INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA

BIOQUMICA MICROBIANA
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HIPTESIS

Se sabe que E. coli es capaz de utilizar lactosa como fuente de carbono y energa. Su
enzima -galactosidasa responsable del metabolismo, se sintetiza ms rpido en presencia
de lactosa y con una concentracin pequea de glucosa (1).
Si ponemos a crecer E. coli en un medio con glicerol y despus de un tiempo agregamos
lactosa podremos ver una induccin en la sntesis de -galactosidasa, en cambio si a esta
misma despus de un tiempo y la lactosa se le adiciona glucosa se esperara provocar un
efecto represor en la sntesis.

DISEO EXPERIMENTAL.

a) Obtencin de cultivo
Para el desarrollo de la prctica se obtuvo un cultivo de Escherichia coli en un matraz que
contena 50 ml de medio de cultivo adicionado de glicerol para una concentracin final de
0.5%. El cultivo se incubo a 37
o
C en agitacin durante 18 horas, se adicion con glicerol y
se utiliz posteriormente para la determinacin la actividad de la -galactosidasa.

Del cultivo anterior se inocularon con 10ml dos matraces Erlenmeyer que contenan 200 ml
del mismo medio sinttico, uno adicionado de glicerol para observar la actividad basal de la
cepa con una concentracin final de 0.5 % y otro de lactosa con una concentracin final del
1% se incubaron a 37
o
C en agitacin durante 6 horas. Las clulas se cosecharon por
centrifugacin, se lavaron dos veces con regulador de fosfatos y el paquete celular se
resuspendi en regulador. La lactosa adicionada permiti la induccin de la sntesis de la -
galactosidasa al ser transformada en alolactosa por la misma enzima que se encuentra en
niveles basales y esta alolactosa actuar a manera de inductor para la expresin de los
genes contenidos en el opern lac.

b) Determinacin de la actividad de la -galactosidasa
Cada una de las dos suspensiones de clulas obtenidas, se ajust a 1.0 de absorbencia a
600 nm para igualar concentraciones y a 10ml de cada suspensin se le agrego 1 ml de
tolueno. El tolueno solubiliza la membrana de la clula ayudando a la permeabilidad y
liberacin de la -galactosidasa al medio, se agito en vortex para homogenizar y se coloc
en bao de hielo. Posteriormente en una celda espectrofotomtrica se coloc 3.8 ml de
regulador de fosfatos, 0.1 ml de ONPG (ortonitro fenil galactopiransido) y 0.1 ml de la
suspensin celular, se agit y se ley inmediatamente a 420 nm. Las lecturas se registraron
desde el tiempo cero y cada minuto durante 10 minutos.

El ONPG es un sustrato de la -galactosidasa que al ser hidrolizado produce un compuesto
(ortonitrofenol) que presenta un intenso color amarillo con el que se puede medir la
concentracin de -galactosidasa en funcin de la intensidad del color. El tolueno ayuda al
contacto de la -galactosidasa y el ONPG.

El aparato se ajust a cero de absorbancia con una celda que contena solamente 3.9 ml de
regulador de fosfatos y 0.1 ml de ONPG.

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c) Velocidad de induccin y represin catablica
Se inocul con 20 ml de cultivo de 18 horas (inciso a) a un matraz Erlenmeyer que contena
200 ml de medio sinttico adicionado de glicerol y fueron incubados a 37
o
C en agitacin
durante 3 horas.
Durante el inicio del experimento se retir una alcuota de 10 ml (tiempo 0) y se adicion al
cultivo que quedaba en el matraz un volumen de lactosa estril para una concentracin final
de 1.2 % para producir la induccin de los genes contenidos en el opern lac, ya que la
alolactosa reconocera su sitio de afinidad en la protena represora ubicada sobre la regin
promotora del operador ocasionando la perdida de afinidad por la regin promotora
dejndola libre para ser reconocida por la RNA polimerasa y llevar a cabo la sntesis
(expresin) de los genes estructurales del opern, entre ellos a la - galactosidasa, dicha
expresin de estos genes ir aumentando en funcin del tiempo teniendo as un aumento en
la cantidad de dicha enzima en las clulas. Se incub a 37
o
C en agitacin y se sigui
retirando alcuotas de 10 ml a los 2.5, 5, 10, 15, 20 y 30 minutos para observar la actividad.

Cuando se retir la alcuota al tiempo 30 se adiciono el volumen de glucosa lo cual produjo
el fenmeno de represin catablica gracias a que la glucosa al ser un mejor sustrato como
fuente de carbono y pasar directamente hacia gliclisis sin necesidad de invertir enzimas
como es el caso de la lactosa para producir glucosa y galactosa, entonces las enzimas
involucradas en su catabolismo (lactosa) sern reprimidas para evitar gastos energticos
innecesarios en la clula y se retiraron las alcuotas de los tiempos 35, 40 y 50 minutos.
Todas las alcuotas tomadas se reciben en tubos cnicos de polipropileno para centrfuga
que contenan 0.1 ml de cloranfenicol.

Despus de que se retir la ltima alcuota se centrifuga a 3000 rpm/10 min, se lavan las
clulas con regulador de fosfatos y posteriormente se ajusta a 1.0 ml de absorbancia a 600
nm. Se trataron con tolueno y posteriormente se midi la actividad de la -galactosidasa
conforme fue descrito en el inciso (b) efectuando dos lecturas de absorbencia, una a los 0
minutos y otra a los 10 minutos de incubacin.

La determinacin de la cantidad de -galactosidasa durante la adicin de lactosa y
posteriormente con glucosa se determin de igual forma que en el inciso (b) es decir que la
-galactosidasa actuara sobre el sustrato ONPG el cual como se observa en la siguiente
figura al ser hidrolizado por la enzima libera galactosa y libero el o-nitro-fenol, compuesto
de color amarillo, la intensidad de color ser directamente proporcional a la cantidad de -
galactosidasa sintetizada a durante el experimento. Para tener una idea de la cantidad
contenida en cada alcuota de los diferentes tiempos los tubos cnicos estuvieron
adicionados con cloranfenicol, un antibitico que inhibe la sntesis de protenas bloqueando
la actividad de la enzima peptidil transferasa al unirse a la subunidad 50S
del ribosoma, evitando la formacin del enlace peptdico deteniendo as la sntesis de
protenas y por lo tanto de la -galactosidasa, en cuanto al tolueno este es nuevamente
utilizado para la perforacin de las clulas y la liberacin de la -galactosidasa.


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Figura 1.- Hidrlisis del ONPG por accin de la -galactosidasa y la liberacin del o-nitro-fenol, de coloracin
amarilla


OBJETIVOS.

Analizar y discutir la actividad de la -galactosidasa en Escherichia coli, a partir de
suspensiones de clulas crecidas en glicerol y lactosa con y sin tolueno.
Demostrar el papel de la lactosa sobre la induccin del opern lactosa en
Escherichia coli.
Demostrar el papel de la glucosa sobre la represin del opern lactosa en
Escherichia coli.

REGISTRO DE DATOS

Tabla 1.- Actividad de la -galactosidasa en E. coli

Tiempo de incubacin
Suspensin de la clulas de E. coli crecidas en:
Glicerol
Lactosa
Abs
Glicerol
Lactosa
Con
Tolueno
Sin
tolueno
Abs
Con
Tolueno
Abs
Sin
tolueno
Absorbencia a 420 nm
0 0.299 0.336 0.334 0 0 0
1 0.296 0.456 0.367 0 0.12 0.033
2 0.295 0.551 0.382 0 0.215 0.048
3 0.299 0.666 0.400 0 0.33 0.066
4 0.305 0.774 0.419 0.006 0.438 0.085
5 0.307 0.869 0.440 0.008 0.533 0.106
6 0.312 0.958 0.453 0.013 0.622 0.119
7 0.315 1.046 0.479 0.016 0.71 0.145
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4
8 0.318 1.128 0.501 0.019 0.792 0.167
9 0.324 1.202 0.518 0.025 0.866 0.184
10 0.328 1.272 0.537 0.029 0.936 0.203



Tabla 2.- Abs obtenidas en la determinacin de la a velocidad de induccin y represin
catablica de - galactosidasa en E.coli

Tiempo de
incubacin
Determinacin de la actividad de la -
galactosidasa
Abs. a 420 nm Abs

t0' t10' (t0'-t10')
0 0.119 0.097 0.022 0.1483
10 0.147 0.155 0.008 0.0894
20 0.215 0.323 0.108 0.3285
30 0.265 0.513 0.348 0.5899
35 0.179 0.600 0.421 0.6488
40 0.161 0.438 0.277 0.5263
50 0.149 0.447 0.298 0.5458
60 0.152 0.424 0.272 0.5215

-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 2 4 6 8 10 12
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

a

4
2
0

n
m

Tiempo (min)
Grafica 1.- Actividad de la -galactosidasa en E. coli
Abs Glicerol
abs Lactosa Con Tolueno
Abs Lactosa Sin Tolueno
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DISCUSIN DE RESULTADOS

En la grafica1 se observa el comportamiento de la -galactosidasa en un cultivo de
Escherichia coli el cual se hizo crecer en 2 medios diferentes, uno con lactosa y otro con
glicerol, a los cuales se les realizo un tratamiento con tolueno. Se observ que el cultivo
crecido en lactosa que se trat con tolueno presento una alta actividad de la enzima -
galactosidasa, mientras que el medio crecido en glicerol tambin presento una pequea
cantidad de la enzima que se encuentra en estado basal, en cuanto al medio crecido en
lactosa al cual no se le realizo un tratamiento con tolueno presento una actividad del 20%
(comprando las pendientes ) con respecto al que se le realizo el tratamiento con tolueno,
quedando demostrado su efectividad para su uso como un medio que facilita la
permeabilidad de las membranas celulares. Con lo dicho anteriormente comprobamos quela
enzima -galactosidasa que es sintetizada por el operon lactosa es inducible cuando en el
medio de crecimiento se encuentra presente la lactosa, y en caso de no estar presente solo
se sintetizara la enzima -galactosidasa en su estado basal.
En la grfica 2 (cintica de induccin y represin catablica) notamos que al adicionar la
lactosa la enzima -galactosidasa no se sintetizara inmediatamente, esta requerir de un
tiempo de adaptacin el cual al observar la grfica fue de 10 minutos, tras los cuales la
sntesis y actividad dela enzima fue aumentando, al cabo de 30 minutos se adiciono glucosa,
observando tambin que tardo 5 minustos en detener la sntesis de -galactosidasa,
despus de este tiempo se observ una disminucin de la actividad enzimtica para
despus estabilizarse ya que la enzima nunca se reprimir totalmente. Con lo anterior
comprobamos que la glucosa es un represor catablico del operon lactosa debido a que
Escherichia coli en el operon lactosa se presenta cuando la protena CRP se encuentra en
forma de dmero y solo es activa cuando lleva unido AMPc para poder sintetizar la enzima -
galactosidasa. El alto contenido de AMPc es debido a que en ausencia de transporte de
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 10 20 30 40 50 60 70
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

a

4
2
0

n
m

Tiempo (min)
Grafica 2.- Cintica de Induccion y Represion catablica de -
galactosidasa en E. coli
Abs
Series2
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glucosa al interior celular se aumenta la actividad de la adelinato ciclasa (enzima encargada
de la sntesis de AMPc) y empieza a consumir lactosa para poder obtener energa para su
metabolismo. Por lo tanto, sin CRP o sin AMPc el sistema permanecera cerrado. Esto unido
al hecho de que la glucosa disminua los niveles de AMPc daba la explicacin por la cual la
glucosa ejerca una represin por catabolito.


CONCLUSIONES

Se comprob experimentalmente la actividad de la -galactosidasa en Escherichia
coli, a partir de suspensiones de clulas crecidas en diferentes medios, dando como
resultado la mayor actividad al medio con lactosa toluenizada, y menor en el de
glicerol, esto indica que existe la sntesis de -galactosidasa, el opern lactosa
tambin est sujeto a un control de tipo positivo, de manera que existe una protena
que estimula la transcripcin de los genes estructurales.

Se demostr que la lactosa es un inductor del opern lactosa y la glucosa es un
represor en Escherichia coli. Se trata. por tanto de un sistema general de control
positivo que se denomina represin catablica. Cuando E. coli crece en un medio
con glucosa, los niveles de AMPc son muy bajos y como consecuencia no se
transcriben los operones de otros azcares.
.

REFERENCIA BIBLIOGRFICA

BIOLOGA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGA Smith y Wood. Editorial Addison-Wesley
Iberoamericana. Universiada Panamericana Mxico. pp 112-132.

http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Operon/Operon.htm