Manual de Hema
Manual de Hema
Manual de Hema
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Conteo de glbulos rojos
OBJETIVO
Aprender a realizar un recuento de Eritrocitos por milmetro cbico de sangre, interpretar el resultado, as
como adiestrarse en el manejo de la cmara de Neubauer y la pipeta de Thoma
FUNDAMENTO
Para el conteo de eritrocitos, se usan mtodos sistemticos que son ms rpidos y precisos, y los
mtodos manuales.
Todo mtodo manual de recuento celular incluye 3 fases:
Dilucin de la sangre
Muestreo de la sangre diluida en un volumen
Recuento de clulas en ese volumen
Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas microscpicas dispersas en
un fluido. Habitualmente ser necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la suspensin
como el porcentaje de stas que son viables.
Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la relativamente simple
cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que utiliza la cmara de
Neubaver
Para el conteo de eritrocitos, es necesario diluir la sangre con el lquido de Hayem, en una proporcin
exacta. Luego se examina en el microscopio con una cantidad pequea colocada en la cmara de
Neubaver, contando el nmero de elementos que se encuentran en el retculo de la cmara y mediante
una operacin se obtiene el nmero total.
Para la realizacin del conteo manual se necesita un lquido de dilucin, una cmara de recuento, una
pipeta diluidora y un microscopio.
Material
Equipo
reactivos
Microscopio ptico
Solucin de Hayem
Sangre
Cubreobjetos
Cmara de Neubaver
Gasas
Tubo de ensaye de
12x75mm
Procedimiento
1. Una vez seleccionada, se desinfecta la zona con alcohol y se practica puncin venosa, la sangre
es recogida en un tubo con anticoagulante EDTA
2. Colocar el tubo de plstico y la boquilla para aspirar en la pipeta
3. Llenar la pipeta de glbulos rojos con sangre hasta la marca 0.5 para realizar una dilucin de
1/200, y si se carga hasta 1, la dilucin ser 1/100. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente.
Si la sangre se pasa de la marca, se puede absorber con gasa el excedente
4. Introducir la pipeta en el tubo de ensaye que contiene el diluyente (Hayem) y llenar de lquido de
dilucin hasta la marca de 101
5. Se tapa la punta con papel parafilm y se coloca en un rotador automtico o se hace rotar
manualmente de 2-3 minutos
6. Destapar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequea cerca de un
extremo de la cmara para que por capilaridad se llene exactamente. Dejar 2 minutos que los
eritrocitos se sedimenten
7. Colocar en la platina del microscopio y enfocar la cuadricula a 10x. Luego con el objetivo de 40x
contar sobre el cuadro grande central de la cmara solo en 5 cuadrados pequeos: uno central y
cuatro angulares (80 cuadritos del total)
8. En el recuento se incluyen las clulas que cubren o tocan por dentro o por fuera las lneas
limitantes superior e izquierda en el cuadro pequeo de recuento y no se consideran los que estn
en los lmites inferior y derecho.
Valores de referencia:
Practica No.5
Cuantificacin de hemoglobina
Objetivo:
Determinar cuntos grs. de hemoglobina (Hb) hay en toda la sangre circulante, para tener un diagnstico
clnico ya que se pueden variar diversas enfermedades debido a un valor anormal de Hemoglobina.
Fundamento:
La hemoglobina es una protena conjugada que sirve para el transporte de oxgeno y dixido de carbono.
La masa total de eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr. De hemoglobina capaces de transportar
800ml de oxgeno.
Una molcula de hemoglobina consta de 2 pares de cadenas poli ppticas (unin de aminocidos)
(globina) y 4 grupos proteicos HEM que contienen cada uno un tomo de fe en estado ferroso. Cada
punto HEM se localiza en una zona determinada de una de las cadenas de polipptidos. Localizando
cerca la superficie de la molcula, el HEM se combina de forma reversible con una molcula de oxgeno y
dixido de carbono. Este grupo HEM es el responsable del color rojo de la hemoglobina (Hb).
La parte proteica o globina tiene 4 cadenas poli peptdicas que se denominan con las letras , , , .
Existe una cadena ms la que est presente durante los 3 primeros meses de vida se diferencian unas
de las otras en el numero o posicin (de los aminocidos de los que estn compuestas). Por lo tanto
existen varios tipos de Hb. En el ser humano se pueden encontrar las siguientes hemoglobinas normales:
Hemoglobina A: consta de 2 cadenas y 2 cadenas en un adulto normal corresponde a ms del 95%
del total.
Hemoglobina A: consta de 2 cadenas y 2 cadenas en un adulto sano esta en porcin menor de 3%.
Hemoglobina F (fetal): consta de 2 cadenas y 2 cadenas . Es la hemoglobina principal en el feto desde
el 4 mes del embarazo hasta aproximadamente los 6 meses de edad. La Hb F tiene mayor afinidad por
el oxgeno.
Hemoglobina Gower: consta de 2 cadenas y 2 cadenas . Desaparece casi por completo en el tercer
mes de embarazo y empieza a aparecer la Hb fetal.
Material
Equipo
Reactivos
Tubos de ensaye de
Espectrofotmetro.
Solucin de Drabkin
13x100mm
Pipeta de shali
Gasas
Procedimiento
1. Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA)
2. En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin, marcarlo como
problema (P).
3. Con una pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mL (20 L) de sangre total, limpiar luego la
punta de la pipeta con gasa
4. Mezcle la solucin de Drabkin con la sangre sumergiendo las pipetas al fondo del tubo y
expulsando la sangre
5. Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se efecte la reaccin.
6. Despus de ese tiempo se observara una coloracin roja transparente, se llena las celdillas hasta
la marca que se encuentra y se procede la lectura.
7. Leer en absorbancia a 540 nm llevando a cero el fotmetro con solucin de Drabkin.
8. Despus colocar el problema en el espectrofotmetro y leer la absorbancia
9. Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta
x 20:%
Valores de referencia
Nios al nacer.. 13,6 - 19,6 g/dL de sangre
Nios de 1 ao..... 11,3 - 13,0 g/dL de sangre
Nios de 10 -12 aos... 11,5 - 14,8 g/dL de sangre
Mujeres... 11,5 - 16,5 g/dL de sangre
Hombres. 14,0 - 18,0 g/dL de sangre
Practica No.6
Determinacin de hematocrito
OBJETIVO
Aprender a realizar la prueba del hematocrito utilizando el macro y micromtodo, conocer su importancia
en el diagnstico de enfermedades y la forma adecuada de su procedimiento.
FUNDAMENTO
El hematocrito es un examen de sangre que mide el porcentaje del volumen de toda la sangre que est
compuesta de glbulos rojos. Esta medicin depende del nmero de glbulos rojos y de su tamao. El
resultado se expresa en porcentaje.
El hematocrito casi siempre se ordena como parte de un conteo sanguneo completo (hemograma).
Para la realizacin de esta prueba, con el macromtodo, la sangre se extrae tpicamente de una vena,
por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano.
Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras
que otras slo sienten un pinchazo o sensacin de picadura. Posteriormente, puede haber algo de
sensacin pulstil.
Un volumen de sangre se deposita en un tubo de Wintrobe, por medio de una pipeta, hasta la marca del
10 y se debe de centrifugar. Al terminar la prueba, deben de quedar separados el plasma de la sangre y
las clulas, depositndose en el fondo y presentando un color rojo intenso.
Para la realizacin del micromtodo, se utilizan unos tubos de un calibre muy delgado, llamados
capilares, y pueden ser llenados con la misma sangre venosa o de capilar. Este ltimo es el ms usado,
por ser ms rpido y menos riesgoso al usar sangre capilar. Para su lectura se usa una escala
estandarizada.
Materia
Tubo de Wintrobe
Pipeta Pasteur de cuello
largo
Bulbo
Papel parafilm
Equipo
Centrifuga
Reactivos
Sangre
Procedimiento
1. Una vez seleccionada, se desinfecta la zona con alcohol y se practica puncin venosa. La sangre
es recogida en un tubo lila con EDTA.
2. Llenar el tubo de Wintrobe con la sangre extrada con anticoagulante ayudndose de una pipeta
Pasteur, comenzando desde el fondo hasta la marca superior de 100 mm, teniendo cuidado de no
provocar espuma ni dejar burbujas en el tubo.
3. Centrifugar a 3500 rpm durante 30 minutos.
4. Leer directamente el paquete globular y aplicar la siguiente operacin
Practica No.2
Puncin capilar
OBJETIVO
Aprender a realizar correctamente la obtencin de sangre por puncin capilar o cutnea.
FUNDAMENTO
Los vasos sanguneos son los conductos que conducen la sangre, y se dividen en arterias, venas y
capilares.
Los capilares son conductos sumamente delgados que se entrelazan formando redes entre las arterias y
las venas. Estn constituidas por una sola capa de clulas epiteliales planas (endotelio) que les permite
ser muy permeables.
La puncin capilar o cutnea recoge la sangre capilar que llega de las arteriolas, vnulas y capilares,
mediante una microherida, en la epidermis, practicada con una aguja o lanceta. La composicin de esta
sangre es ms parecida a la arterial que a la venosa.
Esta puncin permite la obtencin de una cantidad muy pequea de sangre.
La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anular en los adultos, del lbulo de la
oreja y del dedo gordo del pie o taln en los nios.
material
Lanceta
Tubos capilares
Plastilina
Equipo
Reactivos
Procedimiento
1.
2.
3.
4.
Una vez seleccionada la zona, se desinfecta la zona con alcohol al 70%, secar con algodn estril.
Punzar la piel con una lanceta estril desechable (2 mm de profundidad).
La primera gota de sangre se deja perder, limpindola con la gasa sin tocar la zona pinchada
Se espera a que caigan ms gotas, sin exprimir el rea pinchada porque eso diluira la sangre con
lquido extracelular. Se recogen las gotas de sangre necesarias sobre alguno de estos objetos:
5. La tira reactiva.
6. Tubo capilar, mientras se tapa su otro extremo con el dedo. Despus de la recogida se pincha el
tubo capilar en plastilina para que un pequeo fragmento de sta obstruya su extremo o se sella
con calor
Practica N3
Puncin venosa
OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencin de muestras sanguneas, as como
aprender a tomar la muestra por puncin venosa, y aplicar dichos criterios al momento de hacerlo.
FUNDAMENTO
Los vasos sanguneos son los conductos que conducen la sangre, y se dividen en arterias, venas y
capilares.
Las venas son los conductos que llevan la sangre de los tejidos al corazn. Estn constituidas por tejido
muy similar a las arterias, a diferencia de que las venas el tejido muscular y elstico es menor y la
adventicia es ms gruesa, razn por la cual soportan menos presin.
Otra diferencia importante es que en su trayecto presentan vlvulas que facilitan el regreso de la sangre
al corazn.
Las venas ms utilizadas para la venopuncin estn localizadas en el rea
ante cubital:
a) Vena Cubital: Es la ms larga y gruesa de todas y es la preferida por bordear la musculatura del
brazo.
b) Vena Ceflica: Tiene iguales caractersticas de la anterior, pero es un poco menos gruesa.
c) Vena Baslica: Es ms pequea que las anteriores. Esta vena est cerca de la arteria braquial, por lo
que su puncin es riesgosa y su rea es ms sensible y dolorosa para el paciente.
Debido a que la sangre se utiliza para mltiples funciones dentro del cuerpo, los exmenes de sangre o
de sus componentes pueden suministrar indicios claves para el diagnstico de muchas condiciones
mdicas.
Material
Jeringa de 5 mL
Algodn
Ligadura
Reactivos
Anticoagulantes
Centrifuga
Tubo de ensaye de
13x100mm
Gradilla
Procedimiento
1. Verificar que los elementos por usar estn listos y que el paciente se sienta cmodo
2. Aplicar la ligadura aproximadamente cuatro dedos por encima de la flexin del codo o a 10 cm del
codo y sujetar con un medio nudo.
3. Limpiar la zona con una torunda de algodn embebida en alcohol en un rea de 2 pulgadas
4. Se retira el estuche protector de la aguja y se coge con la jeringa de tal manera que el bisel se
encuentre hacia arriba
5. Colocar la aguja en direccin paralela a la vena, se perfora la piel haciendo avanzar la aguja 0.5-1
cm en el tejido subcutneo, luego se perfora la vena
6. Se aspira con la jeringa hasta el volumen requerido
7. Retirar la ligadura indicar al paciente que deje de hacer fuerza en el puo. Se coloca la torunda
encima de la puncin y se retira la aguja
8. Retirar la aguja de la jeringa. Verter la muestra lentamente por las paredes del tubo con
anticoagulante.
Practica No. 9
ndices hematimetricos
Objetivo:
Aprender a realizar los clculos para poder determinar enfermedades
Fundamento:
Wintrobe introdujo los clculos para la determinacin del tamao, contenido y concentracin de Hb en los
glbulos rojos; estos ndices de los eritrocitos han resultado tiles para la caracterizacin morfolgica de
las anemias y pueden calcularse a partir del recuento de glbulos rojos, de la concentracin de
hemoglobina y del hematocrito.
Volumen corpuscular medio (VCM).
El VCM es el medio de los eritrocitos y se calcula a partir del hematocrito (Hto, volumen del concentrado
celular) y del recuento de los eritrocitos. VCM = Hto x1.000/eritrocitos (en millones por 1), expresando
en femtolitros o m. Si el hematocrito = 0,45 y el recuento de eritrocitos = 5 x 1012/l, 1 l contendr 5 x
1012 eritrocitos, que ocuparn un volumen de 0,45l. El VCM = 0,45/ 5 x 1012 = 90 x 10-15 l (fl); femtolitro
(fl) = 10-15 l = 1 m3.
Hemoglobina corpuscular media (HCM).
La HCM es el contenido (peso) de Hb en el promedio de eritrocitos; se calcula a partir de la concentracin
de Hb y el recuento de eritrocitos: HCM = Hb (en g/l) / eritrocitos (n millones / l) expresado en
picogramos. Si la Hb = 15g/dl y el recuento de eritrocitos es de 5 x 1012/l 1 l contiene 150g de Hb
distribuidos en 5 x 10 12 clulas.
Los ndices se determinan de manera algo distinta con aparatos de impedancia elctrica. El VCM se
deriva de la altura media de los impulsos de voltaje formados durante el recuento de glbulos rojos, y la
Hb se mide por la densidad ptica de la HiCN. Los otros tres valores se calculan: Hto = VCM x eritrocitos;
HCM = Hb/eritrocitos; CHCM = Hb/Hto.
Los valores de referencia para los ndices dependern de si se determinan a partir del hematocrito
centrifugado o de contadores celulares. En los individuos normales sern similares si ambos se corrigen
para el plasma retenido. Sin embargo, dado el incremento de plasma retenido en las anemias
hipocrmicas y en la anemia de clulas falciformes, la CHCM, calculada a partir del microhematcrito,
ser significativamente ms baja que la derivada de los contadores de impedancia elctrica.
Con el modelo Coulter S-Plus IV, nuestros intervalos de referencia del 95% para adultos normales son los
siguientes: VCM=80 a 96 fl; HCM= 27 a 33 pg: y CHCM= 33 a 36 g/dL. En una persona sana, la variacin
es muy escasa y no supera ms de ms menos 1 U en cualquiera de los ndices. Las desviaciones del
valor de referencia para un individuo o de los intervalos de referencia para las personas normales son
tiles particularmente para caracterizar los tipos morfolgicos de la anemia. En las anemias microcticas,
los ndices pueden llegar a ser bajos, de slo 50fl para el VCM, 15 pg para la HCM y 22 g/L par la CHCM;
en general no disminuyen ms. En las anemias macrocticas, los valores pueden llegar hasta niveles de
150 fl para el VCM y 50 pg para HCM, pero la CHCCM da valores normales o reducidos. Este ltimo valor
slo aumenta en la esferocitosis y raras veces supera los 38 g/dL.
Practica No.8
Conteo de reticulocitos
OBJETIVO
Identificar los reticulocitos presentes en una muestra de sangre, reconocer y observar su aspecto, y ver la
relacin entre la cantidad presente de estas clulas, con respecto a 2000 hemates.
FUNDAMENTO
Este tipo de anlisis se suele realizar para:
Seguimiento despus de un tratamiento de anemia por deficiencia de ferropnica, Vit. B12, folato o
insuficiencia renal.
Descenso de la Hb
Para la visualizacin de los reticulocitos utilizamos colorantes vitales, como el azul de metileno o azul
cresil brillante, que dan lugar a precipitados de restos de ARN, los cuales se observan como filamentos
azul intenso en el interior celular.
ms maduros:
Material
Equipo
Reactivos
Microscopio ptico
Tubo de ensaye de
13x100mm
Sangre
Pipeta Pasteur
Tubo de hemolisis
1. Echamos tres gotas de colorante en un tubo de hemlisis con otras tres gotas de sangre.
2. Mezclamos con suavidad y tapamos con parafilm.
3. Lo dejamos al bao mara durante 5 minutos.
4. Una vez pasados los 5 minutos, movemos suavemente de nuevo, y aadimos una gota de
la mezcla para hacer una extensin
5. Aadimos aceite de inmersin
6. Enfocamos la muestra con el objetivo 100x. Los hemates se ven teidos de color verdeamarillento y los reticulocitos se distinguirn por los filamentos azul intenso del interior.
7. Se cuentan los reticulocitos que hay entre 2000 hemates. Podemos contar unos
25 aproximadamente. Si aplicamos la frmula para calcular el porcentaje de reticulocitos
que hay, obtenemos el siguiente resultado:
% reticulocitos = N de reticulocitos contados/ N de hemates contados x 100
Practica No.1
Objetivos:
El alumno aprender a realizar anticoagulantes para su uso en el laboratorio.
Conocer los diferentes tipos de anticoagulantes que existen.
Saber cules son sus funciones
Fundamento
ANTICOAGULANTES
Los anticoagulantes son frmacos que dificultan o impiden la coagulacin de la sangre
Son un grupo de sustancias naturales o sintticas que interfieren en los mecanismos de coagulacin de
la sangre
Impiden la coagulacin de la sangre evitando la formacin de trombos impidiendo su crecimiento o
favoreciendo su disolucin en caso de que se hayan formado
Citrato de Na:
Se utiliza para la coagulacin de la sangre y estudio de la accin plaquetaria la proporcin es una parte
de solucin acuosa a 9 partes de sangre total (1:9). Cuando se deposita la sangre en el tubo es necesario
mezclarla 9 veces.
EDTA (ETILEN-DIAMINO-TETRA-ACETATO):
La concentracin es de 1 a 2 miligramos x mm de sangre, anticoagulante preferido para estudios
morfolgicos y recuentos celulares.
Heparina:
Concentracin de 0.1 a 0.2 miligramos por ml de sangre, es el mejor anticoagulante para la prevencin
de hemlisis y prueba de fragilidad osmtica.
No es ideal para recuento leucocitario o plaquetario porque agrega las clulas
material
reactivos
equipo
Agitador de vidrio de 20
cm
3 tubos de ensaye de
13x100 con tapn
Pipeta volumtrica
Vaso de precipitados
Gradilla
Maskin tape
Plumn negro
Hojas
1 abate lenguas
Agua destilada
Balanza analtica
EDTA al 10%
Citrato de sodio al 3.8%
Oxalato de amonio
Oxalato de potasio
Procedimiento:
Se prepararon 5ml de los siguientes anticoagulantes (EDTA, citrato de sodio, mezcla de oxalatos
(Potasio y amonio).
En los tres tubos se colocaron 5ml de agua destilada con ayuda de la pipeta volumtrica
En una caja de papel pesar 0.5 gr de EDTA con ayuda de la balanza granataria .al igual que el anterior
se pesaran 0.5gr de citrato de sodio, en la mezcla de oxalatos (potasio) 0.2gr, (amonio) 0,3gr, para que al
igual que los dos anteriores se diera el peso de 0.5gr.
Ya obtenida el agua destilada en los tubos se le agregaran los tres solutos pesados posteriormente se
mezclaran para obtener lo deseado
Una vez mezclados se rotularan con el nombre adecuado de cada uno, su porcentaje, grupo y equipo.
Practica No.7
Frotis sanguneo
Objetivo:
El objetivo de esta prctica es aprender a realizar un frotis y,seguidamente, observarlo al
microscopio e identificar los distintos glbulos sanguneos
Fundamento:
La sangre es un tejido fluido que circula por capilares, venas y arterias de todos los vertebrados e
invertebrados. Su color rojo caracterstico es debido a la presencia del pigmento hemoglobnico
contenido en los eritrocitos.
Es un tipo de tejido conjuntivo especializado. Tiene una fase slida (que incluye a los glbulos
blancos, los glbulos rojos y las plaquetas) y una fase lquida, representada por el plasma sanguneo.
Un frotis de sangre consiste en realizar una extensin de sangre sobre un portaobjetos, colorearla y
examinarla al microscopio. Lo ms adecuado es emplear sangre que an no ha estado en contacto
con el anticoagulante, pues este podra alterar los resultados (algunos anticoagulantes tienden a
deformar las clulas de la sangre).
Coloracin excesivamente azul: Frotis muy grueso, lavado insuficiente, Tincin muy
Prolongada,
Colorante demasiado alcalino.
Coloracin muy rosada: El agua del lavado, el colorante o el tampn demasiado cidos.
Aparicin de artefactos debido a suciedad, deterioro o presencia de grasa en portaobjetos.
Hidratacin de los hemates: Fijacin inadecuada por uso de alcohol metlico no absoluto.
Material
Portaobjetos
Equipo
Microscopio ptico
Reactivos
Colorantes para tincin
de Wright
Pipeta Pasteur