espécie (4,6%). Em relação às diferenças de topologia obtida nas análises com cit b P. cuvieri não se agrupou como irmão do grupo longicaudatus. P. steerei foi o mais basal dentro do grupo goeldii. Apresentaram-se como irmãos: P. cf. guyannensis e P.simonsi; P.gardneri e P. echinothrix; P. roberti e P. sp. (grupo goeldii). 52 Figura 22 – Árvore de máxima parcimônia utilizando a região do gene mitocondrial coI de 12 espécies do gênero Proechimys. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 1000 réplicas e 25 de busca heurística. 53 Figura 23 – Árvore de máxima verossimilhança utilizando a região do gene mitocondrial coI de 12 espécies do gênero Proechimys. Os números acima dos nós correspondem aos valores de bootstrap obtido em 2000 réplicas e os números abaixo dos nós indicam a distância genética entre cada clado. 54 6. DISCUSSÃO 6.1 Taxonomia molecular em Proechimys Desde a década de 90 tem sido feito um esforço considerável, especialmente por meio de análises moleculares, para se ter um panorama geral sobre a identificação e o relacionamento dos roedore Proechimys da Amazônia. No presente estudo, no total foram analisadas 220 seqüências parciais do citocromo b de 15 espécies de Proechimys (P. brevicauda, P. cuvieri, P. echinothrix, P. gardneri, P. goeldii, P. cf. guyannensis, P. kulinae, P. longicaudatus, P. pattoni, P. quadruplicatus, P. roberti (= P. oris), P. simonsi, P. sp. (grupo goeldi), P. sp. (rio Madeira – grupo longicaudatus) e P. steerei) e 34 seqüências parciais do citocromo oxidase I de 12 espécies de Proechimys (P. cuvieri, P. echinothrix, P. gardneri, P. goeldii, P. gularis, P. cf. guyannensis, P. hoplomyoides, P. roberti (= P. oris), P. simonsi, P. sp. (grupo goeldi), P. sp. (rio Madeira – grupo longicaudatus), e P. steerei). Os altos valores de suporte obtidos nos ramos terminais das árvores de máxima parcimônia e máxima verossimilhança são condizentes com as espécies de Proechimys e claramente demonstraram a validade do cit b e coI como uma ferramenta para a diagnose das espécies desse roedor. Essas análises moleculares, associadas as análises morfológicas e cariotípicas em andamento certamente permitirão uma melhor compreensão dos padrões e processos evolutivos das espécies de Proechimys da Amazônia. No presente trabalho, as variações da distância genética interespecíficas encontradas com cit b variaram de 9% a 11% entre espécies dentro dos grupos propostos por Patton (1987) e de 10% a 18% entre espécies de grupos diferentes. Estas variações são congruentes com os valores observados por da Silva (1998). A distância das espécies de Proechimys para as espécies do grupo externo (Isothrix e Trinomys) aqui analisadas variaram de 15% a 22%, valores também congruentes com da Silva (1998), que reporta valores de 16% a 30% de diferença em comparações entre Proechimys e outros roedores histricognatos usados como grupo externo, como Trinomys, Dactylomys, Euryzygomatomys, Thricomys, Cavia e Coendou. Nas análises de distância utilizando a região do gene coI, os valores mínimos e máximos de distância genética encontrados entre as espécies foram semelhantes aos valores com cit b. Por exemplo, a distância entre P. cf. guyannensis e P. cuvieri foi de 11,55% semelhante ao encontrado por Borisenko et al. (2007) que foi de 10,66%. Bradley & Baker (2001) analisando a variação dos níveis de divergência do citocromo b de quatro gêneros de roedores (Neotoma, Reithrodontomys, Peromyscus e Sigmodon) e sete gêneros de morcegos (Artibeus, Carollia, Chiroderma, Dermanura, Glossophaga, 55 Rhinophylla e Uroderma), verificaram que valores de distância genética em torno de 2% foram indicativos para variação intraespecífica; valores entre 2 e 11% tinham alta probabilidade de ser indicativo de populações disjuntas (eventualmente de espécies válidas); e valores maior de 11% foram indicativos para o reconhecimento seguro das espécies. Dessa maneira os valores de distância genética poderiam ser considerados úteis para a determinação dos limites para a determinação de espécies sob o conceito genético de espécie. Hebert et al (2004) tem advogado a idéia de que tão importante quanto a identificação correta de uma espécie há a necessidade de se estabelecer protocolos padrões para as coleções de DNA bem como protocolo padrão para depósito de esécimes testemunhos "vouchers" nas coleções. Outro objetivo do código de barras de DNA (taxonomia molecular) consiste em estabelecer uma biblioteca pública de 'DNA barcodes' possibilitando o acesso a esta informação, ampliando e democratizando estudos e conhecimentos sobre a biodiversidade. Esses autores também sugeriram que um valor aproximado de 10 vezes a distância média dentro de uma espécie para estabelecer os limites entre espécies, o que é condizente com os valores demonstrados no presente estudo. Borisenko et al. (2007) analisando a performance do código de barras de DNA (coI) em 74 espécies de pequenos mamíferos do Suriname destacaram que inconsistências entre as identificações taxonômicas feitas no campo e as identificações moleculares foram de apenas 3.4% sendo a maioria por má identificação no campo (3%). Esses autores relataram que a distância genética média intraespecifica calculada para 516 sequencias foi de 1.0% (0–5.3%) enquanto que a distância genética média interespecifica foi de 10.1% (1.5–22.2). No presente estudo os seguintes táxons de Proechimys merecem destaque na questão da taxonomia molecular: P. echinothrix, Proechimys sp. (provavelmente uma espécie nova do rio Madeira pertencente ao grupo grupo goeldii) P. cuvieri e Proechimys sp. (provavelmente uma espécie nova do rio Madeira pertencente ao grupo longicaudatus). Em P. echinothix três agrupamentos foram evidentes e a divergência entre estes clados foi de 9,4%. A distância genética entre esses clados de P. echinothrix está no limiar para se propor uma diferenciação em espécies. Assim, estudos comparativos complementares (como citogenéticos, morfológicos e ecológicos) em indivíduos provenientes das bacia do rio Negro (Tiquié/Jaú), do rio Madeira e dos rios Urucu/Juruá são altamente recomendáveis para se testar a hipótese de haver espécies crípticas. Os indivíduos INPA4717 e CGB63, ambos provenientes da margem esquerda do rio Madeira foram molecularmente identificadas como P. sp. do grupo goeldii pois se agruparam em um único clado relacionado às outras espécies do grupo goeldii. A distância genética 56 destes indivíduos em relação a espécie mais próxima (P. goeldii) foi de 11% o que é suficiente para supor que seja uma nova espécie. Porém, mais amostras são necessárias para corroborar tal suposição. Adicionalmente, com a identificação molecular dos indivíduos MNFS2156 e MNFS2168 como P. goeldii aumenta-se a área de distribuição geográfica da espécie que passa a incluir a região do rio Tapajós. Dez indivíduos do rio Madeira que tinham sido identificados morfologicamente como P. cf. brevicauda, P. sp. e P. gardneri formaram um clado distinto inserido no grupo longicaudatus. Por esta razão este grupo foi chamado de P. sp. do grupo longicaudatus. Nove desses 10 roedores são morfologicamente muito similares a P. brevicaida. O indivíduo IM3575 chamado de Proechimys sp. no trabalho de da Silva et al. (1998) se agrupou neste mesmo clado. É bem provável que o indivíduo INPA 4579 que fora identificado morfologicamente como P. gardneri foi ou mal identificado ou houve alguma falha na rotulagem do tecido pois o mesmo se agrupou a este clado e não ao clado de P. gardneri. Sendo assim, uma nova extração de tecido deste indivíduo deve ser feita para dirimir esta dúvida. A distância genética destes indivíduos em relação as espécies mais próximas (P. brevicauda e P. longicaudatus) foi de aproximadamente 11% o que é suficiente para supor que de fato seja mais uma nova espécie do rio Madeira. Estes dados sugerem a presença de uma espécie críptica com morfologia muito similar aos indivíduos de P. brevicauda. Finalmente, P. cuvieri que se dividiu em dois clados distintos com uma distância genética aproximada de 8% entre os clados. Um dos clados corresponde ao oeste/sudoeste da Amazônia (Juruá e Loreto) e o outro clado corresponde ao noroeste/norte/nordeste da Amazônia. Os indivíduos sequenciados neste trabalho se agruparam ao segundo clado. De acordo com Patton et al. (2000), P. cuvieri tem uma ampla distribuição e é formado por uma série de haplótipos estruturados geograficamente. Segundo os autores, morfologicamente P. cuvieri é muito uniforme o que dificulta a correlação entre morfologia e os diferentes grupos de haplótipos detectados. Dessa maneira, visto que a divergência genética entre os clados está bem próxima da divergência genética entre espécies de Proechimys é necessário estudos populacionais mais abrangentes, particularmente nas áreas geográficas intermediárias a estes dois clados. Com a possível presença de espécies crípticas, p. ex. no grupo longicaudatus, pode-se inferir que há casos onde a distribuição de uma determinada espécie foi superestimada. Nestes casos a identificação taxonômica molecular é bastante eficaz quando comparado a identificação morfológica. Caso semelhante foi observado em indivíduos analisados da espécie Sigmodon hispidus onde foi encontrado três clados monofiléticos com alto índice de 57 divergência genética sugerindo a possibilidade de serem espécies crípticas até então diagnosticadas com uma única espécie com ampla distribuição. Os roedores do gênero Proechimys são um dos grupos de mamíferos neotropicais que mais impõem dificuldades para o reconhecimento de espécies. Patton (1987) agrupou 57 espécies nominais de Proechimys em nove grupos, definidos por uma combinação de caracteres do crânio, dentição e báculo. Atualmente são atribuídas 25 espécies a esse gênero (Wilson & Reeder, 2005). Não obstante os grandes esforços feitos nos últimos anos para compreender os padrões da variação morfológica das espécies, o número real das espécies de Proechimys pode estar subestimado, especialmente quando se considera que inventários em regiões não estudadas têm revelado a existência de espécies totalmente desconhecidas para a ciência (da Silva, 1998) e os dados moleculares também apontam para a existência de espécies crípticas. Embora às vezes seja relativamente fácil distinguir espécies simpátricas de Proechimys, especialmente quando se combina análises morfológicas com marcadores genéticos (cromossomos ou DNA), a identifição das espécies quer seja no campo (animais vivos) quanto nos museus (espécimes testemunhos) ainda é uma tarefa difícil mesmo para especialistas, principalmente quando a espécie em questão apresenta uma ampla distribuição. No caso de Proechimys, os poucos estudos que tem contribuído para o entendimento das espécies nominais deste gênero (p. ex. Patton & Gardner, 1972; Gardner & Emmons, 1984; Patton, 1987, da Silva, 1998, dentre outros) ainda não permitem hipóteses detalhadas sobre o relacionamento filogenético das espécies ou dos grupos de espécies (sensu Patton 1987) a qual pertencem. No caso dos roedores Proechimys, geralmente de três a cinco espécies podem estar presentes em uma única localidade (simpatria), algumas vezes sendo inclusive coletadas ao mesmo tempo (sintopia). De acordo com da Silva (1995, 1998) e Patton et al. (2000), somente ao longo do Rio Juruá pelo menos oito espécies de Proechimys existem na região, todas elas reconhecidas com base nos padrões dos caracteres morfológicos, cromossômicos e moleculares. Em outra localidade da bacia amazônica (na Guiana Francesa) duas espécies de Proechimys, P. cayennensis (= P. guyannensis; veja discussão em Voss et al. 2001) e P. cuvieri), morfologicamente similares e simpátricas foram analisadas molecularmente (citocromo b e D-loop) por Steiner et al . (2000) e Van Vuuren et al. (2004). Foi encontrado que P. cuvieri apresenta uma maior diversidade genética quando comparado a P. cayennensis tendo sido cogitado que as populações de P. cuvieri poderiam estar geneticamente 58 estruturadas tendo em vista a existência de linhagens mitocondriais distintas associadas às regiões amostradas na Guiana Francesa. Baseado no conceito genético de espécie (Bateson, 1909) é bem provável que existam espécies com distribuições bem definidas, porém com zonas híbridas interligando outras regiões com espécies morfologicamente parecidas e sem isolamento reprodutivo dando assim, idéia desta maior distribuição (Baker & Bradley, 2006). Estes mesmos autores sugeriram que mais de 2000 espécies de mamíferos não são reconhecidas dentro de espécies já morfologicamente identificadas. Apesar do gênero Proechimys não estar listado entre as espécies com risco de extinção, o impacto nas populações por causa de desmatamentos e construções de hidroelétricas pode estar sendo substimado. É possível que populações ou mesmo espécies crípticas estejam sofrendo reduções drásticas de sua diversidade genética ou extinções de linhagens mitocondriais sem que a ciência tenha feito o devido registro (Garner et al., 2004). 6.2 Sistemática molecular em Proechimys De acordo com Futuyma (1992) o estudo das relações evolutivas entre os organismos é conhecido como Sistemática. A Sistemática é a base para estudos biogeográficos e ecológicos e via de regra a história evolutiva dos organismos está associada às mudanças geográficas e climáticas. O DNA, por sua vez, tem sido utilizado há bastante tempo para estudar a evolução dos organismos denominando-se sistemática molecular ou filogenia molecular tal tipo de abordagem (Hillis et al., 1996). Entre os genes mais comumente utilizados na sistemática molecular dos roedores está o gene mitocondrial cit b, embora genes nucleares começam, também, a serem utilizados. Análises de sistemática molecular nos equimídeos, usando o cit b, evidenciaram uma marcante falta de diferenciação molecular dos gêneros sugerindo ter havido uma divergência quase que simultânea. Lara et al. (1996) denominaram a estrutura da árvore resultante de “star phylogeny” a qual era composta de ramos terminais longos e distintos (principalmente grupos de gêneros e espécies) e apenas os nós imediatamente abaixo ou acima das politomias basais da família possuiam suporte estatístico. À partir do trabalho de Lara et al. (1996) os trabalhos seguintes tem demonstrado que os gêneros Proechimys e Hoplomys são grupos irmãos (Leite & Patton, 2002; Galewski et al., 2005; Patterson & Velazco, 2007) e que Thrichomys tem o staus taxonômico de gênero. 59 da Silva (1998) foi a primeira autora a apresentar uma filogenia molecular para espécies de Proechimys (P. amphicoricus, P. brevicauda, P. cayennensis (= P. guyannensis), P. cuvieri, P. echinothrix, P. gardneri, P. kulinae, P. pattoni, P. sp. (Rio Madeira), P. quadruplicatus, P. simonsi e P. steerei). No trabalho foi mostrado que apesar da filogenia apresentada ter pouco suporte de relacionamento entre as espécies sua topologia condizia com a identificação das espécies. Posteriormente, uma filogenia com várias politomias foi apresentada por Patton et al. (2000) para oito espécies de Proechimys do rio Juruá (P. brevicauda, P. cuvieri, P. echinothrix, P. gardneri, P. kulinae, P. pattoni, P. simonsi e P. steerei). Em ambos trabalhos a árvore de máxima parcimônia apresentada excluia da análise a terceira posição do códon do gene cit b. O mesmo problema relacionado a inconcistência dos nós mais basais obtidos nas analises de máxima parcimônia de Proechimys foi encontrado em estudos com outros roedores, como por exemplo Phyllomys (Leite, 1992) e murídeos (Tiemann-Boege et al., 2000; Durish et al.2004; Steppan et al., 2005). As análises de máxima parcimônia dos genes mitocondriais cit b e coI não foram suficientes para estabelecer relações sistemáticas nos clados mais basais. Apesar de sintetizarem proteínas essenciais e serem genes bastante conservados várias mutações foram observadas no terceiro códon o que pode ter contribuido para reduzir os valores de consistência das árvores nos nós mais basais. As filogenias moleculares apresentadas para ambos os genes apresentaram excesso de politomias nas bases da topologia e baixos valores de bootstrap nos ramos. Porém as análises de máxima parcimônia foram importantes para a confirmação do monofiletismo das espécies e de alguns grupos de espécies. Por outro lado as análises de máxima verossimilhança utilizando tanto o cit b quanto o coI além de confirmar o monofiletismo das espécies conseguiu exibir relações de parentesco entre as espécies agrupando-as algumas vezes de maneira diferente a topologia demonstrada por da Silva (1998) e Patton et al.(2000) com o gene cit b. Porém convém ressaltar que as relações evolutivas dos genes cit b e coI não foram totalmente congruentes. Vários autores ressaltam que o gene coI não oferece um sinal filogenético forte para estudos sistemáticos, porém são úteis na identificação de táxons (Schander & Willassen, 2005; Hajibabaei et al., 2006; Hajibabaei et al., 2007; Köhler, 2007). No caso dos Proechimys aqui analisados, pode se destacar as seguintes informações obtidas a partir da topologia da árvore de máxima verossimilhança do gene cit b. Fica assegurado o estreito relacionamento de P. kulinae, P. pattoni e P. gardneri. Porém, o monofiletismo de P. kulinae não não foi totalmente assegurado. Um indivíduo (INPA3515) 60 identificado como P. kulinae apareceu como a mais basal do gênero e separado dos outros indivíduos molecularmente e morfologicamente identificados como P. kulinae. Além disso, P. pattoni se agrupou como clado irmão de P. gardneri, como relatado anteriormente nos trabalhos de da Silva (1998) e Patton et al. (2000). Porém, este relacionamento não foi corroborado com os dados cariotípicos (Weksler et al., 2001). P. roberti não se se agrupou ao clado do P. cf. guyannensis (sensu Patton, 1987). Assim, o grupo guyannensis apresentou-se parafilético. Caso se confirme morfologicamente que o indivíduo MNFS2174 de fato seja P. roberti então a distribuição da espécie será ampliada em direção à região do rio Madeira. Foi assegurado o monofiletismo de P. echinothrix sendo que esta espécie posicionouse como o grupo irmão dos clados que reúnem as espécies de Proechimys dos grupos simonsi, longicaudatus, guyannensis e goeldi. Foi assegurado o monofiletismo de P. simonsi. O indivíduo INPA4707 proveniente da região do rio Madeira identificado molecularmente como P. simonsi porém são necessários estudos morfológicos mais aprofundados neste indivíduo pois a forma do seu forâmen incisivo é associada mais aos indivíduos pertencente a região do rio Urucu e Juruá (da Silva comunicação pessoal). P. guyanensis posicionou-se como grupo irmão das espécies do grupo longicaudatus + cuvieri. P. cuvieri mostrou-se mais próximo de P. longicaudatus e P. brevicauda do que do grupo guyannensis como proposto por Gardner & Emmons (1984). da Silva (1998) já havia apresentado esta relação. É possível que os grupos longicaudatus e cuvieri (sensu Patton, 1987) devam se fundir. P. brevicauda seria o ramo basal do clado composto por P. longicaudatus, P. sp. (provavelmente uma espécie nova do rio Madeira) e P. cuvieri. A monofilia do grupo goeldii foi fortemente suportada. Este resultado contradiz os resultados de da Silva (1998) e Bonviccino et al. (2005) que apresentaram dados que não demonstravam este monofiletismo. Na maioria das espécies analisadas houve nítida separação dos indivíduos por regiões. As delimitações das bacias de drenagem do rio madeira, rio Juruá, rio Tapajós e rio Jarí demonstraram forte influência na delimitação dos clados. Os rios nem sempre funcionaram como uma barreira geográfica para a dispersão das espécies, pois nas diferentes margens de rios de grande porte não houve distinção de clados, com exceção de P. echinothrix como também demonstrado por Patton e colaboradores em 2000 no rio Juruá. Porém, as bacias de drenagem como um todo parecem delimitar claramente os clados, provavelmente devido a gênese e manutenção (tectônica e neotectônica) inerentes de cada bacia. É importante ressaltar 61 que mesmo dentro do gênero as espécies possuem hábitos diferentes influenciando na sua distribuição ao longo da amazônia (Patton et al., 1998; Matocq et al., 2000). Genes nucleares vêm sendo usados em conjunto com mitocondriais obtendo melhores valores de consistências para os nós. Steppan et al., 2005 utilizou três genes nucleares (GHR, RAG1 e AP5) obtendo um melhor suporte para os clados mais basais, conseguindo fazer uma melhor comparação entre os indivíduos da subfamília Murinae inferindo suas relações de parentesco. Também utilizando a combinação entre genes nucleares e mitocondriais Reeder e colaboradores (2006) observaram melhores resultados no estudo de hipoteses filogenéticas com roedores Neotomine-Peromyscine. Tendo em vista os resultados encontrados com cit b e coI nas abordagens de taxonomia e sistemática molecular de Proechimys da Amazônia é recomendável que futuros estudos sejam utilizados com genes nucleares para tentar verificar se a configuração de árvores do tipo politômica se mantêm nas análises. Adicionalmente, análises genéticas populacionais e filogeográficas deverão ser estimuladas para quantificar o fluxo gênico estabelecido entre indivíduos de distintas regiões e estimar qual o grau de diferenciação destas populações. 62 7. CONCLUSÃO 1) As regiões dos genes mitocondriais cit b e coI utilizadas no presente trabalho foram eficazes no diagnóstico de espécies do gênero Proechimys podendo ser utilizadas como ferramentas auxiliares à taxonomia clássica no sentido de aumentar a precisão da identificação dos espécimes testemunhs depositados em coleções e museus. 3) Foi detectada forte associação entre os clados monofiléticos e as regiões geográficas amostradas, o que abre caminho para novos estudos com o intuito de entender os padrões e processos estabelecidos no processo de especiação de Proechimys. Análises genéticas populacionais e filogeográficas deverão ser estimuladas para quantificar o fluxo gênico estabelecido entre indivíduos de distintas regiões e estimar qual o grau de diferenciação destas populações. 4) Foi observada a importância de associar a sistemática filogenética utilizando marcadores moleculares com a taxonomia clássica. Os dados moleculares fornecidos em vários casos validou os dados morfológicos analisados a décadas atrás mostrando a ligação entre as duas metodologias de análise. Por outro lado, também demonstrou incongruências no agrupamento entre espécies sugerindo que novas abordagens precisam ser buscadas para melhor compreensão dos clados mitocondriais encontrados. 5) Comparando-se as árvores obtidas por meio da máxima parcimônia e máxima verossimilhança ficou evidente a presença de politomias na máxima parcimônia mas com grande suporte monofiletismo nos clados indicativos de espécies e em algumas vezes grupos de espécies. Já a árvore de máxima verossimilhança foi mais elucidativa na indicação de um possível parentesco entre espécies. 6) Foi reforçada a relevância dos dados moleculares no estudo evolutivo do gênero Proechimys quer seja para diagnosticar espécies crípticas e simpátricas quanto para indicar prováveis sinonimizações. 63 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ab’Saber, A. N. 1977. 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Patton e M.N.F. da Silva Museu Número Coletor No. de Campo UF Espécie Localidade MPEG MNFS 1030 Acre brevicauda Fazenda Santa Fé (=Flora), left bank Rio Juruá MPEG MNFS 999 Acre brevicauda Ocidente, right bank Rio Juruá INPA 3440 MNFS 1392 Acre brevicauda opposite Igarapé Porongaba, left bank Rio Juruá MVZ 190660 MNFS 1083 Acre brevicauda Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá INPA 3418 MNFS 1052 Acre brevicauda opposite Ocidente, left bank Rio Juruá INPA 3421 MNFS 1121 Acre brevicauda Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá INPA 3441 MNFS 1393 Acre brevicauda opposite Igarapé Porongaba, left bank Rio Juruá INPA 3446 MNFS 1448 Acre brevicauda Sobral, left bank Rio Juruá MVZ 190657 MNFS 1014 Acre brevicauda Fazenda Santa Fé (=Flora), left bank Rio Juruá MVZ 190671 MNFS 1472 Acre brevicauda Sobral, left bank Rio Juruá MVZ 190678 MNFS 1549 Acre brevicauda Nova Vida, right bank Rio Juruá MVZ 190680 MNFS 1602 Acre brevicauda Nova Vida, right bank Rio Juruá MPEG MNFS 1044 Acre brevicauda Ocidente, right bank Rio Juruá MPEG MNFS 1055 Acre brevicauda Fazenda Santa Fé (=Flora), left bank Rio Juruá INPA 3424 MNFS 1129 Acre brevicauda Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá INPA 3445 MNFS 1443 Acre brevicauda Sobral, left bank Rio Juruá MVZ 190677 MNFS 1541 Acre brevicauda Nova Vida, right bank Rio Juruá MNFS 1458 Acre brevicauda Sobral, left bank Rio Juruá MPEG MVZ 157855 JLP 8271 Amazonas brevicauda La Poza, Río Santiago MVZ 157905 JLP 8445 Amazonas brevicauda La Poza, Río Santiago MVZ 155121 JLP 7733 Amazonas brevicauda Huampami, Río Cenepa MVZ 155125 JLP 7737 Amazonas brevicauda Huampami, Río Cenepa MVZ 157878 JLP 8385 Amazonas brevicauda La Poza, Río Santiago MUSM 13337 RSV 2050 Loreto brevicauda Nuevo San Juan, Río Gálvez MUSM 13338 RSV 2120 Loreto brevicauda Nuevo San Juan, Río Gálvez AMNH 272698 RSV 2092 Loreto brevicauda Nuevo San Juan, Río Gálvez AMNH 272700 RSV 2095 Loreto brevicauda Nuevo San Juan, Río Gálvez MUSM MV 970001 Loreto brevicauda San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970004 Loreto brevicauda San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970006 Loreto brevicauda San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970091 Loreto brevicauda San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970092 Loreto brevicauda San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970093 Loreto brevicauda San Pedro, right bank Río Blanco MVZ 168958 EY 645 Madre de Dios brevicauda Reserva Cusco Amazónico, 14 km E Puerto Maldonado MVZ 168951 EY 609 Madre de Dios brevicauda Reserva Cusco Amazónico, 14 km E 74 Puerto Maldonado INPA 3461 MNFS 1077 Acre Cuvieri Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá INPA 3462 MNFS 1080 Acre Cuvieri Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá MVZ 190693 JLP 15636 Amazonas Cuvieri Seringal Condor, left bank Rio Juruá MVZ 190698 JLP 15890 Amazonas Cuvieri Barro Vermelho, left bank Rio Juruá INPA 2529 VCSV 63 Amazonas Cuvieri Comunidade Colina, right bank Rio Tiquié, S Gabriel da Cachoeira JLP 16783 Amazonas Cuvieri Lago Meduiním, left bank Rio Negro JLP 16804 Amazonas Cuvieri Lago Meduiním, left bank Rio Negro 551 Amazonas Cuvieri Seringal Condor, left bank Rio Juruá INPA 3476 MNFS MVZ 190683 JLP 15308 Amazonas Cuvieri Penedo, right bank Rio Juruá MVZ 190684 JLP 15310 Amazonas Cuvieri Penedo, right bank Rio Juruá MVZ 190697 JLP 15903 Amazonas Cuvieri Barro Vermelho, left bank Rio Juruá USNM 549559 MDC 539 Pará Cuvieri East bank Rio Xingu, 52 km SSW Altamira INPA INPA 2758 CS 22 Pará Cuvieri Floresta Nacional Tapirapé-Aquiri, Município de Marabá V-872 T 1834 Cuvieri La Trinité Mountains V-849 T 1833 Cuvieri La Trinité Mountains 157874 JLP 8380 Amazonas Cuvieri La Poza, Río Santiago MUSM MV 970021 Loreto Cuvieri San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970010 Loreto Cuvieri San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970034 Loreto Cuvieri San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970070 Loreto Cuvieri La Colmena, Quebrada La Colmena MUSM MV 970080 Loreto Cuvieri La Colmena, Quebrada La Colmena MVZ MVZ 160091 JLP 9037 Bolivar Cuvieri 69 km SE Rio Cuyuni (by rd.) MVZ 160092 JLP 9038 Bolivar Cuvieri 69 km SE Rio Cuyuni (by rd.) INPA MNFS 133 Amazonas echinothrix alto Rio Urucu 62 Amazonas echinothrix Comunidade Colina, right bank Rio Tiquié, S Gabriel da Cachoeira 298 Amazonas echinothrix Lago Vai-Quem-Quer, right bank Rio Juruá INPA 2526 VCSV INPA 3482 JUR INPA 3501 MNFS 1723 Amazonas echinothrix Colocação Vira-Volta, left bank Rio Juruá, Igarapé Arabidi INPA 3502 MNFS 1724 Amazonas echinothrix Colocação Vira-Volta, left bank Rio Juruá, Igarapé Arabidi MVZ 187180 JUR 403 Amazonas echinothrix Lago Vai-Quem-Quer, right bank Rio Juruá MVZ 187181 JUR 404 Amazonas echinothrix Lago Vai-Quem-Quer, right bank Rio Juruá MVZ 187183 JUR 430 Amazonas echinothrix Colocação Vira-Volta, left bank Rio Juruá, Igarapé Arabidi INPA INPA 2551 MNFS 722 Amazonas echinothrix Barro Vermelho, left bank Rio Juruá INPA 3927 JUR 357 Amazonas echinothrix Lago Vai-Quem-Quer, right bank Rio Juruá INPA INPA 4226 MNFS 1986 Amazonas echinothrix Tambor, left bank Rio Jaú INPA INPA 4227 MNFS 1987 Amazonas echinothrix Tambor, left bank Rio Jaú INPA INPA 4533 JLP 16730 Amazonas echinothrix Macaco, left bank Rio Jaú 75 INPA INPA 4534 JLP 16736 Amazonas echinothrix Macaco, left bank Rio Jaú INPA INPA 4537 JLP 16746 Amazonas echinothrix right bank rio Jaú above mouth INPA INPA 4538 JLP 16747 Amazonas echinothrix right bank rio Jaú above mouth INPA MNFS 191 Amazonas echinothrix alto Rio Urucu MPEG MNFS 740 Amazonas echinothrix Barro Vermelho, left bank Rio Juruá LHE 834 Pando gardneri Centro, ca. 18 km NNW San Juan de Nuevo Mundo, Abuna LHE 890 Pando gardneri On Río Negro LHE 891 Pando gardneri On Río Negro INPA MNFS 88 Amazonas gardneri alto Rio Urucu INPA MNFS 121 Amazonas gardneri alto Rio Urucu INPA 3504 JLP 16039 Amazonas gardneri Altamira, right bank Rio Juruá MVZ 187206 JLP 16084 Amazonas gardneri Altamira, right bank Rio Juruá MVZ 187209 JLP 16037 Amazonas gardneri Altamira, right bank Rio Juruá LPC 564 Mato Grosso Goeldii Reserva Ecológica Cristalino, 40 km N Alta Floresta USNM 549573 LHE 505 Pará Goeldii East bank Rio Xingu, 52 km SSW Altamira USNM 549572 LHE 504 Pará Goeldii East bank Rio Xingu, 52 km SSW Altamira INPA 2760 CS 48 Pará Goeldii Floresta Nacional Tapirapé-Aquiri, Município de Marabá JPB 0 Amazonas guyannensis São Gabriel da Cachoeira VCSV 74 Amazonas guyannensis Estrada Piçarreira, margem direita rio Cauaburi CCM 42 Amazonas guyannensis PDBFF, 82 km N Manaus VCSV 73 Amazonas guyannensis Estrada Piçarreira, margem direita rio Cauaburi MNFS 1796 not recorded guyannensis not recorded INPA INPA 2534 INPA INPA 2533 INPA MNRJ ROM 42831 98216 CRB 639 Roraima guyannensis São João da Baliza, UHE Alto Jatapú CRB 617 Roraima guyannensis São João da Baliza, UHE Alto Jatapú CRB 633 Roraima guyannensis São João da Baliza, UHE Alto Jatapú FN 31218 DemeraraMahaica guyannensis Loo Creek, 68 km S Georgetown (by rd.) ALG 14255 Amazonas guyannensis Neblina base camp, Río Mawarinuma ALG 14283 Amazonas guyannensis Neblina base camp, Río Mawarinuma ALG 14297 Amazonas guyannensis Neblina base camp, Río Mawarinuma ALG 14242 Amazonas guyannensis Neblina base camp, Río Mawarinuma Bolivar guyannensis 4 km E El Pauji [by road] , 86.5 km W Santa Elena MVZ 160094 JLP 9044 INPA 3515 JUR 186 Amazonas Kulinae Barro Vermelho, left bank Rio Juruá MVZ 187193 JLP 15906 Amazonas Kulinae Barro Vermelho, left bank Rio Juruá MPEG JLP 15541 Amazonas Kulinae Seringal Condor, left bank Rio Juruá MPEG MNFS 541 Amazonas Kulinae Seringal Condor, left bank Rio Juruá MUSM MV 970015 Loreto Kulinae San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970016 Loreto Kulinae San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970028 Loreto kulinae San Pedro, right bank Río Blanco 76 MUSM MV 970031 Loreto kulinae San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970059 Loreto kulinae La Colmena, Quebrada La Colmena MUSM MV 970078 Loreto kulinae La Colmena, Quebrada La Colmena MUSM MV 970079 Loreto kulinae La Colmena, Quebrada La Colmena MUSM 13340 RSV 2026 Loreto kulinae Nuevo San Juan, Río Gálvez AMNH 272714 RSV 2132 Loreto kulinae Nuevo San Juan, Río Gálvez TTS 119 not recorded longicaudatus not recorded LHE 1413 Santa Cruz longicaudatus El Refugio, right bank Río Paragua/Tavo LHE 1419 Santa Cruz longicaudatus El Refugio, right bank Río Paragua/Tavo LPC 462 Mato Grosso longicaudatus Fazenda São Luis, 30 km N Barra do Garças USNM 549582 LHE 512 Pará oris East bank Rio Xingu, 52 km SSW Altamira USNM 549586 LHE 527 Pará oris East bank Rio Xingu, 52 km SSW Altamira USNM 549587 LHE 533 Pará oris East bank Rio Xingu, 52 km SSW Altamira INPA INPA 2746 CS 14 Pará oris Floresta Nacional Tapirapé-Aquiri, Município de Marabá INPA INPA 2747 CS 21 Pará oris Floresta Nacional Tapirapé-Aquiri, Município de Marabá INPA INPA 2748 CS 25 Pará oris Floresta Nacional Tapirapé-Aquiri, Município de Marabá CJ 5 Pará oris Floresta Nacional de Carajás, Distrito de Sossego, Parauapebas Tocantins oris Rio Santa Teresa, 20 km NW Peixe LPC 714 MVZ 187195 MNFS 1165 Acre pattoni Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá MVZ 187194 MNFS 1098 Acre pattoni Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá MVZ 187197 MNFS 1428 Acre pattoni Sobral, left bank Rio Juruá MVZ 187199 MNFS 1201 Acre pattoni Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá MPEG MNFS 1200 Acre pattoni Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá MPEG MNFS 1166 Acre pattoni Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá 16794 Amazonas quadruplicatus Lago Meduiním, left bank Rio Negro INPA INPA 4552 JLP INPA CCM 35 Amazonas quadruplicatus Arquipélago Anavilhanas, Rio Negro INPA CCM 36 Amazonas quadruplicatus Arquipélago Anavilhanas, Rio Negro MVZ 157871 JLP 8375 Amazonas quadruplicatus La Poza, Río Santiago MVZ 157875 JLP 8381 Amazonas quadruplicatus La Poza, Río Santiago MUSM MV 970098 Loreto quadruplicatus El Chino, left bank Río Tahuayo MUSM MV 970101 Loreto quadruplicatus El Chino, left bank Río Tahuayo MUSM MV 970104 Loreto quadruplicatus El Chino, left bank Río Tahuayo MUSM MV 970122 Loreto quadruplicatus El Chino, left bank Río Tahuayo MUSM MV 970102 Loreto quadruplicatus El Chino, left bank Río Tahuayo MUSM MV 970117 Loreto quadruplicatus El Chino, left bank Río Tahuayo MUSM MV 970099 Loreto quadruplicatus El Chino, left bank Río Tahuayo ALG 14243 Amazonas quadruplicatus Neblina base camp, Río Mawarinuma ALG 14039 Amazonas quadruplicatus San Carlos de Río Negro, ca. 4 km N Isla Saramá 77 ALG 14040 Amazonas quadruplicatus San Carlos de Río Negro, ca. 4 km N Isla Saramá DSR 3758 Goiás roberti Niquelândia CRB 931 Goiás roberti Parque Nacional da Chapada dos Veadeiros CRB 963 Goiás roberti Fazenda Fiandeiras, 65 km SSW Cavalcanti LPC 522 Mato Grosso roberti Reserva Ecológica Cristalino, 40 km N Alta Floresta LPC 523 Mato Grosso roberti Reserva Ecológica Cristalino, 40 km N Alta Floresta LPC 540 Mato Grosso roberti margem esquerda do Rio Cristalino, 40 km N Alta Floresta LHE 742 La Paz simonsi Prov. Iturraldi, Río Madidi, Moire camp INPA 3560 MNFS 1000 Acre simonsi Ocidente, right bank Rio Juruá INPA 3561 MNFS 1001 Acre simonsi Ocidente, right bank Rio Juruá INPA 3609 MNFS 1489 Acre simonsi Sobral, left bank Rio Juruá INPA 3622 MNFS 1633 Acre simonsi Nova Vida, right bank Rio Juruá INPA 3625 MNFS 1656 Acre simonsi Nova Vida, right bank Rio Juruá MPEG MNFS 1136 Acre simonsi Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá MPEG MNFS 1336 Acre simonsi Igarapé Porongaba, right bank Rio Juruá MPEG MNFS 1377 Acre simonsi opposite Igarapé Porongaba, left bank Rio Juruá INPA 3574 MNFS 1099 Acre simonsi Ocidente, right bank Rio Juruá INPA 3607 MNFS 1485 Acre simonsi Sobral, left bank Rio Juruá INPA 3528 JUR 346 Amazonas simonsi Ilha Paxiuba, right bank Rio Juruá INPA 3650 MNFS 1754 Amazonas simonsi Ilhazinha, left bank Rio Juruá, Igarapé Arabidi INPA 3655 MNFS 1762 Amazonas simonsi Colocação Vira-Volta, left bank Rio Juruá, Igarapé Arabidi MVZ 190709 JLP 15294 Amazonas simonsi Penedo, right bank Rio Juruá MVZ 190754 JLP 15573 Amazonas simonsi Seringal Condor, left bank Rio Juruá MVZ 190809 JLP 15907 Amazonas simonsi Barro Vermelho, left bank Rio Juruá MVZ 190814 JLP 15994 Amazonas simonsi Altamira, right bank Rio Juruá JUR 271 Amazonas simonsi Lago Vai-Quem-Quer, right bank Rio Juruá 1761 Amazonas simonsi Colocação Vira-Volta, left bank Rio Juruá, Igarapé Arabidi MPEG INPA 3654 MNFS MVZ 190710 JLP 15295 Amazonas simonsi Penedo, right bank Rio Juruá MVZ 190753 JLP 15560 Amazonas simonsi Seringal Condor, left bank Rio Juruá MVZ 190804 JLP 15874 Amazonas simonsi Barro Vermelho, left bank Rio Juruá MVZ 190817 JLP 15997 Amazonas simonsi Altamira, right bank Rio Juruá INPA MNFS 190 Amazonas simonsi alto Rio Urucu INPA MNFS 192 Amazonas simonsi alto Rio Urucu MPEG JUR 270 Amazonas simonsi Lago Vai-Quem-Quer, right bank Rio Juruá MPEG MNFS 1751 Amazonas simonsi Ilhazinha, left bank Rio Juruá, Igarapé Arabidi JLP 8479 Amazonas Simonsi La Poza, Río Santiago LHE 1468 Cusco Simonsi 2 km SW Tangoshiari MVZ 157914 78 KU 158233 LHE 1488 Cusco Simonsi 2 km SW Tangoshiari LHE 1431 Cusco Simonsi 2 km SW Tangoshiari LHE 1432 Cusco Simonsi 2 km SW Tangoshiari LHE 1434 Cusco Simonsi 2 km SW Tangoshiari LHE 1435 Cusco Simonsi 2 km SW Tangoshiari LHE 1466 Cusco Simonsi 2 km SW Tangoshiari LHE 1479 Cusco Simonsi 2 km SW Tangoshiari RMT 4038 Loreto Simonsi San Jacinto MUSM MV 970047 Loreto Simonsi San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970035 Loreto Simonsi San Pedro, right bank Río Blanco MUSM MV 970038 Loreto Simonsi San Pedro, right bank Río Blanco MUSM 13339 RSV 2033 Loreto Simonsi Nuevo San Juan, Río Gálvez MUSM 13342 RSV 2076 Loreto Simonsi Nuevo San Juan, Río Gálvez MUSM 13345 RSV 2027 Loreto Simonsi Nuevo San Juan, Río Gálvez AMNH 272677 RSV 2051 Loreto Simonsi Nuevo San Juan, Río Gálvez USNM 579694 LHE 814 Madre de Dios Simonsi Ccolpa de Guacamayo, Río Tambopata LHE 813 Madre de Dios Simonsi Ccolpa de Guacamayo, Río Tambopata LHE 820 Madre de Dios Simonsi Río Tavara, Fila Boca Guacamayo LHE 821 Madre de Dios Simonsi Río Tavara, Fila Boca Guacamayo MVZ 166805 JLP 11053 Madre de Dios Simonsi Aguas Calientes, Río Alto Madre de Dios, 1 km below Shintuya MVZ 166803 JLP 11051 Madre de Dios Simonsi Aguas Calientes, Río Alto Madre de Dios, 1 km below Shintuya IM 3575 Rondônia sp. Samuel La Paz Steerei Prov. Iturraldi, Río Madidi, Moire camp INPA LHE 747 INPA 3755 MNFS 1056 Acre Steerei Fazenda Santa Fé (=Flora), left bank Rio Juruá INPA 3762 MNFS 1475 Acre Steerei Sobral, left bank Rio Juruá INPA 3764 MNFS 1547 Acre Steerei Nova Vida, right bank Rio Juruá MVZ 191449 MNFS 1476 Acre Steerei Sobral, left bank Rio Juruá MNFS 1548 Acre Steerei Nova Vida, right bank Rio Juruá 1037 Acre Steerei opposite Ocidente, left bank Rio Juruá 254 Acre Steerei opposite Igarapé Porongaba, left bank Rio Juruá MPEG INPA 3753 MNFS MVZ 190954 JUR MVZ 190967 MNFS 1057 Acre Steerei Fazenda Santa Fé (=Flora), left bank Rio Juruá MVZ 191448 MNFS 1254 Acre Steerei opposite Ocidente, left bank Rio Juruá MVZ 190863 JUR 22 Amazonas Steerei Nova Empresa, left bank Rio Juruá MVZ 190890 JLP 15700 Amazonas Steerei Seringal Condor, left bank Rio Juruá INPA 3812 MNFS 570 Amazonas Steerei Sacado, right bank Rio Juruá MVZ 190892 JLP 15709 Amazonas steerei Seringal Condor, left bank Rio Juruá JUR 326 Amazonas steerei Ilha Paxiuba, right bank Rio Juruá MPEG INPA 3773 MNFS 1738 Amazonas steerei Lago Três Unidos, Igarapé Arabidi, left bank Rio Juruá INPA 3778 MNFS 1764 Amazonas steerei Ilhazinha, left bank Rio Juruá, Igarapé Arabidi 79 INPA 3779 MNFS 1765 Amazonas steerei Ilhazinha, left bank Rio Juruá, Igarapé Arabidi INPA 3813 MNFS 571 Amazonas steerei Sacado, right bank Rio Juruá INPA 3817 MNFS 575 Amazonas steerei Sacado, right bank Rio Juruá INPA 3850 MNFS 851 Amazonas steerei Altamira, right bank Rio Juruá INPA 3852 MNFS 870 Amazonas steerei Altamira, right bank Rio Juruá INPA 3861 MNFS 926 Amazonas steerei Boa Esperança, right bank Rio Juruá MVZ 190831 JLP 15268 Amazonas steerei Penedo, right bank Rio Juruá MVZ 190840 JLP 15377 Amazonas steerei Nova Empresa, left bank Rio Juruá MVZ 190846 JLP 15386 Amazonas steerei Nova Empresa, left bank Rio Juruá MVZ 190847 JLP 15387 Amazonas steerei Nova Empresa, left bank Rio Juruá MVZ 190851 JLP 15391 Amazonas steerei Nova Empresa, left bank Rio Juruá MVZ 190882 JLP 15628 Amazonas steerei São José, right bank Rio Juruá MVZ 190899 MNFS 594 Amazonas steerei Sacado, right bank Rio Juruá MVZ 190921 JLP 15837 Amazonas steerei Barro Vermelho, left bank Rio Juruá MVZ 190939 JLP 15927 Amazonas steerei Altamira, right bank Rio Juruá INPA 3772 MNFS 1737 Amazonas steerei Lago Três Unidos, Igarapé Arabidi, left bank Rio Juruá INPA 3783 MNFS 1777 Amazonas steerei Colocação Vira-Volta, left bank Rio Juruá, Igarapé Arabidi INPA 3831 MNFS 688 Amazonas steerei Jainu, right bank Rio Juruá INPA 3832 MNFS 689 Amazonas steerei Jainu, right bank Rio Juruá INPA 3853 MNFS 871 Amazonas steerei Altamira, right bank Rio Juruá MVZ 190832 JLP 15269 Amazonas steerei Penedo, right bank Rio Juruá MVZ 190834 JLP 15396 Amazonas steerei Nova Empresa, left bank Rio Juruá MVZ 190891 JLP 15705 Amazonas steerei Seringal Condor, left bank Rio Juruá MVZ 190918 JLP 15789 Amazonas steerei Barro Vermelho, left bank Rio Juruá MVZ 190957 JUR 257 Amazonas steerei Ilha Paxiuba, right bank Rio Juruá INPA MNFS 114 Amazonas steerei alto Rio Urucu INPA MNFS 134 Amazonas steerei alto Rio Urucu MPEG JLP 15692 Amazonas steerei Seringal Condor, left bank Rio Juruá INPA 4229 MNFS 1994 Amazonas steerei Tambor, left bank Rio Jaú INPA 4240 MNFS 2085 Amazonas steerei right bank rio Jaú above mouth INPA 4535 JLP 16737 Amazonas steerei Macaco, left bank Rio Jaú INPA 4536 JLP 16738 Amazonas steerei Macaco, left bank Rio Jaú INPA 4547 JLP 16766 Amazonas steerei right bank rio Jaú above mouth MVZ 168943 RMW 701 Madre de Dios steerei Reserva Cusco Amazónico, 14 km E Puerto Maldonado MVZ 166036 RMW 457 Madre de Dios steerei Reserva Cusco Amazónico, 14 km E Puerto Maldonado 80 Anexo 2: Seqüências obtidas pelo Genbank e suas respectivas espécies Seqüências coI Genbank Espécie gi|156079185|gb|EU096884.1 P. cuvieri gi|156079183|gb|EU096883.1| P. cuvieri gi|156079181|gb|EU096882.1| P. cuvieri gi|156079211|gb|EU096897.1| P. guyannensis gi|156079209|gb|EU096896.1| P. guyannensis gi|156079207|gb|EU096895.1| P. guyannensis gi|156078511|gb|EU095487.1| P. steerei gi|156078509|gb|EU095486.1| P. simonsi gi|156078507|gb|EU095485.1| P. simonsi gi|156078505|gb|EU095484.1| P. hoplomyoides gi|156078503|gb|EU095483.1| P. hoplomyoides gi|156079181|gb|EU096882.1| P. hoplomyoides gi|156078499|gb|EU095481.1| P. gularis gi|156078497|gb|EU095480.1| P. gularis 81