HPLC

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS.
En cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que circula a travs

de una columna en la que est contenida la fase estacionaria. La fase
mvil no slo arrastra al analito, sino que existen interacciones intensas
entre el analito y la fase mvil.
La retencin cromatogrfica es funcin de:
La fase mvil.
La fase estacionaria.
El analito.
Todas las especies que pueden disolverse pueden separarse eligiendo la
combinacin adecuada de fase mvil y fase estacionaria.
Componentes bsicos en un equipo de HPLC:
MTODOS CROMATOGRFICOS EN HPLC

Hay cinco mtodos cromatogrficos:
CROMATOGRAFA DE REPARTO: La cromatografa de reparto es hoy
en da el mtodo ms utilizado. La cromatografa de reparto se divide en
fase normal, y fase reversa, cuyas principales diferencias radican en
las distintas polaridades de sus fases estacionarias y mviles.
Cromatografa en fase normal: En esta cromatografa a diferencia de

en fase reversa, la fase estacionaria es polar y la mvil apolar. Las fases
estacionarias se obtienen haciendo reaccionar qumicamente los centros
silanoles activos de la slice con un trialquilclorosilano.
La retencin tambin (como la de fase reversa) tiene lugar en esa
especie de capa lquida depositada qumicamente, como consecuencia
de la distinta solubilidad relativa en la fase estacionaria (polar) y la fase
mvil (apolar). Donde el analito menos polar ser el primero que se
eluye y el ms polar el ltimo en eluir.
Cromatografa en fase reversa: En la cromatografa de fase reversa
su fase estacionaria en apolar, y la fase mvil polar. Las fases
estacionarias han sido obtenidas haciendo reaccionar qumicamente los
centros silanoles activos de la slice con un trialquilclorosilano.
La retencin se produce en esta especie de capa lquida depositada
qumicamente como consecuencia de la distinta solubilidad relativa
entre la fase estacionaria (apolar) y la fase mvil (polar).
Los compuestos ms retenidos son los ms apolares. La retencin
y selectividad se controlan fundamentalmente con la composicin de la
fase mvil. Para obtener una fase mvil de fuerza de elucin ptima, se
ensayan mezclas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA DE REPARTO

Como aplicaciones de la cromatografa de reparto en productos de
alimentacin: edulcarantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas,
aditivos en bebidas refrescantes, colorantes, aminocidos, proteinas,
carbohidratos, lpidos.
CROMATOGRAFA INICA: La cromatografa inica se usa para

separar y determinar especies inicas. La fase mvil es un lquido
acuoso y salino que contiene un disolvente orgnico como metanol o
acetonitrilo y un compuesto inico que aporta un contraion de carga
opuesta al analito. La elucin de los pares inicos se consigue mediante
una disolucin acuosa de metanol u otro disolvente orgnico soluble en
agua. La fase estacionaria es una resina de intercambio inico. Se trata
de un material polimrico (Ej: poliestireno), que contiene muchos grupos
funcionales por molcula y prcticamente insoluble en agua.
Hay dos tipos de cromatografa inica, que se clasifican segn el mtodo

empleado, para evitar que la alta conductividad de la fase mvil
interfiera en la medida de conductividad del analito. Estos dos tipos son:
Con detector conductimtrico y supresin qumica: Se coloca una
columna supresora del eluyente inmediatamente despus de la columna
analtica (de baja capacidad). Esta columna supresora es un
intercambiador inico de alta capacidad y de signo opuesto a la columna
analtica, que convierte los iones del eluyente en especies moleculares
poco ionizadas y no retiene los iones del analito. La columna supresora
se debe regenerar peridicamente. Veamos las reacciones entre el
eluyente y el supresor:
La primera reaccin de la imagen se corresponde a cuando la columna
analtica es catinica.
La segunda reaccin de la imagen corresponde a cuando la columna
analtica es aninica:
Fig. 9: Reacciones en cromatografa con detector conductimtrico y supresin qumica.
Con detector conductimtrico y supresin electrnica: Se utilizan

fases mviles de conductividad muy baja y diluida. Su conductividad se
corrige de forma electrnica. Comparada con la supresin qumica,
requiere un equipo ms sencillo, pero menos sensible.
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA INICA:

Como aplicaciones de la cromatografa inica est el anlisis de drogas y
sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas para
vitaminas, azcares, y preparaciones farmacuticas.
CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN: Tambin conocida como

cromatografa en geles permeables o de filtracin en geles. Es una
tcnica que se aplica particularmente a especies de alto peso molecular.
La fase estacionaria est compuesta de partculas de slice o polmeros
en forma de gel, que contienen una red de poros uniformes. La retencin
est basada en el tamao de las molculas. Si las molculas con ms
grandes que los poros, no pueden penetrar en ellos (slo pasan las
partculas), y son las primeras que se eluyen. Si las molculas son ms
pequeas que los poros, penetran en ellos recorriendo caminos mucho
ms largos, y sern las ltimas en eluir. Si las molculas tienen un
tamao intermedio, podrn penetrar en los poros ms grandes (camino
recorrido intermedio). Por tanto, el tiempo de residencia medio en los
poros, depende del tamao afectivo de las molculas de los analitos.
La retencin no se controla con la fase mvil, se controla eligiendo la
fase estacionaria, cuya eleccin vendr determinada por:
Si la separacin se realiza en fase acuosa (filtracin en gel), o en
fase orgnica.
El rango de pesos moleculares (tamaos) que contienen la
muestra que queremos analizar.
Cabe observar, que este tipo de separacin difiere de los dems que han
sido considerados, en que no implica una interaccin qumica o fsica
entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este
tipo de interacciones, dado que originan una mala eficacia de la
columna.
APLICACIONES
TAMAOS
DE
LA
CROMATOGRAFA
DE
EXCLUSIN
DE
Como aplicacin referida a productos alimenticios en cromatografa por

exclusin de tamaos: separacin de cidos grasos, determinacin de
glucosa fructosa y sacarosa en zumos enlatados.
CROMATOGRAFA DE ADSORCIN:
APLICACIONES DEL HPLC

(CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTO
DESEMPEO) EN MEDICAMENTOS Y
FARMACIA
La Cromatografa Lquida de Alto Desempeo (HPLC, por sus siglas en
ingls) se usa en la industria mdica y farmacutica para analizar
productos y los ingredientes que se usan para hacerlos. A menudo, este
anlisis lo desarrolla un laboratorio de control de calidad de la empresa
farmacutica. Los qumicos que contratan a estos fabricantes tienen
muestras de funcionamiento de materias primas o productos terminados
por medio de mquinas de HPLC y despus se analizan los resultados.
Beneficios
Un beneficio para la empresa farmacutica en el uso de la cromatografa
lquida de alto desempeo es la seguridad en la calidad que brinda este
anlisis. Otro es que los mtodos HPLC son relativamente estndar en la
industria. Esto significa que las nuevas contrataciones con experiencia
en el campo farmacutico requieren de un entrenamiento mnimo antes
de que comiencen a desarrollar un anlisis en los laboratorios. Adems,
el desempeo estndar del anlisis HPLC permite contratar a los
fabricantes para transferir mtodos en sus instalaciones de la empresa
que contrata la produccin.
Funcin
La HPLC se usa para analizar materias primas y productos terminados
para asegurarse que la calidad de los niveles previamente establecidos
se cumpla. La HPLC comienza en forma de una manguera de alta presin
que genera y mide una tasa de flujo especializada desde la reserva que
soporta al solvente. Un inyector introduce la muestra de forma continua
en la fase de vapor del flujo mvil que lleva la muestra hacia la columna
de la HPLC. Un detector se usa para medir las bandas separadas del
compuesto conforme se eluden desde la columna HPLC. La fase mvil
saca el detector y se puede recolectar o enviar para hacer pruebas.

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Con detector conductimtrico y supresin electrnica: Se utilizan

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CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN: Tambin conocida como

Como aplicacin referida a productos alimenticios en cromatografa por

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