Calophyllum Brasiliense

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE CULTIVOS DE CALLO DE Calophyllum

brasiliense (CAMBES) PRODUCTORES DE AGENTES ANTI VIH-1
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN BIOTECNOLOGA
PRESENTA
ANTONIO BERNAB ANTONIO
Director
Dr. Francisco Cruz Sosa
Co-Director
Dr. Ricardo Reyes Chilpa
Abril del 2010
El Doctorado en Biotecnologa de la Universidad Autnoma Metropolitana est

incluido en el Programa Nacional de Posgrados de Calidad (PNPC) del CONACyT y
adems cuenta con apoyo del mismo Consejo con el Convenio 471-01 Doctorado en
Biotecnologa
Iztapalapa, D.F. a 23 de abril de 2010
El jurado designado por la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud de la Unidad

Iztapalapa aprob la tesis
ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE CULTIVOS DE CALLO DE Calophyllum

brasiliense (CAMBES) PRODUCTORES DE AGENTES ANTI VIH-1
que present:
ANTONIO BERNAB ANTONIO
Comit Tutorial
Director: Dr. Francisco Cruz Sosa
Co-Director: Dr. Ricardo Reyes Chilpa
Asesor: Dr. Vctor Manuel Chvez vila
Jurado
Presidente: Dr. Juan Orozco Villafuerte
Secretario: Dra. Leticia Buenda Gonzlez
Vocal: Dra. Mara Elena Estrada Ziga
Vocal: Dr. Vctor Manuel Chvez vila
AGRADECIMIENTOS Y DEDICATORIAS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) y a la Universidad
Autnoma Metropolitana-Iztapalapa, por el financiamiento y la aceptacin respectiva,
que me han permitido seguir desarrollndome.
Al Dr. Francisco Cruz Sosa, por su asesora y las facilidades otorgadas durante el
desarrollo de esta investigacin.
Al Dr. Vctor Manuel Chvez vila y al Dr. Ricardo Reyes Chilpa, por sus valiosos
comentarios y sugerencias.
A la Dra. Leticia Buenda Gonzlez, Dra. Mara Elena Estrada Ziga y al Dr. Juan
Orozco Villafuerte, por sus valiosos comentarios y el apoyo incondicional brindado, que
permitieron culminar satisfactoriamente esta investigacin.
Al Dr. Jaime Eduardo Vernon Carter, que por su gran ayuda en la revisin del Artculo
derivado de este trabajo.
A mis hermanos, en especial a Victoria que ha sido como una Madre. A mis sobrinos,
Toa, Gaby, Lalo, Nery y Pablo, que con una sonrisa fue ms que suficiente para
impulsarme y seguir adelante.
A mis compaeros y amigos: Lety, Male y Juan por su valiosa amistad y por los
momentos de alegra que hemos pasamos en esta Universidad.
A mis amigos: Lorenzo Martn y Leonardo lvarez, que siempre me han brindado su
amistad y me han apoyado en los momentos ms difciles.
A todas aquellas personas que de alguna u otra forma me ayudaron a culminar este trabajo.
Gracias!
TABLA DE CONTENIDO
INDICE DE TABLAS..iv
INDICE DE FIGURAS..v
1. ABREVIATURAS ............................................................................................................ 1
2. RESUMEN ........................................................................................................................ 2
3. ABSTRACT ...................................................................................................................... 3
4. INTRODUCCIN ............................................................................................................. 4
4.1. Virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ............................................................... 4
4.1.1. El virus de inmunodeficiencia en el mundo ........................................................ 4
4.1.2. El virus de inmunodeficiencia humana en Mxico ............................................. 6
4.2. Biotecnologa vegetal ................................................................................................. 9
4.3. Cultivo de tejidos vegetales ...................................................................................... 11
4.4. Factores que afectan el cultivo de tejidos vegetales ................................................. 14
4.4.1. Material vegetal ................................................................................................. 14
4.4.2. Medio de cultivo ................................................................................................ 15
4.4.2.1. Sales inorgnicas ........................................................................................ 15
4.4.2.2. Compuestos orgnicos ................................................................................ 17
4.4.2.2.1. Reguladores de crecimiento vegetal .................................................... 17
4.4.2.2.2. Vitaminas ............................................................................................. 19
4.4.2.2.3. Fuente de carbono................................................................................ 19
4.4.2.3. Material de soporte y pH ............................................................................ 20
4.4.3. Temperatura, luz y humedad ............................................................................. 20
4.5. Metabolitos secundarios ........................................................................................... 21
4.5.1. Terpenos ............................................................................................................ 23
i
4.5.2. Fenoles ............................................................................................................... 24

4.5.3. Alcaloides .......................................................................................................... 25
4.6. Produccin de metabolitos secundarios en cultivos in vitro..................................... 26
5. ANTECEDENTES .......................................................................................................... 29
5.1. Distribucin .............................................................................................................. 29
5.1.1. Gnero Calophyllum .......................................................................................... 29
5.1.2. Calophyllum brasiliense .................................................................................... 30
5.2. Usos tradicionales de Calophyllum brasiliense ........................................................ 32
5.3. Metabolitos secundarios del gnero Calophyllum y su actividad biolgica ............. 34
5.4. Cultivo in vitro del gnero Calophyllum .................................................................. 40
6. JUSTIFICACIN ............................................................................................................ 41
7. OBJETIVOS .................................................................................................................... 42
7.1. Objetivo general ....................................................................................................... 42
7.2. Objetivos particulares ............................................................................................... 42
8. HIPTESIS ..................................................................................................................... 43
9. MATERIALES Y MTODOS........................................................................................ 43
9.1. Material vegetal ........................................................................................................ 43
9.2. Establecimiento de plntulas .................................................................................... 43
9.3. Evaluacin de medios de cultivo, antioxidantes....................................................... 44
9.4. Condiciones aspticas ............................................................................................... 45
9.5. Medio de cultivo y condiciones de incubacin ........................................................ 46
9.6. Induccin de callo ..................................................................................................... 46
9.7. Preparacin de extractos y muestras para el anlisis por HPLC .............................. 47
9.8. Anlisis por HPLC ................................................................................................... 48
9.9. Anlisis estadstico ................................................................................................... 49
ii
10. RESULTADOS Y DISCUSIN ................................................................................... 49

10.1. Establecimiento de plntulas .................................................................................. 49
10.2. Evaluacin de compuestos antioxidantes y medios de cultivo ............................... 50
10.3. Induccin de cultivos callo ..................................................................................... 52
10.4. Produccin de calanlidos y cido apetlico .......................................................... 60
11. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 66
12. PERSPECTIVAS .......................................................................................................... 67
13. REFERENCIAS ............................................................................................................ 68
iii
NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Composicin de algunos medios de cultivos......................................................... 16

Tabla 2. Rendimiento de compuestos de cultivos de clulas vegetales en comparacin con
las plantas madre. ................................................................................................................ 27
Tabla 3. Actividad biolgica y principales clases de compuestos del gnero Calophyllum 35
Tabla 4. Porcentaje de induccin de callo en explantes de hojas inmaduras de C.
brasiliense Cambes con diferentes concentraciones y combinaciones de KIN y 2,4-D
KIN y ANA despus de seis semanas de cultivo. ............................................................... 55
Tabla 5. Porcentaje de induccin de callo en explantes de hoja inmadura y semilla madura
de C. brasiliense, bajo diferentes concentraciones y combinaciones de BAP + IBA despus
de 6 semanas de cultivo. ...................................................................................................... 58
de C. brasiliense bajo diferentes concentraciones y combinaciones de BAP + PIC y BAP +
ANA despus de 6 semanas de cultivo................................................................................ 59
Tabla 7. Anlisis cuantitativo de calanlidos y cido apetlico en extractos hexnicos de
cultivos de callo y muestras de hoja de C. brasiliense. ....................................................... 62
iv
NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Nmero estimado de personas que viven con VIH (millones de personas) en el
mundo, 1990-2008. ................................................................................................................ 5
Figura 2. Nmero de casos acumulados (miles de personas) de SIDA en Mxico, por ao
de diagnstico y notificacin, 1990-2009. ............................................................................ 7
Figura 3. Esquema general del cultivo de tejidos vegetales ................................................ 14
Figura 4. Distribucin geogrfica del gnero Calophyllum ............................................... 29
Figura 5. Distribucin geogrfica de Calophyllum brasiliense ........................................... 30
Figura 6. Ejemplar de C. brasiliense en los Tuxtlas, Veracruz, Mxico ............................. 31
Figura 7. Productos artesanales a base de madera, y ltex como uso medicinal del gnero
Calophyllum ........................................................................................................................ 33
Figura 8. Distribucin geogrfica en Mxico de los quimiotipos 1, 2 y 3 de C. brasiliense
............................................................................................................................................. 37
Figura 9. Compuestos qumicos aislados de Calophyllum brasiliense (quimiotipo 1) ....... 38
Figura 10. Compuestos qumicos aislados de Calophyllum brasiliense (quimiotipo 2) ..... 39
Figura 11. Planta joven de C. brasiliense que muestra hojas inmaduras usadas para el
cultivo in vitro. .................................................................................................................... 44
Figura 12. Explantes de C. brasiliense inmersos en solucin antioxidante previo a la
siembra ................................................................................................................................ 46
Figura 13. Establecimiento de plntulas de C. brasiliense en invernadero. ........................ 50
Figura 14. Porcentaje de sobrevivencia de explantes de hoja de C. brasiliense con
diferentes compuestos antioxidantes y condiciones de incubacin.. ................................... 52
Figura 15. Respuestas inducidas de callo y raz en explantes de hoja de C. brasiliense, bajo
tratamientos de RCV. .......................................................................................................... 53
Figura 16. Respuestas inducidas de callo en explantes de semilla de C. brasiliense, con

BAP 8.88 M + PIC 24.84 M. .......................................................................................... 57
Figura 17. Cromatograma por HPLC del calanlido B. ...................................................... 61
Figura 18. Cromatograma por HPLC del calanlido C. ...................................................... 61
Figura 19. Cromatograma por HPLC del cido apetlico. .................................................. 61
Figura 20. Cromatograma por HPLC de extractos de callo de semilla (CS). ..................... 63
Figura 21. Cromatograma por HPLC de extracto de callo de hoja (CH). .......................... 63
Figura 22. Cromatograma por HPLC de extracto de hojas de plantas de invernadero. ...... 64
vi
1. ABREVIATURAS
AIA
AIB
ANA
BAP
CENSIDA
CH
CS
CTV
DGE
DWAD
DW
FAO
HPLC
IMSS
KIN
MCPA
OMS
p/v
PF
PS
PIC
PVP
RCV
SIDA
SS
TDZ
TR
Tr
UNAIDS
v/v
WPM
Zeatina
VIH-1
2iP
2,4,5-T
2,4-D
cido 3-indolactico
cido 3-indolbutrico
cido naftalenactico
6-bencilaminopurina
Centro Nacional para la Prevencin y Control del VIH/SIDA
Callos provenientes de explantes de hojas
Callos provenientes de explantes de semillas
Cultivo de tejidos vegetales
Direccin General de Epidemiologa
Detector de absorcin de doble longitud de onda
Dry weight
Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentacin
High performance liquid chromatography
Instituto Mexicano del Seguro Social
Cinetina (6-furfuril aminopurina)
cido 2-metil-4-cloro fenoxiactico
Organizacin Mundial de la Salud
Peso/volumen (concentracin)
Peso fresco
Peso seco
Picloram (cido 4-amino-3,5,6-tricloropicolinico)
Polivinilpirrolidona
Reguladores de crecimiento vegetal
Sndrome de inmunodeficiencia adquirida
Secretara de Salud
Tidiazuron [1-fenil-3-(1,2,3-tidiazol-5-il) urea]
Transcriptasa reversa
Tiempo de retencin
Programa Conjunto de las Naciones Unidas sobre el VIH/SIDA)
Volumen/volumen (concentracin)
Medio de cultivo para plantas leosas (Woody Plan Medium)
6-hidroximetil buterilamino purina
Virus de Inmunodeficiencia Humana tipo 1
6-dimetilamino purina
cido 2, 4, 5- triclorofenoxiactico
cido 2,4-diclorofenoxiactico
2. RESUMEN
La incidencia del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) ha aumentado
drsticamente en las ltimas dcadas, lo que ha motivado la bsqueda de nuevos frmacos
y mtodos de produccin. Calophyllum brasiliense (Cambes) es un rbol tropical que
produce calanlidos, metabolitos secundarios que son activos contra la transcriptasa
reversa (TR) del VIH-1. En este trabajo, se demuestra que el cultivo de tejidos vegetales es
una tcnica til para la produccin de estos metabolitos. Para ello, se evaluaron diferentes
concentraciones y combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal (KIN, BAP, TDZ,
ANA, 2,4-D, AIB y PIC) en explantes de hojas y semillas de C. brasiliense en cultivo in
vitro, para establecer cultivos de callo capaces de producir calanlidos. Se utiliz el medio
de cultivo para plantas leosas WPM y todos los cultivos se incubaron en condiciones de
oscuridad. Los resultados mostraron que, la mayor induccin de callo en explantes de
semillas (100%) ocurri con BAP 8.88 M + PIC 24.84 M, mientras que la mayor
induccin de callos para los explantes de hoja (80.67%) se obtuvo con KIN 0.46 M +
ANA 5.37 M. Los anlisis cuantitativos realizados a los extractos hexnicos de callo por
medio del HPLC, revel que hubo mayor produccin de calanlido B y calanlido C en los
callos provenientes de los explantes de semillas que en aquellos desarrollados a partir de
los explantes de hojas, en cantidades de 309.25 vs 8.70 mg kg-1 PS para el calanlido B;
117.70 vs 0.0 mg kg-1 PS para calanlido C, respectivamente. Este trabajo es un paso
inicial para la investigacin de la produccin por cultivo de tejidos, de estos compuestos
para contrarrestar el VIH-1.
3. ABSTRACT
The incidence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected people has
drastically increased over the last few decades, and has motivated the search for new drugs
and drug production methods. Calophyllum brasiliense (Cambes) is a rain forest tree that
produces
calanolides,
secondary
metabolites
that
are
active
against
human
immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase (HIV-1 RT). In this thesis, we

demonstrate that plant tissue culture is a useful technique for producing these metabolites.
Different concentrations and combinations of plant growth regulators (KIN, BAP, TDZ,
NAA, 2,4-D, IBA and PIC) were tested in leaf and seed explants to establish callus
cultures capable of producing calanolides. Woody Plant Medium was used as substrate,
and all cultures were incubated in dark conditions. The highest callus induction in seed
explants (100%) occurred with BAP 8.88 M + PIC 24.84 M, whereas the highest callus
inducement for the leaf explants (80.67%) occurred with KIN 0.46 M + naphthaleneacetic acid (NAA) 5.37 M. HPLC quantitative analysis revealed higher
calanolide B and calanolide C production in calluses from seed explants than those
developed from leaves, in amounts of 309.25 vs. 8.70 mg kg-1 DW for calanolide B;
117.70 vs. 0.0 mg kg-1 DW for calanolide C, respectively. This study is therefore an initial
step to investigating the production of these compounds in tissue culture with activity
against HIV-1 RT.
4. INTRODUCCIN
4.1. Virus de inmunodeficiencia humana (VIH)
4.1.1. El virus de inmunodeficiencia en el mundo
El sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), causado por el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), es una enfermedad inmunosupresora que resulta en
infecciones oportunistas y neoplasias malignas (Singh et al. 2005). Hasta el momento dos
tipos principales de VIH se han identificado, el VIH-1 y VIH-2. El VIH-1 es la causa de la
epidemia en todo el mundo y es el ms conocido, es un virus muy variable y que muta con
facilidad, permitiendo as escapar de la inmunidad del husped y crear variantes resistentes
a los medicamentos y presente el mayor desafo para el desarrollo de una vacuna eficaz
contra este virus (Papathanasopoulos et al. 2003). El VIH-2 es mucho menos patgeno se
produce rara vez, ya que se encuentra principalmente en frica occidental. (Singh et al.
2005; De Clercq 1995).
Pese a los avances constantes en la terapia antirretroviral, el SIDA causado por el VIH-1 se
ha convertido en la principal causa de muerte en frica y en cuarto a nivel mundial, el
nmero de personas con el VIH est aumentando a un ritmo alarmante en la India y el
sudeste asitico (OMS 2009). De acuerdo a cifras del Programa Conjunto de las Naciones
Unidas sobre el VIH/SIDA (UNAIDS), hasta el 2009, el porcentaje mundial de personas
que viven con el VIH se ha estabilizado desde el ao 2000. Sin embargo, el nmero de
personas que viven con VIH en el mundo continu creciendo en el 2008, estimando 33.4
millones (Figura 1), siendo 20% mayor que en el ao 2000 (UNAIDS 2009).
Figura 1. Nmero estimado de personas que viven con VIH (millones de personas) en el
mundo, 1990-2008 (UNAIDS 2009).
La UNAIDS (2009) menciona tambin que, cada da 7,400 personas se infectan por el VIH
en todo el mundo, esto es, 2.7 millones de personas contrajeron la infeccin en el 2009, y
hubo 2 millones de defunciones relacionadas con el SIDA en este mismo ao. De los 33.4
millones de personas que viven con el VIH, 31.3 millones corresponden a adultos, 15.7
millones a mujeres, y 2.1 millones a menores de 15 aos. Afortunadamente, la tasa nueva
de infecciones por el VIH ha disminuido en varios pases pero, a nivel mundial, el aumento
de nuevas infecciones en otros pases contrarresta, al menos en parte, estas tendencias
favorables. A medida que ha aumentado el acceso a tratamientos antirretrovirales en los
ltimos diez aos, disminuy el nmero anual de fallecimientos por SIDA (UNAIDS
2009).
4.1.2. El virus de inmunodeficiencia humana en Mxico

En Mxico, el SIDA ocup el lugar 17 como causa de muerte en el 2007, pero al igual que
en el resto de los pases del mundo, se ha convertido en un problema prioritario de salud
pblica muy complejo, con mltiples repercusiones psicolgicas, sociales, ticas,
econmicas y polticas que rebasan el mbito de la salud, que constituye una amenaza para
la seguridad nacional y para el desarrollo econmico y social de las naciones. Del
continente americano, Mxico ocupa el tercer lugar despus de Estados Unidos y Brasil
(UNAIDS 2009). De acuerdo a estimaciones realizadas por el Centro Nacional para la
Prevencin y Control del VIH/SIDA (CENSIDA), de manera conjunta con el UNAIDS, en
Mxico existan 220,000 personas adultas infectadas por el VIH en el 2009. Por otra parte,
CENSIDA (2009) indic que desde el inicio de la epidemia en nuestro pas en 1981, hasta
el 17 de noviembre del 2009, en el Registro Nacional de Casos de SIDA se han
contabilizado 135,003 casos acumulados de SIDA. Adems, Magis et al. (2008) con apoyo
de los datos de CENSIDA menciona que la mayora de los casos registrados correspondan
a personas que ya haban fallecido y el resto (39%) a quienes padecan la enfermedad y se
encuentraban recibiendo tratamiento antirretroviral. De estos casos, el 80% corresponda a
hombres y 20% a mujeres, lo que indic que por cada cinco hombres se ha infectado una
mujer. El intervalo de edades que comprende 15 a 44 aos acumula el 77.5% de los casos,
seguido por un 20.1% en personas mayores de 45 aos y el resto (2.4%) corresponde a
personas de 0 a 14 aos. En el ao de 1999 se elev la notificacin oportuna de los
diagnsticos debido a la oferta de tratamientos antirretrovirales a cargo del IMSS y la
Secretaria de Salud (SS) (Figura 2).
25
Proceso activo de la DGE

para disminuir el subregistro.
20
Incremento por oferta de

antirretrovirales por SS.
15
10
5
Diagnstico
2009
2008
2007
2006
2005
2004
2003
2002
2001
2000
1999
1998
1997
1996
1995
1994
1993
1992
1991
1990
Notificacin
Figura 2. Nmero de casos acumulados (miles de personas) de SIDA en Mxico, por ao

de diagnstico y notificacin, 1990-2009 (CENSIDA 2009).
A diferencia del ao 2004 cuando solamente se haba registrado puntualmente el 18.6% de

los casos ingresados al Registro Nacional de Casos de SIDA, entre los aos 2005 y 2007 se
consigi registrar eficazmente entre el 50% y el 65%, lo que indic la presencia de una
mejora progresiva en el registro adecuado de los nuevos casos diagnosticados en cada ao
(Magis et al. 2008). Las cifras ms elevadas en los aos 2002, 2004 y 2008 fueron debidos
a procesos activos de la Direccin General de Epidemiologa (DGE) para disminuir el
subregistro de casos.
En lo que se refiere a la distribucin del VIH, hasta marzo del 2009 se registr que el
54.5% de los casos se concentr en slo seis entidades federativas: Distrito Federal
(16.9%), Estado de Mxico (11.0%), Veracruz (9.1%), Jalisco (8.0%), Puebla (4.8%) y
Baja California (4.7%) (CENSIDA 2009). Conocer las cifras de mortalidad por VIH/SIDA
y realizar el adecuado seguimiento y anlisis de las mismas posee un valor estratgico
7
enorme a la hora de evaluar logros y fracasos en la lucha contra la infeccin en Mxico. En

otras palabras, la mortalidad disminuira siempre y cuando descienda el nivel de contagio,
se detecte el VIH/SIDA en sus etapas ms tempranas y se apliquen tratamientos
especficos mas sencillos, econmicos y eficaces (Magis et al. 2008).
En relacin a esto, han hecho esfuerzos con el objetivo de buscar medicamentos ms

efectivos y de bajo costo, sin embargo hasta el momento, no se tiene alguna droga que
pueda eliminar el VIH. La bioactividad guiada por el fraccionamiento de los extractos
crudos ha proporcionado molculas dirigidas al descubrimiento de drogas candidatas antiVIH. Es as, que durante la ltima dcada, se han realizado importantes progresos en la
investigacin sobre productos naturales que poseen actividad anti-VIH (Singh et al. 2005).
Algunos ejemplos, son los extractos del gnero Ipomoea carnea, varias especies de Vitex
sp., Canna indica, Justicia gendarussa, extractos de Rhus chinensis, e incluso algunas
cianobacterias verde-azules de agua dulce se han mostrado tener de moderada a buena
actividad contra el VIH (Jassim y Naji 2003; Wang et al. 2006; Woradulayapinij et al.
2005). A la fecha se ha logrado identificar poco ms de 120 compuestos naturales,
principalmente de plantas, que pueden contrarrestar in vitro los efectos citopticos de
clulas infectadas con este tipo de virus e impedir su replicacin. Estos compuestos
presentan una gran diversidad estructural encontrndose, entre otros, alcaloides, cumarinas,
flavonoides, lignanos, fenoles, quinonas, saponinas, diterpenos, triterpenos, xantonas y
polisacridos sulfatados (Reyes-Chilpa y Huerta-Reyes 2009).
4.2. Biotecnologa vegetal

Originalmente el concepto de biotecnologa se circunscriba al campo de la ingeniera
bioqumica, de manera fundamental en el rea de la microbiologa industrial y la
tecnologa enzimtica (Garibay et al. 1993). Sin embargo ha adquirido un significado ms
amplio. La biotecnologa es un gradiente de tecnologas que van desde las tcnicas de la
biotecnologa tradicional como la fermentacin de alimentos y el control biolgico, hasta
la biotecnologa moderna, basada en la utilizacin de las nuevas tcnicas de la ingeniera
gentica (Altman 1999). La Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentacin (FAO 2000), menciona que de acuerdo al convenio sobre la diversidad
biolgica, se define a la biotecnologa como: "toda aplicacin tecnolgica que utilice
sistemas biolgicos y organismos vivos o sus derivados para la creacin o modificacin de
productos o procesos para usos especficos". En el sentido amplio de la definicin de
biotecnologa, la biotecnologa vegetal constituye el empleo de las plantas para la
produccin de bienes y servicios, incluyendo todas las tcnicas agronmicas y hortcolas
tradicionales, pues sin stas, no podra alcanzarse el objetivo de la biotecnologa que es la
produccin de cultivos de mayor calidad y mas alto rendimiento (Robert et al. 1993). En
las tres ltimas dcadas, la biotecnologa moderna ha emergido como un rea promisoria
que ofrece diversas oportunidades para la manipulacin de los sistemas biolgicos y su
explotacin comercial (Daz 2005). En la actualidad, diversos problemas relacionados con
la elaboracin de productos se resuelven mediante la aplicacin de biotecnologas
novedosas. Las aplicaciones mas potenciales de la biotecnologa vegetal sobre la
produccin de alimentos son enormes y prcticamente todos los cultivos alimentarios
pueden beneficiarse en una forma u otra de las nuevas tcnicas como en mayores
rendimientos, incrementar la superficie cultivable y mayor calidad de productos (Robert et
9
al. 1993). En este aspecto, la biotecnologa vegetal contribuye en cuatro enfoques

principales: a) la multiplicacin masiva de cultivares sanos y de alta calidad a travs de las
tcnicas de propagacin in vitro conocidas como micropropagacin, b) la generacin de
germoplasma libre de enfermedades, c) la generacin de plantas con nuevas caractersticas
genticas, y d) la conservacin de germoplasma por medio de cultivos in vitro contribuir
tambin aunque indirectamente, al mejoramiento gentico de los cultivos (Robert et al.
1993; Altman 1999; George et al. 2008).
Por otra parte, la biodiversidad de Mxico ofrece varias opciones, que slo con las
herramientas de la biotecnologa vegetal es factible aprovechar; por ejemplo, el desarrollo
del campo de la etnobotnica para la identificacin de especies con principios activos para
la produccin de nuevos frmacos, aditivos y enzimas para la industria puede constituirse
en una nueva actividad sumamente redituable para las comunidades vinculadas a las zonas
de reserva ecolgica, propiciando con ello, su aprovechamiento racional y su proteccin
(Bosh 2003). Aproximadamente el 25% de todos los frmacos prescritos en los pases
industrializados contienen compuestos que son directa o indirectamente, a travs de semisntesis, derivados de las plantas, y muchas veces el sustitutos sintticos no poseen la
misma eficacia y especificidad farmacolgica (Neumann et al. 2009). De acuerdo a Rates
(2001), el 11% de los 252 medicamentos que son considerados por la Organizacin
Mundial de la Salud (OMS) como bsicos y esenciales, derivan exclusivamente de las
plantas con flores.
En las ltimas dos dcadas la biotecnologa vegetal se ha desarrollado como un rea nueva
y prometedora en el campo de la biotecnologa, centrndose en la produccin de
metabolitos secundarios vegetales. Para algunos compuestos de inters, como la
escopolamina la morfina, la quinina, vinblastina, atropina, y la digoxina, hasta el momento
10
no se han podido llegar a un proceso comercialmente viable, lo que ha limitado la cantidad

de investigacin en el desarrollo de alternativas biotecnolgicas para la produccin de cada
uno de los productos mencionados (Verpoorte et al. 1994). Aunque en la biotecnologa
vegetal los esfuerzos de investigacin de las plantas se han diluido, para algunos
compuestos se ha podido incrementar considerablemente los niveles de produccin, por
ejemplo, shikonina (Tabata 1988) y berberina (Fuyita y Tabata 1987). Actualmente la
investigacin se centra especialmente en las posibilidades de aplicar la ingeniera
metablica para mejorar el rendimiento a niveles comercialmente interesantes. Si bien es
cierto que la biotecnologa moderna abarca una gran variedad de instrumentos de
investigacin, muchos de los productos exitosamente comercializados en la actualidad
provienen de dos grandes reas, la ingeniera gentica y el cultivo in vitro de tejidos
vegetales (Diaz 2005).
4.3. Cultivo de tejidos vegetales

El cultivo de tejidos vegetales (CTV) o cultivo in vitro vegetal es una poderosa
herramienta de la biotecnologa moderna, y a grandes rasgos, esta tecnologa consiste en el
uso de partes aisladas de las plantas, llamados explantes, y mantenidos en un medio
nutritivo artificial asptico bajo condiciones ambientales controladas (Barba et al. 2001).
Este medio nutritivo funciona como reemplazo de las clulas, tejidos o elementos
conductores originalmente vecinos del explante (Neumann et al. 2009).
11
Pierik (1990), menciona seis tipos de cultivos in vitro o cultivo de tejidos vegetales:
1. Cultivo de plantas intactas: se siembre la semilla in vitro, de la cual se obtiene una
plntula y finalmente una planta.
2. Cultivo de embriones: se cultiva el embrin aislado despus de retirar el resto de los
tejidos de la semilla.
3. Se cultiva in vitro un rgano aislado (una porcin de tejido o un rgano). Se pueden
distinguir distintos tipos, por ejemplo, cultivos de meristemos, cultivos de pices del
vstago, cultivo de races, cultivo de anteras, etc.
4. Cultivo de callo: Es un tejido obtenido por medio del aislamiento de rganos o tejidos
diferenciados los cuales posteriormente son llevados a una desdiferenciacin celular
presentado una proliferacin continua, acelerada y de apariencia desorganizada, que da
origen a una masa amorfa de tejido.
5. Cultivo de clulas aisladas. Es el crecimiento de clulas individuales obtenidas de un
tejido, callo o cultivo en suspensin.
6. Cultivo de protoplastos: Se obtiene a partir de clulas, por digestin enzimtica de la
pared celular.
Se debe enfatizar en que el CTV es una serie de tcnicas que se utilizan en investigacin y
en la produccin comercial de productos vegetales y plantas. En el primer caso, se ha
empleado en estudios de fisiologa, bioqumica, morfognesis, anatoma, embriologa,
fitomejoramiento y preservacin de germoplasma; mientras que el segundo caso se utiliza
en la biosntesis de productos naturales (saborizantes, colorantes, aromatizantes, frmacos)
12
y en la micropropagacin de plantas ornamentales, forestales, frutales y hortcolas (Barba

et al. 2001).
El cultivo de tejidos vegetales explora tambin condiciones que promueven la divisin
celular y la reprogramacin gentica en condiciones in vitro. Adems, se ha convertido en
un procedimiento estndar para la biotecnologa vegetal y hoy en da se puede reconocer
cinco grandes reas donde el cultivo in vitro de clulas es generalmente aplicado (LoyolaVargas y Vzquez-Flota 2006): a) propagacin a gran escala de material elite, b)
generacin de individuos frtiles genticamente modificados; c) como un modelo para
estudios de fisiologa celular vegetal; d) preservacin de especies en peligro de extincin y
recursos fitogenticos; y e) para la produccin de productos naturales o metabolitos
secundarios.
Dentro de estas aplicaciones, la propagacin in vitro o micropropagacin es una de las
tcnicas ms estudiadas, con mayores avances y la que ms se aplica comercialmente a un
mayor nmero de especies, incluyendo a muchas plantas medicinales (Barba et al. 2001;
Rout et al. 2000). Este ultimo autor menciona tambin que la propagacin de plantas, a
travs del cultivo de tejidos se puede dividir en tres grandes categoras: el enfoque ms
comn consiste en aislar los meristemos organizados como pices o yemas axilares e
inducirlos para convertirse en plantas completas, este sistema de propagacin es
comnmente conocida como la micropropagacin; en el segundo enfoque, los brotes
adventicios se inician en las hojas, raz y del tallo o en segmentos de callos derivados de
dichos rganos; el tercer sistema de propagacin consiste en la induccin de embriognesis
somtica en clulas y en cultivos de callos (Figura 3). Otra de las grandes aplicaciones en
que actualmente se est potencializando en la tcnica del CTV, es la produccin de
13
compuestos de gran valor para la industria, la cual es un rea de intensa investigacin

dentro de la biotecnologa.
Figura 3. Esquema general del cultivo de tejidos vegetales (Lindsey y Jones 1989).
4.4. Factores que afectan el cultivo de tejidos vegetales

En gran parte, el xito del cultivo de tejidos vegetales se encuentra en s, en el propio
material vegetal, la composicin del medio de crecimiento (sales inorgnicas), hormonas, y
condiciones del cultivo tales como la temperatura, pH, luz, y humedad (Pierik 1990;
Cardoza 2008).
4.4.1. Material vegetal

El material vegetal por s mismo, as como el medio de cultivo y los factores fisiolgicos
de crecimiento, pueden influir en el crecimiento y desarrollo in vitro. La capacidad de
regeneracin de las plantas es muy variada, siendo las dicotiledneas las que generalmente
14
se regeneran mejor que las monocotiledneas. Adems, conforme una planta envejece, su
capacidad regenerativa suele disminuir, por lo cual, se tienen que utilizar plantas juveniles.
Los tejidos jvenes, no lignificados, generalmente son los ms apropiados para el cultivo,
aunque esto puede variar. Por otra parte, es importante que el material vegetal este sano,
puesto que esto repercute en el porcentaje de infeccin. Tambin se ha observado que los
explantes obtenidos de plantas de campo son ms difciles de regenerar que aquellas
provenientes de invernadero. Es conocido que es mucho ms difcil inducir el crecimiento
en estructuras muy pequeas como clulas, agregados de clulas, y meristemos, que en
estructuras ms grandes, como explantes de hojas, tallo o tubrculos (Pierik 1990).
4.4.2. Medio de cultivo

4.4.2.1. Sales inorgnicas
El medio de crecimiento es una composicin de minerales esenciales y vitaminas que son
necesarias para el crecimiento y desarrollo de la planta, es decir, sin agua y nutrientes
minerales, las plantas o los explantes no pueden vivir in vitro, ya que no son
completamente auttrofos cuando se desarrollan en estas condiciones. Los minerales
constan de macronutrientes como el nitrgeno (N), potasio (K), fsforo (P), calcio (Ca),
magnesio (Mg), y azufre (S), que son requeridos por las plantas en grandes cantidades
(g/l); mientras a aquellos que se requieren en cantidades mnimas (mg/l) se denominan
micronutrientes como el fierro (Fe), zinc (Zn), cloro (Cl), boro (B), cobre (Cu), nquel (Ni),
molibdeno (Mo), manganeso (Mn) (Pierik 1990; Cardoza 2008). Estos elementos junto con
el carbono (C), oxgeno (O) y el hidrgeno (H), conforman los 17 elementos esenciales.
Algunos otros, como el cobalto (Co), aluminio (Al), sodio (Na) y el iodo (I) han sido
esenciales o benficos para algunas especies (George et al. 2008).
15
Por lo general, los medios de cultivo (Tabla 1), estn basados en formulaciones ya
establecidas (Pierik 1990; Gamborg y Phillips 1995).
Tabla 1. Composicin de algunos medios de cultivos.
Gamborg et al
(1976)
Murashige y Skoog
(1962)
Lloyd y McCown
(1981)
mg l-1
Componentes
Macronutrientes
KNO3
Ca(NO3)2.4H2O
NH4NO3
(NH4)2.SO4
NaH2PO4.H2O
KH2PO4
K2SO4
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
2500
134.00
150.00
150.00
250.00
1900
1650
170.00
440.00
370.00
556.00
400.00
170.00
990.00
96.00
370.00
FeSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
CuSO4.5H2O
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA
27.80
13.20
2.00
3.00
0.75
0.025
0.25
0.025
37.30
27.80
22.30
8.60
6.20
0.83
0.025
0.25
0.025
37.30
27.80
22.30
8.60
6.20
0.25
0.25
37.30
Compuestos orgnicos
Mioinositol
Glicina
cido nicotnico
Piridoxina
Tiamina
100.0
1.0
1.0
10.0
100.0
2.0
0.5
0.5
0.1
100.0
0.5
0.5
1.0
Sacarosa (g/l)
20.0
30.0
20.0
Micronutrientes
Fuente: Pierik (1990) y Gamborg y Phillips (1995).
16
Uno de los medios nutritivos ms usados en el CTV es el de Murashige y Skoog (1962),

que fue desarrollado para el crecimiento ptimo de cultivos de callos de tabaco, y el
desarrollo result til para un gran nmero de especies. Este medio, consiste en preparar
por separado soluciones base (stock) de macroelementos, microelementos, etc.,
almacenarlas en fro y mezclarlos en la proporcin adecuada en el momento de su
utilizacin (Pina 2008), aunque actualmente se encuentran formulaciones preparadas a
nivel comercial. A pesar de que este medio de cultivo es ms utilizado para la mayora de
las plantas, no siempre es el ms adecuado para ciertas especies, debido a su alto contenido
de sales. Por ejemplo algunas especies responden mejor al medio realizado por Lloyd y
McCown (1981). Este medio de cultivo denominado Woody Plant Medium (WPM) es
usado ampliamente para el cultivo de tejidos de plantas leosas o sensibles a la salinidad
(Cardoza 2008, Pierik 1990).
4.4.2.2. Compuestos orgnicos

4.4.2.2.1. Reguladores de crecimiento vegetal
Los RCV ms usadas en el cultivo de tejidos son las auxinas, tales como, el cido 3indolactico (AIA), cido 3-indolbutrico (AIB), cido naftalenactico (ANA), cido 2,4diclorofenoxiactico (2,4-D), cido 2, 4, 5- triclorofenoxiactico (2,4,5-T), cido 2-metil-4cloro fenoxiactico (MCPA). Las auxinas como el AIA (auxina natural) se utilizan en
concentraciones de 0.01 a 10 mg l-1, y las auxinas sintticas como AIB, ANA y 2,4-D, se
usan desde concentraciones menores que van desde 0.001-10 mg l-1, por ser relativamente
ms activas. Las auxinas estimulan principalmente la elongacin celular y expansin de los
tejidos, divisin celular (formacin de callo) y formacin de races adventicias, inhibicin
17
de formacin de vstagos axilares y adventicios, y frecuentemente embriognesis en los

cultivos de clulas en suspensin. Es decir, con una concentracin baja de auxinas
predomina la formacin de races adventicias, mientras que con altas concentraciones da
lugar a la formacin de callo (Pierik 1990). Se menciona tambin que, el 2,4-D y 2,4,5-T
son muy efectivas para el crecimiento de callos (Bhojwani y Razdan 1983). Por otra parte,
el cido 4-amino-3,5,6-tricloropicolinico picloram (PIC), es un herbicida de tipo
sistmico que a concentraciones bajas tiene efectos similares a las auxinas (Collins et al.
1978). Aunque no es comnmente usado, se han obtenido resultados favorables para la
induccin de callo, brotes y embriognesis somtica (Valverde y Arias 1989; Beyl y
Sharma 1983).
Las citocininas por su parte, se usan para estimular el crecimiento y el desarrollo, siendo
las ms comunes, el 6-furfurilaminopurina cinetina (KIN), 6-bencilaminopurina (BAP),
6-dimetilaminopurina
(2iP),
6-hidroximetilbuterilaminopurina
(zeatina).
Estos
reguladores, adems de promover la divisin celular, inducen la formacin de vstagos

axilares por la disminucin de la dominancia apical y retarda el envejecimiento y se usa
generalmente altas concentraciones de 1-10 mg l-1 (Cardoza 2008; Pina 2008; Pierik 1990).
Adems de estos reguladores tambin se ha llegado a utilizar el N-fenil-N-1,2,3-tidiazol5-il urea tidiazuron (TDZ), el cual induce una gran diversidad de respuestas en el cultivo.
El TDZ presenta la propiedad nica de imitar los efectos de las auxinas y a las citocininas
en el crecimiento y la diferenciacin de los explantes cultivados (Murthy et al. 1998). En
concentraciones menores de 0.22 mg l-1 puede inducir mayor proliferacin axilar que
muchas otras citocininas, sin embargo, al incorporar cantidades mayores a 0.22 mg l-1, el
TDZ puede estimular la formacin de callos, brotes adventicios embriones somticos
(Huettema y Preece 1993).
18
4.4.2.2.2. Vitaminas
Las vitaminas ms utilizadas en el cultivo de tejidos vegetales son la tiamina (B1),
piridoxina (B6) y el acido nicotnico (PP niacina). La nica vitamina que ha demostrado
tener importancia en el cultivo de clulas y rganos es la tiamina, y se usan
concentraciones de 0.1-5 mg l-1 al igual que el cido nicotnico (PP niacina), mientras
que la piridoxina es de 0.1-1 mg l-1. Estas dos ltimas se utilizan debido a que pueden
estimular procesos de crecimiento especficos (Hurtado y Merino 1987). El mio-inositol
tiene un efecto estimulante muy significativo y se utilizan concentraciones generalmente
de 100-200 mg l-1. El cido ctrico junto con el cido ascrbico (vitamina C), a veces se
utilizan en concentraciones muy elevadas (1-100 mg l-1), principalmente para evitar la
oxidacin de ciertos inculos (Pierik 1990).
4.4.2.2.3. Fuente de carbono

En adicin, las plantas requieren de une fuente de carbono externa (azcares), ya que los
cultivos in vitro no fotosintetizan lo suficiente para soportar las necesidades de carbono del
tejido, adems de que el crecimiento de ciertos cultivos tiene lugar en condiciones de
oscuridad (Cardoza 2008). La fuente de carbono ms usada es la sacarosa y se emplean
concentraciones de 2 a 3%, pudiendo variar de acuerdo a la especie entre 5 a 12%.
Generalmente el crecimiento y desarrollo aumentan con la concentracin de azcar, hasta
que alcanza un ptimo, mientras que disminuye a elevadas concentraciones (Pierik 1990).
19
4.4.2.3. Material de soporte y pH

Como material de soporte, el agar (8 g l-1) es el ms usado en el cultivo de tejidos, pues
provee al medio un excelente gel hmedo que sirve como soporte al inoculo. Sin embargo,
fisiolgicamente no es inerte, puesto que es una fuente de cantidades variables de
sustancias inhibidoras o estimulantes del crecimiento, por lo que, se pueden sustituir por
Gelrite o Phytagel (2 g l-1), los cuales son ms puros y de apariencia clara que el agar
(Cardoza 2008; Hurtado y Merino 1987).
El pH en el medio es de gran importancia ya que influye en la absorcin de varios
componentes del medio, la mayora de stos se ajustan a un pH de 5.2-5.8 (Cardoza 2008).
Pierik (1990) menciona que el pH en el rango de 5-6.5 es apto para el crecimiento, con un
mximo de 6.0, mientras que un pH bajo (menor de 4.5) o alto mayor de 7), generalmente
frena el crecimiento y desarrollo in vitro. Si el pH es demasiado bajo, puede ocasionar que
la auxina AIA y el cido giberlico sean menos estables, el agar pierde su rigidez, y
algunas sales como el fierro y fosfato pueden precipitar.
4.4.3. Temperatura, luz y humedad

Otros tipos de factores que influyen en el cultivo son la luz, temperatura y la humedad
relativa. A pesar de que los cultivos de tejidos no son fotosintticamente eficientes, la
iluminacin influye en los procesos morfogenticos y en general en el metabolismo. El
fotoperiodo generalmente utilizado es de 16 horas luz y 8 de oscuridad, intensidad de luz
de 25-50 mol m-2 s-1. Algunos cultivos son tambin incubados en la oscuridad, debido a
que la luz incrementa la produccin de compuestos fenlicos, los cuales interfieren con el
crecimiento del cultivo de callos (Pina 2008; Cardoza 2008; George y Davis 2008). A
20
veces, dependiendo de la especie experimental, se elige una temperatura ms baja (18

para especies bulbosas), o una temperatura ms alta (28-29 para especies tropicales), pero
debe tomarse en cuenta que la temperatura interior de los recipientes que contienen los
cultivos in vitro es 3-4 grados ms alta que en la cmara de crecimiento. Por otra parte,
debe tenerse tambin en cuenta que la humedad en los recipientes del cultivo es
relativamente alta, por lo que la humedad de la cmara de crecimiento debe ser 30-50%.
Sin embargo, si la humedad es elevada en la cmara, dar como resultado una mayor
cantidad de infecciones al igual que una elevada temperatura (Pierik 1990).
4.5. Metabolitos secundarios

Todas las clulas vegetales realizan procesos metablicos comunes que conducen a la
formacin de compuestos como los azcares simples, aminocidos, nucletidos, cidos
grasos y polmeros derivados de ellos (polisacridos, protenas, cidos nucleicos y lpidos,
entre otros), esenciales para la vida celular y, en general, de la planta (Piol et al. 2000).
Estos procesos constituyen, en su conjunto, el metabolismo primario, y a los compuestos
indicados se denominan metabolitos primarios, los cuales estn involucrados directamente
en el crecimiento y en el metabolismo (Ramawat 2007). Adems de estos procesos
metablicos, en las plantas se pueden desarrollar otras rutas que conducen a la formacin
de compuestos usualmente peculiares de ciertos grupos taxonmicos vegetales (gnero,
especie o familia) (Ramawat 2007). Estas rutas constituyen el metabolismo secundario y
sus productos secundarios se denominan metabolitos secundarios, productos secundarios o
productos naturales (Piol et al. 2000). Estos compuestos estn considerados como
productos finales del metabolismo primario y por lo general no estn involucrados en
21
procesos de fotosntesis, respiracin, transporte de solutos, translocacin, sntesis de

protenas, asimilacin de nutrientes, diferenciacin, formacin de carbohidratos, protenas
y lpidos (Taiz y Zeiger 2006).
La distribucin de los metabolitos secundarios en las plantas es mucho ms restringida que
el de los metabolitos primarios; un compuesto a menudo slo se encuentra en unas pocas
especies, o incluso dentro de unas pocas variedades de una especie (Smetanska 2008).
Adems, la biosntesis de estos metabolitos se restringe tambin a fases especficas del
desarrollo, tanto del organismo como de las clulas especializadas, y a perodos de estrs
causados, por ejemplo, por la deficiencia de nutrientes, factores ambientales, o el ataque de
microorganismos (Piol et al. 2001). Tambin, desempean un papel importante en la
adaptacin de las plantas con su entorno, y en su mayora tienen un papel ecolgico puesto
que protegen a las plantas de ser comidas por herbvoros y en contra de ser infectados por
patgenos; sirven como atrayentes (olor, color y sabor) de polinizadores, y al ser ingeridas
por animales ayudan a la dispersin de las semillas; funcionan tambin como agentes de
competencia entre las plantas y a la simbiosis de microorganismo planta (Bourgaud et al.
2001; Taiz y Zeiger 2006). Por ejemplo, se ha probado que las plantas producen
fitoalexinas como respuesta al ataque de bacterias y hongos (Gurib-Fakim 2006). La
produccin de metabolitos secundarios suele ser bajo (menos del 1% PS), dependiendo en
gran medida de estos tipos de factores (Neumann et al. 2009). Por otra parte, muchas
plantas han sido utilizadas desde cientos de aos para el tratamiento y cura de las
enfermedades infecciosas y no infecciosas, lo que propici una de las bases ms
importantes para el nacimiento de la medicina (Samuelsson 2004 y Floriani et al. 2006). En
la actualidad, la investigacin y desarrollo se centran en las plantas que producen
metabolitos
secundarios
de
inters
farmacutico,
tales
como,
sustancias
con
22
inmunomoduladores,
antibiticos,
antiparasitarios,
antitumoral,
antiinflamatorio,
hipoglucemia y antivirales (Yamada 1991).

De acuerdo a Croteau et al. (2000), los metabolitos secundarios vegetales se clasifican
generalmente en tres grandes familias (terpenos, compuestos fenlicos y alcaloides).
4.5.1. Terpenos
Los terpenos o terpenoides constituyen la clase ms grande de los productos secundarios, y
el nombre deriva del hecho que fue el primer miembro de la clase que fue aislado de la
trementina (terpentin) (Croteau et al. 2000). Las diversas sustancias de esta clase son
generalmente insolubles en agua. Todos los terpenos se derivan de unidades de cinco
tomos de carbono (Taiz y Zeiger 2006). En el metabolismo primario los terpenos
funcionan como constituyentes de membranas, pigmentos fotosintticos, sustancias de
crecimiento y hormonas vegetales. La mayora de los terpenos se encuentran en resinas,
ltex, ceras y aceites, y le confieren toxicidad o indigestas como una medida de defensa
contra herbvoros (Staba 1982). Por ejemplo, los piretroides que ocurren en las hojas y
flores de especies de Chrysanthemum funcionan como insecticida; los cardenlidos de la
planta Digitalis purpurea tienen un sabor amargo y son extremadamente txicos para
animales superiores incluyendo a humanos; los aceites esenciales de la menta, el limn, la
albahaca y la salvia, contienen monoterpenos voltiles que dan un olor caracterstico al
follaje; las hormonas vegetales como las giberelinas y los brasinoesteroides las cuales
regulan el crecimiento; los esteroles que forman parte de la membrana celular; y los
carotenoides rojos, naranja y amarillos funcionan como accesorios en la fotosntesis y
protegen a los tejidos fotosintticos de la oxidacin
(Taiz y Zeiger 2006). Algunas
23
familias de plantas en las que los terpenos se encuentran en abundancia son la Asteraceae,
Chenopodiaceae, Taxaceae y Euphorbiaceae (Habermehl y Fliegner 1998).
4.5.2. Fenoles
Los fenoles son otras de las caractersticas comunes de las plantas, las cuales contienen una
gran variedad como flavonoides, estilbenos, taninos, cumarinas, lignanos y ligninas, y
varios funcionan como antibiticos y pesticidas naturales. Otros actan como seales
qumicas en la floracin y la polinizacin de las plantas, y en los procesos de simbiosis
vegetal como en la fijacin del nitrgeno y de parasitismo vegetal (Heldt y Heldt 2005).
Los polifenoles son de caractersticas aromticas y de fcil oxidacin en las plantas,
tienden a ser solubles en agua y usualmente se localizan en la vacuola. Econmicamente
son importantes porque contribuyen al sabor, aroma y color de los alimentos y bebidas, por
ejemplo, el aroma y el sabor del t estn relacionados con el contenido de polifenoles de la
hoja, as mismo, el sabor amargo de la cerveza se debe a su contenido de humulona,
mientras que el color rojo del vino es debido a la presencia de antocianinas (Piol et al.
2000). Las cumarinas pueden encontrarse en cubiertas de semillas, frutos, flores, races,
hojas y tallos, aunque en general las mayores concentraciones se encuentran en frutos y
flores, ya que juegan un papel importante en defensa antimicrobial, antialimentaria, filtro
de UV, y tiene propiedades inhibidoras de la germinacin (Croteau et al. 2000). Estos
compuestos se producen en varias plantas de las familias por ejemplo, Rutaceae,
Umbellifereae, Solanaceae y Clusiaceae (Ramawat 2007).
24
4.5.3. Alcaloides
Los alcaloides pertenecen a un grupo de metabolitos secundarios que se sintetizan de
aminocidos y contienen 1 o ms tomos de nitrgeno como constituyentes de
heterociclos. Son de naturaleza alcalina (bsica) y generalmente solubles en agua (Held y
Held 2005;).
Por otra parte, los alcaloides, a diferencia de la mayora de los otros productos naturales
constituyen el grupo de sustancias vegetales secundarias ms representativo, numeroso y
diverso (Taz y Zeiger 2006). Estos compuestos han sido utilizados desde hace mucho
tiempo por los humanos en forma de extractos de plantas como veneno, estimulantes, y
narcticos. La importancia de los alcaloides para la planta que los produce radica en que
constituyen reservorio de nitrgeno para s misma, a la vez, pueden actuar como sustancias
alelopticas o disuasorios alimentarios, contribuyendo as a la defensa vegetal o el ataque
de determinados patgenos o depredadores (Piol, et al. 2000). Por ejemplo, la nicotina del
tabaco se us como uno de los primeros insecticidas por el humano, y sigue siendo uno de
los ms efectivos; la cafena es una toxina efectiva para insectos, se encuentran en hojas y
semillas del cacao, caf, hierba de mate, y t (Croteau et al. 2000). Casi todos los
alcaloides son txicos para los humanos cuando se usan en cantidades suficientes, sin
embargo, a concentraciones bajas son tiles farmacolgicamente tales como la morfina, la
codena y la escopolamina, y otros, como la cocana, la nicotina y la cafena se usan como
estimulantes o sedantes (Taiz y Zeiger 2006).
25
4.6. Produccin de metabolitos secundarios en cultivos in vitro

Las plantas medicinales se han utilizado como una fuente importante de frmacos durante
miles de aos, y an son base de las prcticas sistemticas de la medicina tradicional en
muchos pases de todo el mundo (Pan et al. 2009). Adems, el descubrimiento de frmacos
de plantas medicinales sigue proporcionando nuevas e importante pistas contra varios
objetivos farmacolgicos incluyendo el cncer, el Alzheimer, la malaria, y el dolor, como
sealan Balunas y Kinghorn (2005). Dichos autores tambin mencionan que, a pesar de
que el descubrimiento de principios activos de plantas medicinales sigue proporcionando
una importante fuente de nuevos frmacos, hay numerosos desafos como la adquisicin de
materiales vegetales. Por otra parte, la produccin de metabolitos secundarios de plantas se
ha logrado por mucho tiempo a travs del cultivo solo de algunas plantas medicinales en
campo. Sin embargo, las plantas procedentes de biotopos especficos pueden ser difciles
de cultivar fuera de sus ecosistemas. Tambin ocurre que las plantas comunes no resisten
los grandes cultivos de campo, debido a la sensibilidad de patgenos, lo que ha llevado a
los cientficos y biotecnlogos a considerar el cultivo de tejidos y clulas vegetales como
una forma alternativa de producir los metabolitos secundarios correspondientes (Bourgaud
et al. 2001).
El primer gran avance de la tcnica del cultivo de tejidos ocurri con el establecimiento
exitoso de lneas celulares capaces de producir altos rendimientos de metabolitos
secundarios en cultivos de clulas en suspensin (Zenk 1978). Los productos de ms alto
inters son generalmente glucsidos y alcaloides. Junto a estos, esteroides, enzimas,
pigmentos, los cuales tambin, son de considerable inters. Tales son los casos de la
produccin de vinblastina y la vincristina en lneas celulares de Catharanthus roseus,
quinolina en Cinchona ledgeriana y diosgenina en cultivos de callos de
Dioscorea
26
deltoidea, entre otros (Constable et al. 1981; Scragg et al. 1990; Ravishankar y Grewal
1991). A nivel comercial se han logrado en cultivos in vitro la produccin industrial de
algunos compuestos como la shiconina, ginsensidos y berberina, en biorreactores con
escalas de 4000 a 75000 litros (Merillon 2007). Ambos productos se usan comnmente en
la industria de alimentos, el primero como colorante y el segundo como saborizante
(Calva-Calva et al. 2000). Existen en la literatura, reportes de una serie de cultivos de
clulas vegetales que producen una mayor cantidad de metabolitos secundarios que en las
plantas madre (Tabla 2) (Smetanska 2008).
Tabla 2. Rendimiento de compuestos de cultivos de clulas vegetales en comparacin con

las plantas madre.
Rendimiento (% PS)
Planta
Cultivo in vitro madre
Cultivo/plant
a
Compuesto
Especie
Ajmalicina
Catharanthus
roseus
0.3
3.3
Antraquinonas
Morinda citrifolia
18
2.2
Berberina
Coptis japonica
13
3.3
Ginsensidos
Panax ginseng
27
4.5
Nicotina
Nicotiana tabacum
3.4
1.7
Acido rosmarnico
Coleus blumei
27
Shiconina
Lithospermum
erythrorhizon
20
1.5
13.5
Ubiquinona-10
Nicotiana tabacum
0.036
0.003
12
Fuente: Smetanska (2008).
27
Por otra parte, tambin se ha incrementado el inters en las medicinas naturales que se
obtienen de las plantas o extractos de ellas. Los sistemas tradicionales de utilizar
medicamentos a base de plantas medicinales estn en aumento, lo que ha dado lugar a una
enorme presin sobre la biodiversidad y la destruccin de los biotopos de valor particular
en los pases en desarrollo (Neumann et al. 2009).
Las plantas son la fuente tradicional de muchos productos qumicos y farmacuticos. La
mayora de los productos naturales valiosos son resultado del metabolismo secundario de
las plantas, y poseen gran complejidad estructural de forma que la sntesis artificial es
difcil y costosa, por lo cual, el cultivo de clulas vegetales es una tcnica prometedora
para la produccin in vitro de metabolitos secundarios complejos (Barz y Ellis 1981;
Ravishankar y Venkataraman 1988). Algunos ejemplos de medicamentos derivados directa
o indirectamente de los vegetales son el paclitaxol (Taxol), la podofilotoxina y la
camptotecina, para tratar el cncer. La morfina, es utilizada como analgsico, y otros
productos semi-sinteticos (hormonas esteroidales) son derivados de la diosgenina
(Neumann et al. 2009).
28
5. ANTECEDENTES
5.1. Distribucin
5.1.1. Gnero Calophyllum
La familia Clusiaceae o Guttiferae consta de aproximadamente 50 gneros y 1200 especies
distribuidas en todo el mundo (Cronquist 1981). De acuerdo a Stevens (1980), el gnero
Calophyllum est constituido por 187 especies, todas ellas rboles tropicales, de las cuales
179 especies se encuentran en la Zona Indo-Malasia y solo 8 especies en el continente
Americano, distribuyndose principalmente en Mxico, Centroamrica y Sudamrica
(Figura 4). Entre las especies del gnero Calophyllum ms conocidas por su importancia
qumica y medicinal se encuentran: C. brasiliense, C. fragrans, C. inophyllum, C. dispar,
C. thwaitesii, C. moonii, C. cordato-oblongum, C. panciflorum, C. caledonicum, C.
mucigerum, C. teysmannii, C. venulosum, C. polyanthum, C. blancoi y C. enervosum. C.
brasiliense es la ms investigada en ste gnero por sus actividades biolgicas (CechinelFilho et al. 2009).
Figura 4. Distribucin geogrfica del gnero Calophyllum (http://www.discoverlife.org).
29
5.1.2. Calophyllum brasiliense

Calophyllum brasiliense Cambes es un rbol tropical que pertenece a la familia Clusiaceae.
Comnmente se conoce como Oc, bar, sakbalamt, barillo, cedro cimarrn y guaya, entre
otros, dependiendo de la regin donde se encuentre. C. brasiliense es la especie con mayor
distribucin en Amrica, y de su gnero, es el de mayor importancia medicinal. Se
encuentra en las selvas tropicales hmedas desde Brasil hasta Mxico (Figura 5). Esta
especie, es la nica de su tipo en Mxico, y se localiza desde el sur de Veracruz hasta
Quintana Roo y de Nayarit hasta Chiapas, a una altitud de 0 a 650 msnm (Niembro 1986).
Figura
5.
Distribucin
(http://www.discoverlife.org).
geogrfica
de
Calophyllum
brasiliense
De acuerdo a Pennington y Sarukhn (1968) y Niembro (1990), esta especie se describe

como un rbol caducifolio de 20 a 45 m de altura y un dimetro de 40 a 60 cm (Figura 6).
La corteza externa es fisurada de color pardo morena, interna de color crema rosado,
laminada, fibrosa, amarga y con exudado amarillo. Las hojas son decusadas, simples;
lminas de 6 x 2.5 a 14 x 5.5 cm, elpticas u oblongas, verde oscuras y brillantes en el haz,
30
verde plidas en el envs; glabras; nervadura central prominente en el envs; nervios

secundarios perpendiculares al central, numerosos y cerca uno del otro; de textura coricea.
Algunos rboles tiran las hojas en abril o mayo en las zonas ms secas. Las flores son
dioicas, en panculas axilares de 2 a 5 cm de largo, glabras; flores masculinas y bisexuales
perfumadas, spalos verdosos, glabros, ptalos de color crema amarillentos, estambres
numerosos y flores femeninas con el perianto semejantes a las masculinas, ovario spero
hinchado, estilo corto, estigma grande y obtuso, florece de julio a diciembre.
Figura 6. Ejemplar de C. brasiliense en los Tuxtlas, Veracruz, Mxico. a) planta adulta, b)

tronco fisurado, c) inflorescencia en forma de pancula, d) frutos inmaduros y e) semillas
maduras.
31
Los frutos son drupas de 2.5 a 3 cm de largo, ovoides o esfricas, verde amarillentas en la
madurez, de olor fragante, con endocarpio duro y una semilla grande por fruto. El
mesocarpio contiene fibras que se contraen y arrugan cuando se secan. Las semillas son
esfricas de 1.5 x 1.3 cm, blanco amarillentas, sin endospermo. Maduran generalmente de
octubre a diciembre.
De acuerdo a Cronquist (1981), la clasificacin taxonmica es la siguiente:
Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Divisin: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Dilleniidae
Orden: Theales
Familia: Clusiaceae
Gnero: Calophyllum
Especie: brasiliense
5.2. Usos tradicionales de Calophyllum brasiliense

El gnero Calophyllum comprende plantas a las cual se les ha atribuido gran cantidad de
usos en los trpicos (Figura 7).
Dentro de los usos tradicionales ms comunes del gnero C. brasiliense destacan los
siguientes:
Maderable: Se elaboran artculos torneados y artesanas. Se ha usado para sustituir al
cedro y la caoba. Su principal producto es la madera de excelente calidad que se usa para
hacer quillas, mstiles, costillas y armaduras de embarcaciones as como para muebles
finos, triplay, parquet, puentes, carroceras, armazones, tejamanil, chapas, ebanistera,
32
durmientes, decoracin de interiores, partes de molinos, puertas y ventanas, telares,

pasamanos, huellas y descansos, mangos para cubiertos. La madera es especialmente til
para los platos de comida y calabazas, ya que no imparte algn sabor a los alimentos
(Stevens 1980; Dweck y Meadowsy 2002).
Figura 7. Productos artesanales a base de madera, y ltex como uso medicinal del gnero
Calophyllum (Friday y Okano 2006).
Aromatizante: La corteza contiene un aceite esencial semejante al del sndalo.

Combustible: El aceite que contienen las semillas se utiliza con fines de iluminacin.
Forrajero: En algunos pases se usa como alimento para ganado, adems son fuente de
alimento para una gran cantidad de animales del bosque.
Colorante: La corteza, hervida por 25 minutos produce un tinte de color pardo, excelente
en la tincin de fibras naturales.
Medicinal: En algunas comunidades rurales en Mxico se ha extrado el aceite de las
semillas, y se ha usado para curar enfermedades cutneas. La resina que mana del tronco se
33
conoce como blsamo de Mara y se le atribuyen propiedades medicinales para disminuir

la comezn en la piel, cicatrizar ulceras, diurticas, inflamacin de ojos e insolacin
(Niembro 1986; Dweck y Meadowsy 2002). En particular, las hojas y corteza de C.
brasiliense frecuentemente se usan en la medicina tradicional para tratar diferentes
enfermedades como dolor, infecciones, infusiones para el asma, y como laxantes (Oliveira
1994). Tambin se han usado para tratar la bronquitis, disturbios gstricos y hepticos
(Sartori et al. 1999), diabetes e hipertensin (Duke y Martnez 1994), diarrea y herpes
(Rutter 1990), as como, reumatismo, varices, hemorroides y lceras crnicas (Correa
1978).
5.3. Metabolitos secundarios del gnero Calophyllum y su actividad biolgica

El gnero Calophyllum es considerado con un rico potencial para obtener nuevos
compuestos especialmente con actividades qumicas y biolgicas y que puede contribuir al
desarrollo de la fitoterapia. Las plantas del gnero Calophyllum contienen principalmente
cumarinas, xantonas, flavonoides, esteroides, y triterpenos, algunos de ellos con actividad
biolgica relevante (Tabla 3) (Cechinel-Filho et al. 2009).
Varios compuestos del gnero Calophyllum han sido estudiados desde el punto de vista
farmacolgico, para contrarrestar algunas enfermedades como el cncer, el cual es una de
las patologas comunes en todo el mundo. Al respecto, se ha demostrado que este gnero
contiene compuestos como el calofilolido y mammea B/BB, potentes contra lneas
celulares de leucemia humana (HL-60) (Ito et al. 2006) y clulas cancergena KB de la
nasofaringe (Guilet et al. 2001). Por otra parte, la cumarina GUT-70 inhibi el crecimiento
de otras clulas de leucemia (BV173) (Kimura et al. 2005). Las mammeas A/BA y A/BB,
34
cumarinas tipo mammea han destacado por tener propiedades altamente citotxicas contra
lneas tumorales PC3 (prstata), K562 (linfoma) y U251 (sistema nervioso central) (ReyesChilpa et al. 2004).
Tabla 3. Actividad biolgica y principales clases de compuestos del gnero Calophyllum

Especie
Actividad biolgica
C. brasiliense
C. dispar
C. thwaitesii
Analgsico, antiviral
Antiulceregnico,
anticancergeno
Antibacterial, molusquicida
Desconocida
Antitumoral, antiviral
Citotxica, antibacterial
Desconocida
Desconocida
C. moonii
C. cordato-oblongum
C. panciflorum
C. caledonicum
C. mucigerum
C. teysmannii
C. venulosum
C. polyanthum
C. blancoi
C. enervosum
Desconocida
Desconocida
Desconocida
Antifngico, antimalaria
Antileucmico, insecticida
Desconocida
Desconocida
Desconocida
Desconocida
Antibacterial
C. fragrans
C. inophyllum
Tipo de compuesto
Terpenos,
coumarinas,
xantonas
Cromanonas, flavonoides
Triterpenos
Xantonas
Coumarinas, Xantonas
triterpenos
Coumarinas
Xantonas, terpenos
Xantonas,
biflavonoides
triterpenos, esteroides
Xantonas, biflavonoides
Xantonas, biflavonoides
Xantonas
Xantonas, coumarinas
Xantonas
Biflavonoides
Coumarinas, cido benzoico
Cromanonas, xantonas
Xantonas, cetonas
Fuente: Cechinel-Filho et al. 2009.
Varias familias de plantas producen diversos metabolitos secundarios que poseen actividad
para detener la infeccin por el VIH (Harnett et al. 2005; Mi-Jeong et al. 2002; Ovenden et
al. 2004). En particular, la familia Clusiaceae, de la cual destaca el gnero Calophyllum, es
una de las fuentes actuales para este tipo de investigacin, ya que produce cumarinas cuyos
35
metabolitos tienen actividad significativa contra el VIH-1 (Dharmaratne et al. 2002;

McKee et al. 1996, Reyes-Chilpa y Huerta-Reyes 2009).
En una colecta de hojas de C. lanigerum var. Austrocoriaceum realizada en Malasia en
1987, se aisl por primera vez las cumarinas calanlido A y calanlido B, en el cual se
demostr que ambos compuestos fueron altamente activos para inhibir la TR del VIH-1
(Kashman et al. 1992). Posteriormente, en un esfuerzo por identificar una fuente natural
suficiente y sostenible del calanlido A, se llevaron a cabo estudios qumicos y biolgicos
del exudado de ltex de esta misma especie, en el cual no se encontr el calanlido A.
Mientras que en los extractos de ltex de C. teysmannii var. inophylloide, se observ de
forma abundante el calanlido B (costatlido) y que actualmente est siendo evaluado
como una alternativa posible al calanlido A para el desarrollo de frmacos anti-VIH
(Fuller et al. 1994; Buckheit et al. 1999). Patil et al. (1993) menciona que otras cumarinas
como el inofilum B y el inofilum P, aisladas de C. inophyllum Linn, fueron activos contra
la TR del VIH-1 en cultivos de clulas infectadas, aunque otros compuestos relacionados
como el infilum A, C, D, y E, incluyendo el cido caloflico fueron menos activos o
totalmente inactivos.
Para el caso particular de Mxico, slo existe la especie, C. brasiliense Cambes. En
estudios realizados en el Instituto de Qumica de la UNAM, se evaluaron extractos de
diferentes colectas de hojas de C. brasiliense, los cuales revelaron la existencia de dos
quimiotipos, es decir, tienen dos diferentes composiciones qumicas en sus hojas (HuertaReyes et al. 2004 y Reyes et al. 2004). stos se distribuyen en las zonas hmedas del pas
(Figura 8) (Fonseca 2007).
36
Figura 8. Distribucin geogrfica en Mxico de los quimiotipos 1, 2 y 3 de C. brasiliense

(Fonseca 2007).
El primer quimiotipo (quimiotipo 1) produce cumarinas tipo mammeas (Figura 9) y tienen

alta actividad citotxica en clulas tumorales humanas in vitro (Reyes-Chilpa et al. 2004).
El segundo quimiotipo (quimiotipo 2) contiene compuestos minoritarios dipirano
cumarinas tetraccilicas (Figura 10), como el (+)-calanlido A, el (-)-calanlido B y el (+)calanlido C, los compuestos mayoritarios son cromanonas, principalmente el cido
apetlico de los cuales, los dos primeros son inhibidores potentes in vitro de TR del VIH-1
(Huerta-Reyes et al. 2004). Sin embargo, el contenido de calanlidos es bajo, mientras que
los compuestos ms abundantes son cromanonas, de las cuales el cido apetlico es el
compuesto mayoritario y tiene tambin actividad contra hongos fitopatgenos y
antibacterial (Aguilar-Bauelos 2005; Cottiglia et al. 2004). Otro estudio realizado por
Fonseca (2007) revel la presencia de un tercer quimiotipo (Figura 8) con un perfil
cromatogrfico diferente a los quimiotipos 1 y 2, y que actualmente estn en estudio.
37
Mammea A/BA, R1
Mammea A/BB, R2
Mammea C/OA, R1
Mammea C/OB, R2
Mammea B/BA, R1 ciclo F

Mammea B/BB, R2 ciclo F
Mammea B/BA, R1
Mammea B/BB, R2
Figura 9. Compuestos qumicos aislados de hojas de Calophyllum brasiliense (quimiotipo

1). (Reyes-Chilpa et al. 2004).
38
(+)- Calanlido A
(-)- Calanlido B
(-)- Calanlido C
cido apetalico
Figura 10. Compuestos qumicos aislados de hojas de Calophyllum brasiliense (quimiotipo

2) (Huerta-Reyes et al. 2004).
Las xantonas de la madera de C. brasiliense inhiben en un rango de 21-83% el crecimiento

del micelio de Postia placenta, un hongo xilfago comn (Reyes et al. 1997). Adems, el
cido apetalico, un compuesto aislado de las hojas, present actividad contra hongos
fitopatgenos Curvularia lunata y Rhizoctonia repens Aguilar-Bauelos (2005). En otro
estudio, se demostr que compuestos aislados de extractos metanlicos de races, tallos,
hojas, flores y frutos, en su mayora tuvieron efectos positivos en contra de bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas (Pretto et al. 2004). Los extractos orgnicos de diversas
especies mexicanas fueron evaluadas para determinar su actividad antimicrobiana,
especficamente contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus, se encontr que las
39
mejores son cinco plantas, dentro de las que destaca C. brasiliense (Yasunaka et al. 2005).
Por otra parte, en una evaluacin in vitro de Leishmania amazonensis, un protozoario que
causa leishmaniosis, se encontr que el compuesto aislado mammea A/BB, una cumarina
de C. brasiliense tuvo actividad en contra de este organismo en 50-90% (Brenzan et al.
2008, 2007). Por lo tanto, estos estudios demuestran el por qu del uso tradicional de
extractos de la planta en contra de afecciones antimicrobianas. Otro estudio reciente,
relacionado a problemas gstricos, se demostr que los extractos de esta especie, evaluados
en ratas de manera in vitro e in vivo, presentaron actividad contra la bacteria Helicobacter
pylori, validando as el uso popular de esta planta para tratamientos antiulcerosos (Souza et
al. 2009).
5.4. Cultivo in vitro del gnero Calophyllum

Aunque el gnero Calophyllum parece ser una fuente prometedora de frmacos anti-VIH,
pocos trabajos se han realizado sobre estas especies en lo que a cultivos in vitro se refiere,
e inicialmente fueron enfocado a estudios de micropropagacin debido a que la especie se
encuentra en zonas restringidas, aunado a esto, la explotacin de bosques (Nair y Seni
2003), por lo que sus poblaciones y sus hbitat estn desapareciendo. En un estudio sobre
micropropagacin estos mismos autores reportaron alta eficiencia y multiplicacin in vitro
de C. apetalum quienes obtuvieron un 85% supervivencia ex situ de las plantas
micropropagadas. En otro trabajo relacionado en C. inophyllum tambin se han obtenido
resultados favorables de micropropagacin, del cual se han obtenido porcentajes de
supervivencia hasta del 72% en condiciones de campo (Thengane et al. 2006). Por otra
parte, debido a la importancia de sta planta por sus propiedades medicinales contra el
40
VIH, se han realizado trabajos recientemente sobre la produccin de metabolitos

secundarios en cultivo in vitro del gnero Calophyllum. Los estudios realizados en C.
inophyllum fueron enfocados a la produccin de dipiranocumarinas anti-VIH en cultivos
de callo y cultivos de clulas suspensin y los resultados fueron prometedores al obtener
altas cantidades de inofilum B, inofilum D, calofillido, inofilum A, inofilum P, y el
inofilum C, con 40.5, 44.7, 45.2, 73.7, 141.3 y 142.1 mg/100 g de peso fresco de callo,
respectivamente (Pawar et al. 2007; Pawar y Thengane 2009). Sin embargo, hasta el
momento no se han realizado trabajos sobre cultivos in vitro de la especie C. brasiliense.
6. JUSTIFICACIN
Tanto en Mxico como el mundo, el VIH sigue aumentando ao tras ao, y la produccin
de los frmacos para combatir el SIDA son cada vez ms costosos, lo que ha motivado a la
exploracin de nuevos frmacos y mtodos para su produccin. Algunos estudios actuales
se estn enfocando a la investigacin de productos naturales de algunas plantas que
producen diversos compuestos para detener la infeccin por el VIH. La familia Clusiaceae,
en especial el gnero Calophyllum ha tenido mayor relevancia por contener compuestos
con buena actividad anti VIH-1 como son los calanlidos. Sin embargo, estudios realizados
han demostrado que este tipo compuestos se encuentran en concentraciones muy bajas, por
lo cual, se requieren grandes cantidades de materia seca para obtener mnimas cantidades
(menos del 1%). Por otra parte, sta especie posee amenaza potencial por la disminucin
de la poblacin debido a diferentes factores biticos y factores abiticos. Los sistemas
tradicionales de utilizar medicamentos a base de plantas medicinas, estn aumentando en
todo el mundo. Esto ha dado lugar a una enorme presin sobre la biodiversidad, y la
41
destruccin de los biotopos de valor particular en los pases en desarrollo que participan en
el cumplimiento de las exigencias de los mercados mundiales. La tecnologa del Cultivo de
Tejido Vegetales podra ser una herramienta til para superar estas limitaciones y
proporcionar nuevos medios para la produccin de metabolitos secundarios. Recientemente
se ha realizado un estudio sobre la produccin in vitro de distintos tipos de inofilum en C.
inophyllum contra el VIH; sin embargo no existen estudios relacionados para la produccin
de calanlidos, utilizando cultivo de tejidos de C. brasiliense.
7. OBJETIVOS
7.1. Objetivo general
Establecer las condiciones para el establecimiento de cultivos de callo de C. brasiliense
Cambes capaces de producir compuestos inhibidores del HIV-1.
7.2. Objetivos particulares

Evaluar diferentes tipos de explantes (hojas juveniles y semillas maduras) para la
induccin de callo.
Evaluar distintos reguladores de crecimiento vegetal (auxinas: ANA, AIB, 2,4-D y
picloram; y citocininas: KIN, BAP y TDZ) en la induccin de callo en cultivos de C.
brasiliense.
Seleccionar lneas celulares de callos de C. brasiliense a partir de cultivos de ambos tipos
de explantes.
Identificar y cuantificar los metabolitos secundarios (calanlidos) inhibidores del VIH-1.
42
8. HIPTESIS
C. brasiliense es una planta que de forma natural produce calanlidos, metabolitos
secundarios que poseen una fuerte actividad contra la reversa transcriptasa del VIH-1, por
lo que se espera que los cultivos in vitro de callo de sta especie retengan la capacidad de
sintetizar dichos metabolitos.
9. MATERIALES Y MTODOS
9.1. Material vegetal
Se colectaron frutos y semillas de C. brasiliense Cambes, en el mes de noviembre del
2005, 2006 y 2007 en la regin de Los Tuxtlas, en la comunidad de La Laguna del
municipio de Catemaco, Estado de Veracruz, Mxico. Un muestra de la planta previamente
identificada y registrada con el nmero 14425 se deposit en el herbario del IMSS (HuertaReyes et al. 2004).
9.2. Establecimiento de plntulas

Las semillas sin endocarpio y sin tegumento fueron desinfectadas con una solucin
fungicida de Bravo 720 (tetracloroisoftalonitrilo) al 27% (v/v) durante una hora y fueron
germinadas bajo condiciones de sombra en contenedores de plstico con agrolita y peat
moss como sustrato a una relacin 1:1, respectivamente. Cuando las plntulas alcanzaron
entre 10 y 15 cm de altura (aproximadamente 3 meses despus), se transfirieron a bolsas
negras de polietileno de 20 x 30 cm conteniendo una mezcla de agrolita, peat moss y tierra
43
negra (1:1:1). Las plantas se condicionaron y crecieron en el invernadero localizado en la

Universidad Autnoma Metropolitana Campus Iztapalapa (UAM-I).
Una vez que las plantas se climatizaron y empezaron a crecer nuevos brotes, las hojas
inmaduras de aproximadamente 5 cm de longitud se cortaron de la planta para ser usadas
como recurso de explantes para el cultivo in vitro (Figura 11).
Figura 11. Planta joven de C. brasiliense que muestra hojas inmaduras usadas para el
cultivo in vitro.
9.3. Evaluacin de medios de cultivo, antioxidantes

Se evaluaron diferentes medios de cultivo como el MS (Murashige y Skoog 1962), B5
(Gamborg et al. 1976), y WPM de Lloyd y McCown (1981), sin RCV (Tabla 1). Adems,
se evaluaron diferentes tipos de compuestos considerados como antioxidantes: a) cido
ctrico 100 mg l-1 + cido ascrbico 50 150 mg l-1, b) carbn activado 250 500 mg l-1, y
c) polivinilpirrolidona (PVP) 250 500 mg l-1. Los cultivos se incubaron en condiciones
44
de oscuridad total con luz (luz fluorescente blanca a 50 mol m-2 s-1) con un fotoperodo
de 16 horas. Todos los tratamientos se hicieron con 4 repeticiones cada uno.
9.4. Condiciones aspticas

Las hojas inmaduras y semillas maduras se desinfectaron de manera superficial con una
solucin jabonosa por 5 min, seguida por una inmersin en etanol al 70% (v/v) por 30 s.
Posteriormente, a baja y con agitacin constante, las hojas fueron sumergidas en una
solucin de hipoclorito de sodio al 0.6% (v/v) por 15 min, agregando tres gotas de Tween20 por cada 100 ml de solucin preparada. Para las semillas usadas como explantes, el
tratamiento de desinfeccin fue un tanto diferente, stas se sumergieron por 1 h en una
solucin fngica de Bravo 720 (tetracloroisoftalonitrilo) al 27% (v/v), seguido por una
inmersin de hipoclorito de sodio al 4.2% (v/v) durante 1 h.
Posteriormente, en el interior de una campana de flujo laminar (Figura 12), previamente
desinfectada, ambos tipos de explantes fueron lavados tres veces con agua destilada
esterilizada. Una vez desinfectados, los explantes se cortaron dentro de cajas petri
conteniendo solucin antioxidante compuesta por cido ctrico y cido ascrbico (100 mg
l-1 + 150 mg l-1, respectivamente). Las hojas se cortaron en segmentos de 5 x 5 mm, y las
semillas se cortaron en cuatro secciones iguales. Despus, los segmentos se sumergieron en
soluciones nuevas de antioxidante en vasos de precipitado, realizando 3 cambios
peridicos de dicha solucin durante 3 o 4 min para eliminar la mayor parte del ltex
exudado durante los cortes. Finalmente, 3 4 explantes se depositaron en frascos tipo
Gerber contenido 25 ml de medio de cultivo, previamente esterilizado.
45
Figura 12. Explantes de C. brasiliense inmersos en solucin antioxidante previo a la

siembra: a) hojas, b) semillas.
9.5. Medio de cultivo y condiciones de incubacin

El medio de cultivo utilizado fue el Woody Plant Mdium (WPM) de Lloyd y McCown
(1981), el cual fue suplementado con 2 % de sacarosa (p/v), 10 mg l-1 de cido ctrico, 150
mg l-1 de acido ascrbico, 250 mg l-1 de PVP, y 0.18% de phytagel (p/v), (Sigma, St. Louis,
MO, USA). Todos los cultivos se incubaron a 25 2C en oscuridad total.
9.6. Induccin de callo

Para inducir la respuesta de callo en los explantes, diferentes concentraciones y
combinaciones de RCV (citocinina y auxinas) se incorporaron al medio del cultivo: a) KIN
(0.00, 0.46, 2.32, 4.65, 6.97, 9.30 y 11.63 M) + 2,4-D (0.00, 0.45, 2.26, 4.53, 6.8, 9.06 y
11.32 M) + ANA (0.00, 0.53, 2.68, 5.37, 8.05, 11.74 y 13.42 M); b) BAP (0.0, 4.44
and 8.88 M) + AIB (9.80, 19.60 y 29.40 M); c) BAP (8.88 M) + PIC (8.28, 16.56 y
24.84 M) + ANA (10.74, 21.48 y 32.22 M); y d) TDZ (0.04, 0.45, 4.54, 13.62 y 27.24
M). Finalmente, el valor del pH se ajust a 5.8, y el medio de cultivo se esteriliz a una
46
temperatura de 121C durante 18 min. Los explantes de hojas y semillas se evaluaron

usando los tratamientos descritos arriba, con excepcin del inciso (a), que no fue evaluado
en los explantes de semilla. Para cada tratamiento se usaron tres frascos. La respuesta de
induccin de callos o races desarrollados de los explantes, se expresaron como un
porcentaje del total de los explantes evaluados despus de 6 o 9 semanas. Los tratamientos
que indujeron los mejores porcentajes de callos de explantes de semilla fueron
seleccionados como lneas celulares, los cuales se siguieron subcultivando en sus
respectivos medios de induccin y RCV. Las transferencias a medio de cultivo fueron
realizadas en periodos de 15 das para los primeros cuatro ciclos de subcultivos,
posteriormente las transferencias se hicieron cada mes durante 10 ciclos. Despus de los
ciclos de subcultivo, se realiz el anlisis por HPLC para cuantificar la produccin de
metabolitos de los callos.
9.7. Preparacin de extractos y muestras para el anlisis por HPLC

Las muestras frescas de hojas y callos se secaron a 60C en una estufa y posteriormente se
pulverizaron. Las muestras secas (500 mg) se extrajeron usando cinco ciclos de hexano
por 24 h a temperatura ambiente. Posteriormente las muestras se filtraron, se mezclaron y
se concentraron bajo presin reducida en un Rotavapor (Buchi RE-111; Buchi
Laboratoriums-Tecnick AG, Flawil, Switzerland). Las muestras concentradas se secaron
por evaporacin del disolvente restante a temperatura ambiente. Los compuestos de
referencia calanlido B, calanlido C y cido apetlico fueron proporcionados por el Dr.
Ricardo Reyes Chilpa del Instituto de Qumica de la UNAM. Antes de iniciar el anlisis
por HPLC, se prepararon soluciones de 0.75 mg ml-1 de los compuestos de referencia con
47
acetonitrilo (3 mg/4 ml). Adems, con el fin de obtener la curva de calibracin, se hicieron
diluciones de cada uno de los compuestos de referencia preparados (10, 25, 50 y 100 mg
ml-1). Cada muestra de biomasa extrada de callos provino de un frasco. Mientras que para
las muestras de las hojas de las plantas de invernadero se tomaron 3 hojas diferentes por
cada repeticin. Ambos tipos de muestras con un total de 3 repeticiones.
9.8. Anlisis por HPLC

El contenido de calanlido B, calanlido C y cido apetlico se determin en un equipo
Waters HPLC equipado con una bomba binaria 1525 (Waters Co., MA, EE.UU), una
columna C18 kromasil (250 x 3 mm, tamao de partcula 5 m) y un detector de absorcin
de doble longitud de onda (2487 DWAD) (Waters
Co., MA, USA). La fase mvil
consisti de una mezcla de acetonitrilo (60%) y agua (40%), la cual se bombeo

isocrticamente durante 45 min a un flujo de 1 ml por min. La deteccin se realiz
utilizando una longitud de onda de 284 nm con DWAD. El volumen de inyeccin fue de
20 l. Las muestras y los compuestos de referencia se analizaron de la misma forma. Cada
solucin preparada se pasaron por un filtro de nylon de 0.45 m (Acrodisc, 25 mm Syringe
Filter), antes de ser inyectada. Para procesar los datos cromatogrficos se us el software
Waters Breeze 3.3. Para identificar y cuantificar los calanlidos y el cido apetlico de las
muestras, se utilizaron los datos de los respectivos tiempos de retencin y las reas de los
picos de las curvas de calibracin. Cada muestra se inyect tres veces.
48
9.9. Anlisis estadstico

Para el anlisis estadstico se us el software SAS 9.0 (SAS Institute Inc, 2002). Los datos
obtenidos de los porcentajes de induccin callos y la cuantificacin de calanlidos y el
cido apetlico se sometieron a un anlisis de varianza (ANOVA), seguido por una prueba
de comparacin de medias mltiple Tukey-Kramer. Los valores de P menores de 0.05 se
consideraron como significativos. Cada tratamiento se realiz con al menos tres
repeticiones.
10. RESULTADOS Y DISCUSIN

10.1. Establecimiento de plntulas
Se estima que los frutos colectados tenan aproximadamente un mes de maduracin, puesto
que tenan una coloracin amarillenta (caracterstica de madurez). Adems, otra cantidad
de semillas (sin mesocarpio) fueron recolectadas directamente del suelo. Estas
caractersticas pudieron haber influido en el bajo porcentaje de germinacin obtenido
(36%). Por otra parte, se menciona que las temperaturas en donde se desarrolla sta especie
oscilan entre 25 y 28 C (Flores 2002). Adems, para obtener una mejor germinacin y
establecimiento de plntulas de C. brasiliense la temperatura optima debe ser de 30C
(Nery et al. 2007). Este mismo autor menciona que las cubiertas seminales como el
endocarpo y/o el tegumento no influyen estadsticamente en la germinacin, pero hay una
tendencia a reducirla si la semilla es sembrada con alguno de estas cubiertas. En relacin a
esto, las semillas en el presente trabajo fueron sembradas sin cubiertas seminales, pero no
hubo un control sobre las temperaturas en el invernadero, lo que cual pudo tambin haber
influido en el porcentaje de germinacin.
49
La emergencia radicular ocurri aproximadamente a los 20 das y el epicotilo apareci a

los 44 das despus de la siembra como se muestra en la Figura 13.
Figura 13. Establecimiento de plntulas de C. brasiliense en invernadero. a) semilla sin

cubierta, b) emergencia radicular a los 20 das, c) emergencia epicotiledonar a los 44 das,
d) plntulas de 3 meses de edad, y e) plntulas de un 1 ao de edad.
10.2. Evaluacin de compuestos antioxidantes y medios de cultivo

Durante el establecimiento de cultivos aspticos (sin reguladores de crecimiento), se
observ una apariencia de color marrn oscuro en todos los explantes despus de 1 semana
del cultivo. A las dos semanas, todos los explantes murieron. Para tratar de disminuir este
problema, se realizaron subcultivos frecuentes. Sin embargo, esta tcnica no evit
completamente el problema de oxidacin de los explantes, tal como lo encontrado por FettNeto et al. (1992). El cido ctrico y cido ascrbico, se usan como antioxidantes, en tanto
50
que el carbn activado, posee una red muy fina de poros, con una gran superficie interna,
en la cual puede absorber todo tipo de sustancias como son: pigmentos txicos, marrones,
y negros (compuestos de tipo polifenol oxidados y taninos), pero tambin puede absorber a
los RCV, vitaminas, y algunos minerales como Zn, Fe, etc. Las concentraciones de uso del
carbn activado van de 0.2-3% p/v (Pierik 1990). El PVP es un polmero, que al ser
adicionado al medio en concentraciones de 250-1000 mg l-1 absorbe sustancias de tipo
fenlico (Johansson 1983; Tomas 2008).
Se observ una clara diferencia de los tratamientos, siendo la condicin de oscuridad en la
que se present la mayor supervivencia de los explantes, principalmente cuando se
adicionaron 250 mg l-1 de PVP al medio de cultivo, obteniendo un 87.5% de supervivencia
(Figura 14). Es probable que los metabolitos secundarios, como las cumarinas, u otros
compuestos producidos por C. brasiliense, hayan sido liberados de la vacuola debido a las
heridas de la hoja (Buchanan et al. 2000, lo que pudo ser toxico a los explantes; Wink
1997). Se sabe tambin que, las condiciones de crecimiento ptimo de los cultivos in vitro
dependen de las condiciones nutricionales, y que pueden variar entre especies (Bhojwani y
Razdan 1983). En cuanto a los medios de cultivo utilizados, se observ que el WPM fue el
que tuvo el mejor efecto sobre el crecimiento de los explantes. Estos explantes mostraron
un aspecto liso, suave, con alargamiento y mantuvieron su coloracin verdosa. Por el
contrario, en los explantes cultivados en los otros medios de cultivo (B5 y MS), se observ
un aspecto duro, quebradizo y sin crecimiento o alargamiento. Por lo tanto, el WPM se
seleccion como el medio de cultivo ms apropiado para C. brasiliense en la induccin de
callo con RCV. Estos resultados son similares a los publicados por Pawar et al. (2007) en
C. inophyllum quien encontr que con el WPM encontr una mejor respuesta en la
induccin de callos.
51
100.0
87.5 a
90.0
Sobrevivencia de explantes (%)
80.0
70.0
62.5 b
62.5 b
60.0
50.0 c
50.0
50.0 a
37.5 d
40.0
31.3 bc
31.3 bc
37.5 d
50.0 c
37.5 b
31.3 bc
30.0
25.0 c
25.0 c
20.0
10.0
0.0
Testigo
A. citrico + A.
ascorbico
(100+50)
A. citrico + A.
Carbn
Carbn
ascorbico
activado (250) activado (500)
(100+150)
PVP (250)
PVP (500)
Compuestos antioxidantes (mg l-1)

Luz
Oscuridad
Figura 14. Porcentaje de sobrevivencia de explantes de hoja de C. brasiliense con

diferentes compuestos antioxidantes y condiciones de incubacin. Media + DS con la
misma letra en barras del mismo color no son estadsticamente diferentes al nivel de 5% de
probabilidad.
10.3. Induccin de cultivos callo

Cuando se analiz el efecto de RCV, se observ que el tratamiento del control (sin
reguladores de crecimiento), no tuvo induccin de callo o alguna respuesta en los explantes
de hoja o de semilla, los cuales se observaron de aspecto quebradizo y sin crecimiento
(Figura 15a, 16a), en tanto que otros tratamientos con RCV indujeron respuesta a callo y
en algunos indujeron rizognesis directa. En los explantes de hoja, los tratamientos donde
se combin KIN + (2,4-D ANA) favorecieron la induccin de callo a partir de los 40 das
de cultivo. El tratamiento con KIN + 2,4-D indujo un callo verde friable, que se observ en
toda la superficie de los explantes de hoja (Figura 15b). Despus de 2 semanas, las callos
52
se tornaron de un aspecto amarillento (Figura 15c). El tratamiento con KIN + ANA indujo
un callo de aspecto compacto y blanco (Figura 15d) o raz (Figura 15e) en los bordes de
corte del explante. En tanto que la races inducidas de los explantes de hoja dieron origen a
callo semifriable de color caf, (Figura 15f) despus de 3 semanas (61 das de cultivo).
Figura 15. Respuestas inducidas de callo y raz en explantes de hoja de C. brasiliense, bajo
tratamientos de RCV: a) Explantes sin reguladores (control); b) callo verdoso friable
inducido de explantes de hoja con KIN 4.65 M + 2,4-D 4.53 M despus de 40 das de
cultivo; c) callo desarrollado a partir de (a), dos semanas despus; d) callo compacto; e)
rizognesis directa en explantes de hoja con KIN 0.46 M + ANA 5.37 M, despus de 40
das de cultivo; f) callo semifriable desarrollado a partir de (e), tres semanas despus.
En trminos generales, las auxinas 2,4-D o ANA tuvieron un mayor efecto que las
citoquininas sobre la induccin de callo en los explantes de hoja (Tabla 4). Por otra parte,
cuando se compar el efecto de la induccin de callo entre las auxinas 2,4-D y ANA, no se
encontraron diferencias estadsticas entre stas. En las tres concentraciones bajas de 2,4-D
o ANA (0.45, 2.26 y 4.53 M o 0.53, 2.68 y 5.37 M, respectivamente), evaluadas como la
53
nica fuente de RCV, los explantes de hoja mostraron una induccin de callo de 50-67%
(Tabla 4). Cuando se evaluaron las tres concentraciones ms bajas de KIN (0.46, 2.32 y
4.65 M) sin auxina, hubo porcentajes de induccin de callo de 29-35.25% en los
explantes de hoja (Tabla 4). Estos resultados pueden deberse al hecho de que las auxinas
estn implicadas en muchos aspectos del proceso de crecimiento y desarrollo de las plantas
(Benjamins y Scheres 2008; Vanneste y Friml 2009). El tratamiento con 4.65 M de KIN
tuvo una influencia significativa en la formacin de callo, una respuesta que ocurri en
cada concentracin evaluada de la auxina 2,4-D (Tabla 4). Sin embargo, la induccin de
callo ms alta (80.67%) se obtuvo cuando la KIN se combin con ANA en concentraciones
de 0.46 M y 5.37 M, respectivamente (Tabla 4). Adems, estos callos mostraron un
mejor desarrollo que a los obtenidos con los tratamientos de KIN + 2,4-D (Tabla 4). Los
tratamientos con KIN + (2,4-D ANA) que indujeron los mayores porcentajes de callo en
explantes de hoja fueron evaluados para los explantes de semilla, sin embargo, no se
observ ninguna respuesta. Se esperaba que los explantes de semilla produjeran
significantes porcentajes de induccin de callo como se observ en los explantes de hoja,
ya que las clulas pertenecientes a las semillas estn menos diferenciadas que las de hojas.
Debido a la insatisfactoria respuesta de induccin obtenidas en los explantes de semilla y
debido al escaso material vegetal, no se hicieron ms intentos con el resto de los
tratamientos de KIN, 2,4-D y ANA (inciso a).
54
Tabla 4. Porcentaje de induccin de callo en explantes de hojas inmaduras de C.

brasiliense Cambes con diferentes concentraciones y combinaciones de KIN y 2,4-D
KIN y ANA despus de seis semanas de cultivo.
RCV (M)
KIN
0
0
0
0
0.46
0.46
0.46
0.46
2.32
2.32
2.32
2.32
2.32
4.65
4.65
4.65
4.65
4.65
4.65
4.65
6.97
6.97
6.97
6.97
9.30
9.30
9.30
9.30
11.62
11.62
11.62
2,4-D
0
0.45
2.26
4.53
0
0.45
2.26
4.53
0
0.45
2.26
9.06
11.32
0
0.45
2.26
4.53
6.80
9.06
11.32
4.53
6.80
9.06
11.32
0.45
2.26
4.53
6.80
4.53
6.80
9.06
Induccin de callo
(%)
RCV (M)
ANA
Induccin de callo
(%)
0.00 0.00k
52.84 4.01fg
67.00 0.00bcd
50.00 0.00fg
29.00 5.66ij
71.00 5.66bc
52.84 4.01fg
47.17 4.01g
35.25 3.18hi
66.85 0.24bcd
62.67 6.13de
0.00 0.00k
0.00 0.00k
33.00 0.00hi
52.67 3.77fg
64.75 3.18cd
72.34 2.12b
50.00 0.00fg
29.00 5.66ij
37.34 6.13h
37.34 6.13h
25.00 0.00j
25.00 0.00j
25.00 0.00j
66.84 0.24bcd
66.84 0.24bcd
57.00 1.88ef
37.34 6.13h
37.34 6.13h
25.00 0.00j
25.00 0.00j
0
0.53
2.68
5.37
0
0.53
2.68
5.37
0
5.37
8.05
11.74
13.42
0
0.53
2.68
5.37
8.05
11.74
13.42
0.53
2.68
5.37
11.74
2.68
5.37
8.05
11.74
0.53
2.68
5.37
0.00 0.00k
54.25R 6.01fg
62.50 5.89de
50.00 0.00fg
29.00 5.66ij
50.00 0.00fg
64.00 3.77cd
80.67R 3.77a
35.25 3.18hi
37.34 6.13h
50.00 0.00fg
25.00 0.00j
57.00 1.88ef
33.00 0.00hi
0.00 0.00k
0.00 0.00k
0.00 0.00k
57.00 1.88ef
0.00 0.00k
50.00 0.00fg
25.00 0.00j
64.75 3.18cd
64.75R 3.18cd
50.00 0.00fg
0.00 0.00k
0.00 0.00k
0.00 0.00k
25.00 0.00j
37.50 5.89h
67.00 0.00bcd
64.75R 3.18cd
Solo se presentan los tratamientos que fueron capaces de inducir la formacin de callo.
Las combinaciones usadas de KIN y 2,4-D ANA fueron establecidas usando un diseo factorial (7x7x2).
Media + DS con la misma letra en las columnas no son estadsticamente diferentes al nivel de 5% de
probabilidad; media seguida por el superndice "R" indica que el callo inducido se desarrollo de raz.
55
Debido a que ninguna investigacin sobre cultivos de tejidos vegetales para la produccin
de metabolitos secundarios ha sido reportada en Calophyllum brasiliense, la citocinina
KIN, y las auxinas 2,4-D y ANA fueron inicialmente seleccionadas para la investigacin
de callo, debido a que son los ms activos y comnmente son empleados para establecer
cultivos de tejidos (Staba 1982). Sin embargo, stos primeros resultados, no fueron tan
satisfactorios como se esperaba. Estos callos, desarrollados a partir de los tratamientos que
generaron el mayor porcentaje de induccin (KIN 0.46 M + ANA 5.37 M), mostraron
un crecimiento lento cuando se subcultivaron. Por lo tanto, se decidi establecer
tratamientos con otros RCV utilizando tambin combinaciones de citocininas y auxinas [b)
BAP + AIB, c) BAP + PIC o ANA, y d) TDZ] para evaluar explantes de semilla y hoja. De
acuerdo a los nuevos tratamientos (b c) utilizados para la induccin, el callo apareci en
toda la superficie de los explantes de hoja y semilla. De igual forma, la respuesta ocurri
despus de los 40 das de cultivo en los explantes de hoja, y se desarroll un callo blanco y
compacto similar a lo observado en los tratamientos con KIN + ANA (Figura 15d),
mientras que en los explantes de semilla inicialmente se form un callo blanco y friable a
los 10 das (Figura 16b), y dos semanas despus (aproximadamente 20 das de inicio del
cultivo) se volvi de un color ms amarillento (Figura 16c) y despus de 30 das, ste se
torno a un color caf claro y de aspecto semifriable (Figura 16d).
56
Figura 16. Respuestas inducidas de callo en explantes de semilla de C. brasiliense, con

BAP 8.88 M + PIC 24.84 M. a) Explante sin reguladores (control); b) a los 10 das; c) a
los 20 das; y d) despus 30 das de cultivo, respectivamente.
Los tratamientos con BAP + AIB (tratamientos b) mostraron una induccin de callo pobre,
y se present slo en dos tratamientos en los explantes de hoja y con bajos porcentajes,
mientras que en los explantes de semilla no hubo respuesta (Tabla 5). Despus del
tratamiento con 19.6 M de AIB se observ la induccin de callo del 29.17%, y al
combinar este RCV con 4.44 M de BAP el porcentaje de callo aument a 33.33% (Tabla
5). En los tratamiento posteriores con una combinacin de BAP + PIC ANA (tratamiento
c), se observ que la adicin de la auxina PIC indujo una mayor produccin de callo en
comparacin con ANA en los explantes de hoja o semilla (Tabla 6). Para los tratamientos
con BAP + PIC, se observ un mayor porcentaje de induccin de callo en los explantes de
semilla en comparacin con los explantes de hoja (Tabla 6). La induccin de callo ms alta
(100%) se produjo en los explantes de semilla tratados con BAP 8.88 M + PIC 24.84 M
57
(Tabla 6). Observaciones similares fueron hechas por Pawar et al. (2007) en Calophyllum
inophyllum, quien encontr una induccin de callo del 86.66% en los explantes de semilla
mediante la aplicacin de concentraciones similares de BAP + PIC. Las clulas vegetales
son totipotentes, y las respuestas de induccin dependen de la edad del explante (Bhojwani
y Razdan 1983; Pierik 1990). Por lo tanto los explantes de semillas pueden producir mayor
porcentaje de callo.

de C. brasiliense, bajo diferentes concentraciones y combinaciones de BAP + IBA despus
de 6 semanas de cultivo.
RCV (M)
Induccin de callo (%)

Explantes
BAP
AIB
Hojas
Semilla
4.9
0.00 0.00c
0.00 0.00c
19.6
29.17 5.89b
0.00 0.00c
29.4
0.00 0.00c
0.00 0.00c
4.44
4.9
0.00 0.00c
0.00 0.00c
4.44
19.6
33.33 0.00a
0.00 0.00c
4.44
29.4
0.00 0.00c
0.00 0.00c
8.88
4.9
0.00 0.00c
0.00 0.00c
8.88
19.6
0.00 0.00c
0.00 0.00c
8.88
29.4
0.00 0.00c
0.00 0.00c
Media + DS con la misma letra en columnas no son estadsticamente diferentes al nivel de

5% de probabilidad.
58

de C. brasiliense bajo diferentes concentraciones y combinaciones de BAP + PIC y BAP +
ANA despus de 6 semanas de cultivo.
RCV (M)
Induccin de callo (%)

Explantes
BAP
PIC
Hojas
Semillas
8.88
8.28
0.00 0.00e
87.50 6.36b
8.88
16.56
54.17 5.89c
0.00 0.00e
8.88
24.84
5.00 0.00d
100.00 0.00a
BAP
ANA
8.88
10.74
0.00 0.00e
0.00 0.00e
8.88
21.48
0.00 0.00e
0.00 0.00e
8.88
32.22
0.00 0.00e
0.00 0.00e
Media + DS con la misma letra en columnas no son estadsticamente diferentes al nivel de

5% de probabilidad.
Con el fin de comparar el efecto de las auxinas AIB, PIC y ANA en la induccin de callo
de los explantes de hojas y semillas, se analizaron los resultados obtenidos de los
tratamientos b y c. Se observaron diferencias significativas entre las auxinas para estos
explantes. De todas las auxinas, el PIC mostr el mayor nmero de tratamientos con
induccin de callo en ambos explantes, mientras que el AIB y ANA no mostraron
diferencias significativas. Por otra parte, los explantes de hoja y semilla fueron comparados
para evaluar el efecto del tipo de explantes en la induccin de callo, y no se encontraron
diferencias significativas entre ellos. Las hojas jvenes se evaluaron de manera ms
extensiva que las semillas ya que las hojas son ms fciles de adquirir, y tienen menor
contenido microbiano en su superficie (Cassells 1997).
59
Por otra parte, cuando el TDZ se aplic como tratamiento de RCV (experimento d), los
resultados no mostraron induccin de callo en ambos tipos de explantes. El hecho de que el
TDZ se aplic como nica fuente de RCV se debe a que es un regulador que acta como
auxina citocinina, de acuerdo a las concentraciones utilizadas (Murthy et al. 1998).
Debido a que los porcentajes ms altos de callo friable se registraron en los explantes de
hoja (CH) con los tratamientos de KIN 0.46 M + ANA 5.37 M y en los explantes de
semilla (CS), con BAP 8.88 M + PIC 24.84 M se observ un mejor crecimiento en
comparacin con los otros tratamientos. Los cultivos derivados de estos tratamientos
fueron seleccionados y mantenidos a travs de los subcultivos. Ambos tipos de callos (CH
y CS) se cosecharon despus de haberse mantenido en subcultivos frecuentes durante 1
ao. Este es el perodo de tiempo recomendado para la etapa de mantenimiento antes de
realizar un anlisis fitoqumico, ya que podra ocurrir variacin somaclonal en los callos, lo
cual puede afectar la produccin de metabolitos secundarios (Bourgaud et al. 2001).
10.4. Produccin de calanlidos y cido apetlico

Una vez estandarizada la metodologa para cuantificar los compuestos de referencia
(calanlido B, calanlido C y cido apetlico) por HPLC, se observ que, el tiempo de
retencin (Tr) para el calanlido B fue a los 31.56 min (Tr = 31.56 min) (Figura 17), para
el calanlido C (Tr = 32.87 min) (Figura 18), y para el cido apetlico (Tr = 25.90 min)
(Figura 19).
60
Minutos
Figura 17. Cromatograma por HPLC del calanlido B (Tr=31.56).
Minutos
Figura 18. Cromatograma por HPLC del calanlido C (Tr=32.87).
Minutos
Figura 19. Cromatograma por HPLC del cido apetlico (Tr=25.90).
61
Posteriormente se analizaron las muestras de los extractos hexnicos de callos de semilla y

de hojas, y de hojas de las plantas de invernadero. Se observ que los callos provenientes
de los explantes de semilla (CS) fueron los mejores productores de metabolitos secundarios
en comparacin con los obtenidos de los callos de hoja (CH) (Tabla 7).
Tabla 7. Anlisis cuantitativo de calanlidos y cido apetlico en extractos hexnicos de

cultivos de callo y muestras de hoja de C. brasiliense.
Compuestos
Tr
Contenido de metabolitos (mg kg -1 PS)
(min)
Calanolido B
31.56
Calanolido C
32.87
cido apetlico
25.90
Muestras
Hojas
Cultivos de callo
Plantas de invernadero
Callo de hoja Callo de semilla
1040.71 13.87a
0.00 0.00b
a
1425.02 4.53
(CH)
(CS)
8.70 1.95c
309.25 42.48b
0.00 0.00b
117.70 9.07a
0.00 0.00c
30.98 1.07b
Media + DS con la misma letra dentro de una fila no son estadsticamente diferentes al
nivel de 5% de probabilidad (n=3).
El calanolido B, el calanlido C y el cido apetlico fueron identificados en las muestras de

extractos hexnicos de CS (Figura 20), mientras que solamente el calanlido B se detect
en CH (Tabla 7, Figura 21). Adems, en CS se detect 35.54 veces mayor concentracin
de calanlido B en comparacin con CH (Tabla 7). El calanlido B fue la cumarina que se
produjo en mayor concentracin en CS (309.25 mg kg-1 PS), seguido por el calanlido C
(117.70 mg kg-1 PS) y el cido apetlico (30.98 mg kg-1 PS) (Tabla 7).
62
Calanlido B
cido apetlico
Calanlido C
Minutos
Figura 20. Cromatograma por HPLC de extractos de callo de semilla (CS).
Calanolido B
Minutos
Figura 21. Cromatograma por HPLC de extracto de callo de hoja (CH).
Concentraciones similares fueron obtenidas en cultivos de callos de C. inophyllum en la

produccin de dipiranocumarinas anti-VIH-1 RT (405.9 mg kg-1 PF de inofilum B y
1413,50 mg kg-1 de inofilum P PF) (Pawar et al. 2007). El calanolido A no se evalu en el
presente estudio debido a que el compuesto de referencia se agot en estudios previos. Por
otra parte, al inicio de los cromatogramas de CS y CH, se observaron otros picos de menor
tamao, de compuestos no identificados, ya que en los estudios fitoqumicos de C.
brasiliense an no se han concluido. Por ejemplo, Mckee et al. (1996) encontr nuevas
piranocumarinas en C. lanigerum y C. teysmanniil.
63
El patrn de produccin de cumarinas fue diferente para CS y CH. Las cantidades de

calanlidos producidos en CS fueron mayores que en CH, debido posiblemente al efecto de
los RCV o al crecimiento. Pawar y Thengane (2009) han demostrado que los RCV afectan
el crecimiento y la expresin de las dipiranocumarinas en cultivos de clulas en suspensin
de C. inophyllum. Encontrar diferencias significativas en la produccin de cumarinas entre
CS y CH, permite mostrar la importancia de las condiciones de incubacin, medios de
cultivo, fuente de explante y el tipo de RCV, en los estudios induccin, seleccin y
establecimiento de lneas celulares de cultivos de callo.
Tambin se analizaron por cromatografa extractos de hojas de las plntulas (menor de 1
metro del altura) de invernadero y se observ que el calanlido B y el cido apetlico
fueron producidos en mayores concentraciones, pero no se observ el calanolido C (Tabla
7, Figura 22). Adems, la produccin del calanlido B y el calanlido C FCS fue de
aproximadamente 3.4 y 3.9 veces mayor que los reportados para la planta silvestre
(Huerta-Reyes et al. 2004). Las plantas provenientes de invernadero estuvieron sometidas a
estrs bitico cuando se cosecharon, pues presentaron evidencia de ataques por hongos
cuando los extractos se prepararon.
cido apetlico
Calanlido B
Minutos
Figura 22. Cromatograma por HPLC de extracto de hojas de plantas de invernadero.

64
El hecho de registrarse mayor produccin de cumarinas en hojas estresadas, podra estar

asociado con la produccin secundaria, ya que se incrementa bajo condiciones de estrs
bitico y abitico (Ramachandra y Ravishankar 2002; Taiz y Zeiger 2002). Por tanto, es
probable que el calanolido B y el cido apetlico actuaron como fitoalexinas en C.
brasiliense (Whitehead y Threlfall 1992). Hay et al. (2003) reporta varias cromanonas con
actividad antifungica, compuestos a la cual pertenece el cido apetlico. Estos autores
destacaron que hay un esfuerzo constante de investigacin para determinar compuestos no
solo con actividad biolgica contra el VIH-1, sino tambin contra bacterias patgenas u
hongos, especialmente en pacientes inmunodeficientes.
Los resultados mostraron que los cultivos de callo pueden representar una posible fuente
biolgica para la produccin de calanlidos. Con el fin de aumentar la produccin, se
podran evaluar varias estrategias. En primer lugar, y debido a que no fue un objetivo de
este trabajo, es necesario establecer un cultivo de clulas en suspensin con el fin de
caracterizar el crecimiento y la produccin de calanlidos. Esto nos permitir tener un
mejor control de la manipulacin, tal y como fue observado en los estudios realizados en
Calophyllum inophyllum, en el cual se demostr la produccin de dipiranocumarinas antiVIH en cultivos de callos y en cultivos de clulas en suspensin (Pawar, et al. 2007; 2009).
Adems, se ha reportado que a travs de la optimizacin de las condiciones del cultivo
pueden obtenerse concentraciones ms altas de metabolitos secundarios en cultivos de
clulas en suspensin, comparados con las plantas silvestres (Mulabagal y Tsay 2004). Es
probable que la elicitacin bitica represente una opcin adecuada para incrementar el
contenido de calanlidos. Adems, se deben considerar otras estrategias para mejorar la
produccin; por ejemplo, el aumento de la concentracin de carbono, que ha sido sealada
65
como una estrategia de xito para el cido rosmarnico en Coleus blumei y algunos
alcaloides en Catharanthus roseus (Knobloch y Berln 1980; Misawa 1985).
11. CONCLUSIONES
El WPM fue el medio ms adecuado para el establecimiento de cultivos de callo,
principalmente en los cultivos derivados de explantes de semilla.
Las condiciones de oscuridad favorecieron el desarrollo de los cultivos en comparacin
con aquellos expuestos a condiciones de luz.
La mayor induccin de callo de C. brasiliense (100%) se produjo en los explantes de
semilla tratados con BAP 8.88 M + PIC 24.84 M (CS), mientras que para los explantes
de hoja ocurri en el tratamiento con KIN 0.46 M + ANA 5.37 M (CH) (80.67%). Los
callos que se desarrollaron a partir de estos tratamientos mostraron un mejor crecimiento
despus de un ao de mantenimiento, y por lo tanto se analizaron por HPLC.
El cultivo de CS fue el mejor para la produccin de cumarinas en comparacin con el
cultivo de CH, produciendo calanlido B en cantidades de 309.25 mg kg-1 PS, calanlido
C 117.70 mg kg-1 PS y cido apetlico 30.98 mg kg-1 PS.
El cultivo de CS es una alternativa viable para la produccin de metabolitos secundarios,
que ofrece la posibilidad de aplicar otras tcnicas para aumentar la acumulacin de estos
compuestos importantes.
Actualmente no existe alguna investigacin relacionada con la deteccin de calanlidos en
cultivos de tejidos de C. brasiliense, por lo que ste estudio es un paso inicial para la
66
investigacin en la produccin del calanlido B y calanlido C en cultivo de tejidos de C.

brasiliense.
12. PERSPECTIVAS
Debido al poco crecimiento que tuvieron los cultivos de callos en C. brasiliense Cambes,
es necesario realizar estudios ms profundos sobre la optimizacin del medio de cultivo,
como es en la concentracin de la fuente de carbono, nitrgeno, y algunos suplementos
orgnicos. Esto con la finalidad de obtener mayor produccin de biomasa y poder as,
establecer cultivos de clulas en suspensin, y cultivos elicitados que puedan ayudar a
incrementar la produccin de calanlidos.
Aunque en este trabajo, no se abordaron objetivos sobre tcnicas de micropropagacin para
sta especie, es importante recalcar que debido a la deforestacin que ocurren ao tras ao,
esta especie, la cual es la nica en Mxico, corre el riesgo de disminuir an ms su
poblacin o incluso desaparecer si no se toman medidas para su conservacin. Para C.
brasiliense, hasta el momento, no se han reportado estudios sobre la propagacin in vitro o
por otra va, por lo que realizar algn protocolo para propagarla sera de gran importancia.
67
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80

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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE CULTIVOS DE CALLO DE Calophyllum

El Doctorado en Biotecnologa de la Universidad Autnoma Metropolitana est

Iztapalapa, D.F. a 23 de abril de 2010

El jurado designado por la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud de la Unidad

ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE CULTIVOS DE CALLO DE Calophyllum

ANTONIO BERNAB ANTONIO

Director: Dr. Francisco Cruz Sosa

Co-Director: Dr. Ricardo Reyes Chilpa

Asesor: Dr. Vctor Manuel Chvez vila

Presidente: Dr. Juan Orozco Villafuerte

Secretario: Dra. Leticia Buenda Gonzlez

Vocal: Dra. Mara Elena Estrada Ziga

Vocal: Dr. Vctor Manuel Chvez vila

4.5.2. Fenoles ............................................................................................................... 24

10. RESULTADOS Y DISCUSIN ................................................................................... 49

Tabla 1. Composicin de algunos medios de cultivos......................................................... 16

Figura 16. Respuestas inducidas de callo en explantes de semilla de C. brasiliense, con

immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase (HIV-1 RT). In this thesis, we

4.1.2. El virus de inmunodeficiencia humana en Mxico

Proceso activo de la DGE

Incremento por oferta de

Figura 2. Nmero de casos acumulados (miles de personas) de SIDA en Mxico, por ao

A diferencia del ao 2004 cuando solamente se haba registrado puntualmente el 18.6% de

enorme a la hora de evaluar logros y fracasos en la lucha contra la infeccin en Mxico. En

En relacin a esto, han hecho esfuerzos con el objetivo de buscar medicamentos ms

4.2. Biotecnologa vegetal

al. 1993). En este aspecto, la biotecnologa vegetal contribuye en cuatro enfoques

no se han podido llegar a un proceso comercialmente viable, lo que ha limitado la cantidad

4.3. Cultivo de tejidos vegetales

y en la micropropagacin de plantas ornamentales, forestales, frutales y hortcolas (Barba

compuestos de gran valor para la industria, la cual es un rea de intensa investigacin

4.4. Factores que afectan el cultivo de tejidos vegetales

4.4.1. Material vegetal

4.4.2. Medio de cultivo

Fuente: Pierik (1990) y Gamborg y Phillips (1995).

Uno de los medios nutritivos ms usados en el CTV es el de Murashige y Skoog (1962),

4.4.2.2. Compuestos orgnicos

de formacin de vstagos axilares y adventicios, y frecuentemente embriognesis en los

reguladores, adems de promover la divisin celular, inducen la formacin de vstagos

4.4.2.2.3. Fuente de carbono

4.4.2.3. Material de soporte y pH

4.4.3. Temperatura, luz y humedad

veces, dependiendo de la especie experimental, se elige una temperatura ms baja (18

4.5. Metabolitos secundarios

procesos de fotosntesis, respiracin, transporte de solutos, translocacin, sntesis de

hipoglucemia y antivirales (Yamada 1991).

(Taiz y Zeiger 2006). Algunas

4.6. Produccin de metabolitos secundarios en cultivos in vitro

Tabla 2. Rendimiento de compuestos de cultivos de clulas vegetales en comparacin con

Fuente: Smetanska (2008).

Figura 4. Distribucin geogrfica del gnero Calophyllum (http://www.discoverlife.org).

5.1.2. Calophyllum brasiliense

De acuerdo a Pennington y Sarukhn (1968) y Niembro (1990), esta especie se describe

verde plidas en el envs; glabras; nervadura central prominente en el envs; nervios

Figura 6. Ejemplar de C. brasiliense en los Tuxtlas, Veracruz, Mxico. a) planta adulta, b)

5.2. Usos tradicionales de Calophyllum brasiliense

durmientes, decoracin de interiores, partes de molinos, puertas y ventanas, telares,