El Hipotiroidismo Congnito (HC), es una enfermedad que se conoce desde el siglo 15 donde las personas que sufran de esta

condicin eran llamados cretinos. Es causada por la ausencia anatmica o funcional de la glndula tiroides, lo que ocasiona una deficiencia en la produccin de hormonas tiroideas. Estas hormonas son imprescindibles para un adecuado desarrollo fsico y mental desde los primeros momentos de la vida. Esta enfermedad constituye la causa ms frecuente de retardo mental evitable en el nio. El HC est incluido en los programas de Tamizaje Neonatal de muchos pases y estados por las siguientes razones: 1.- La enfermedad trae como consecuencias anormalidades neurolgicas irreversibles. 2.- La deteccin clnica en neonatos es prcticamente imposible, ya que sus sntomas son muy subjetivos y escasos. 3.- La enfermedad puede ser tratada eficazmente con un tratamiento simple, suplementacin oral con tiroxina. 4.- La incidencia de la enfermedad es de 1:4000 recin nacidos. 5.- Los mtodos de tamizaje disponibles son simples, rpidos, confiables y econmicos. 6.-La relacin costo-beneficio resulta positiva para la sociedad. El sndrome de hipotiroidismo congnito HC fue conocido antes del advenimiento del tamizaje masivo para esta enfermedad.

 ETIOLOGA: Deficiencia en la produccin de hormonas tiroideas. CLASIFICACIN: HC primario (afectacin a nivel del tiroides). HC secundario

(afectacin a nivel de la hipfisis). HC terciario (afectacin a nivel de hipotlamo) CONSECUENCIAS: Retardo mental, cretinismo, retardo en el crecimiento y desarrollo psicomotor anormal. TIPO DE PRUEBA: Inmunoensayos para medir concentraciones de las hormonas TSH y T4. UNIDADES: TSH (mUI/L o mUI/mL) y T4 (mg/dL o nmol/L) CONSIDERACIONES ESPECIALES: Existen valores fisiolgicos diferentes en nios prematuros y enfermos. En el 10 % de los casos se produce una elevacin tarda de la TSH. La medicamentacin materna, los anticuerpos maternos antitiroideos o la

exposicin del recin nacido frente a iodo ejerce un efecto sobre el tiroides del nio. TRATAMIENTO: Terapia substitutiva con Levo-tiroxina sdica.

El diagnstico de la funcin tiroidea consiste en un control del mecanismo de regulacin mediante la determinacin de la TSH y la hormonas T4 (TSH en sangre de cordn). Para el tiempo diagnstico de los infantes: 1.- Realizacin del tamizaje utilizando como prueba inicial de tamizaje la determinacin de T4, y utilizando la determinacin de TSH en la confirmacin de casos positivos al tamizaje. 2.- Realizacin del tamizaje utilizando como prueba inicial de tamizaje la determinacin de TSH y utilizando la determinacin de T4 en la confirmacin.

TSH: Enzimoinmunoensayo tipo sandwich en el cual los anticuerpos estn dirigidos contra la cadena de la TSH. Es un ensayo de tipo cuantitativo.

Elevado: >= 30mUI/L en suero >= 25mUI/L en papel de filtro

T4:
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CARACTERSTICAS DE LOS HAPTENOS Son generalmente molculas pequeas No son inmunognicas por s solas Necesitan ser acopladas a protenas portadoras Tienen un solo determinante antignico Se detecta mediante un ensayo competitivo para la determinacin de tiroxina total en sangre seca colectada en papel de filtro donde el Ag natural y marcado con Enzima compiten por una cantidad limitada de sitios de unin. (UMELISA T4), donde < 55,17 nmol/L --- Bajo.

El Hipotiroidismo Congnito (HC), es una enfermedad que se conoce desde el siglo 15 donde las personas que sufran de esta condicin eran llamados cretinos. Es causada por la ausencia anatmica o funcional de la glndula tiroides, lo que ocasiona una deficiencia en la produccin de hormonas tiroideas. Estas hormonas son imprescindibles para un adecuado desarrollo fsico y mental desde los primeros momentos de la vida. Esta enfermedad constituye la causa ms frecuente de retardo mental evitable en el nio. El HC est incluido en los programas de Tamizaje Neonatal de muchos pases y estados por las siguientes razones: 1.- La enfermedad trae como consecuencias anormalidades neurolgicas irreversibles. 2.- La deteccin clnica en neonatos es prcticamente imposible, ya que sus sntomas son muy subjetivos y escasos. 3.- La enfermedad puede ser tratada eficazmente con un tratamiento simple, suplementacin oral con tiroxina. 4.- La incidencia de la enfermedad es de 1:4000 recin nacidos. 5.- Los mtodos de tamizaje disponibles son simples, rpidos, confiables y econmicos. 6.-La relacin costo-beneficio resulta positiva para la sociedad. El sndrome de hipotiroidismo congnito HC fue conocido antes del advenimiento del tamizaje masivo para esta enfermedad.
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 ETIOLOGA: Deficiencia en la produccin de hormonas tiroideas. CLASIFICACIN: HC primario (afectacin a nivel del tiroides). HC secundario

(afectacin a nivel de la hipfisis). HC terciario (afectacin a nivel de hipotlamo) CONSECUENCIAS: Retardo mental, cretinismo, retardo en el crecimiento y desarrollo psicomotor anormal. TIPO DE PRUEBA: Inmunoensayos para medir concentraciones de las hormonas TSH y T4. UNIDADES: TSH (mUI/L o mUI/mL) y T4 (mg/dL o nmol/L) CONSIDERACIONES ESPECIALES: Existen valores fisiolgicos diferentes en nios prematuros y enfermos. En el 10 % de los casos se produce una elevacin tarda de la TSH. La medicamentacin materna, los anticuerpos maternos antitiroideos o la

exposicin del recin nacido frente a iodo ejerce un efecto sobre el tiroides del nio. TRATAMIENTO: Terapia substitutiva con Levo-tiroxina sdica.

El diagnstico de la funcin tiroidea consiste en un control del mecanismo de regulacin mediante la determinacin de la TSH y la hormonas T4 (TSH en sangre de cordn). Para el tiempo diagnstico de los infantes:
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1.- Realizacin del tamizaje utilizando como prueba inicial de tamizaje la determinacin de T4, y utilizando la determinacin de TSH en la confirmacin de casos positivos al tamizaje. 2.- Realizacin del tamizaje utilizando como prueba inicial de tamizaje la determinacin de TSH y utilizando la determinacin de T4 en la confirmacin.

TSH: Enzimoinmunoensayo tipo sandwich en el cual los anticuerpos estn dirigidos contra la cadena de la TSH. Es un ensayo de tipo cuantitativo.

Elevado: >= 30mUI/L en suero >= 25mUI/L en papel de filtro

T4:

CARACTERSTICAS DE LOS HAPTENOS Son generalmente molculas pequeas No son inmunognicas por s solas Necesitan ser acopladas a protenas portadoras Tienen un solo determinante antignico Se detecta mediante un ensayo competitivo para la determinacin de tiroxina total en sangre seca colectada en papel de filtro donde el Ag natural y marcado con Enzima compiten por una cantidad limitada de sitios de unin. (UMELISA T4), donde < 55,17 nmol/L --- Bajo.

INMUNOENSAYOS ENSAYOS INMUNOENZIMTICOS. GENERALIDADES PRINCIPIOS Y CARACTERSTICAS DE LOS ENSAYOS INMUNOENZIMTICOS

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INMUNOENSAYOS

Introduccin Los primeros intentos de medir molculas de inters mdico en los fluidos biolgicos, datan de la dcada del 40 del siglo XX, y concernieron principalmente a metabolitos tales como glucosa y urea, cuyas concentraciones eran elevadas (mayor de 0.1 mM), o enzimas, ya que estas podan transformar muchas molculas de sustrato. Sin embargo, una importante cantidad de sustancias de inters vital, no podan medirse directamente, ni podan someterse al anlisis enzimtico, o estaban presentes en concentraciones muy pequeas para su deteccin por los mtodos clsicos de qumica clnica.

A partir de las ltimas dcadas del pasado siglo creci el inters por aquellos mtodos de anlisis que aprovechan la gran sensibilidad y especificidad de las reacciones inmunolgicas. Esto ha permitido que puedan ser detectadas sustancias presentes en concentraciones muy pequeas en muestras biolgicas y tienen gran significado en la prctica mdica.

Los mtodos inmunolgicos estn basados en el extraordinario poder discriminatorio que presentan los anticuerpos, los que pueden ser producidos por el sistema inmune de los vertebrados prcticamente de forma ilimitada, stos presentan una gran afinidad por agentes externos extraos (inmungenos).

Concepto de Inmunoensayo De acuerdo a las consideraciones expuestas anteriormente se definen como

inmunoensayos a aquellos procedimientos analticos, cuyo principio se basa en la elevada especificidad y sensibilidad de la reaccin antgenoanticuerpo para la deteccin de diversas sustancias o compuestos, ya sea en forma cualitativa o cuantitativa.

Existen diferentes tipos de inmunoensayos dentro de los que se encuentran los siguientes: Cromatografa de afinidad Radioinmunoensayo (RIA) Ensayo Radioinmunomtrico (IRMA
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 Enzimoinmunoensayo (EIE) Inmunoelectroforesis Ensayo inmunofluorescente Inmunoblotting (Western Blot) Turbidimetra y Nefelometra

Desarrollo y Evolucin de los Inmunoensayos 1950: Coons y Kaplan describieron los mtodos de marcaje fluorescente de Ac para la tcnica de Inmunofluorescencia. 1959-1960: El surgimiento de las Tcnicas de Radioinmunoensayo (RIA), a partir de los trabajos de Yalow y Berson. 1971: Las tcnicas ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) fueron descritas casi al mismo tiempo por dos grupos de trabajo, el de Engvall y Perlmann en Suecia y el de Van Weemen y Schuurs en Holanda. 1972: Rubenstein y col. desarrollaron un procedimiento analtico de Inmunoensayo homogneo, en el que marcaban la enzima con haptenos, procedimiento denominado EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique). 1975: Desarrollo de la Tecnologa de obtencin de Anticuerpos Monoclonales por Klher y Milstein. 1980: Ensayos Radioinmunomtricos o IRMA (Ekins y col.)

En 1959, Yallow y Benzon presentan un mtodo para la deteccin de algunas sustancias, las cuales estaban marcadas con istopos, stas constituan antgenos para determinados

anticuerpos, surgiendo as los conocidos mtodos de Radioinmunoensayos (RIA). Estos mtodos tuvieron una amplia difusin, jugando un papel importante en el desarrollo de las ciencias biomdicas.

Estos RIA originalmente utilizaban a las sustancias que se queran determinar marcadas isotpicamente, es decir presentaban marcado al antgeno.

Pocos aos despus aparecieron mtodos en los cuales los anticuerpos eran marcados con istopos, surgiendo as el llamado ensayo Radioinmunomtrico o IRMA, lo cual lo distingue
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del RIA, que como se ha sealado es el antgeno el que est marcado isotpicamente. De manera general se les denomina radioinmunoensayo, indistintamente si lo que se

muestra marcado es el antgeno o el anticuerpo.

Muchos ensayos fueron utilizados, principalmente para la cuantificacin de hormonas mediante mtodos de RIA, la rpida aceptacin de ste, atribuida a su aplicacin general, especificidad y sensibilidad del istopo radiactivo que minimiza las interferencias, lo convirti en un mtodo casi rutinario.

Sin embargo debido a que el tiempo de vida media de mucho de los istopos radiactivos es limitada, el efecto daino de las radiaciones tanto para la salud humana de los operadores como para el ambiente, as como la necesidad de separar los anticuerpos unidos a los antgenos marcados y no marcados, adems del alto costo de los equipos contadores de radiactividad y las restricciones legales en el uso de marcadores radioactivos en algunos pases, motiv a que muchos investigadores desarrollaran otros mtodos de inmunoensayo en los que utilizaban marcadores no isotpicos.

El desarrollo de inmunoensayos que utilizan marcadores no radiactivos, hizo posible la aparicin de mtodos en los cuales no era necesario la separacin de los componentes de las reacciones, es decir mtodos en una sola fase u homogneos, as como permiti el desarrollo de ensayos diagnsticos simples en su uso como por ejemplo las pruebas de embarazo y otros.

En general los inmunoensayos constan de dos etapas fundamentales:

1. Formacin del complejo antgeno-anticuerpo. Incubacin del anticuerpo con un extracto que contenga el antgeno. Adsorcin del antgeno (o el anticuerpo) a una fase slida. 2. Deteccin del complejo antgeno-anticuerpo. Conjugacin directa del anticuerpo (o el antgeno) con un marcador detectable (radioactivo, fluorescente, enzima).

 Conjugacin de un anticuerpo (anti-especie) que reconozca al primer anticuerpo. Conjugacin de Protenas A o G que son capaces de detectar el complejo

antgeno-anticuerpo.

Diferentes tipos de fases slidas han sido utilizadas en los inmunoensayos dentro de ellos podemos sealar: Poliestireno (PES) Cloruro de Polivinilo (PVC) Nylon Polipropileno Nitrocelulosa Celulosa Ltex Goma de Silicona Vidrio

Muchos son los marcadores que han sido utilizados en los inmunoensayos en la deteccin de sustancias biolgicas, entre ellos podemos citar a: - Radioistopos - Bacterifagos - Liposomas - Grupos fluorescentes - Grupos quimioluminiscentes - Partculas de ltex - Iones lantnidos - Inmunosensores - Enzimas

Uno de los marcadores ms ampliamente utilizados han sido las enzimas, empleadas inicialmente en la identificacin y localizacin de antgenos en preparados histolgicos.

En 1971 Eva Engvall y Perlman describen por primera vez un inmunoensayo, en el cual utilizan tubos de poliestireno como soporte o fase slida en que fijaron anticuerpos, a los que se enlazaban los antignos o sustancias a detectar, a stas posteriormente se le unan anticuerpos marcados con enzimas, las que actuaban sobre un sustrato determinado, pudindose de sta manera cuantificar la cantidad de dicha sustancia en una muestra biolgica, surgiendo as lo que actualmente es conocido como ELISA. En ese mismo ao

Von Wemeen y Schuurs reportan un enzimoinmunoensayo con caractersticas similares.

Muchas aplicaciones y modificaciones de

las

tcnicas

de enzimoinmunoensayos

aparecieron seguidamente para el uso de la qumica clnica y la investigacin, hacindose universal su utilizacin debido a que su especificidad, sensibilidad y reproducibilidad es comparable a los RIA.

ENZIMOINMUNOENSAYOS

Concepto de enzimoinmunoensayo Los enzimoinmunoensayo (EIE), se definen como aquellos inmunoensayos en los cuales la deteccin del compuesto a determinar es realizada al evaluar los cambios de concentracin en el producto de una reaccin enzimtica.

Muchas son las ventajas que avalan el uso de las enzimas como marcadores de anticuerpos y antgenos, entre ellas podemos mencionar:

- Estabilidad en condiciones de almacenamiento y en la realizacin del anlisis. - Relativa facilidad en su obtencin. - Relativamente econmicas. - Forman conjugados estables y conservan su actividad despus de la conjugacin. - No se contaminan fcilmente. - No se requiere permiso para su utilizacin. - Gran cantidad de sustratos disponibles quimioluminiscentes, fluorignicos y cromognicos. - Gran especificidad y versatilidad de las mismas. - Pureza, fcil preparacin y bajo costo. - Actividad detectable fcilmente.
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En la siguiente tabla se muestran algunas de las enzimas ms usadas como marcadores y sus correspondientes sustratos, as como el mtodo mediante el cual se detecta el producto de la reaccin.

Enzima

Sustrato cido r -hidroxifenilactico

Mtodo de deteccin Fluorimtrico Fluorimtrico Colorimtrico Colorimtrico Fluorimtrico Fluorimtrico Colorimtrico Colorimtrico Fluorimtrico Fluorimtrico Fluorimtrico Colorimtrico

Peroxidasa de Rbano

c. 3-(4-hidroxifenil) propinico o-fenilendiamina cido 5-aminosaliclico 4-metilumbeliferil fosfato

Fosfatasa Alcalina

b-naftil fosfato r-nitrofenil fosfato BCIP/NBT 4-metilumbeliferil-b-D-galactosido

b-Galactosidasa

o-nitrofenil-b-D-galactosido 6-Bromo-2-naftil-b-D-galactosido o-nitrofenil b-D-galactopiranosido

Clasificacin Diversas son las distintas clasificaciones que encontramos en la literatura con relacin a este tipo de inmunoensayo, nosotros para una mejor comprensin de los mismos los clasificaremos, teniendo en cuenta si es necesaria o no la separacin de los participantes en dicha reaccin, en dos grandes grupos: homogneos y heterogneos.

EIE Homogneos Estos ensayos se caracterizan por ocurrir en una sola fase (lquida). Este tipo de ensayo no conlleva la realizacin de lavados intermedios para separar los componentes que han reaccionado, lo que se explica por la modificacin de la actividad de la enzima utilizada en el sistema, no siendo necesaria esta separacin para poder evaluar el resultado del ensayo.

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Debido a que estos EIE ocurren en una sola fase lquida, es que reciben el nombre de homogneos. Tiene su fundamento en la inhibicin o activacin cataltica en la reaccin AgAc. La inhibicin en la actividad enzimtica se basa probablemente en una inhibicin en el espacio de entrada del sustrato al conjugado Hapteno-Enzimas durante la formacin del complejo Hapteno-Anticuerpo. Los EIE homogneos, se caracterizan porque el conjugado que ha reaccionado puede distinguirse funcionalmente del que no lo ha hecho, y por tanto, es posible distinguirlos, y por consiguiente, evaluar los resultados del ensayo sin separar la fraccin del conjugado que reacciona de la que no lo hace, por lo cual se denomina "separation-free". El primer EIE homogneo desarrollado fue descrito en 1972, con la publicacin de Rubinstein, Schneider y Ullaman de un EIE para la deteccin de Morfina. En general, estos EIE son muy empleados en la deteccin de drogas en fluidos biolgicos y en el monitoreo teraputico.

Caractersticas Los EIE homogneos se caracterizan por: Diferenciacin funcional de la fraccin del conjugado que ha reaccionado y la que no lo ha hecho, y por tanto, no requieren la separacin de ambas fracciones para evaluar los resultados del ensayo. Se basan en un diseo competitivo, en el cual el analito libre compite con el analito conjugado. Son generalmente muy rpidos.

Clasificacin Existen diversos tipos de EIE homogneos, y las clasificaciones que se han hecho de ellos mismos son muy variadas. A continuacin se muestra una clasificacin de este tipo de EIE, abarca a la mayor parte de los mismos: 1- EIE homogneos en los que el analito se conjuga a una enzima simple. 2- EIE homogneo en los que el analito se conjuga a una apoenzima. 3- EIE homogneo en los que el analito se conjuga a un grupo prosttico. 4- EIE homogneo en los que el analito se conjuga a un modulador enzimtico. 5- EIE homogneo en los que el analito se conjuga a un sustrato.
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Debido al hecho de que los EIE homogneos ms difundidos, tanto a nivel de laboratorio como en forma comercial, son aquellos en los cuales el analito a estudiar se encuentra conjugado con una enzima simple o con un sustrato, slo consideraremos a continuacin estos casos.

EIE homogneos en los cuales el analito se conjuga a una enzima simple Es el tipo de EIE homogneo ms difundido. En el mismo, se establece una competencia entre el analito conjugado a la enzima y el analito libre por anticuerpo antianalito que se incluyen en el sistema. La unin del anticuerpo al conjugado determina una alteracin de la actividad enzimtica (generalmente una disminucin de la misma). Por supuesto, mientras mayor sea la concentracin del analito libre en la muestra, menor ser la cantidad de anticuerpos que se unan al analito unido al conjugado y por consiguiente, menor ser, en trminos cuantitativos, el nmero de molculas de enzimas cuya actividad es alterada. La utilizacin de estndares de concentracin contra la cual se comparan los resultados obtenidos con una muestra de concentracin desconocida.

Este tipo de ensayo se ha comercializado fundamentalmente bajo el nombre de EMIT, y se han desarrollado kits para la determinacin de anticonvulsivantes, antibiticos y otros medicamentos, tales con Digoxina, Teofilina, etc.

A A E
S

A E A A E
P

A E
P

Fig. 1. EIE homogneo donde el analito se conjuga a una enzima simple.

EIE Homogneos en los que el analito se conjuga con un sustrato

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Se basa en que un sustrato conjugado con un analito, puede ser transformado en la reaccin enzimtica, pero ello no ocurre si el conjugado reacciona con un anticuerpo especfico al analito.

Debe destacarse que en este ensayo la enzima no produce efecto de amplificacin, sino que se usa solamente para distinguir y cuantificar la fraccin sustrato-analito libre de la que ha reaccionado con el anticuerpo. Por ello, para poder obtener seales medibles, se requiere de sustratos fluorignicos.

Este tipo de ensayos se recomienda para medir analitos en el rango micromolar.

El analito puede ser una sustancia de bajo peso molecular (menor de 1000) como drogas teraputicas, o una macromolcula, como la IgE y la IgM.

A A A AP A A A
S P

S S

S S

Fig. 2. EIE homogneo donde el analito se conjuga con un sustrato.

EIE Heterogneos
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Los EIE heterogneos fueron los primeros en ser descritos, y en general, se conocen como ELISA (Enzyme Linked InmunoSorbent Assay), ya que en los mismos se utiliza un soporte slido en el cual se fija uno de los componentes de la reaccin.

Estos ensayos transcurren en dos fases: la fase slida, en la cual se fija uno de los componentes de la reaccin, y la fase lquida, ya que el resto de los reaccionantes se aade en solucin. Este tipo de ensayo conlleva la realizacin de lavados intermedios para separar los componentes que han reaccionado con la sustancia fijada en el soporte, de los que no lo han hecho. Esta separacin es necesaria, al no existir modificacin de la actividad de la enzima utilizada en el sistema, para poder evaluar el resultado del ensayo. Debido a que estos EIE ocurren en dos fases diferentes, una slida y otra lquida, es que reciben el nombre de heterogneos.

Se han usado diferentes tipos de fase slida a las que se unen anticuerpos o antgenos, entre ellas podemos citar microplacas y tubos de materiales polimricos, esferas, microparticulas y membranas.

Las microplacas y tubos de materiales polimricos son ampliamente usados en los sistemas de ELISA, por sus grandes posibilidades de automatizacin, utilizndose fundamentalmente el poliestireno como material plstico, aunque tambin es usado el polivinilo y otros.

Las microplacas de 96 posiciones se han convertido en formato estndar en los ensayos inmunoenzimticos, debido a que la naturaleza hidrfobica del poliestireno con el cual estn conformadas stas, permite una gran estabilidad a la unin de las molculas de los antgenos o anticuerpos a la superficie de las mismas, as como a las excelentes cualidades pticas de dicho material.

En la actualidad estas microplacas pueden ser utilizadas como un solo bloque o formadas varias tiras de reaccin con caractersticas similares.

En general los EIE heterogneos o ELISA se caracterizan por su:

1- Elevada sensibilidad, detectabilidad y especificidad.

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2- Facilidad y bajo costo para su automatizacin. 3- Reproducibilidad y evaluacin objetiva. 4- Adaptabilidad a procesos micro y ultramicroanlisis. 5- Posible estandarizacin con anticuerpos monoclonales.

Los enzimoinmunoensayos son clasificados por muchos autores en:

Competitivos No Competitivos

Los EIE heterogneos de tipo competitivo, son aquellos en los que se presenta el antgeno o el anticuerpo conjugado a la enzima, establecindose una competencia entre stos y los antgenos o anticuerpos de la muestra por una cantidad limitada del anticuerpo o antgeno especfico fijado en la fase slida. Cuanto ms antgeno o anticuerpo srico est presente en la muestra menos antgeno o anticuerpo marcado se fija, por tanto la actividad enzimtica disminuir. Estos ensayos se emplean para antgenos de pequeo peso molecular. Son menos sensibles que los ensayos tipo sndwich aunque tienen buena especificidad. Los componentes del suero pueden producir interferencia.

ELISA competitivo para la medicin de antgeno

ELISA competitivo para la medicin de antgeno

Anticuerpo de captura Antgeno en la muestra

E E E E E E E E

Anticuerpo de captura Antgeno en la muestra

E E E E E E E

Conjugado de antgeno con una enzima

Incubacin

Conjugado de antgeno con una enzima

Incubacin

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ELISA competitivo para la medicin de antgeno

ELISA competitivo para la medicin de antgeno

Anticuerpo de captura Antgeno en la muestra

E Conjugado de

Anticuerpo de captura Antgeno en la muestra Conjugado de Sustrato antgeno con una enzima Producto de la reaccin enzimtica

antgeno con una enzima

Los ensayos competitivos en general se caracterizan por:

1- Tener menor sensibilidad. 2- Ser ms especficos. 3- Ser relativamente ms lentos. 4- Requerir cantidades de antgeno o anticuerpo de alta pureza. 5- Tener interferencia con los componentes del suero. 6- Detectar antgeno fundamentalmente. 7- Ser usados para detectar molculas pequeas.

Un ejemplo de este tipo de E.I.E lo tenemos en el UMELISA T4 y UMELISA 17-OH Progesterona.

En los ensayos de tipo no competitivo, la fase slida queda recubierta por el anticuerpo o antgeno en exceso, a stos se unen los antgenos o anticuerpos especficos presentes en la muestra, posteriormente se realiza un lavado para eliminar a los que no se fijaron, aadindose luego el anticuerpo marcado con la enzima, el cual despus de un lavado se aade el sustrato.

Este tipo de ELISA se caracteriza por:

1- Tener mayor sensibilidad y detectabilidad.

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2- Ser menos especficos. 3- Requerir anticuerpos puros y antisueros de elevado ttulo. 4- Ser ms rpidos. 5- No interferir con los componentes del suero.

Entre los distintos tipos de EIE heterogneo no competitivo utilizados tenemos: El de doble Anticuerpo o Sndwich.

En este E.I.E. la fase slida es recubierta con anticuerpos especficos, a los cuales se unir el antgeno de la muestra luego de un tiempo de incubacin que permite dicha unin, se realiza un lavado para eliminar el resto del antgeno no unido, aadindose a continuacin el anticuerpo unido a la enzima que es lo que llamamos conjugado, el cual se unir al antgeno que previamente se haba unido al anticuerpo de la fase slida, posteriormente se lleva a efecto una incubacin, efectundose un lavado despus con el fin de eliminar el exceso de conjugado que no se haya unido al complejo ya formado, y por ltimo se aade el sustrato correspondiente. Se obtendr una seal dada por el producto de la accin de la enzima sobre el sustrato, siendo sta proporcional a la cantidad de antgeno presente en la muestra.

ELISA de doble anticuerpo para la medicin de antgeno

Anticuerpo de captura

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ELISA de doble anticuerpo para la medicin de antgeno

Anticuerpo de captura Antgeno en la muestra

ELISA de doble anticuerpo para la medicin de antgeno

Anticuerpo de captura Antgeno en la muestra -E Conjugado de Ac antgeno especfico unido a una enzima

-E -E -E -E

Ejemplos de este tipo de EIE los tenemos en el UMELISA TSH y UMELISA AFP.

ELISA Indirecto para la deteccin de anticuerpos Los ELISA indirectos se caracterizan por unir a la fase slida los antgenos, luego las muestras se incuban fijndose los anticuerpos presentes en las mismas a dichos antgenos, al realizar un lavado posterior se eliminan los componentes no fijados, quedando el complejo antgeno-anticuerpo, luego se aade un anticuerpo del tipo de las inmunoglobulinas antiespecie del anticuerpo de la muestra marcado con una enzima, posteriormente se realiza un lavado para eliminar los anticuerpos marcados no fijados y se adiciona el sustrato. Se obtendr una seal dada por el producto de la accin de la enzima sobre el sustrato, siendo sta proporcional a la cantidad de anticuerpos presente en la muestra.

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Podemos citar como ejemplo de este tipo de E.I.E al UMELISA HIV 1+2 recombinant, UMELISA HCV, UMELISA HTLV I/II, etc.

ELISA de captura para la deteccin de IgM. Se caracterizan por unir a la fase slida los anticuerpos de captura anti-IgM, luego se aade la muestra que tiene IgM no dirigida al antgeno y puede tener IgM especfica para el antgeno los cuales se unen a los anticuerpos de captura, se realiza un lavado para eliminar los componentes no fijados, posteriormente se aade el antgeno marcado con una enzima el cual se une a la IgM especfica para el antgeno, posteriormente se realiza un lavado para eliminar los antgenos marcados no fijados y se adiciona el sustrato. Se obtendr una seal dada por el producto de la accin de la enzima sobre el sustrato, siendo sta proporcional a la cantidad de anticuerpos especficos para el antgeno presente en la muestra. Estos ensayos se utilizan cuando es necesario diferenciar entre una infeccin reciente y una anterior, o entre anticuerpos del nio y de la madre. Ej.: Dengue, Rubola, Toxoplasma, Sfilis. No hay que eliminar previamente la para IgM. Ejemplos de este tipo de EIE lo tenemos en el UMELISA Dengue IgM. IgG de la muestra como en los ensayos indirectos

COLECTA DE LA MUESTRA DE SANGRE EN PAPEL DE FILTRO Introduccin Los programas de Pesquisa Neonatal (Screening) se han convertido en uno de los aspectos ms aceptados de la medicina preventiva peditrica actual. El inters por el Screening neonatal fue creciendo desde sus comienzos en la dcada del 60 con los trabajos de Guthrie sobre fenilcetonuria. La idea revolucionaria de Guthrie de que los constituyentes de la sangre podran ser estables en muestras de sangre secadas en papel de filtro fue un presagio de que no slo los aminocidos sino tambin las hormonas, enzimas y anticuerpos podran ser fidedignamente detectadas y cuantificadas en muestras de sangre entera.

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Antecedentes Guthrie, 1961: Desarrolla la metodologa de la determinacin de fenilalanina en sangre seca sobre papel de filtro utilizando la prueba de inhibicin bacteriana de Guthrie.

Inhibicin bacteriana de Guthrie: Mtodo bacteriolgico en el cual la presencia de inhibicin alrededor del disco indica la presencia de Phe en la muestra.

Positivo

Negativo

Placa con agar / beta 2 tienilalanina / glucosa / bacteria Bacillus Subtilus

1961: Guthrie inicia el pilotaje de PKU en una localidad del estado de N. York. E.U. 1962:Se detecta el primer caso de hiperfenilalalinemia en los E.U. con este mtodo, despus de estudiar 800 nios. 1963:Se incorporan otros programas neonatales en papel de filtro (galactosemia, homocistinuria) 1963-1967: Se desarroll el equipo ponchador de muestras de sangre seca en papel de filtro

Ventajas de la colecta de sangre en papel de filtro.

Simplicidad de su colecta : No se requiere de puncin venosa y la cantidad de sangre necesaria es pequea, no es necesario tubos, ni centrfugas)
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Facilidad de su transportacin: Simplifica el traslado de las muestras desde lugares distantes hasta un laboratorio central sin necesidad de refrigeracin ni cuidados especiales.

Implica un menor riesgo biolgico. Fcil almacenamiento y conservacin sin que se afecte la estabilidad. Facilidad de procesada y manipulada en el laboratorio

Aplicaciones de las muestras de sangre seca en papel de filtro

1-Pesquisaje neonatal.

PKU Hipotiroidismo congnito Toxoplasmosis Congnita Fibrosis qustica Biotinidasa Hiperplasia Adrenal Congnita Galactosemia Homocistinuria VIH Ensayos de Gentica Molecular

2-Pesquisaje con aplicacin en la Vigilancia Epidemiolgica.

Ac contra el VHC Ac contra el VIH HBsAg Ac IgG Chagas Ac IgM Dengue Ac IgM Hansen

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Cuando tomar la muestra de sangre para el pesquisaje neonatal? 1. Pesquisaje de Hipotiroidismo Congnito Suero de cordn: en el momento del nacimiento Taln: A partir de las 48 horas de nacido.

2. Pesquisaje de Fenilcetonuria Taln: A partir del 5to da de nacido.

Tcnicas para la coleccin de la sangre sobre papel de filtro. Puncin del taln con aplicacin directa sobre el papel. Recoleccin de la sangre del taln en tubos estriles heparinizados y su posterior adicin en el papel. Extraccin de la sangre con una aguja de la vena dorsal de la mano o del dedo y adicin en el papel.

Instrucciones para la toma de muestra de sangre del taln y su coleccin en papel de filtro. 1-Preparacin de las condiciones Lanceta estril Alcohol isopropanol al 70 % Guantes estriles Gasa estril Paos suaves Tarjeta de recoleccin

2-Preparacin del formulario. Los datos requeridos en la tarjeta deben de llenarse a mano, con letra legible y correcta antes de hacer la toma de sangre para evitar daar la muestra y no ser contaminada con agentes externos (rodillo de mquina de escribir, etc.). Asegrese de llenar la tarjeta sobre una superficie limpia y seca.

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Las reas dentro del papel de filtro no deben ser tocadas en ningn momento, ni siquiera con guantes, ya que la grasa de la piel o talco de los guantes puede contaminar y alterar el resultado.

Despus de colectada la mancha de sangre, la misma no debe ser tocada, ni tener contacto alguno con agua, alimentos soluciones antispticas y otros materiales.

Datos que debe tener la tarjeta de recoleccin: 1. Nombre(s) y Apellidos del nio. 2. Nmero de Historia Clnica del paciente. 3. Fecha de nacimiento del nio y de colecta de la muestra 4. Sexo y peso del nio al nacer. 5. Status alimentario. 6. Direccin completa. 7. Tipo de parto y edad gestacional de la madre. 8. Fecha de llegada de la muestra al laboratorio.

3-Localizacin del sitio de puncin reas laterales mediales de la superficie plantar del taln

4- Preparacin y limpieza del sitio de extraccin. El nio debe ser cargado de forma que sus piernas estn ms bajas que el corazn para que se incremente la presin venosa. El sitio de puncin se debe limpiar con una esponja o algodn con solucin de alcohol al 70 % (isopropanol/agua, 70/30 volumen). El exceso de alcohol se debe eliminar con una gasa estril y dejar secar al aire (si quedara algn residuo de alcohol se puede diluir la muestra y afectar los resultados).

5-Puncin Requisitos para obtener sangre de taln: Se debe utilizar una lanceta estril con una profundidad de 2.0 a 2.4 mm. La primera gota se debe eliminar con una gasa estril y la siguiente es la que se debe aplicar en el papel.
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6-Aplicacin directa sobre el papel La gota de sangre debe caer dentro del rea del crculo. La gota debe ser lo ms grande posible para garantizar el llenado del crculo y embeber el papel de filtro de forma tal que la mancha de sangre se observe por ambas caras del papel. El papel se debe tocar suavemente con la gota y nunca presionarlo contra el taln buscando una mancha mayor. La sangre debe ser aplicada por una sola cara y asegurarse que la misma traspase el papel. Despus que la sangre ha sido colectada del taln del recin nacido, el pie debe ser elevado por encima del cuerpo y presionar con una gasa estril o algodn contra el sitio de puncin hasta que deje de sangrar.

Recomendaciones

No se debe exprimir el sitio de puncin porque puede causar hemlisis y adems mezcla de tejidos con la muestra. La aplicacin de sucesivas gotas sobre el mismo crculo causa sobrecapas y/o concentraciones no uniformes de la sangre. Si un crculo no ha sido llenado completamente con una gota, debe repetirse el procedimiento con un nuevo crculo.

Precauciones durante el secado de la muestra de sangre en papel de filtro 1-Temperatura Despus de llenar todos los crculos, permita que la sangre se seque a temperatura ambiente entre 15 y 22 grados C en posicin horizontal. Las manchas de sangre no deben estar expuestas al sol, calefactores, incubadoras, ni sobre otras fuentes de calor, ya que puede ocurrir una desnaturalizacin de las protenas: La hemoglobina se fija al papel impidiendo la elucin de la muestra y subestimando el resultado.

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2-Tiempo El secado debe de ocurrir en posicin horizontal durante 3 horas como mnimo, ya que de lo contrario la humedad provoca la contaminacin por microorganismos. 3-Contacto Las manchas de sangre no deben amontonarse ni tocar otra superficie durante el proceso de secado, ya que puede ocurrir contaminacin entre una u otra tarjeta.

Variantes para evitar la contaminacin Usar un sobre de papel para cada muestra. Rotar las tarjetas 180 para garantizar que no coincidan las manchas de sangre. Usar papel en blanco entre las muestras.

Precauciones durante la conservacin Utilizar preferiblemente sobres de papel, no usar sobres de nylon sin slica gel ya que la transpiracin provoca la contaminacin por microorganismos. Estabilidad de la Phe y TSH en muestra de sangre colectada en papel de filtro ss 903 Temperatura de conservacin Ambiente (20-25 Grados C) TSH y Fenilalanina 2 a 8 grados C -20 grados C

Analito

Estabilidad 1 semana 4 meses 1 ao

Estabilidad de los Anticuerpos IgG contra el VIH, HCV y HBsAg Analito Temperatura de conservacin Menos 20 grados C 4 a 8 grados C Ac contra el VIH 20 a 25 grados C 37 grados C y Humedad Relativa del 80 %
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Estabilidad 1 ao 1 ao 1 mes 15 das

Ac contra el HCV HbsAg Secado a 15 grados C y Humedad Relativa de 55 % HbsAg Secado a 20 grados C con Humedad relativa de 89 %

2 a 8 grados C 20 a 32 grados C Menos 20 y hasta 4 grados C 20 a 25 grados C 36 grados C

3 meses 15 das 5 meses

2 meses 1 mes

Menos 20 grados C hasta 4 grados C.

5 meses

Cdigo--------------------

Cdigo--------------------

Cara Anterior correcto

Cara Posterior

Cdigo-------------------

Cdigo-------------------

Cara Anterior incorrecto

Toma de la muestra

Cara Posterior

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28

Muestras no vlidas 1-La cantidad de la muestra es insuficiente para la ejecucin de la prueba. 2-La muestra aparenta estar rayada desgastada. 3-La muestra no se sec antes del envo. 4-La muestra aparenta estar sobresaturada. 5-La muestra aparenta estar desteida, diluida contaminada. 6-La muestra exhibe anillos de suero. 7-La muestra aparenta tener cogulos o capas sucesivas. 8-No hay sangre.

ELEMENTOS TCNICOS A TENER EN CUENTA AL EVALUAR MUESTRAS EN EL PESQUISAJE NEONATAL. CRITERIOS PARA LA EVALUACIN

Tiempo entre la toma de muestra y procesamiento en el laboratorio: Las muestras no deben ser procesadas si son recibidas en el laboratorio en un perodo mayor de 30 das, despus de haber sido colectadas.

Adecuacin o suficiencia: Como mnimo una muestra debe permitir al menos 4 ponches de 3 mm.

Apariencia: Criterio basado en las caractersticas que tiene la mancha de sangre.

MUESTRAS NO TILES (Ver anexo 1) Desgastadas. Con cogulos. Descoloridas. Las gotas se encuentran superpuestas.
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 La muestra no fue secada antes de ser enviada al laboratorio. La muestra fue recibida en bolsa plstica.

NATURALEZA DE LAS CAUSAS DE ERRORES QUE PUEDEN CONDUCIR A FALSOS POSITIVOS O FALSOS NEGATIVOS

Los errores concernientes a las etapas: Preanalticas. Analticas. Postanalticas.

Errores accidentales, errores sistemticos y errores de imprecisin.

CAUSAS DE FALSOS POSITIVOS

Etapa preanaltica. Contaminacin eventual.

Etapas analticas. Incumplimiento de las tcnicas operatorias o protocolos de ensayo. Anomalas en la medicin de la seal. Errores sistemticos, fundamentalmente en la zona cercana al nivel de corte fijado.

Etapas post-analticas. Errores en la interpretacin de los resultados. Errores de clculo. Errores en la emisin de los datos.

CAUSAS DE FALSOS NEGATIVOS

En la maternidad: Utilizacin de papel de filtro inadecuado. Depsito de sangre defectuoso.

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Error de identificacin. Malas condiciones de almacenamiento y transporte.

En el lugar de recepcin: Error de identificacin. Malas condiciones de almacenamiento.

En el laboratorio: Error de identificacin. Incumplimiento de las tcnicas operatorias. Error analtico Elucin incompleta de la muestra. Error accidental relacionado con la medicin de la seal. Falta de algn elemento del estuche de reactivos. Error de clculo o mala interpretacin de los resultados. Error en la trascripcin y emisin de los datos.

PROBLEMAS QUE DE MANERA GENERAL PUEDEN CONDUCIR A ERRORES Tipo de papel de filtro usado. Modalidad empleada en la colecta de sangre. Demora en la realizacin de las pruebas. Estabilidad de los analitos. Seleccin de los reactivos.

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Anexo 1

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ENSAYOS INMUNOENZIMTICOS CUALITATIVOS Qu es un inmunoensayo? Es un ensayo basado en la reaccin antgeno-anticuerpo.

Qu se entiende por enzimoinmunoensayos? Son inmunoensayos que para la deteccin o cuantificacin de la reaccin antgenoanticuerpo requieren de una enzima.

Utilidad de los enzimoinmunoensayos Son mtodos utilizados para la deteccin o cuantificacin de antgenos o anticuerpos especficos en una muestra.

Qu se entiende por enzimoinmunoensayos cualitativos? Son enzimoinmunoensayos para la DETECCIN de antgenos o anticuerpos en la muestra de inters. Se caracterizan por cualificar a la muestra y por tanto los resultados se emiten como: - presenta o no presenta - si o no - positivo o negativo

Cundo se emplean? 1. Para realizar la seleccin de materiales biolgicos a emplear con fines de transplante, transfusin, preparados vacunales u otro destino. 2. Para establecer o confirmar que un individuo ha estado en contacto con determinado antgeno, lo cual es vital para el tratamiento o la conducta a seguir con el mismo.

EN AMBOS CASOS SLO INTERESA ESTABLECER LA EXISTENCIA DE UN DETERMINADO ANTGENO O ANTICUERPO Y NO LA CANTIDAD EN QUE SE ENCUENTRAN

Parmetros de calidad fundamentales en los enzimoinmunoensayos cualitativos: Valor de corte, sensibilidad y especificidad.
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Valor de corte: Es el valor que permite diferenciar la poblacin de muestras negativas de la poblacin de muestras positivas.

D i a g r a m a d e di s t ri b u c i n d e f re c u e n ci a s p a r a e s t a bl e ce r v a l o r d e c o r t e
Frec.Abs.
900 800 700 600 500
P o blaci n de p o s i ti v o s V al or d e c or te

400 300 200 100 0 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00 2,20 2,40 2,60 2,80 3,00

M /P
P o blaci n de n e g a t iv o s

Empleando los datos obtenidos con una prueba en evaluacin y con otra prueba considerada como referencia se calculan la sensibilidad y la especificidad.

Sensibilidad: Definida como la proporcin de muestras positivas (reactivas) correctamente identificadas por la prueba en evaluacin. Su clculo se realiza mediante la frmula:

S = (VP / VP + FN) 100 Donde: VP: Son las muestras que fueron positivas tanto por la prueba de referencia como por la prueba en evaluacin. FN: Son las muestras que por la prueba de referencia fueron positivas y por la prueba en evaluacin fueron negativas.

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Especificidad: Definida como la proporcin de muestras negativas (no reactivas) correctamente identificadas por la prueba en evaluacin. Su clculo se realiza mediante la frmula:

E = (VN / VN + FP) 100

Donde: VN: Son las muestras que fueron negativas tanto por la prueba de referencia como por la prueba en evaluacin. FP: Son las muestras que por la prueba de referencia fueron negativas y por la prueba en evaluacin fueron positivas.

Ejemplo de clculo de sensibilidad y especificidad

Prueba de referencia Prueba en evaluacin Resultados positivos 995 VP Resultados negativos 8 FP Total

Resultados positivos

1003

Resultados negativos Total

5 FN

992 VN

997

1000

1000

2000

S = (995 / 1000) 100 = 99,5 %

E = (992 / 1000) 100 = 99,2 %

Precisin: Es un parmetro relacionado con la ejecucin de las pruebas . Se define como la dispersin de los datos obtenidos para una muestra procesada varias veces.

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Buena

Regular

Mala

Buena: Los diferentes datos de la muestra no difieren significativamente entre s y se encuentran muy cercanos del valor central. Ejemplo: 120, 124, 125 y 122. Regular: Los diferentes datos de la muestra difieren poco entre s y se encuentran prximos al valor central. Ejemplo 100, 110, 115 y 120. Mala: Los diferentes datos de la muestra difieren significativamente entre s y se encuentran distantes del valor central. Ejemplo: 50, 90, 140 y 170.

Componentes de los enzimoinmunoensayos Fase slida: fundamentalmente POLIESTIRENO y cloruro de polivinilo (PVC) como placas de 96 pocillos. Muestras: PLASMA, SUERO, ORINA, lquido cefalorraqudeo y material bipsico. Se pueden utilizar puras, con una o varias diluciones. Conjugado: formado de la unin qumica entre una enzima con un anticuerpo o con un antgeno. Las enzimas ms utilizadas son peroxidasa de rbano picante,

betagalactosidasa y la FOSFATASA ALCALINA. Sustrato: sustancias transformadas por la accin de las enzimas que se encuentran formando parte del conjugado. Pueden ser cromognicos, quimioluminiscentes o radioactivos. Procesamiento de los datos: manual o AUTOMTICO. FLUORESCENTES,

Ejemplos enzimoinmunoensayos cualitativos de la tecnologa SUMA

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Deteccin de antgeno: UMELISA HBSAg Plus, para detectar antgeno de superficie del virus de la hepatitis B en muestras de suero.

En

la

figura

aparecen

representados

los

diferentes

componentes

anteriormente

mencionados.

Fundamento del ensayo

Anti-HBsA g Monoclonal

HBsAg en la Anti-HBsA g m uestra Enzima

Sustrato

Emisin de los resultados: La tecnologa SUMA dispone de programas que realizan automticamente el procesamiento y emisin de los resultados.

Deteccin de anticuerpo: UMELISA HCV, para detectar anticuerpos IgG contra la hepatitis C en muestras de suero.

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E A: Antgeno de hepatitis C B: Anticuerpos IgG en la muestra C: Conjugado anticuerpos anti IgG humana / FA D: Sustrato

C D

Emisin de los resultados

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Interpretacin de los resultados en los ensayos cualitativos de la tecnologa SUMA.

Inter pr eta ci n
Fl u o r e s c e n ci a

d e lo s r e s u lt a d o s

A A C o r te Z o n a C o r te - 1 5 %
G ris

N Ne e g ga at ti iv vo o B BL L P Po os si it ti iv vo o N Ne e g ga at ti iv vo o P Po os si it ti iv vo o R Re e p pe et ti ir r

B B C C D D E E F F -

A A

B B

C C

D D

E E

F F

R Re e s s u ul lt ta ad do os s

Negativo: Muestra cuyo resultado se encuentra por debajo del valor de corte. BL: Muestra cuyo resultado se encuentra en la frontera entre la poblacin de negativos y la poblacin de positivos. A esta zona se le llama Zona Gris y a las muestras que caen en ella se les denomina BL (border line) o dudosas, y a estas muestras por tanto no se les puede definir el diagnstico. Positivo: Muestra cuyo resultado se encuentra por encima del valor de corte. Repetir: Muestra evaluada por duplicado y cuyos resultados fueron discordantes, o sea, estuvieron por encima y por debajo del nivel de corte. Constituye un ejemplo de mala precisin.

ENSAYOS INMUNOENZIMTICOS CUANTITATIVOS. Objetivos: - Que el alumno sea capaz de dominar los conceptos Inmungenos, Antgenos, Anticuerpos, precisin, exactitud, especificidad, linealidad y lmite de deteccin.
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- Que el alumno conozca la importancia que tienen los enzimoinmunoensayos cuantitativos en los pesquisajes.

Introduccin:

Actualmente existe la necesidad de contar con sistemas de tamisajes econmicos que permitan estudiar a grupos relativamente grandes de poblacin, para esto se cuenta con mtodos analticos como son los sistemas cuantitativos y cualitativos en los cuales es necesario tener en cuenta determinados factores como son: * Qu necesidad satisface? * Qu destino va a seguir? * Cunto va a costar para ponerlo en marcha? * Qu beneficio reporta?

Desarrollo:

Conceptos bsicos para llevar a cabo la cuantificacin en una muestra:

Inmungeno: Cualquier sustancia capaz de inducir una respuesta inmunitaria, ya sea de tipo humoral o celular, o de ambas a la vez. La respuesta se denomina inmunogenicidad.

Antgenos: Aquellas sustancias a las que se les pueden unir especficamente una inmunoGlobulina o un receptor de clulas T. Pueden ser o no inmungenos.

Haptenos: Son sustancias muchas veces de bajo peso molecular, capaces de unirse con anticuerpos especficos, pero que solo pueden inducir una respuesta inmunitaria si al efectuarse la inmunizacin estn unidos qumicamente a una molcula portadora, generalmente una protena.

Anticuerpos: Son molculas proteicas que poseen las propiedades de combinarse especficamente con una sustancia que provoca su formacin (Ag). Comprenden un grupo

heterogneo de protenas que constituyen aproximadamente el 20 % de las protenas plasmticas totales y forman parte del mecanismo adaptativo del sistema inmune es decir
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que cuando el sistema inmune adaptativo se activa se produce una respuesta especfica a cada agente infeccioso.

Enzimoinmunoensayos heterogneos

Estos ensayos transcurren en dos fases: la fase slida en la cual se fija uno de los componentes de la reaccin, y la fase lquida en el que el resto de los reaccionantes se aaden en solucin. Este tipo de ensayo conlleva la realizacin de lavados intermedios para separar los componentes que han reaccionado con la sustancia fijada en el soporte, de los que no lo han hecho, debido a que no se afecta la actividad de la enzima utilizada en el sistema. Debido a que estos EIEs ocurren en dos fases diferentes, es que reciben el nombre de heterogneos.

La introduccin de fases slidas en la reaccin, basada en la adsorcin de protenas en las superficies plsticas, le concede a los EIEs heterogneos ms facilidad en la ejecucin y en la automatizacin.

-F.A

ELISA tipo Sandwich (Cuantitativo) para la determinacin de antgenos.

Ensayos cuantitativos: es la estimacin cuantitativa del analito.

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Criterios a tener en cuenta para un sistema cuantitativo:

* Fciles de llevar a cabo. * Tiempos de incubacin aceptables. * Fcil manipulacin sin riesgo a contaminacin. * Fcil interpretacin de los resultados.

Estos ensayos presentan una curva de calibracin la cual debe comprender todo el rango de valores normales y patolgicos. La concentracin de los controles debe estar en la zona de rango normal de la curva y stos se procesan junto con la misma. Para que un ensayo cuantitativo cumpla con las buenas prcticas de calidad debe seguir los parmetros siguientes: buena exactitud, linealidad, precisin, detectabilidad y especificidad. Precisin: Dispersin de los datos obtenidos con respecto al valor central para una muestra analizada repetidas veces.

Se usan muestras de concentracin conocida (3 muestras cuyos niveles de concentracin cubran todo el rango analtico de la curva). Se calculan la media aritmtica (X), desviacin estndar (S) y el coeficiente de variacin (CV).

Especificidad: Es la potencialidad de reactividad cruzada o interferencias por una diversidad de sustancias, tanto de origen endgeno como frmacos que pueden ser administrados. Las sustancias a explorar se determinarn en funcin del inters clnico. Linealidad: Capacidad del mtodo de responder de forma lineal y proporcional a cambios en la concentracin. El mtodo es lineal si la pendiente es constante.

Lmite de deteccin: Capacidad de un mtodo para discriminar entre la presencia o ausencia de analito en una muestra. Concentracin de analito que puede diferenciarse de cero para un coeficiente estadstico determinado.

Exactitud: Capacidad del mtodo para dar el resultado ms cercano a la concentracin verdadera del analito. Por ejemplo:
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Ensayo de Recuperacin:

Se aaden cantidades conocidas del analito que se est analizando, para preparar muestras con niveles de concentracin bajo, medio y alto. R= ( Valor obtenido - Valor endgeno / Valor aadido) x 100 %

200 150 100 50

Comportamiento grfico en un sistema Cuantitativo.

A-C A-D B-C B-D

0 0.1 0.2 0.025

hCG (UI/mL)

Estos EIEs cuantitativos son aplicables en las determinaciones de analitos tales como hormonas, drogas teraputicas, marcadores tumorales, marcadores bioqumicos de inters y de otras protenas en general para la evaluacin, tratamiento y pronstico del paciente de manera individual como por ejemplo tenemos: UMELISA AFP ( para la determinacin cuantitativa de alfa feto-protena), UMELISA TSH (para la determinacin cuantitativa de la hormona estimulante del tiroide), UMELISA HCG (para la determinacin cuantitativa de la hormona gonadotropina corinica humana), UMTEST PKU (para la determinacin cuantitativa de la fenilalanina), UMTEST GAL (para la determinacin cuantitativa de la galactosa 1-P uridil transferasa), entre otros.

0.05

0.4

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UMELISA HCG + UMELISA AFP (Trisoma 21)

UMELISA AFP (Anencefalia Adrenal)

UMELISA AFP (Mielomeningocele Lumbo-sacro y Hidrocefalia)

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UMELISA TSH (Hipotiroidismo Congnito)

UMTEST PKU (nios fenilcetonricos: de 6, 4 y 3 aos de edad)

ASEGURAMIENTO DE CALIDAD EN EL LABORATORIO SUMA.

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OBJETIVOS 1.- Introduccin. Ejemplos, conceptos y definiciones relacionados con la Calidad. 2.- Buenas Prcticas de Laboratorio. Tipos de Control de Calidad. 3.- Aseguramiento de la calidad en un Laboratorio SUMA.

Los resultados del laboratorio son utilizados con tres propsitos fundamentales:

Prevencin de enfermedades Diagnstico de enfermedades. Seguimiento de enfermedades.

Definicin de Calidad:

Conjunto de propiedades o caractersticas de un producto o servicio que le confiere la aptitud para satisfacer las necesidades expresadas o implcitas.

Tradicionalmente la calidad del producto o servicio ha sido establecida a partir del criterio del que lo realiza sin tomar en cuenta la opinin del que lo recibe.

Hoy en da, es necesario compatibilizar y en ltima instancia subordinar el criterio del suministrador (CREADOR-PRODUCTOR) al del cliente (RECEPTOR).

Resultados de encuestas realizadas en pases desarrollados: - Slo uno de cada diez clientes que han quedado insatisfechos repite la compra. - Cada cliente insatisfecho lo comenta con una docena de personas como promedio. - Slo cuatro de cada cien clientes insatisfechos se lo comunica al suministrador.

Diagnosticador.

Cualquier producto que consista en un reactivo, juego de reactivos, sistema, calibrador, controlador o medio de cultivo, destinado por un fabricante a ser utilizado en el estudio in
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vitro de muestras procedentes del cuerpo humano, incluidas las donaciones de sangre y tejidos, con el objetivo de proporcionar informacin: relativa a un estado fisiolgico o patolgico relativa a una anomala congnita para determinar la seguridad y compatibilidad con receptores potenciales para supervisar medidas teraputicas.

Aseguramiento de la Calidad.

Parte de la gestin de la calidad (todas las actividades planificadas y sistemticas aplicadas en el marco del sistema de la calidad y demostradas como necesarias) orientada a proporcionar confianza en el cumplimiento de los requisitos de la calidad.

Control de la Calidad.

Parte de la gestin de la calidad (Tcnicas y actividades de carcter operativo ) orientada a la satisfaccin de los requisitos de la calidad.

BUENAS PRCTICAS DE LABORATORIO (BPL). Principios que identifican, definen y describen la organizacin y las condiciones bajo las cuales se debe llevar a cabo la planificacin y ejecucin de los ensayos del laboratorio, incluyendo registro de datos, la preparacin de informes y el aseguramiento de la calidad de estas actividades. Las BPL forman parte de los sistemas de calidad.

ASPECTOS DE LAS BPL:

Personal Facilidades / Instalaciones / Organizacin Reactivos Documentacin Mtodos analticos. Validacin

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Muestreo. Procesamiento de muestras Equipos. Mantenimiento. Calibracin Materiales de referencia Seguridad

REQUISITOS DEL PERSONAL: Personal suficiente y calificado. Programa de capacitacin. Educacin, adiestramiento y experiencia

en las tareas quede ejecutar. Conocimientos en BPL. Procedimientos normalizados de operacin. Entrenamiento continuo o peridico. Hbitos correctos relacionados con la higiene y la salud. Garantizar el aseo, vestuario e higiene del personal. Presencia y aspecto personal. Chequeos mdicos Reglamentada prohibicin de fumar, comer y beber. Participacin en actividades y decisiones. Programa de entrenamiento.

Causas ms frecuentes de errores humanos: .- Limitaciones fsicas del individuo. .- Fatiga o aburrimiento. .- Descuido. .- Pobre entrenamiento. .- Predisposicin, prejuicios, parcialidad.

MOTIVACION. Fuerza interna que se da en el individuo y va a dirigir y orientar su conducta para realizar una actividad determinada encaminada a satisfacer una necesidad.

SEGURIDAD EN EL LABORATORIOS:
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.-En la zona de laboratorio no se permitir al personal, comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicar cosmticos. .-No se permite pipetear con la boca. .-Mantener el laboratorio limpio y aseado, retirando del mismo cualquier material que no tenga relacin con el trabajo. .-La superficie de trabajo se descontaminar al menos una vez al da, y se desinfectar en caso de derramamiento de sustancias potencialmente infecciosas. .-Todos los procedimientos tcnicos se practicarn de manera que se evite en lo posible la formacin de aerosoles. .-En el laboratorio se utilizarn batas, uniformes u otras prendas apropiadas, no se llevar ropa de laboratorio fuera de este. .-Siempre que sea necesario, proteger los ojos y la cara de salpicaduras mediante el uso de dispositivos de proteccin. .-Debe existir un programa de lucha contra insectos y roedores.

PRINCIPIOS BASICOS DE BIOSEGURIDAD APLICADOS A LOS LABORATORIOS BASICOS. NORMAS GENERALES. Las reglas ms importantes se enumeran a continuacin: 1.- No se permitir pipetear con la boca. 2.- En la zona de trabajo de laboratorio no se permitir al personal comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicar cosmticos. 3.- Habr que mantener el laboratorio limpio y aseado, retirando de l cualquier material que no tenga relacin con el trabajo. 4.- La superficie de trabajo se descontaminar al mes una vez al da, y se desinfectar en caso de derramamiento de sustancias potencialmente infecciosas. 5.- Los miembros del personal se lavarn las manos despus de haber manipulado los materiales, as como al abandonar el laboratorio. 6.- Todos los procedimientos tcnicos se practicarn de manera que se evite en lo posible la formacin de aerosoles. 7.- Todos los lquidos o slidos contaminados se descontaminarn antes de eliminarlos o de volver a utilizarlos; los que se vayan a reutilizar deben esterilizarse en autoclaves y los que se eliminarn se incinerarn fuera del laboratorio.
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8.- En el laboratorio se utilizarn batas, uniformes u otras prendas apropiadas, no se llevar ropa de laboratorio fuera de este; se desinfectarn las prendas contaminadas por los procedimientos apropiados. 9.- Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras mediante el uso de dispositivos de proteccin. 10.-Slo se autorizar el paso a la zona de trabajo del laboratorio, a las personas que laboren en l y que hayan sido informadas sobre los posibles riesgos satisfaciendo as los requisitos que se exijan para su entrada. No se permitir la entrada de nios en dicha zona. 11.- Habr que utilizar guantes en todos los trabajos que entraen un contacto accidental directo con sangre, materiales infecciosos o animales infectados. Los guantes se deben quitar aspticamente y esterilizar en autoclaves antes de proceder a su eliminacin. Si no se dispone de guantes de un slo uso se utilizarn guantes reutilizables limpindolos y desinfectndolos despus de haberlos usado y antes de volverlos a utilizar. 12.- Todos los derramamientos como los accidentes y exposicin a materiales infecciosos se notificarn inmediatamente al jefe de laboratorio, quien habr de llevar a cabo un protocolo escrito para tal efecto, previendo una evaluacin, vigilancia y tratamiento mdico apropiado. 13.- El director del establecimiento se ocupar de que el personal reciba una preparacin o formacin apropiada sobre seguridad en el laboratorio. Habr que adoptar un manual de seguridad y de operaciones en el que se identifiquen los riesgos o potencia y se indiquen las prcticas o procedimientos adecuados para reducir al mnimo o eliminar tales riesgos. Al personal se le informar sobre la existencia de riesgos especiales y se le pedir que lea y observe las instrucciones sobre las prcticas y los procedimientos establecidos.

PRINCIPALES DIFICULTADES PRESENTADAS EN LOS LABORATORIOS. 1. Experimentos mal diseados y ejecutados con resultados inexactos. 2. Personal tcnico no consciente de ajustarse a observaciones y registro incorrecto de los resultados. 3. Falta de revisin crtica de los datos por parte de los responsables. 4. Imposibilidad de conocer detalles y poder rastrear el problema a partir de resultados (documentos deficientes). protocolos, a exactitud de las

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ENSAYO INMUNOENZIMATICO. Inmunoensayo en el cual la deteccin del compuesto a determinar es realizado al evaluar los cambios de concentracin en el producto de una reaccin enzimtica o de los componentes que en sta participen (cofactores, grupos prostticos, etc.).

CALIDAD EN LOS LABORATORIOS SUMA

TIPOS DE CONTROL DE CALIDAD Control de Calidad Interno. Anlisis Externo del Control Interno. Control de Calidad Externo.

CONTROL DE CALIDAD INTERNO:

ETAPAS DEL EXAMEN: 1. POBLACIN EN ESTUDIO (pacientes, embarazadas, recin nacidos,etc.) 2. PREPARACIN PARA EL EXAMEN (ayuna, dieta previa, etc.) 3. TOMA DE MUESTRAS (venosa, capilar, conservacin y transportacin, etc.)

4. ANLISIS (Procedimiento analtico) 5. VALIDACIN E INTERPRETACIN DE RESULTADOS

Conceptos y definiciones empleados en las tcnicas de Control de la Calidad aplicadas en el laboratorio.

Precisin: Dispersin de valores entorno a un Valor Central(VC) cuando se procesa una muestra varias veces.

Exactitud: Identidad entre el valor obtenido y el valor real de la muestra.

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Error: Desviacin no intencional. Error Aleatorio: Desviacin no intencional, fortuita, casual, generalmente no evitable. Error Sistemtico: Desviacin no intencional, generalmente evitable, se relaciona estrechamente con la falta de exactitud. Error Grosero: Equivocacin absolutamente evitable.

Calibrador: Referencia utilizada para asignar los valores a las muestras.

Controlador: Referencia utilizada para la deteccin de errores evitables en los procedimientos analticos.

Lmites de Control: Valores lmites (a ambos lados del Valor Central) que delimitan en el intervalo de valores posibles del controlador para considerar el procedimiento analtico bajo control. Se establece por mtodos estadsticos.

CONTROL DE CALIDAD INTERNO. Calidad antes que Control de la Calidad.

Es responsabilidad de cada laboratorio individualmente y tiene como objetivo fundamental garantizar la confiabilidad de los resultados brindados. Debe concebirse cumpliendo las siguientes Etapas secuentes:

Medidas Preventivas: Evitar resultados errneos o deficientes. Tcnicas de Control Detectar resultados errneos o deficientes. Medidas Remediales Eliminar las causas de los resultados errneos o deficientes (Acciones correctivas).
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Es imposible evitar y eliminar las causas de los resultados deficientes, sin conocer con profundidad todas las etapas del examen del laboratorio que aspira a controlar.

1-Medidas Preventivas: Deben establecerse de forma clara e inequvoca para cada una de las etapas enunciadas anteriormente.

Ejemplos:

- Control y Calibracin de los diferentes equipos e instrumentos. - Control de las condiciones ambientales que tengan influencia en la ejecucin de los ensayos (Ejemplos: temperatura, humedad, vibraciones, ruidos, etc) - Control de la conservacin de los reactivos, diagnosticadores y muestras. - Medidas organizativas generales. - Entrenamiento adecuado de los analistas. - Control y utilizacin adecuados de la documentacin (Procedimientos Normalizados de Operacin, Registros de Trabajo y los Informes de Resultados)

TECNOLOGA SUMA. CONCEPTO Y APLICACIN (UMELISA Y UMTEST). Tecnologa: Conjunto de los conocimientos propios de un oficio mecnico o arte industrial. SUMA: Sistema Ultra Micro Analtico. Tecnologa SUMA: Sistema integral que incluye equipos, reactivos y software.

Por qu surge la Tecnologa SUMA? La situacin de la mortalidad infantil cubana haba experimentado cambios significativos en la dcada de los aos 70, como consecuencia de la aplicacin de un plan de medidas sanitarias y preventivas, e innumerables inversiones en centros asistenciales, as como el establecimiento de un sistema mdico preventivo y asistencial. Las enfermedades infecciosas y diarreicas agudas, as como las infecciones perinatales en general, mostraron disminuciones sostenidas y comenzaron entonces a hacerse evidentes otras causas de enfermedad y de muertes, que por su relativa baja frecuencia haban
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resultado menos importantes como es el caso de las malformaciones congnitas y de las enfermedades hereditarias y genticas. Sin embargo, para enfrentar esta nueva problemtica de salud se requera del establecimiento de un efectivo sistema de atencin primaria, y de la realizacin de estudios a escala masiva, con el objetivo de detectar y/o evitar de manera precoz las enfermedades que de una u otra manera afectan la calidad de vida del ser humano, Para nuestro pas resultaba casi imposible pensar en la adquisicin de la tecnologa disponible en el mercado para abordar esta nueva problemtica de salud, de ah la necesidad de buscar soluciones tecnolgicas propias, adaptadas a nuestras condiciones de desarrollo econmico y social, cuyas caractersticas permitieran su extensin y aplicacin en primer lugar al estudio de las malformaciones congnitas que ya en ese momento haban pasado a ocupar la tercera causa de mortalidad infantil. As, en 1979, se inici el desarrollo de una tcnica que permitira estudiar un gran nmero de muestras, con el ms bajo costo posible, conjugando las ventajas de los mtodos ELISA pero utilizando ultra micro volmenes (10 microlitros de muestras y reactivos). Para llevar a cabo esta tarea fue necesario desarrollar placas especiales, con una nueva geometra, a las que se denomin placas de ULTRAMICROELISA, teniendo en cuenta el pequeo volumen a utilizar, para las que se adaptaron los instrumentos necesarios que permitieran la lectura, el clculo y la interpretacin de los resultados.

Placa de Micro y Ultra Micro Elisa. 54

El desarrollo a escala de laboratorio de un ultra micro mtodo de inmunoensayo de 10 microlitros para la cuantificacin de AFP en el suero de las gestantes y del instrumental necesario, condicionaron el surgimiento, desarrollo y aplicacin de lo que posteriormente sera la tecnologa SUMA como un sistema de diagnstico integral basado en las tcnicas de inmunoensayo.

En 1982 se realiz el primer pilotaje con reactivos a granel para la determinacin de la AFP a 5000 gestantes de Ciudad de La Habana para esta tarea se utiliz el equipo KAPPA de fabricacin alemana, pero con adaptaciones para ultramicroensayos realizados por un grupo multidisciplinario del CNIC. En la actualidad en el CIE se disean y se producen todos los equipos necesarios para llevar a cabo los programas de pesquisaje con la mejor calidad y a un costo mnimo.

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APLICACIN DE LA TECNOLOGIA SUMA

Con la metodologa establecida y partiendo del modelo inicial del UMELISA-AFP se desarrollaron ms de 20 ensayos diferentes, los cuales se aplican en diversos programas de salud. El desarrollo y aplicacin de la tecnologa SUMA en los ltimos 17 aos ha estado orientada fundamentalmente a programas o aplicaciones de salud en tres lneas de trabajo principales:

Materno - Infantil:

Diagnstico prenatal Diagnstico neonatal

Certificacin de la sangre Vigilancia epidemiolgica

M a t e r n o -I n f a n ti l

D D ii a ag gn n s s tt ii c co o P Pr re en na a tt a all

AF P

H C G

D D ii a ag gn n s s tt ii c co o N Ne eo on na a tt a all

TSH TS H T4 N E O N AT A L

T4 N E O N AT A L

U M TE ST P K U

U M TE ST
BIO T IN ID A SA

U M TE ST 17 O H P G AL Ig E

Vi g i l a n c i a E p i d e m i o l g i c a

H B s Ag HI V 1+ 2 C H A G A S PL U S

H B s Ag Co n f ir m

A N TI H B s Ag

A N TI H C V H B c

D E N G U E Ig M P L U S

D E N G U E H A N S E N Ig G

C e r ti fi c a c i n d e l a s a n g r e

H B s Ag C H A G A S PL U S

H B s Ag Co n f ir m HI V 1+ 2

A N TI H C V H B c

Algunos de estos diagnosticadores como el UMELISA AFP y el UMELISA HCG, adems el UMELISA PSA se utilizan tambin como Marcadores Tumorales en el
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diagnstico y seguimiento de algunas enfermedades como el cncer de la prstata, el hepatocarcinoma, el coriocarcinoma, la mola hidatiforme, etc. Tanto los UMELISAs como los UMTESTs pueden ser cuantitativos o cualitativos en dependencia del objetivo para el cual fue diseado el ensayo: UMELISA cuantitativo: UMELISA AFP para la determinacin cuantitativa de AFP en el suero humano y lquido amnitico.
P R O C E DI M IE N T O E s t n d a r e s, C o n t r o l y A c P M u e str a s 1 0 1 0 L L D E L U M E L IS A A F P

a n ti

A F P / F. A

3 0 A c P a n ti A F P

mi n

3 7 C

L a va d o 3 0 mi n 3 7 C

L a va d o

1 0 L e ct ur a P R - 5 2 1 30 mi n

S u str at o

2 0 -2 5 C

UMELISA cualitativo: UMELISA HIV 1+2 Recombinant para la deteccin de anticuerpos al VIH 1 y 2 en suero humano, plasma o sangre seca sobre papel de filtro.

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P ro c e di mi e nt o d el U M E L I S A

HI V

1+2

Re c o m bi n a nt

1 0 L d e m u e s tr a

Incub a ci n 3 0 m in a 3 7 La va d o Tir a d e r ea cci n ( A g . r e c. y s n t eti c o )

10 L de Conjugado ( a nt i- I g G
h

/FA)

10 L

s u st r at o L e c t u r a , va li d a ci n e i nt e r p r e ta c i n d e l o s r es u lt a d o s c o n el P R 5 2 1

E E

Incub a ci n 3 0 m in 3 7 La va d o

3 0 m i n. Te m p . a m b .

UMTEST cuantitativo: UMTEST PKU. Prueba fluorescente para la cuantificacin de phe en sangre seca sobre papel de filtro.
P R O C E DI M I E N T O DE L UM T E S T P K U

RE A CTIV O 3 1

. . . .. . . .. . . .. . . .. . 1 0 L 60 m M 50 m M 5, 8

N i n hi dri n a

L- L e u c i l- L- Al a ni n a

T a m p n S u c ci n at o 0, 2 2 M p H

E XT R A C CI N 7 0 L Et a n ol 70 %

60 mi n T A 1 0 L El u at o di sc o s d e 3 m m C al i b r a d o r e s y M u e st r a s 60 mi n a 60 C

R e a c ti v o d e C o b r e . 1 0 L L e ct u r a e i nt er p r et a ci n Cu S O d e re s ulta d o s 5 - 15 mi n T A
4

1,2 m M

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UMTEST cualitativo: UMTEST Biotinidasa. Prueba colorimtrica para la deteccin de biotinidasa en sangre seca sobre papel de filtro.
P R O C E DI M I E N T O DE L UM T E S T BI O TI NI D A S A

D i sc o s de 3 m m

In c u b a ci n 16 h (37 C)

Pl a ca s d e r e a c ci n

S u st r at o (40 L)

T r a n sf e r e n c i a (10 L) T CA

E sperar 1 0 mi n. Vit a mi n a K 6 (10 L) S ulf a m a t o E sp e ra r d e a m o ni o E sp e ra r 3 mi n. (10 L) 3 mi n. N i t ri t o d e so di o (10 L) E sp e r a r 1 0 mi n.

En la actualidad existen 176 laboratorios instalados en nuestro pas que utilizan la tecnologa SUMA (Red Nacional de Laboratorios SUMA) ya sea en Hospitales Maternos, Banco de Sangre, policlnicos como en Centros de Higiene y Epidemiologa, destinados a servir a toda la poblacin en general y su buen funcionamiento depende no slo de la calidad de los equipos y reactivos, sino tambin de la capacitacin del personal que en ellos labora, constituyendo un modelo de organizacin para pesquisajes masivos en pases en vas de desarrollo. Adems nuestra tecnologa se utiliza en otros pases como Venezuela, Brasil, Argentina, Mxico, Colombia y China.

El Equipamiento de la Tecnologa SUMA abarca los siguientes Equipos e Instrumentos: 1. EQUIPO LECTOR DE PLACAS 2. EQUIPO LAVADOR DE PLACAS

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3. Ponchador

1. EQUIPO LECTOR DE PLACAS. Modelos: PR-521 y PR-621 PR-621 PR-521

DESCRIPCIN GENERAL El Lector de Placas (PR-521 o PR-621) es un Fotmetro-fluormetro, diseado para realizar lecturas de fluorescencia y absorbancia en placas y tiras UMELISA y MICROELISA. La lectura se realiza en sets que contienen entre 1 y 12 tiras de 8 pozos. El tiempo de lectura de un set no excede los 9 segundos. Los sets ledos son almacenados en la memoria del equipo, para su posterior procesamiento. La capacidad de la memoria es de 24 sets de 12 tiras y la informacin se conserva an despus de desconectada la alimentacin durante un perodo de 72 horas como mnimo. El procesamiento de la informacin se puede realizar directamente en el equipo, mediante funciones establecidas en el o a travs de una computadora acoplada va RS-232, permitiendo el uso de programas ms diversos y especializados, suministrados por el fabricante. PARTES FUNDAMENTALES (La ubicacin de las partes es igual para los dos modelos.) Vista frontal d c f g k Vista posterior

e b h i j

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abcdefghijk-

Puerta de entrada/salida de la placa Teclado alfanumrico y de funciones Pantalla de visualizacin de la informacin Compartimiento para filtros de interferencia (absorbancia) Compartimiento para el filtro secundario de fluorescencia Interruptor de encendido / apagado del equipo Porta-fusibles Toma de entrada de alimentacin Conector para Impresora Conector para la comunicacin serie (norma RS-232C) con la computadora Ventilador-extractor para el refrescamiento interior

FUNCIONES DE LAS TECLAS

READ - Leer un set de tiras en fluorescencia o absorbancia almacenando los resultados en memoria. PROG - Permite programar los valores de concentracin de los puntos de la Curva estndar, el factor de dilusin de las muestras y el valor de referencia de la lectura. Estos valores se utilizan para el clculo de los resultados en las tcnicas cuantitativas de fluorescencia. TIME - Permite actualizar la fecha y la hora en el equipo.

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MEM - Da informacin sobre la memoria disponible y los sets almacenados en memoria. DISP - Calcula y muestra por el display los resultados de la muestra. PRINT - Calcula e imprime los resultados. DEL - Borra todo el contenido de la memoria o el ltimo set almacenado. 0 al 9 y . Estas teclas permiten introducir datos al equipo. C- La tecla C se utiliza para la correccin de datos errneos. ESC - Es usada para retornar al men anterior o para salir de alguna pantalla con entrada de datos manteniendo activo el dato anterior que fue programado. ENTER / START - Se utiliza para configurar los datos introducidos por el usuario o una opcin de men que sea seleccionada. Se utilizan en las pantallas donde el operador requiere buscar en una lista de datos, almacenada en la memoria del lector. Permiten adems introducir y extraer el soporte donde se colocan los sets de tiras para ser ledos.

MODOS DE MEDICIN. Este equipo posee dos modos de medicin. Fluorescencia y Absorbancia. En la medicin de fluorescencia, una lmpara fluorescente emite luz ultravioleta (365nm) que incide sobre la muestra y la excita. La seal resultante es captada por los detectores. En la medicin de absorbancia una lmpara de algeno emite luz que incide sobre un filtro de interferencia cuya longitud de onda selecciona el usuario. La luz monocromtica proveniente del filtro atraviesa la muestra llegando a los detectores.

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ESQUEMA PTICO GENERAL

Lmpara Ultravioleta

Lectura
Filtro primario de fluorescencia Filtro secundario de fluorescencia

Lmpara Halgeno

Cubeta de lectura

Filtro de interferencia para Absorbancia

Fibra ptica

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HIPOTIROIDISMO CONGNITO El Hipotiroidismo Congnito (HC) es una enfermedad producida principalmente por disgenesia de la glndula tiroides y constituye la causa ms frecuente de retraso mental evitable en la infancia. Se caracteriza por el dficit en la produccin o utilizacin de las hormonas tiroideas lo cual se expresa por disminucin de la actividad metablica, retraso en la maduracin sea, retardo del crecimiento y deficiencia mental; su deteccin precoz y el inicio temprano de una tratamiento sustitutivo con hormonas tiroideas posibilita un desarrollo psicomotor normal en los nios afectados. La incidencia aproximada a nivel internacional es de 1: 4000 recin nacidos.

Etiologa del Hipotiroidismo Congnito El Hipotiroidismo Congnito (HC) es la endocrinopatologa infantil ms frecuente, se caracteriza por el dficit en la produccin o utilizacin de las hormonas tiroideas, lo cual se expresa en: la disminucin de la actividad metablica basal, afectacin del sistema nervioso central, atraso en la maduracin sea, retardo del crecimiento y deficiencia mental, por lo que su deteccin precoz y el inicio de una teraputica temprana con hormonas tiroideas evita que se produzcan estas afectaciones, logrndose un desarrollo psicomotor normal en los nios afectados. La casi totalidad de los recin nacidos afectados no presentan signos clnicos apreciables para ser diagnosticados por examen fsico, solo el 5 % puede ser identificado y diagnosticado al nacer. Aproximadamente el 85 % de los casos son espordicos debido a disgenesia de la glndula tiroides y el resto se debe a factores hereditarios originados por errores en la sntesis de tiroxina o por la presencia de anticuerpos maternos.

1- HIPOTIROIDISMO PERMANENTE a) DEBIDO A ANORMALIDADES TIROIDEAS (HIPOTIROIDISMO PRIMARIO) DEFECTOS DEL DESARROLLO AGENESIA TIROIDEA
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HIPOPLASIA TIROIDEA TIROIDES ECTPICO

DISHORMONOGNESIS b) DEBIDO A ANORMALIDADES EXTRA TIROIDEAS CAUSAS HIPOTLAMO HIPOFISARIAS (HIPOTIROIDISMO SECUNDARIO O TERCIARIO) 2- HIPOTIROIDISMO NEONATAL TRANSITORIO HIPOTIROXINEMIA TRANSITORIA HIPOTIROIDISMO TRANSITORIO PRIMARIO

3- DEFICIENCIA DE YODO

Mecanismo de regulacin de la biosntesis de las hormonas tiroideas Existen dos factores que juegan un papel importante en esta regulacin: El mecanismo autoregulador (retroalimentacin negativa) a travs del eje hipotlamo-hipfisis-tiroides. Aporte de yodo.

Los numerosos datos experimentales obtenidos de las observaciones endocrino y neuroendocrinolgicas, han proporcionado la evidencia de la secrecin por parte de la hipfisis de un estimulador tiroideo (TSH) y la secrecin por parte del hipotlamo de un estimulador de la hipfisis (TRH), siendo comprendida la funcin del complejo como un sistema de retroalimentacin negativa clsica que responde a la disponibilidad de hormonas tiroideas.

En la actualidad se conoce que la regulacin de la secrecin de TSH, es el resultado de una compleja interaccin fundamentalmente localizada en la hipfisis, mediante la cual la TRH acta estimulando primero la liberacin de la TSH y ms

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tarde su sntesis, mientras que las hormonas tiroideas actan inhibiendo estas funciones.

El tejido hipofisiario contiene receptores de alta afinidad y de capacidad limitada localizados en el ncleo celular que se unen a la T3 y con menor afinidad a la T4. La inhibicin por retroalimentacin negativa de la secrecin de TSH es aparentemente, mediada a nivel nuclear, ya que el pretratamiento con inhibidores de la sntesis proteica previene el efecto inhibitorio de las hormonas tiroideas sobre la TSH, esto concuerda con el efecto demostrado de las hormonas tiroideas en la estimulacin de la sntesis de cidos nucleicos y de protenas en otros tejidos.

FUNCIONES DE LAS HORMONAS TIROIDEAS.

Las funciones de las hormonas tiroideas son: Controlan el desarrollo y aseguran la regulacin de la actividad metablica. Son esenciales para la diferenciacin y maduracin del tejido seo y cerebral durante el perodo fetal y perinatal. Regulan el metabolismo basal.

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 Aumentan el consumo de oxgeno y la produccin de calor (termo-regulacin) en el organismo. El contino desarrollo anatmico y funcional de la glndula tiroides despus que han comenzado estas funciones y an antes es dependiente de la TSH.

Manifestaciones Clnicas

NO SIGNOS CLINICOS AL NACER (SOLO EL 5 %)

AFECCIONES DEL SNC: Retraso mental profundo Espasticidad Incoordinacin Ataxia Estrabismo Disminucin de la audicin.

RETARDO EN LA MADURACION OSEA. RETARDO DEL CRECIMIENTO. DISMINUCION DE LA ACTIVIDAD METABOLICA BASAL.

ESTRATEGIAS PARA EL PESQUISAJE DE HIPOTIROIDISMO CONGNITO

Determinacin de T4 como prueba inicial y cuantificacin de TSH en la confirmacin de los casos positivos. Determinacin de TSH como prueba inicial y cuantificacin de T4 en la confirmacin. Determinacin simultnea de TSH y T4 en todas las muestras como prueba inicial.

Tipo de muestra Cordn umbilical: Suero o sangre total colectada en papel de filtro.

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Taln: Sangre total colectada en papel de filtro. Las muestras en papel de filtro deben conservarse preferiblemente en refrigeracin (4-8 C) en su defecto en lugares frescos, y sin exposicin a la luz solar. Las muestras de suero deben conservarse congeladas (-20 C), deben evitarse sucesivas descongelaciones.

Momento de la toma de muestra Cordn: En el momento del nacimiento. Taln: Entre el 5to y 7mo da del nacimiento.

Confirmacin Los casos con un resultado ELEVADO deben ser evaluados por un pediatra entrenado o, preferiblemente, un endocrinlogo pediatra, para la posible identificacin de signos de HC y obtencin de una segunda muestra del taln (preferiblemente suero). Se recomienda iniciar tratamiento preventivo con Ltiroxina (entre 12-15 g/kg/da). En la segunda muestra del taln se miden las concentraciones de TSH (UMELISA TSH) y T4 (UMELISA T4). Si el valor de TSH es superior a 10 mUI/L y el valor de T4 es inferior a 80 nmol/L, se ratificar el diagnstico presuntivo de Hipotiroidismo Congnito. Cuando fuera posible se realizarn estudios complementarios que incluyen evaluacin de indicadores de la funcin tiroidea, ecografa del tiroides, captacin de Tc99 y estudios radiogrficos.

Tratamiento y Seguimiento evolutivo. Una vez ratificado el diagnstico presuntivo de HC se mantendr el tratamiento con L-tiroxina. El seguimiento se basa en la evaluacin peridica del paciente. En todas las consultas se debe valorar el ritmo de crecimiento y desarrollo y se indicar el anlisis cuantitativo de las hormonas TSH y T4. La dosis de L-Tiroxina debe ajustarse, para mantener los niveles sricos de TSH por debajo del lmite superior

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normal (6 mUI/L) y el nivel srico de T4 sobre el 50 percentil de la distribucin de la poblacin normal. Es importante instruir a los padres para que conozcan la enfermedad y la importancia de mantener ininterrumpidamente el tratamiento. Al trmino del tercer ao de edad, de no haberse llegado previamente a una confirmacin diagnstica definitiva, se evala el caso suspendiendo el tratamiento durante un mes y midiendo los niveles sricos de TSH y T4. Los pacientes con valores de TSH superior a 10 mUI/L y T4 inferiores a 80 nmol/L se ratifican como hipotiroideos permanentes y mantiene el tratamiento de por vida. Los casos que presentan niveles normales de TSH y T4 se considera que fueron hipotiroideos transitorios, no se reinicia el tratamiento, se recomienda mantener la evaluacin peridica por un ao.

Evaluacin neurocognitiva. Como parte de un seguimiento integral de los pacientes se recomienda la intervencin de un psiclogo y la realizacin de pruebas psicomtricas acordes con la edad del nio. Para la evaluacin neurocognitiva de los nios, a partir de los 7 aos de edad, se dispone del programa SESH que incluye un paquete de pruebas computarizadas, especficamente diseada para la exploracin de las reas bsicas cognitivas y evaluacin del desarrollo del sistema nervioso, que posibilitan la deteccin de alteraciones subclnicas, permitiendo optimizar el tratamiento de estos pacientes.

ENSAYOS UMELISA DISPONIBLES

UMELISA TSH NEONATAL (para la determinacin de TSH en sangre seca colectada en papel de filtro) UMELISA TSH (para la determinacin de TSH en suero)

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UMELISA T4 NEONATAL (para la determinacin de T4 en sangre seca colectada en papel de filtro) UMELISA T4 (para la determinacin de T4 en suero)

UMELISA TSH NEONATAL El UMELISA TSH NEONATAL es un ensayo heterogneo inmunoenzimtico tipo sandwich, en el cual se utiliza como fase slida, placas de tiras con pocillos revestidos previamente con anticuerpos monoclonales Anti cadena Beta de la TSH, lo cual garantiza la especificidad del ensayo. Las muestras, los calibradores y el control en manchas de sangre seca se eluyen con un conjugado Anti TSH Humana (Carnero)/Fosfatasa Alcalina (F.A.). Este eluato se deposita en los pocillos de las tiras, permitiendo la formacin del complejo anticuerpo/TSH/anticuerpo-enzima. La realizacin de un lavado posterior elimina los componentes no fijados. Al aadir un sustrato fluorignico (4Metilumbeliferil fosfato) en los pocillos de las tiras, ste resultar hidrolizado por la enzima del conjugado y la intensidad de la fluorescencia emitida ser proporcional a la concentracin de TSH presente en la muestra.

MATERIALES Y REACTIVOS (UMELISA TSH NEONATAL) Solucin Tampn 25 X. Placas sensibilizadas con anticuerpos anti cadena de la hTSH. Suero de Carnero. Solucin al 20 %. Conjugado anti cadena de la TSH/F.Alcalina Calibradores en sangre seca. Sustrato 10X. Tampn Sustrato.

PLACAS DE REACCIN (Placas de 96 posiciones con capacidad mxima de 30 L) Tipo de fase slida: Poliestireno.

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Conservacin: 2-8 C

CONJUGADO Mtodo de conjugacin: Glutaraldehdo Enzima: Fosfatasa Alacalina Anticuerpos: Anti cadena alfa TSH Conservacin: 2-8C

CALIBRADORES Y CONTROLES EN SANGRE SECA Sangre humana: Ajustada a 55 % de hematocrito (negativa a las pruebas de deteccin de Anti-VIH 1+2, HBsAg y Anti- VHC). Papel de filtro: Schleicher and Schuell 903.

Calibrados con el Patrn internacional (2da preparacin de referencia 80 558 de la OMS).

Estas son las concentraciones aproximadas que deben tener los calibradores del ensayo, en cada lote se determinan las concentraciones de los mismos. Calibrador A: Calibrador B: Calibrador C: Calibrador D: Calibrador E: Calibrador F: Control CB: 0 mUI/L de sangre total 8-12 mUI/L de sangre total 21-29 mUI/L de sangre total 42-58 mUI/L de sangre total 85-115 mUI/L de sangre total 135-165 mUI/L de sangre total Control del ensayo.

Conservacin: 2-8C.

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CARACTERSTICAS FUNCIONALES DEL ENSAYO Tiempo de duracin del ensayo: 4 horas totales.

Tipo de Muestra: Muestras de sangre seca colectadas en pape de filtro S&S 903, obtenidas por puncin del taln entre 5to y el 7mo da de nacido o de sangre del cordn umbilical. No interferencia con EDTA o Citrato.

Lmite de Deteccin: La concentracin mnima detectable es de 1,3 mUI/L. Se define como la concentracin calculada para la fluorescencia equivalente al Calibrador A + 2 DE.

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CLASIFICACIN E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS SEGN EL TIEMPO DE COLECTA DE LA MUESTRA

En el momento del nacimiento o antes de las 24 horas: Elevado (>30 mUI/L).

Despus de las 24 horas: Elevado (>15 mUI/L).

5to y 7mo da: Elevado (>10 mUI/L).

Teniendo en cuenta los factores genticos y ambientales que actan sobre las poblaciones de diferentes localizaciones geogrficas, se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia, a partir de la distribucin de TSH en la poblacin normal de recin nacidos, empleando inicialmente un valor de corte correspondiente al 99 percentil de la distribucin.

PROBLEMAS QUE SE PUEDEN PRESENTAR EN EL UMELISA TSH NEONATAL

Problemas Baja seal de fluorescencia de la curva de calibracin y el control del ensayo -

Posibles Causas Tiempo de incubacin incorrecto Temperatura de incubacin de la inmurreaccin inferior a los 37 C. Preparacin inadecuada de la dilucin de conjugado

Blancos con seal de fluorescencia elevada

Lavado ineficiente de las placas Sustrato hidrolizado Temperatura de incubacin de las placas muy superior a los 37C.

Evaporacin de la solucin de

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elucin.

UMELISA T4 NEONATAL El UMELISA T4 NEONATAL es un ensayo inmunoenzimtico competitivo para la determinacin de Tiroxina total en sangre seca colectada en papel de filtro, donde el antgeno natural y el antgeno marcado con una enzima compiten por una cantidad limitada de sitios de unin al anticuerpo. En este ensayo se utiliza como fase slida tiras de ultramicroELISA presensibilizadas con anticuerpos Anti-T4, lo cual garantiza la especificidad del ensayo. Las manchas de sangre seca se eluyen con la solucin que contiene el conjugado T4/Fosfatasa Alcalina (F.A.) y el eluato se deposita en los pocillos de las tiras de reaccin. Se procede a la incubacin de las mismas para permitir la formacin del complejo anticuerpo-antgeno-enzima. La realizacin de un lavado posterior elimina el conjugado no fijado y los otros componentes de la muestra. Al aadir el sustrato fluorignico (4-Metilumbeliferil fosfato), ste resultar hidrolizado por la enzima del conjugado y la intensidad de la fluorescencia emitida ser inversamente proporcional a la concentracin de tiroxina presente en la muestra.

MATERIALES Y REACTIVOS (UMELISA T4 NEONATAL) Solucin Tampn 25 X. Placas sensibilizadas con anticuerpos anti-T4 Tampn Conjugado Conjugado anti-T4/F.Alcalina Calibradores en sangre seca. Sustrato 10X. Tampn Sustrato.

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PLACAS DE REACCIN (Placas de 96 posiciones con capacidad mxima de 30 L) Tipo de fase slida: Poliestireno. Conservacin: 2-8C CONJUGADO Mtodo de conjugacin: Glutaraldehdo Enzima: Fosfatasa Alacalina Anticuerpos: Anti -T4 Conservacin: 2-8C

CALIBRADORES Y CONTROLES EN SANGRE SECA Sangre humana: Ajustada a 55 % de hematocrito (negativa a las pruebas de deteccin de Anti-VIH 1+2, HBsAg y Anti- VHC). Papel de filtro: Schleicher and Schuell 903.

Estas son las concentraciones aproximadas que deben tener los calibradores del ensayo, en cada lote se determinan las concentraciones de los mismos.

Calibrador A: Calibrador B: Calibrador C: Calibrador D: Calibrador E: Calibrador F: Control CB:

0 nmol de T4/L de suero 21 - 29 nmol de T4/L de suero 47 - 63 nmol de T4/L de suero 85 - 115 nmol de T4/L de suero 170 - 230 nmol de T4/L de suero 340 - 460 nmol de T4/L de suero Control del ensayo.

Factor de Conversin: nmol/L x 0.078= g/dL

g/dL x 12.87= nmol/L.

Conservacin: 2-8C.

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CARACTERSTICAS FUNCIONALES DEL ENSAYO

Tiempo de duracin del ensayo: 4 horas totales.

Tipo de Muestra: Muestras de sangre seca colectadas en papel de filtro S&S 903, obtenidas por puncin del taln entre 5to y el 7mo da de nacido o de sangre del cordn umbilical.

Lmite de Deteccin: La concentracin mnima detectable es de 17 nmol de T4/L Suero. Se define como la concentracin calculada para la fluorescencia equivalente al Calibrador A - 2 DE.

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CLASIFICACIN E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Despus de haber solicitado una segunda muestra, si el valor de TSH es superior a 10 mUI/L y el valor de T4 es inferior a 80 nmol/L, se ratificar el diagnstico presuntivo de Hipotiroidismo Congnito.

PROBLEMAS QUE SE PUEDEN PRESENTAR EN EL UMELISA T4 NEONATAL

Problemas Imprecisin en el ensayo -

Posibles Causas Lavado ineficiente Contaminacin del material utilizado con suero humano. Mala manipulacin del analista

Exactitud del ensayo

Preparacin inadecuada de la dilucin del conjugado

Calidad de las muestras

CONSIDERACIONES PRCTICAS. Las muestras deben ser colectadas segn el procedimiento descrito en: Blood collection on Filter Paper for neonatal Screening Programs-second edition. NCCLS Document LA4-A2 Vol 12 N13 (1992). Una transfusin de sangre o el tratamiento con suero o plasma al recin nacido, previa a la toma de la muestra, puede alterar los resultados de la prueba por tanto la muestra debe obtenerse antes de la transfusin. Es importante obtener muestras de recin nacidos que fueron transferidos a las Unidades de Cuidados Intensivos Neonatales y no se les tom la muestra previamente. En estos casos y aquellos con bajo peso, se recomienda tomar una segunda muestra a los 15 das de nacido.

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Los criterios relativos al nivel de corte, confirmacin, tratamiento y seguimiento constituyen solo recomendaciones de referencia. Los organizadores del programa de pesquisaje definirn los criterios definitivos a utilizar en cada caso. Las muestras deben conservarse preferiblemente en refrigeracin (4-8 C) o en su defecto en lugares frescos, y sin exposicin a la luz solar.

FENILCETONURIA La fenilcetonuria, llamada frecuentemente PKU (siglas en ingls) es un error innato del metabolismo con una alta incidencia (1:5000) que afecta al aminocido fenilalanina. Este trastorno es producido por la disminucin o deficiencia del complejo enzimtico presente en el hgado, denominado fenilalanina hidroxilasa, el cual cataliza la conversin de fenilalanina a tirosina . Este defecto enzimtico, desde el punto de vista bioqumico, provoca la acumulacin de la fenilalanina (Phe) en la sangre y en otros lquidos y tejidos orgnicos, as como una ligera disminucin de los niveles de tirosina.

La concentracin de Phe en el recin nacido con fenilcetonuria puede ser normal hasta el cuarto da de vida, pero aumenta con rapidez al comenzar la alimentacin proteica. Si no se inicia el tratamiento en el perodo neonatal o al menos bastante temprano durante la lactancia, aparecen los signos clnicos de la enfermedad, entre los que se encuentran retraso mental irreversible, anormalidades neurolgicas y defectos en la piel y en su pigmentacin. De ah que sea muy importante el diagnstico temprano y la aplicacin de una dieta deficitaria de Phe antes de la tercera o cuarta semana de vida, con la cantidad suficiente de este aminocido para el crecimiento normal del nio. Cuando las concentraciones de Phe han sido controladas por el empleo de las dietas especiales no aparecen los sntomas de la enfermedad, ni ninguna manifestacin de retraso mental o lesin cerebral.

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Metabolismo de la fenilalanina. La fenilalanina es un aminocido cetognico y gluconeognico ya que puede ser degradado en mltiples intermediarios como el acetil CoA, dando origen a cuerpos cetnicos y/o piruvato o intermediarios del ciclo del cido ctrico, llegando as con la va de la glucosa a la formacin de fosfoenolpiruvato . La degradacin de la Phe se lleva a cabo cuando este aminocido y el producto de su oxidacin, la tirosina, originan dos fragmentos, los cuales pueden entrar al ciclo del cido ctrico. La primera enzima de la ruta de la Phe es la fenilalanina hidroxilasa, la cual cataliza la hidroxilacin de la Phe a tirosina. Esta enzima inserta uno de los dos tomos de oxgeno en la Phe para formar el grupo hidroxilo de la tirosina. El otro tomo de oxgeno se reduce formando agua por el NADH. La Phe hidroxilasa requiere un cofactor denominado la tetrahidrobiopterina o BH , durante la reaccin el BH4 se oxida a dihidrobiopterina reducindose otra vez por la enzima dihidrobiopterina reductasa en una reaccin que requiere de NADH. La tetrahidrobiopterina es adems un cofactor para la tirosina hidroxilasa y el triptofan hidroxilasa, enzimas esenciales para la formacin de neurotransmisores catecolamnicos, dopamina, noradrenalina, adrenalina y serotonina. La

disminucin de esos neurotransmisores lleva a un deterioro neurolgico con dificultades como hipotona, ataques y muerte.

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Gentica de la enfermedad. Los genes para la fenilcetonuria son hereditarios, y su patrn de herencia es autosmico recesivo, es decir que cada progenitor lleva un gen defectuoso y uno normal, lo cual los hace portadores; el individuo en condicin recesiva porta dos genes defectuosos para tener el desorden. Cuando esto ocurre existe un cuarto de probabilidades de que se produzca un nio afectado por cada embarazo. Los individuos con afectacin en el gen para la enzima presentan esta con actividad parcial o no detectable.

Formas Clnicas. A pesar de que las cifras normales en suero de la Phe pueden variar discretamente segn el origen tnico de la poblacin, internacionalmente se han considerado como normales, niveles alrededor de 1 mg/dL (60 mol/L sangre). Teniendo en cuenta el nivel en suero, la tolerancia a la ingesta del mismo, la actividad residual de la enzima y la mutacin que la originan, las

Hiperfenilalaninemias (HFA) pueden clasificarse en:

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 HFA transitoria: Se produce secundariamente a inmadurez heptica que conlleva a una enzima fenilalanina hidroxilasa funcionalmente deficiente de manera transitoria, observndose niveles de Phe en suero entre 4-10 mg/dL (240-600 mol/L sangre) que tienden a normalizarse a los seis meses. Los niveles de tirosina son normales y se detecta una actividad de la enzima de aproximadamente el 50% de los controles. La HFA transitoria se observa generalmente en los recin nacidos prematuros y/o con ctero, sin traduccin gentica en la mayora de los casos, excepto en la que se produce por dficit de la enzima Carbamilfosfato deshidratasa. HFA Persistente o Benigna: Se presenta con niveles en suero de Phe que pueden ir desde 4 hasta 19 mg/dL (240-1140 mol/L sangre), sin presentarse manifestaciones clnicas por lo cual de manera general no requieren tratamiento. Tiene una actividad enzimtica entre el 3 y el 50 % y se tolera una ingesta de FA por encima de los 50 mg/Kg/da. Los niveles de tirosina suelen ser normales. Fenilcetonuria o FC clsica: Se presenta con niveles de Phe por encima de 20 mg/dL (1200 mol/L sangre) y de tirosina menores de 1.8 mg/dL (normales o bajos). Muestra un cuadro clnico caracterstico con retraso mental severo y convulsiones, disfuncin neurolgica y alteracin del encefalograma. Se distingue un olor a ratn, caracterstico de la piel, pelo, orina y tendencia a la hipopigmentacin y eccema. La actividad enzimtica est por debajo del 5 o 6 % y se tolera una ingesta del aminocido inferior a 20 mg/Kg/da. FC atpica: Los niveles de Phe encontrados generalmente estn entre 1020 mg/dL (600-1200 mol/L sangre) con un cuadro clnico variable, mucho menos severo que la forma clsica. Generalmente son ms tolerantes a la ingestin de Phe.

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 FC maligna: Se debe a defectos en las enzimas relacionadas con el cofactor y es por ello que a pesar que los niveles altos de Phe sean tratados nutricionalmente, no se produce respuesta a dicho tratamiento, desarrollando dao neurolgico precoz. Los niveles de Phe pueden ser variables y van desde 4-40mg/dL (240-2400 mol/L).

En la mayora de los pases desarrollados los nios son pesquisados para Fenilcetonuria por medicin de la Phe en sangre durante el perodo neonatal, empleando tcnicas microbiolgicas y fluorimtricas. En Cuba, desde el ao 1984 se inici el Programa Nacional de Prevencin de Hiperfenilalaninemias en los recin nacidos de Ciudad de la Habana, utilizando sangre seca en papel de filtro para medir la concentracin de Phe por el mtodo de Guthrie-Susi, que se extendi a todo el pas a partir del ao 1986. En la actualidad este pesquisaje ha sido descentralizado en todas las provincias, utilizndose el UMTEST PKU, diseado y producido por el Centro de Inmunoensayo, para la determinacin de los niveles de Phe en muestras de sangre en papel de filtro.

Tratamiento y Seguimiento. Como la Phe es un aminocido esencial, el tratamiento consiste en la restriccin diettica de la Phe. Se dispone comercialmente formulaciones lcteas y de otros alimentos, especialmente diseados para este padecimiento. Es importante la participacin de un nutricionista entrenado para tratar a estos pacientes, adems se debe instruir a los padres para que conozcan la enfermedad y la importancia de mantener ininterrumpidamente el tratamiento. En los nios con valores de Phe 10 mg/dL (600 mol/L), la ingestin de Phe deber ser ajustada, en cada caso, para mantener los niveles sricos de Phe entre 2 y 6 mg/dL (120-360 mol/L) en los primeros aos de edad, en nios mayores se puede permitir hasta 8 mg/dL (480 mol/L). El seguimiento se basa en la evaluacin peridica del paciente.

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Evaluacin neurocognitiva. Como parte de un seguimiento integral de los pacientes se recomienda la intervencin de un psiclogo y la realizacin de pruebas psicomtricas acordes con la edad del nio. Para la evaluacin neurocognitiva de los nios, a partir de los 7 aos de edad, se dispone del programa SESH que incluye un paquete de pruebas computarizadas, especficamente diseada para la exploracin de las reas bsicas cognitivas y evaluacin del desarrollo del sistema nervioso, que posibilitan la deteccin de alteraciones subclnicas, permitiendo optimizar el tratamiento de estos pacientes.

PRINCIPALES MTODOS UTILIZADOS PARA EL DIAGNSTICO DE PKU.

- Inhibicin bacteriana (Guthrie). - Fluorimtricos (modificaciones de McCaman y Robins). - Espectrofotomtricos. - Enzimticos. - HPLC.

UMTEST PKU. Como mtodo para la determinacin cuantitativa de Phe se utiliza el UMTEST PKU, un ultramicroensayo fluorescente para la cuantificacin de Phe en sangre seca sobre papel de filtro obtenida del taln de recin nacidos. La prueba se basa en la reaccin de la Phe presente en la muestra con la Ninhidrina, en condiciones ptimas de pH y temperatura, formando un complejo poco fluorescente. Con la adicin de iones cobre, se produce la amplificacin de la fluorescencia, aumentando su intensidad por la previa adicin de L-Leucil-LAlanina a la mezcla de reaccin. La intensidad de la fluorescencia emitida es proporcional a la concentracin de Phe presente en la mezcla.

MATERIALES Y REACTIVOS (UMTEST PKU)

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 Placas de elucin. Placas de reaccin. Calibradores en sangre seca. Tampn Succinato (pH 5.8). Ninhidrina (liofilizado). L-Leucil- Alanina (liofilizado). Reactivo de Cobre (listo para el uso).

CALIBRADORES Y CONTROLES EN SANGRE SECA Sangre humana: Ajustada a 55 % de hematocrito (negativa a las pruebas de deteccin de Anti-VIH 1+2, HBsAg y Anti- VHC). Papel de filtro: Schleicher and Schuell 903.

Estas son las concentraciones aproximadas que deben tener los calibradores y control del ensayo. En cada lote se determinan las concentraciones de los mismos.

Calibrador A (disco de papel): 0 mol de Fenilalanina/L de sangre total Calibrador B: 160-200 mol de Fenilalanina/L de sangre total Calibrador C: 320-400 mol de Fenilalanina/L de sangre total Calibrador D: 650-800 mol de Fenilalanina/L de sangre total Calibrador E: 1300-1580 mol de Fenilalanina/L de sangre total Calibrador F: 2590-3170 mol de Fenilalanina/L de sangre total Control CB (Control del ensayo): 800 1000 mol de Fenilalanina/L de sangre total

Factor de conversin: 1mg/dL= 60.54 mol/L.

Conservacin: 2-8C.

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CARACTERSTICAS FUNCIONALES DEL ENSAYO

Tiempo de duracin del ensayo: 2 Horas.

Tipo de Muestra: Muestras de sangre seca colectadas en papel de filtro S&S 903, obtenidas por puncin del taln entre 5to y el 7mo da de nacido.

Lmite de Deteccin: La concentracin mnima detectable es de 30 mol/L. Se define como la concentracin calculada para la fluorescencia equivalente al Calibrador A + 2 DE.

CLASIFICACIN E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS El resultado se considera ELEVADO cuando la concentracin de Phe supera los 240 mol/L (4 mg/dL).

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PROBLEMAS QUE SE PUEDEN PRESENTAR EN EL UMTEST PKU

Problemas Baja seal de fluorescencia de la curva de calibracin y el control del ensayo Seales de fluorescencia muy bajas, a nivel del blanco del ensayo, para la curva de calibracin como para las muestras y el control Valores de fluorescencia muy altos para la curva de calibracin y el control del ensayo tanto

Posibles Causas Temperatura de incubacin de la reaccin qumica es inferior a 60C.

No hubo desproteinizacin, posiblemente debido a que el etanol no est al 70 %.

El pH al cual ocurri la reaccin no es el adecuado.

Temperatura de incubacin de la reaccin superior a 62C.

Las cmaras de incubacin no tienen la cantidad de agua suficiente para propiciar un ambiente hmedo que impida la evaporacin de las muestras.

Evaporacin reaccin

de

la

mezcla

de

La cmara de incubacin qued abierta y esto provoca la evaporacin de las muestras.

Interaccin del agua de la cmara con la placa ultramicroelisa, esto provoca la evaporacin de las muestras.

Confirmacin. Los casos con un resultado ELEVADO deben ser evaluados con una segunda muestra de sangre del taln en papel de filtro (se recomienda, cuando sea posible,

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la determinacin de fenilalanina en suero). De acuerdo con la concentracin de Phe en la segunda muestra el caso puede clasificarse como sigue: 4-10 mg/dL (240-600 mol/L). Con tirosinemia

Hiperfenilalaninemia benigna: normal

Hiperfenilalaninemia persistente: 10-20 mg/dL (600-1200 mol/L) Fenilcetonuria Clsica: > 20 mg/dL (1200 mol/L)

Cuando sea posible se recomiendan estudios complementarios que incluyen la medicin en suero de la tirosina y de la actividad de fenilalanina hidroxilasa.

Consideraciones prcticas.

Las muestras deben ser colectadas segn el procedimiento descrito en: Blood collection on Filter Paper for neonatal Screening Programs-second edition. NCCLS Document LA4-A2 Vol 12 N13 (1992).

Una transfusin de sangre o el tratamiento con suero o plasma al recin nacido, previa a la toma de la muestra, puede alterar los resultados de la prueba, por tanto la muestra debe obtenerse antes de la transfusin.

Es importante obtener muestras de recin nacidos que fueron transferidos a las Unidades de Cuidados Intensivos Neonatales y no se les tom la muestra previamente. En estos casos y aquellos con bajo peso, se recomienda tomar una segunda muestra a los 15 das de nacido.

Las muestras procedentes de sangre del cordn umbilical no pueden ser empleadas para el pesquisaje de Fenilcetonuria . Los recin nacidos deben tener al menos 24 horas de vida y alimentacin previa con leche antes de la determinacin de Phe. Si la muestra es tomada antes de las 24 horas, debe repetirse la prueba a los 7 das de nacido, independientemente del resultado de la primera muestra.

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Los criterios relativos al nivel de corte, confirmacin, tratamiento y seguimiento constituyen solo recomendaciones de referencia. Los organizadores del programa de pesquisaje definirn los criterios definitivos a utilizar en cada caso.

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