UNIVERSIDAD NACIONAL

AUTÓNOMA DE MÉXICO

PURIFICACIÓN DE PROTEINAS
BCT I (1453)

Catalina Cárdenas Ascención

 ¿POR QUÉ PURIFICAR A LAS PROTEÍNAS?
Es un paso básico para conocer su función:
Secuencia de aminoácidos (estructura primaria)
Relaciones evolutivas
Función bioquímica
Estudio de la estructura terciaria (formación de cristales)

Dicho bioquímico: “No desperdicies pensamientos

puros en proteínas impuras”

Una proteína de interés puede existir en muy pequeña

proporción dentro de la muestra biológica (rango
dinámico).
Proceso formado por varias etapas cuyo objetivo es
lograr la concentración diferencial de una proteína.

Una célula contiene miles de diferentes proteínas.

Separarlas y determinar su estructura es
extremadamente difícil.
 Ubicación de la proteína de interés

 Conocimientos previos de la proteína de interés

 Conocimientos indirectos a través de proteínas homólogas

 Tamaño de la proteína de interés

 Punto isoeléctrico de la proteína de interés

 Rango dinámico de abundancia de la proteína de interés

 Número de aminoácidos

 Tipo de aminoácidos que la conforman

¿Está dentro de la célula o fuera?
 Métodos para liberar el contenido celular

Ciclos de congelación-descongelación
Prensa francesa
Física Macerado con nitrógeno líquido
Macerado con CO2 sólido
Sonicado Ultrasonido
Lisis
Choque osmótico
Tolueno 10% de la
Disolución lipídica
biomasa
Química Detergentes
Enzimas Lisozimas
Tratamiento alcalino
 RANGO DINÁMICO DE UNA PROTEINAS
Indica el órdenes de magnitud (número de copias por célula o
por ml de fluido) en los que se encuentran las proteínas en una
determinada muestra.

En células es de unos 5-7 órdenes, mientras que en el plasma es

de 10-11 órdenes.

Ejemplo:
la concentración de albúmina y de glucagón en plasma difieren
en 9 órdenes de magnitud.

La concentración de la hemoglobina es del orden de 1011

pg/ml, mientras que las interleucinas están en concentraciones
del orden de 1 a 10 pg/ml.
 REGLAS BÁSICAS PARA LA SELECCIÓN DE UN PROCESO
DE PURIFICACIÓN
1. Elige procesos de separación basados en las diferentes
propiedades físico-químicas

2. Elige condiciones que exploten las mayores diferencias

posibles entre las propiedades de la enzima a purificar y las
proteínas contaminantes
3. Se busca en el primer paso, separa las mayor parte de las
proteínas contaminantes
4. Usa un paso muy selectivo tan pronto como sea posible

5. El último paso se reserva para la tecnología mas costosa

 ESTRATEGIA

Obtener de la muestra la proteína pura en

la menor cantidad de pasos y con la menor
pérdida de actividad posible
 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN
Basado en las siguientes propiedades proteicas:

Tamaño
Solubilidad
Carga
Adsorción
Afinidad
Característica Procedimientos
Tamaño  Dialisis – ultrafiltración
 Electroforesis en gel
 Cromatografia de exclusión molecular
 Ultracentrifufacion
Solubidad  Precipitación con Sales
 Precipitación con solventes organicos
 Precipitación por pH

Polaridad  Cromatografia de absorción

 Cromatografía en papel
 Cromatografía en fase reversa
 Cromatografía de interaccion hidrofóbica
Carga  Cromatografia de intercambio iónico
 Electroforesis
 Isoelectroenfoque

Selectividad  Cromatografia de afinidad

 PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Estrategias de separación:
Por solubilidad
Por tamaño
Por carga
Por afinidad de unión

Generalmente involucra varios de estas estrategias en

secuencia.

El objetivo es llegar a purificar varios miligramos de

proteína:
Estructura tridimensional
Mecanismo de acción
 EMPEZAR A SEPARAR

Métodos de Precipitación con sales, precipitación con

Baja resolución temperatura y pH

Métodos cromatográficos: filtración en

Métodos de
gel, intercambio iónico, afinidad
Alta
Resolución Métodos electroforéticos: electroforesis
no desnaturalizante, desnaturalizante
 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS
Las proteínas se mantienen disueltas gracias a sus
interacciones con el agua.
Cuando se añade (NH4)2SO4 a una solución de proteínas, las
moléculas de agua forma enlacen ión-dipolo con la sal.

Al haber menos agua disponible para hidratar a las proteínas,

estas comienzan a interactuar hidrofóbicamente entre ellas.

A una concentración definida de sulfato de amonio, se forma

un precipitado conteniendo determinadas proteínas.
Se recuperan éstas por centrifugación.
Se añade más sal para que precipite un grupo distinto de
proteínas.
 PRECIPITACIÓN CON(NH4)2SO4
El Sulfato de amonio, presenta la siguiente solubilidad:

 70,6 g/100 ml (0 ° C)
 74.4 g/100 mL (20 °C)
 103.8 g/100 mL (100 °C)

Cada proteína tiene una composición de aminoácidos específica

que las hace diferentes unas de otras y, por lo tanto, su
comportamiento en disoluciones también es distinta.

Por lo general las proteínas fibrosas son solubles en agua y

resistentes a la degradación enzimática, sin embargo, con
soluciones de cierta fuerza iónica se pueden solubilizar.
TABLA para determinar la cantidad de sulfato de amonio necesaria para
alcanzar los respectivos porcentajes de saturación.

La concentración inicial y
final de sulfato de
amonio, expresada como
porcentaje de
saturación, se encuentra
en las escalas vertical y
horizontal,
respectivamente.

El punto de intersección de dos líneas trazadas a partir de estos puntos

indica el número de gramos de sal a añadir a cada littler de solución a la
concentración inicial para conducir a la concentración final requerida.
Las proteínas globulares son relativamente mas solubles en
agua y en soluciones de baja fuerza iónica, aunque algunas
coagulan cuando se calientan.

La composición de aminoácidos, es también responsable del

comportamiento de las proteínas en diferentes condiciones de
pH.
Así al acidificar o alcalinizar una determinada proteína, ésta
puede llegar a su punto isoeléctrico, es decir, alcanzar una carga
neta de cero y por lo tanto precipitar.
Ejemplo:

La leche es un producto rico en proteínas, tales como

las caseínas y globulinas, además de contener
carbohidratos y ácidos grasos.

De la leche se puede separar la caseína por

precipitación en su punto isoeléctrico (pH 4.6).
 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS
La precipitación por la remoción del agua hidratante como
con la precipitación con (NH4)2SO4 o PEG (polietilenglicol) es
generalmente reversible, pero la liofilización o la
precipitación con solventes puede ser irreversible.

Las proteínas se encuentran solubles en nuestro extracto,

pero se debe tener presente que la máxima solubilidad de las
proteínas es a una concentración salina similar a la del
citoplasma: 0.15 a 0.25 M para eucariotes, 0.3 a 0.6 M en
bacteria.

Ej. La ARN T7 polimerasa es más soluble a 0.30 M KCl

que a 0.25 o 0.35 M.
 PURIFICACIÓN POR TAMAÑO

Utiliza membrana semipermeable donde

moléculas de agua y las de solutos pequeños la

atraviesen

LAS PROTEÍNAS SON RETENIDAS

 DIÁLISIS
Es uno de los métodos de filtración molecular más utilizados.

Se coloca una solución acuosa que contiene moléculas de

distintos tamaños dentro de una bolsa de diálisis que se
encuentra a su vez sumergida en un gran volumen de un buffer
determinado.

Las moléculas pequeñas del soluto (excepto aquellas que se

encuentran fuertemente cargadas) pasan libremente a través de
la membrana, hasta alcanzar el equilibrio.
 DIÁLISIS
Reemplazando la solución externa repetidas veces, puede
lograrse reducir la concentración de las moléculas pequeñas a
valores prácticamente despreciables.

El agua pasa también libremente a través de la bolsa,

dependiendo de si la solución interna se encuentra más o
menos concentrada que la externa (efecto osmótico).
Diálisis
 DIÁLISIS INVERSA
concentración de material dentro de la membrana de
diálisis .
La membrana de diálisis llena es enterrada en un polímero
seco y soluble en agua que no pueda penetrar en la
membrana, por ejemplo, polietilenglicol o
carboximetilcelulosa.

El agua abandona la bolsa para equilibrarse con la fase

externa.
También puede utilizarse sacarosa, pero debido a que ésta
es una sustancia dializable, puede entrar en la bolsa de
diálisis cuando el agua es eliminada.
 EJEMPLO
Se quiere disminuir la concentración de sales de 1 M a menos
de 1 mM
Muestra inicial: 50 ml de una solución de proteína en buffer
que contiene sulfato de amonio 1 M
PROCEDIMIENTO 1

Diálisis contra 1 L de Se llega a [sulfato de amonio] en el

agua equilibrio la bolsa equilibrio = 95 mM
se hincha hasta
100 ml en 3 y 5 h.
Reemplazar el la bolsa se hincha [sulfato de amonio] en el
dializado por agua hasta 110 ml equilibrio = 9.3 mM
pura
Reemplazar el no hay [sulfato de amonio] en el
dializado por agua hinchamiento de equilibrio = 0.9 mM
pura la bolsa
 EJEMPLO
Protocolos de diálisis para disminuir la concentración de
sales de 1 M a menos de 1 mM
Muestra inicial: 50 ml de una solución de proteína en
buffer que contiene sulfato de amonio 1 M

PROCEDIMIENTO 2
Dializar contra 5 litros la bolsa se [sulfato de
de agua hincha hasta amonio] = 20 mM
110 ml
Dializar contra 5 litros no hay [sulfato de
de agua hinchamiento amonio] en el
de la bolsa equilibrio = 0.4
mM
 TAMAÑO

Ultrafiltración
Se utiliza una membrana semipermeable que retiene las
proteínas
La presión o fuerza centrífuga se usa para separar por
filtración el medio acuoso y las moléculas de tamaño
pequeño
• Uso de celofán o membranas
 Ultrafiltración
En la ultrafiltración consiste en aplicar vacío
o fuerza centrífuga al recipiente en que se
encuentra la membrana semipermeable
cargada con la muestra.
 Ultrafiltración
Diaflo (Amicon).

En este sistema, la membrana está formada por un

polímero muy fino con un tamaño de poro que varía
entre 0.2 y 10 nm, montado sobre una capa de
soporte gruesa (.05-.25 mm de espesor), con poros
muy grandes.

Estas membranas pueden utilizarse para procesos de

concentración (empleando una membrana a través
de la cual sólo pase agua), y de eliminación de sales
en preparaciones para cromatografía, y
fraccionamiento por tamaño molecular.
 Ultrafiltración
La velocidad de flujo a través de estas membranas es tan baja
que debe aplicarse presión (aire comprimido o nitrógeno, hasta
a 5 atmósferas).

Por lo general, para utilizar estas membranas se necesitan

soportes especiales.

Con este método se pueden concentrar volúmenes de 50 ml a 5

ml o de 200 ml a 10 ml en una hora o menos, especialmente si la
concentración final es aún relativamente baja (la velocidad de
filtración cae rápidamente a medida que la concentración de la
sustancia que se quiere concentrar crece).
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Esta técnica comenzó a usarse a principios del siglo XX para
separar pigmentos vegetales, cuyos colores facilitan la tarea.
En la actualidad es posible separar compuestos incoloros.
Se basa en el hecho de que diferentes compuestos
interaccionan de forma diferente con el medio.
Se compone de dos fases: estacionaria y móvil.
La fase móvil fluye sobre la fase estacionaria y arrastra con ella
la muestra a separar.
Cada componente de la muestra fluye en función de las
interacciones que presente con la fase móvil y la fase
estacionaria.
El material que constituye la fase estacionaria se empaca en una
columna, se coloca la muestra y la fase móvil se hace pasar a
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de
retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos
componentes.
Muestra
aplicada Eluyente

Volumen
de columna

Matriz

Tapón
poroso

Eluyente Proteínas separadas

 PARAMETROS DE LA CROMATOGRAFÍA
Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente
y que se empaqueta en la columna. También se denomina:
 fase estacionaria o
lecho de la columna.

Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de

la columna.

Longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se

empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de
cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en
otras como la cromatografía de afinidad.
Volumen de la columna. Volumen total de gel que se
empaqueta en una columna cromatográfica.

Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que

tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha
reemplazado completamente.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO

Intercambio catiónico
Fase estacionaria cargada
negativamente
Intercambio aniónico
Fase estacionaria
cargada positivamente
ELUCIÓN CON GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
FACTORES QUE AFECTAN A LA RETENCIÓN
1. Fuerza Iónica

2. pH

3. Modificadores Orgánicos
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Utiliza la alta
especificidad entre las
moléculas biológicas
para separar
componentes
específicos de mezclas
complejas.

(Antígeno-Anticuerpos)
RECONOCIMIENTO MOLECULAR
VENTAJAS:
No hay restricción por volumen.
Especificidad
Pureza del producto final

DESVENTAJAS:
Precio (alto)
Condiciones de elución drásticas
Ligando específico no disponible o inadecuado
 Tamaño
Cromatografía de filtración o de exclusión
molecular
Las columnas se rellenan de polimeros inertes

Sephadex: polimeros de dextrano

Sepharose: agarosa
Superose: agarosa entrecruzada
Sephacryl: dextrano-bisacrilamida
Superdex: agarosa y dextrano
 Exclusión molecular
Separa mezclas de proteínas por tamaño
1.La columna se equilibra con el buffer de elución
2. Aplicación de la muestra (0.5 - 5% volumen de
columna)
3. Elución.
.
PRINCIPIO:
 Tamaño de partícula y masa
molecular.
 Mayor masa molecular eluye
primero
 El gel retiene partículas de menor
masa molecular
APLICACIONES TIPOS DE MATRIZ
GRANULOS DE UN MATERIAL
ESPONJOSO E HIDRATADO
 Desalado de proteínas  Dextranos con
 Purificación de proteínas enlaces cruzados
 Determinación del peso  Agarosa
molecular de las
proteínas
 Poliacridamida
 CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE

Método separación y análisis

Centrifugation en gradiente de densidad
Gradientes continuos de sacarosa tubo
de centrifuga
Recuperación del materia:
Se perfora el tubo o bien se congela y se
corta en capas
• Figure 4.15. Zonal Centrifugation. The steps are as follows: (A) form a density
gradient, (B) layer the sample on top of the gradient, (C) place the tube in a
swinging-bucket rotor and centrifuge it, and (D) collect the samples. [After D.
Freifelder, Physical Biochemistry, 2d ed. (W. H. Freeman and Company, 1982),
p. 397.]
 Solubilidad
Interacciones mencionadas dependen de:

pH
Fuerza iónica
Disolvente
Temperatura
 Solubilidad-pH
La carga neta de las proteínas depende del
contenido de aminoácidos ácidos y de
aminoácidos básicos.

El valor del pH donde la carga neta de la

proteína es cero  pI (punto isoelectrico)

Solubilidad es mínina
Ej: contenido de aminoácidos ácidos pI bajo
(4-5)
Solubilidad-pH
SOLUBILIDAD-FUERA IÓNICA

Salting in

Salting out
 Salting in
aumenta con la [ sales]  Salting in

Al aumentar la [sales]
proteina se rodea de contraiones
más soluble por > interacción proteína-solvente

Las proteínas en H2O tienden a formar

COMPLEJOS electrostáticos  precipitan
 Salting out
disminuye con la [sales]  Salting out
Sales capturan el H2O > interacción prot-prot

La alta [sal] remueve la esfera de

solvatación de la proteína
 Solubilidad-Disolventes
Adición de disolventes neutros miscibles en agua
(ACETONA, ETANOL)

Se usan en distintas proporciones

Disminuyen el poder de solvatación de una solución

acuosa.
SOLUBILIDAD- TEMPERATURA

0-40 oC >T > solubilidad.

40-50oC  inestabilidad

DESNATURALIZAN ( solubilidad)
 Purificación de Proteínas
Ensayo de actividad
Debe ser una prueba específica para la proteína de
interés
A más específico el ensayo, mejor calidad de
purificación
 ¿CÓMO RECONOCER A LA
PROTEÍNA QUE SE BUSCA?
Es importante tener un punto de referencia:
cantidad total de proteínas en la muestra
Métodos para la determinación de proteínas

Actividad específica = actividad de la proteína de

interés / cantidad total de proteína.
PRECIPITACION DE PROTEINAS
 Efecto de la Fuerza Iónica
Un aumento de la fuerza iónica del medio (por adición
de sulfato de amonio, urea o hidrocloruro de
guanidinio, por ejemplo) también provoca una
disminución en el grado de hidratación de los grupos
iónicos superficiales de la proteína, ya que estos
solutos (1) compiten por el agua y (2) rompen los
puentes de hidrógeno o las interacciones
electrostáticas, de forma que las moléculas proteicas
se agregan y precipitan.
En muchos casos, la precipitación provocada por el
aumento de la fuerza iónica es reversible
 Efecto de la Fuerza Iónica
Mediante una simple diálisis se puede eliminar
el exceso de soluto y recuperar tanto la
estructura como la función original.
A veces es una disminución en la fuerza iónica
la que provoca la precipitación.
Así, las proteínas que se disuelven en
medios salinos pueden desnaturalizarse al
dializarlas frente a agua destilada, y se
renaturalizan cuando se restaura la fuerza
iónica original.
 Carga

pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación.

pH solución< pI= proteína carga(+) por protonación
pH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble
 LAS PROTEÍNAS SON MOLÉCULAS CARGADAS

• Suma de las cargas de las cadenas laterales de los

aminoácidos
• Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea
 Efecto del pH
Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos a la
fuerza iónica
Además de afectar a la envoltura acuosa de las proteínas
también afectan a la carga eléctrica de los grupos ácidos y
básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos
Esta alteración de la carga superficial de las proteínas elimina
las interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura
terciaria y a menudo provoca su precipitación
La solubilidad de una proteína es mínima en su punto
isoeléctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece
cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera
dificultar la formación de agregados.
 Efecto de la Temperatura
Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética
de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa
de las proteínas, y se desnaturalizan
Un aumento de la temperatura destruye las interacciones
débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma que
el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuoso y se
produce la agregación y precipitación de la proteína
desnaturalizada
 Efecto de la Temperatura
Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética
de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa
de las proteínas, y se desnaturalizan
Un aumento de la temperatura destruye las interacciones
débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma que
el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuoso y se
produce la agregación y precipitación de la proteína
desnaturalizada
Sal más usada: Sulfato de Amonio
 DETERMINACIÓN DE LA
CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA

Métodos espectrofotométricos

Ventajas de la técnica
Rápida
Precisa
Versátil
Fácil de usar
Eficiente en costo
MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS
Método de Absorción No se pierden las Interfieren compuestos
muestras que absorben en el UV
MÉTODOS
COLORIMÉTRICOS
Biuret Específico para Poca sensibilidad
proteínas, muestra pocas 1 a 6 mg/mL
interferencias es barato
Lowry Tiene bastante No todas las proteínas
sensibilidad reaccionan igual.
de 0,1-1 mg/mL. Muestra interferencias
con detergentes no
iónicos, sulfato de
amonio
Bradford Muy sensible Muestra interferencias
0,5 -1,4 mg/mL con detergentes
 EVALUACIÓN DE LA
PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA

GRADO DE PURIFICACIÓN
Incremento de actividad específica respecto a la de partida

RENDIMIENTO
Porcentaje de enzima purificada

Parámetros que se evalúan en la purificación

Concentración de proteínas
Actividad enzimática
 Tabla de Purificación

Volum. Total Actv. Actividad

(ml) Prot (und) específica Grado de
(mg) Units/mg purificación
Extracto 1400 1000 100000 10
1
celular 0
Cromat. 90 400 80000 200
20
exclusión
Cromat 80 100 60000 600
60
Intercam.
iónico

Rendimiento
 UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Unidad internacional de actividad enzimática se
define como la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de 1 micromol de sustrato por minuto
en condiciones estándar
Katal, cantidad de enzima que consume un mol
de sustrato por segundo
1 kcat = 60 106 UI
ACTIVIDAD ESPECÍFICA
Es el resultado de dividir la actividad en UI por la
cantidad de proteína presente en la fracción
Pureza
 Purificar es un procedimiento secuencial
Preparación

Fuente Técnica de
separación

Repetir con otra tecnica de

separación
Separación

No
Ensayo de la cantidad de proteínas
Ensayo de la actividad enzimática

No SI Combinar Pura?
Desechar Control de
Fracciones
Hay actividad? pureza

SI

Estudios enzimáticos/estructurales, etc

 FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS
DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN

Factor Fuente de frecuencia Modo de

inactivante enzima contrarrestarlo
Calor cualquiera universal Enfriamiento
Frio cualquiera raro Calentamiento
Proteasa mayoría Común Inhibidores de
proteasas o frío
Productos Plantas y hongos Bastante común Agentes reductores
oxidación de
fenoles

oxidación cualquiera común Agentes reductores

Dilución proteína cualquiera Bastante común Concentración rápida

Inhibidores Plantas y Raro Separación del
específicos bacterias inhibidor
Metales pesados cualquiera Raro Agentes quelantes
 Intercambio iónico
- + -
+ - - +
- -
+
- +
- + -
+
-
+ + - - -
+ - + - -
- --
+
- -
+ - + + -
+ - + - - -
- - +
- -
+ - +
- -
+
- -
+ - +
- - + - -
- -
+ - +
- - +
-
A baja concentración A mayor concentración
Proteínas adsorbidas
de sal, se desprenden de sal se desprenden
al intercambiador
las proteínas menos las proteínas más
iónico
electronegativas electronegativas
Soportes cromatográficos
Carga
ISOELECTROENFOQUE
Carga
 Hidrofobicidad
Cromatografía de hidrofobicidad fracciona a las proteínas explotando los
diferentes grados de hidrofobicidad superficial de las proteínas.

Las muestras se cargan con una alta fuerza iónica

La elución se produce con un gradiente de fuerza iónica negativa,

se pueden incluir detergentes o sustancias orgánicas

Tipo de resina, consiste en partes hidrofóbicas unidas a una matriz inerte

Fenil-Sefarosa, octil sefarosa

 Selectividad Cromatografía afinidad

Método más poderoso y selectivo

Ligando: Sustrato, Cofactor, Inhibidor, Anticuerpo, etc

Elución: Bajando el pH, aumentando fuerza iónica, incluir ligando soluble, etc
Problemas:
No se puede anclar el ligando
El anclaje produce un cambio conformacional
Fuerza de unión debe ser media
Inespecificidad
TEST JUZGAR EL ÉXITO DE UNA PURIFICACIÓN
ENZIMÁTICA

Test de pureza

- Electroforesis en gel de acrilamida. 1D ó 2D

Tinción? Plata, Comassie, Fluerescencia, etc

- Isoelectroenfoque.

-Espectrometria de masas

Test de actividad
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN

Diseño de enzimas:

 La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras

eficientes hace que una proteína se sobreexprese.

 Dirigir la proteína sintetizada de novo al periplasma de la

célula.

 Adición de colas de afinidad.

 AISLAMIENTO DEL PRODUCTO

Luego de la formación del producto de

interés procederemos a su aislamiento.

En este caso particular consideramos como

producto:

Proteína
Aislamiento de una proteína
Se requiere conocimiento de la proteína
De que tipo de célula proviene
De que parte de la célula
Qué hace esa proteína
Particularmente útil si se conoce :
Tamaño
Composición
 Aislamiento de una proteína
Selección de la fuente proteica

Ej: de tejidos de animales como pollos, cerdos, vacas,

ratas son los elegidos
Distribución de la proteina (mayor concentración)
Ej: microorganismos
1. bacterias: E. coli
2. Levaduras: Saccharomyces cerevisiae
Tecnicas de clonado molecular
 Métodos de solubilización

Es el primer paso obligado de la purificación



la proteína debe estar en solución

 Estabilizacón de la proteina
Existencia de agentes que provocan un daño
irreversible
pH
T
Proteasas
Interfase agua–aire
Adsorción a la pared de los recipientes
Crecimiento de microorganismos
En el caso de proteína intracelular  muy
baja concentracion y acompanada de
millares de proteinas y otras
macromoleculas
En el caso de proteínas extracelulares
pueden estar en baja concentración y
también acompañada o ser el principal
producto extracelular