Trabajo prctico

de
HPLC y Espectrometra de
masas.

Profesor: Anbal Lapa.

Alumnos: Emiliano Silveira, Marcos
Carriquiri, Julin Sobrero y Nicols
Michalski.
6to ao 10ma divisin.
2015.

HPLC
La cromatografa lquida de alta eficacia o high performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada
frecuentemente en bioqumica y qumica analtica. Tambin se la denomina a
veces cromatografa lquida de alta presin o cromatografa lquida de alta
resolucin (high pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta
terminologa se considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnica
utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes
tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatogrfica.
Principio
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a
travs de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas
partculas redondeadas con ciertas caractersticas qumicas en su superficie)
mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a travs de la
columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus
componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones
qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la
columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de
la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la
fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se
denomina tiempo de retencin y se considera una propiedad identificativa
caracterstica de un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria.
La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la
velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce as su
difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la cromatografa. Los
disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua
puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido trifluoroactico,
que ayudan a la separacin de los compuestos.
Tipos de HPLC
Cromatografa de fase normal
La cromatografa de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer
tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por
separar los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase
estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de
inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase

estacionaria. La fuerza de adsorcin aumenta a medida que aumenta la

polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto polar y la fase
estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de
retencin.
La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del
compuesto de inters, sino tambin en factores estricos de forma que los
ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La
utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de
retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos
tienden a aumentar el tiempo de retencin.
La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC de
fase reversa o reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de
los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el
estado de hidratacin de la silica o almina de la cromatografa.

Cromatografa de fase reversa

La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y
una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms
comunes de este tipo de cromatografa es la silica tratada con RMe2SiCl, donde
la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retencin es
mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las molculas de
carcter polar eluyen ms rpidamente.

El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase

mvil y disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. La
cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina
HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se
basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las
fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto
relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en
la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea del
segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofbico
est dominado por el aumento de la entropa, y la consecuente disminucin de
la energa libre, asociada con la minimizacin de la interfase compuestodisolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente
apolar a la fase mvil. Esto modifica el coeficiente de particin de forma que el
compuesto se mueve por la columna y eluye.

Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante

en la retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se
asocia con un tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de
la molcula. Aun as, las molculas muy grandes pueden ver reducida la
interaccin entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo
de retencin aumenta con el rea de superficie hidrofbica que suele ser
inversamente proporcional al tamao del compuesto. Los compuestos
ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros lineales puesto
que la superficie total se ve reducida.

Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modificaciones de la fase

mvil pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de
sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como
que la entropa de la interfase compuesto-disolvente est controlada
precisamente por la tensin superficial, la adicin de sales tiende a aumentar
el tiempo de retencin.

Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad

del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn
como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones
controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o cualquiera resto de silica
de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como contraiones
que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la
cromatografa puede variar, pero en general mejoran la separacin
cromatogrfica.

Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las
columnas de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn
formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca
con bases en medio acuoso puesto que stas podran daar el esqueleto de
silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en cidos en medio acuoso
pero no deberan estar expuestas demasiado tiempo al cido porque puede
corroer las partes metlicas del aparato de HPLC.

Cromatografa de exclusin molecular

La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como
cromatografa por filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en
funcin de su tamao. Generalmente se trata de una cromatografa de baja

resolucin de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de
purificacin. Tambin es muy til para la determinacin de la estructura
terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas purificadas.

La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en

columna por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso
molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes.

En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros

entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines prcticos,
la columnas se empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por
esos polmeros entrecruzados. En consecuencia, estas partculas son porosas, y
el tamao de los poros es tal que algunas molculas (las demasiado grandes)
no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente
pequeas) podrn pasar libremente. Los poros quedan conectados formando
una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las
molculas que acceden al interior de esta.

Cromatografa de intercambio inico

Artculo principal: Cromatografa de intercambio inico
En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la atraccin
electrosttica entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase
estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de
carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores
inicos son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores inicos de celulosa y
dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamao de poro controlado. En
general los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones elevada carga
y radio pequeo. Un incremento en la concentracin del contrain (respecto a
los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retencin. Un
incremento en el pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de
intercambio catinico mientras que una disminucin del pH reduce el tiempo
de retencin en las cromatografas de intercambio aninico. Este tipo de
cromatografa es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones:
purificacin de agua, concentracin de componentes traza, Ligand-exchange
chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anionexchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.

Cromatografa basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de las sustancias
biolgicamente activas de formar complejos estables, especficos y reversibles.
La formacin de estos complejos implica la participacin de fuerzas
moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones
electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofbicas y
puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la fase estacionaria.

Cromatografa lquida de alta eficacia en condiciones desnaturalizantes

(DHPLC)
Se trata de un mtodo que se emplea para el rastreo de mutaciones (ya casi
totalmente en desuso debido al auge de la secuenciacin), que permite
detectar la presencia de variaciones en el ADN aunque no se determinan
especficamente cules. En este caso, se utiliza la tcnica cromatogrfica para
la deteccin de heterodplex de ADN, en lugar de utilizar un gel para correr las
molculas de cidos nucleicos.

El procedimiento consiste en desnaturalizar (aumentando la temperatura

normalmente) una muestra que contenga tanto el ADN problema como un ADN
control, que no es ms que el mismo ADN problema pero en su versin
silvestre o normal (sin mutaciones). Luego se procede a renaturalizar
(disminuyendo la temperatura), de manera que aquellas cadenas de ADN que
vuelvan a unirse con sus respectivas complementarias (cadena "a" silvestre
con cadena "b" silvestre; o bien cadena "a" mutante con cadena "b" mutante)
no presentarn diferencia con el estado original; sin embargo, si por ejemplo
una cadena "a" silvestre hbrida con una cadena "b" mutante, aquella regin
(ms o menos amplia) en la que exista mutacin no complementar,
formndose un bucle u horquilla, es decir, una regin en la que las bases
nitrogenadas no son complementarias y no establecen las uniones
caractersticas por puentes de hidrgeno en la doble hlice de ADN. Dichas
estructuras son los denominados heterodplex (dplex de ADN hbridos). Estos
heterodplex migran de forma diferente a los homodplex en la columna de
cromatografa de fase reversa(al igual que lo hacen en un gel de agarosa o
acrilamida). La separacin se realiza en condiciones desnaturalizantes
variables, detectndose las molculas de ADN midiendo la absorbancia a 260
nm. Esto origina un pico de elucin a un tiempo caracterstico. A medida que se
incrementan las condiciones desnaturalizantes los heterodplex migran por
delante de los homodplex, apareciendo los picos correspondientes a
heterodplex antes en el grfico resultante, el cromatograma. De esta manera,

como los heterodplex se desnaturalizan a temperaturas distintas a los

homodplex, ambas molculas dan lugar a picos de elucin distintos.

Previo al proceso inicial de desnaturalizacin se suele llevar a cabo una PCR

para la amplificacin del ADN molde en fragmentos de unas 150-450 pb.

Con este sistema pueden detectarse fcilmente sustituciones de una base,

inserciones o deleciones, con un coste reducido y de manera rpida
(aproximadamente 16 minutos).

Parmetros
Dimetro interno
El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que
determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin
influye en su sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande
(>10mm) se utilizan normalmente en la purificacin de compuestos para su
utilizacin posterior. En cambio, las columnas de dimetro interno menor (4-5
mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan
por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del consumo de disolventes
que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango
analtico y normalmente estn asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen
otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un dimetro inferior a
0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometra de masas.

Medida de las partculas

La mayora de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al
exterior de partculas esfricas de silica. Estas partculas pueden tener
diferentes medidas, siendo las de 5\mum de dimetro las ms utilizadas.
Partculas ms pequeas ofrecen una mayor superficie y una mejor separacin,
pero la presin que se requiere por obtener una velocidad lineal ptima
aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del dimetro de la
partcula. Esto significa que disminuir la medida de las partculas a la mitad,
aumentara la resolucin de la columna, pero a la vez, aumentara la presin
necesaria en un factor de ocho.

Tamao de poro
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor
superficie. Los poros pequeos proporcionan una mayor superficie mientras
que los poros de mayor medida proporcionan una cintica mejor,
especialmente para los compuestos de tamao ms grande; por ejemplo, una
protena que sea ligeramente ms pequea que el tamao de los poros puede
entrar, pero difcilmente saldr con facilidad.

Presin del sistema

La presin de las bombas es variable segn el modelo y fabricante, pero su
rendimiento se mide en su habilidad para generar un flujo constante y
reproducible. La presin puede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400
atmsferas). Los aparatos ms modernos de HPLC incorporan mejoras para
poder trabajar a presiones ms altas y, por lo tanto, poder utilizar partculas de
tamao ms pequeo en las columnas (< 2 micrmetros). Estos nuevos
aparatos, denominados ultra performance liquid chromatography (UPLC)
pueden trabajar con valores de hasta 100 MPa de presin (unas 1000
atmsferas). (Hay que tener en cuenta que las siglas UPLC son una marca
registrada de Waters Corporation aunque a veces se utilizan de forma general
para designar este tipo de aparatos).

Espectrometra de masas.
La espectrometra de masas es una tcnica de anlisis que permite la medicin
de molculas. El espectrmetro de masas es un artefacto que permite analizar
con gran precisin la composicin de diferentes elementos qumicos e istopos
atmicos, separando los ncleos atmicos en funcin de su relacin cargamasa (z/m). Puede utilizarse para identificar los diferentes elementos qumicos
que forman un compuesto, o para determinar el contenido isotpico de
diferentes elementos en un mismo compuesto. Con frecuencia se encuentra
como detector de un cromatgrafo de gases, en una tcnica hbrida conocida
por sus iniciales en ingls, GC-MS.

El espectrmetro de masas mide razones carga/masa de iones, calentando un

haz de material del compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los
diferentes tomos,el haz de iones produce un patrn especfico en el detector,
que permite analizar el compuesto. En la industria es altamente utilizada en el
anlisis elemental de semiconductores, biosensores y cadenas polimricas
complejas. Drogas, frmacos, productos de sntesis qumica, pesticidas,
plaguicidas, anlisis forense, contaminacin medioambiental, perfumes y todo
tipo de analitos que sean susceptibles de pasar a fase vapor e ionizarse sin
descomponerse.

Lmites de deteccin
En general, a mayor velocidad de erosin, mejor sensibilidad, por lo que, a
corriente alta, el haz primario de iones de alta energa es el ideal. Pero,
desafortunadamente, con la energa, no solo la eficiencia del sputtering
aumenta; tambin la profundidad de penetracin y el volumen de cascada
(dao inducido, perturbacin). Es por eso que SIMS es una tcnica de anlisis
destructiva. La distincin entre condiciones dinmicas y estticas podemos
comprenderla analizando el tiempo de vida (t) en la primera capa atmica
encontrada en superficie:

donde:

t = tiempo de vida de la monocapa.

A = rea de superficie pulverizada [cm2].

y = parte dispersada.

Ip = flujo primario de partculas [cm-2].

La asistencia del oxgeno (O2+) ocurre como resultado de los enlaces metaloxgeno en una zona enriquecida con oxgeno. Cuando estos enlaces se
rompen durante la emisin de iones, el oxgeno se carga negativamente debido
a su alta afinidad electrnica, favorece la captura, y su alto potencial de
ionizacin inhibe las partculas positivas (iones positivos). El metal es aislado
entonces de cargas positivas. Adems, el bombardeo con oxgeno incrementa
la concentracin de oxgeno en la superficie.

Por otra parte, el bombardeo con cesio (Cs+) favorece los iones negativos de la
muestra. Este fenmeno se pueden explicar por funciones trabajo que son
reducidas por la implantacin de cesio en la superficie de la muestra. Ms
electrones secundarios son excitados sobre la superficie de la barrera de
potencial. Incrementar la disponibilidad de electrones lleva a la formacin de
iones negativos.

Funcionamiento

Detector
En trminos generales, molculas diversas tienen masas diversas, hecho
utilizado por un espectrmetro de masas para determinar qu molculas estn
presentes en una muestra. Por ejemplo, se vaporiza sal de mesa (NaCl) y se
analizan los iones en la primera parte del espectrmetro de masa. Esto
produce iones del sodio e iones del cloro que tienen pesos moleculares
especficos. Estos iones tambin tienen una carga, que significa que debido a
ella tendrn movimiento bajo influencia de un determinado campo elctrico.

Estos iones se envan a un compartimiento de aceleracin y se pasan a travs

de una lmina metlica. Se aplica un campo magntico a un lado del
compartimiento que atrae a cada uno de los iones con la misma fuerza
(suponiendo carga idntica) y se los desva sobre un detector. Naturalmente,
los iones ms ligeros se desviarn ms que los iones pesados porque la fuerza
aplicada a cada ion es igual pero los iones ligeros tienen menos masa. El
detector mide exactamente cun lejos se ha desviado cada ion y, a partir de
ese dato se calcula el "cociente masa por unidad de carga". Con esta
informacin es posible determinar con un alto nivel de certeza cul es la
composicin qumica de la muestra original.

Hay muchos tipos de espectrmetros de masas que no solamente analizan los

iones, sino que tambin producen diversos tipos de iones. Sin embargo, todos
utilizan campos elctricos y magnticos para cambiar la trayectoria inica de
determinada manera.

Componentes
Un espectrmetro de masas tiene tres componentes fundamentales: la fuente
de ionizacin, el analizador de masa y el detector.